本發(fā)明涉及一種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗及其生產方法。屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
小反芻獸疫和山羊痘是山羊的兩種傳染性疫病。
小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)也稱為小反芻獸偽牛瘟、卡他、肺腸炎以及口肺腸炎綜合癥，是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)引起的小反芻獸一種急性傳染病。聯合國糧農組織(FAO)和國際獸醫(yī)局(OIE)都將此病列為A類烈性傳染病，在我國該病也被列為一類動物傳染病。
1942年，世界上首次在西非的科特迪瓦報道發(fā)生小反芻獸疫。隨后的幾年里，在尼日利亞、塞爾維亞和加納等非洲國家都報道發(fā)生此病。近幾年來，小反芻獸疫又有進一步蔓延發(fā)展的趨勢，并且流行形勢日益嚴峻。到目前為止，中非、東非、西亞以及南亞的許多國家都報道發(fā)生過小反芻獸疫。世界各國對此病都予以高度重視，美國、韓國、印度等國家都在積極進行相關方面的研究工作。我國在2007年7月首次在西藏阿里地區(qū)報道發(fā)生小反芻獸疫，給我國的養(yǎng)羊業(yè)造成了重大的損失。
PPRV主要感染山羊和綿羊等小反芻獸，但是不同品種的羊敏感性有顯著差別。山羊比綿羊更易感，其中歐洲品系的山羊更為易感。幼齡動物易感性較高，但是哺乳期的動物抵抗力較強。PPR一般多發(fā)生在雨季以及干燥寒冷的季節(jié)。山羊的發(fā)病率可以達到100％，死亡率在20％-90％不等，嚴重爆發(fā)時死亡率也能夠達到100％。耐過動物經過一段時間可以恢復健康。
研究表明，山羊在感染PPRV后的四年時仍能夠檢測到抗體。防制PPR的主要措施就是進行疫苗免疫接種。由于PPRV和牛瘟病毒(Rinderpest virus，RPV)之間的抗原相關性很強，可用RPV組織培養(yǎng)的牛瘟活疫苗對綿羊、山羊進行免疫，并獲得了很好的免疫保護效果，但是這種疫苗不利于在全球牛瘟消滅計劃的實施，主要在非洲一些少數國家和地區(qū)有所使用。目前OIE在發(fā)生小反芻獸疫的國家和地區(qū)推薦使用的疫苗是PPRV 75/1株的生產的弱毒活疫苗。有研究人員還利用基因反向遺傳技術研究成功PPRV/RPV的嵌合體疫苗，即利用PPRV的糖蛋白基因取代RPV表面的相應糖蛋白基因。利用這種方法構建的疫苗，對PPRV能夠產生良好的免疫原性。此外，G.Berhe等將小反芻獸疫的F基因克隆到山羊痘病毒中構建了基因重組疫苗，能夠抵抗小反芻獸疫強毒的感染，但是還沒有應用到臨床生產實踐中。
小反芻獸疫活疫苗是由1975年從尼日利亞分離到的PPRV 75/1株病毒接種Vero細胞并連續(xù)傳代達70代以后致弱獲得的疫苗毒株。目前OIE參考實驗室已經傳代至120代，病毒仍然保持一定的免疫保護力。毒株在細胞上繁殖以后以凍干的形式－20℃條件下保存。
山羊痘(Goat pox)是由山羊痘病毒(Goat pox virus)引起的山羊的一種高度接觸性傳染病。臨床特征與綿羊痘相似。主要表現為皮膚和粘膜上出現皰疹，進而形成痘腫，并漸進發(fā)展為化膿，結痂和引起全身痘及全身性反應。但臨床上也有痘腫不經化膿過程的，即所謂“石痘”。重癥患羊多出現內臟器官病變和死亡。本病在地中海地區(qū)，非洲、和亞洲的一些國家，以及中、近東一帶均有發(fā)生。也偶見歐洲部分地區(qū)和澳大利亞。呈散發(fā)或地方性流行。其病狀和死亡率，因毒株及宿主不同而有差異。有報告稱土耳其的死亡率為3％～40％(Chefik)；摩洛哥的死亡率為5％～70％(Grimpret)等。
本病在我國五十年代，僅見三北地區(qū)(西北、華北、東北)流行。但最近幾年，南方數省、區(qū)亦有發(fā)生。山羊痘在我國的發(fā)病率可高達37.59％(陜西榆林地區(qū)，1985)。死亡率多在3％(青海省，1953年)～15.13％(陜西榆林地區(qū)，1985)之間。山羊痘嚴重影響了我國養(yǎng)羊業(yè)和制革工業(yè)的發(fā)展。
山羊痘病毒為雙股DNA病毒，屬豆病毒科，山羊痘病毒屬成員。該病毒嗜上皮性，沒有血清型的區(qū)別。病毒容易在羔羊及犢牛的睪丸細胞和腎細胞上生長、繁殖，并致明顯的細胞病變(CPE)。病毒也可在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)上繁殖，但繼代時要與羊體交替進行。否則，繼代的代數有限。
中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所王紹華、江煥賢等用青海株山羊痘弱毒免疫綿羊，免后8天即可抵抗10000個感染量的綿羊痘強毒攻擊，與AL-Bana等多數學者的試驗結果相同。
山羊痘疫苗有滅活疫苗和弱毒活疫苗兩類。前者，是國外至今廣為使用的疫苗。后者，是我國1984年以來使用的疫苗。
目前市場上已有小反芻獸疫活疫苗和山羊痘活疫苗，需要多次分別注射，使用不方便，而多聯疫苗雖然使用比較方便，但疫苗各免疫抗原成分之間往往會產生干擾作用。因此在制備小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗時，應保證兩者不產生免疫干擾現象，即不降低各自的免疫效果。
技術實現要素：
本發(fā)明目的在于制備出小反芻獸疫、羊痘抗原二者之間無相互干擾，相容性好的小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗。
本發(fā)明技術方案
1.一種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有小反芻獸疫病毒弱毒株活病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)和山羊痘病毒(Goat pox virus)弱毒株活病毒，可同時預防小反芻獸疫和山羊痘。
2.本發(fā)明所述小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗，其特征在于：所述小反芻獸疫病毒弱毒株活病毒為小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants)PPRV 75/1-Clone 9株，該株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No.13388。
3.本發(fā)明所述的如權利要求1所述小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗，其特征在于所述山羊痘病毒弱毒株活病毒為山羊痘病毒(Goat pox virus)溫度敏感弱毒株，保藏編號為：CVCC No.AV41。
4.本發(fā)明所述小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗的制備方法，其特征在于用所述小反芻獸疫病毒75/1Clone9株(CGMCC No.13388)和山羊痘病毒溫度敏感弱毒株(AV41)病毒作為疫苗生產毒株，分別接種Vero細胞和山羊腎細胞單層，當細胞出現細胞病變達70％以上時，將細胞瓶移至-20℃反復凍融3次，分別收獲病毒液；再將其混合后加凍干保護劑經真空干燥制成小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗。
5.本發(fā)明所述小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗的制備方法，其特征在于其中的凍干保護劑配方及制備方法是(W/V)：蔗糖0.75，右旋糖苷0.40，山梨醇0.40，魚明膠0.25，Na2HPO4 0.051，NaH2PO4 0.125，加少量雙蒸水溶解，1mol KOH調pH至7.2，雙蒸水補至100％,115℃高壓滅菌30min。
具體實施方式
1.小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗的制備
(1)生產用毒種小反芻獸疫病毒75/1-Clone 9株(CGMCC No.13388)生產用基礎種毒和山羊痘病毒溫度敏感弱毒株(CVCC AV41)生產用基礎種毒，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并提供。
(2)生產用細胞Vero細胞：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存(CVCC CL 28)；山羊腎原代(次代)細胞：用新鮮山羊腎臟制備，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并提供。
(3)小反芻獸疫病毒液的制備將PPRV 75/1-Clone 9株毒種用無血清MEM水化后，按0.1％、0.5％、1％、2％同步接種不同細胞濃度的Vero細胞懸液，細胞懸液濃度分別調整為20～30萬/ml、50～60萬/ml。混勻后分別分裝細胞瓶，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，記錄出現70％以上病變的時間，病變達到70％以上時，將細胞瓶移至-20℃反復凍融3次，收獲病毒液。
(4)山羊痘病毒液制備將山羊痘毒種用無血清MEM培養(yǎng)液水化后，按細胞維持液總量0.1％、0.5％、1％、2％的比例接種山羊腎細胞單層，接種時間分別為山羊腎細胞單層鋪滿程度為80％、100％，接種后置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，記錄出現70％以上病變的時間，病變達到70％以上時，將細胞瓶移至-20℃凍融3次，收獲病毒液，取樣測定病毒含量，按Reed-Muench法計算每0.1ml的TCID50。
(5)病毒液檢驗分別提取兩種進行病毒液樣品進行無菌檢驗、支原體檢驗和病毒含量測定。
1)無菌檢驗及支原體檢驗按現行《中國獸藥典委員會編.中華人民共和國獸藥典》二〇一五年版(三部)中國農業(yè)出版社，2016，本發(fā)明以下稱《中國獸藥典》)進行檢驗。
2)病毒含量測定將收獲的病毒液樣品用無血清MEM作10倍系列稀釋，取10-1～10－88個稀釋度病毒液，接種96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種5孔，每孔0.1ml，接種后每孔加入0.1ml山羊腎細胞懸液。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，根據細胞病變孔數按Reed-Muench法計算TCID50。
(6)配苗與凍干將檢驗合格的PPR病毒液、山羊痘病毒液與保護劑按(V/V)1:1:2混合后充分混勻、分裝后，裝箱后按本發(fā)明設計的凍干曲線凍干經真空冷凍干燥而成。
2.疫苗成品檢驗
(1)性狀淡黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
(2)無菌檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定方法進行檢驗，應無菌生長。
(3)支原體檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定方法進行檢驗，應無支原體生長。
(4)外源病毒檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定方法進行檢驗，應無外源病毒污染。
(5)病毒含量測定PPRV病毒含量規(guī)定為不低于103TCID50/頭份；羊痘病毒含量應不低于103.5TCID50/頭份。
(6)安全檢驗
1)非特異性安全試驗
將小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗用無血清MEM細胞營養(yǎng)液稀釋成每毫升含10頭份，接種體重為200～250g豚鼠，其中肌肉注射2只，每只0.5ml；腹腔注射2只，每只0.5ml；2只不接種作為對照。觀察14日，所有動物均健活。接種體重為18～22g小鼠，經腹腔注射6只，每只0.1ml；另設4只不接種對照。觀察14日，所有動物均健活。表明該疫苗安全性良好。
2)特異性安全試驗
用4頭份小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗經胸腹部皮內接種1～12月齡左右健康易感山羊和綿羊，除個別動物體溫出現一過性升高外，未見其他異常臨床癥狀。所有接種羊和對照羊精神食欲均正常，經胸腹部皮內接種的痘種反應在1.2～3.8cm的范圍內，痘腫均為無色或粉紅色，無紫紅色、水腫、化膿、結痂等反應。
(7)效力檢驗
本發(fā)明采用中和抗體測定和免疫攻毒方法分別進行小反芻獸疫病毒和山羊痘病毒部分的效力檢驗，將二聯苗的接種劑量0.1頭份，接種5只山羊；同時設立對照羊2只，接種途徑采用皮內接種；小反芻獸疫免疫檢驗的觀察期為21日，山羊痘免疫檢驗的觀察日期為15日。小反芻獸疫部分判定標準與小反芻獸疫活疫苗標準一致。山羊痘效力判定標準與現有山羊痘單苗標準一致。
1)小反芻獸疫中和抗體效價判定標準為：將100％細胞孔不出現細胞病變的血清最高稀釋度作為中和抗體效價，效價標準為不低于1:10。
2)羊痘攻毒方法檢驗標準為：本發(fā)明以0.1頭份免疫山羊5只，在接種后5-7日，至少有4只山羊出現直徑為0.5-3cm微紅色痘腫反應，持續(xù)4-7日，逐漸消退，發(fā)痘羊精神、食欲均正常。
羊痘攻毒方法如下：攻毒劑量為1000ID50/只，攻毒方式為山羊后腿內側皮內接種，攻毒后第10日經剖檢進行結果判定，免疫組山羊應至少有4只不發(fā)痘或僅在注射點出現原發(fā)痘。對照組山羊應至少4/5發(fā)病。發(fā)病判定標準為：同時符合下列情況之二者，判為發(fā)病。(1)體溫升高持續(xù)2-3日，食欲減少，精神沉郁。(2)除注射點形成痘腫外，在身體其他部位出現痘腫；或注射點痘腫直徑大于4cm，出現紫紅色、嚴重水腫、化膿、結痂等。
3)小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗中羊痘病毒含量與羊痘免疫攻毒保護呈正相關，以102.5TCID50及以上劑量免疫山羊，對羊痘強毒攻擊產生100％的保護，確定羊痘部分最小免疫劑量為102.5TCID50。在進行效力檢驗時，可以通過測定羊痘病毒含量的方法進行效力檢驗?！吨袊F藥典》規(guī)定羊痘活疫苗病毒含量應不低于103.5TCID50/頭份，根據聯苗質量標準不應低于單苗的規(guī)定，本發(fā)明確定小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗中羊痘病毒含量應不低于103.5TCID50/頭份。
(7)剩余水分測定按《獸藥典》附錄進行測定，應符合規(guī)定。
(8)真空度測定按《中國獸藥典》附錄進行測定，應符合規(guī)定。
附圖說明
圖1凍干疫苗外觀圖圖中B為本發(fā)明所述的方法制備的小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗成品圖；A、C、D為不同保護劑和凍干曲線組合對照凍干產品圖。
本發(fā)明涉及生物材料資源信息
小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)PPRV 75/1-Clone 9株，該株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC No.13388。山羊痘病毒(Goat pox virus)溫度敏感弱毒株(CVCC AV41)；山羊痘病毒強毒青海株(CVCC AV40)；Vero細胞(CVCC CL28)：F168代，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并提供，(請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農業(yè)科學技術出版社，2002年，p150,150,348)。
本發(fā)明的積極意義
本發(fā)明涉及一種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗及其制備方法。本發(fā)明采用小反芻獸疫病毒PPRV 75/1-Clone 9株和山羊痘病毒溫度敏感弱毒株(CVCC No.AV41)作為疫苗生產毒株分別在Vero細胞和山羊腎原代(次代)細胞培養(yǎng)收獲的病毒液混合后加入凍干保護劑經真空冷凍干燥制備成有效地預防小反芻獸疫和山羊痘的二聯活疫苗。
實施例
本實施例所用試驗材料為：
1.病毒
本實驗室制備的小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗3批，批號分別為01、02、03。
2.實驗動物
小白鼠和豚鼠，新疆天康生物科技有限公司健康動物室自繁自養(yǎng)；
5-12月齡左右山羊、綿羊，2-3月齡懷孕山羊、綿羊，1月齡山羊、綿羊，購于新疆烏魯木齊市南山地區(qū)。免疫前采血測定中和抗體效價，選羊痘病毒、小反芻獸疫病毒中和抗體效價均低于1:4的羊用于試驗；試驗用羊包括山羊和綿羊，山羊包括絨山羊、奶山羊、波爾山羊；綿羊品種包括德國美利奴、薩福克、小尾寒羊。
實施例1
——小反芻獸疫和山羊痘的二聯活疫苗的制備
1.生產用毒種 小反芻獸疫病毒75/1-Clone 9株(CGMCC No.)生產用基礎種毒和GPV溫度敏感弱毒株(CVCC No.AV41)生產用基礎種毒，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并提供。
2.生產用細胞 Vero細胞：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存；山羊腎原代(次代)細胞：用新鮮山羊腎臟制備，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并提供。
3.小反芻獸疫病毒液的制備 將PPRV75/1-Clone 9株毒種用無血清MEM水化后，按0.1％、0.5％、1％、2％同步接種不同細胞濃度的Vero細胞懸液，細胞懸液濃度分別調整為20～30萬/ml、50～60萬/ml?；靹蚝蠓謩e分裝細胞瓶，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，記錄出現70％以上病變的時間，病變達到70％以上時，將細胞瓶移至-20℃反復凍融3次，收獲病毒液。
4.山羊痘病毒液制備 將山羊痘毒種用無血清MEM培養(yǎng)液水化后，按細胞維持液總量0.1％、0.5％、1％、2％的比例接種山羊腎細胞單層，接種時間分別為山羊腎細胞單層鋪滿程度為80％、100％，接種后置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，記錄出現70％以上病變的時間，病變達到70％以上時，將細胞瓶移至-20℃凍融3次，收獲病毒液，取樣測定病毒含量，按Reed-Muench法計算每0.1ml的TCID50。
5.病毒液檢驗 分別提取兩種進行病毒液樣品進行無菌檢驗、支原體檢驗和病毒含量測定。
(1)無菌檢驗及支原體檢驗 按現行《中國獸藥典》進行檢驗。
(2)病毒含量測定 將收獲的病毒液樣品用無血清MEM作10倍系列稀釋，取10-1～10－88個稀釋度病毒液，接種96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種5孔，每孔0.1ml，接種后每孔加入0.1ml山羊腎細胞懸液。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，根據細胞病變孔數按Reed-Muench法計算TCID50。
6.配苗與凍干 將檢驗合格的PPR病毒液、山羊痘病毒液與保護劑按(V/V)1:1:2混合后充分混勻、分裝后，裝箱后按本發(fā)明設計的凍干曲線凍干經真空冷凍干燥而成。
凍干保護劑配方:
蔗糖 75g，右旋糖苷 40g，山梨醇 40g，魚明膠 25g，Na2HPO4 0.51g，NaH2PO41.25g，加少量雙蒸水溶解，1mol KOH調pH至7.2，雙蒸水補至1000ml，115℃高壓滅菌30min。
確定疫苗凍干曲線如下：預凍：-22～-27℃0.5小時，-40～-50℃2.0小時；一期升華：-8.0℃20小時，26℃6小時，二期升華：24℃3.5小時。
采用以上方法制備的小反芻獸疫和山羊痘的二聯活疫苗3批，批號分別為01、02、03。
實施例2
——疫苗成品檢驗
1.性狀 淡黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后均迅速溶解。
2.無菌檢驗 按《中國獸藥典》規(guī)定方法進行檢驗，均無菌生長。
3.支原體檢驗 按《中國獸藥典》規(guī)定方法進行檢驗，均無支原體生長。
4.外源病毒檢驗 按《中國獸藥典》規(guī)定方法進行檢驗，均無外源病毒污染。
5.病毒含量測定病毒含量測定 將收獲的病毒液樣品用無血清MEM作10倍系列稀釋，取10-1～10－88個稀釋度病毒液，接種96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種5孔，每孔0.1ml，接種后每孔加入0.1ml山羊腎細胞懸液。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，根據細胞病變孔數按Reed-Muench法計算TCID50。三批二聯苗的病毒含量測定結果見表1。
表1 三批小反芻獸疫和山羊痘的二聯活疫苗的病毒含量測定結果
5.安全檢驗
(1)非特異性安全試驗
將小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗用無血清MEM細胞營養(yǎng)液稀釋成每毫升含10頭份，接種體重為200～250g豚鼠，其中肌肉注射2只，每只0.5ml；腹腔注射2只，每只0.5ml；2只不接種作為對照。觀察14日，所有動物均健活。接種體重為18～22g小鼠，經腹腔注射6只，每只0.1ml；另設4只不接種對照。觀察14日，所有動物均健活。表明該疫苗安全性良好。
(2)特異性安全試驗
小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗以4頭份經胸腹部皮內接種1-12月齡左右健康易感山羊和綿羊，除個別動物體溫出現一過性升高外，未見其他異常臨床癥狀。所有接種羊和對照羊精神食欲均正常，經胸腹部皮內接種的痘種反應在1.2～3.8cm的范圍內，痘腫均為無色或粉紅色，無紫紅色、水腫、化膿、結痂等反應。見表2
表2 小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗安全試驗(羊)檢驗結果
6.效力檢驗
本發(fā)明采用中和抗體測定和免疫攻毒方法進行效力檢驗，將二聯苗的接種劑量確定為0.1頭份，接種羊數采用小反芻獸疫活疫苗效力檢驗的羊數，即5只山羊；同時設立對照羊2只，接種途徑采用皮內接種；小反芻獸疫免疫檢驗的觀察期為21日，山羊痘免疫檢驗的觀察日期為15日。
(1)小反芻獸疫部分的檢驗：中和抗體效價判定：將100％細胞孔不出現細胞病變的血清最高稀釋度作為中和抗體效價，效價均不低于1:10。
(2)羊痘部分的檢驗：
1)羊痘病毒含量的方法進行效力檢驗各批次二聯苗的羊痘部分檢驗結果，病毒含量均不低于103.5TCID50/頭份。
2)羊痘攻毒方法檢驗：本發(fā)明以0.1頭份免疫山羊5只，在接種后5～7日，免疫組山羊應至少有4只不發(fā)痘或僅在注射點出現原發(fā)痘(山羊出現直徑為0.5～3cm微紅色痘腫反應，持續(xù)4～7日，逐漸消退)發(fā)痘羊精神、食欲均正常。對照組山羊應至少4/5發(fā)病，結果見表3。
(7)剩余水分測定按《中國獸藥典》附錄進行測定，均符合規(guī)定。
(8)真空度測定按《中國獸藥典》附錄進行測定，均符合規(guī)定。
表3 五批疫苗效力檢驗(免疫羊后PPRV中和抗體和山羊痘攻毒保護試驗)結果
實施例3
——制苗用小反芻獸疫病毒、羊痘病毒抗原相容性
將繁殖的小反芻獸疫病毒液和羊痘病毒液分別進行如下試驗(見表4)，測定處理后樣品的病毒含量，每個樣品做3個重復處理，按Reed-Muench法計算TCID50。
表4結果顯示：小反芻獸疫、羊痘抗原相容性研究結果表明，二者之間無相互干擾，相容性較好。小反芻獸疫、山羊痘抗原相容性研究試驗結果見表5。
表4 抗原相容性試驗方案
表5 抗原相容性試驗——不同處理后病毒含量測定結果
實施例4
——疫苗凍干保護劑的選擇
用不同的凍干保護劑與病毒液配制疫苗，采用不同的凍干曲線凍干疫苗，凍干后測定病毒含量及剩余水分含量。結果見表6。
影響疫苗凍干效果的主要因素是凍干保護劑配方和凍干曲線，本發(fā)明設計了兩種保護劑配方，采用兩種凍干曲線分別進行凍干，結果配方1按照第2凍干曲線進行凍干，效果較好，確定該疫苗凍干保護劑配方如下：
凍干保護劑配方:
蔗糖 75g，右旋糖苷 40g，山梨醇 40g，魚明膠 25g，Na2HPO4 0.51g，NaH2PO41.25g，加少量雙蒸水溶解，1mol KOH調pH至7.2，雙蒸水補至 1000ml 115℃高壓滅菌30min。
確定疫苗凍干曲線如下：預凍：-22～-27℃0.5小時，-40～-50℃2.0小時；一期升華：-8.0℃20小時，26℃6小時，二期升華：24℃3.5小時。
表6 兩種凍干保護劑的凍干效果
實施例5
——小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗(Clone9株+AV41株)安全性
為評價小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗的安全性，采用實驗室制備的3批小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗，分別以不同接種劑量、不同接種途徑、不同接種部位接種山羊，檢測該疫苗的安全性?，F將試驗結果報告如下。
2.靶動物一次單劑量接種的安全性試驗
選取健康、易感山羊、綿羊各9只，各隨機分為3組，3只/組；取小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗3瓶，復溶后混勻，稀釋至1頭份/ml，每批疫苗免疫山羊和綿羊各3只，每只羊胸腹部皮內接種疫苗1頭份，分2點注射，每點0.5ml，免疫前測定體溫，設立同條件對照山羊和綿羊各3只，免疫后觀察14天，每日測量體溫，觀察臨床癥狀，并進行詳細記錄。山羊和綿羊經胸腹部皮內注射接種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗后，連續(xù)觀察14天，接種羊和對照羊均體溫正常，采食、精神狀態(tài)良好，未見不良反應。
胸腹部皮內注射接種羊出現痘腫反應見表7。
表7 單劑量胸腹部皮內接種羊痘腫反應
備注：痘腫均為無色或粉紅色，無紫色、水腫、結痂等反應。
3.單劑量不同途徑重復接種安全性試驗
選取健康、易感山羊、綿羊各9只，各隨機分為3組，3只/組；取小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗3瓶，復溶后混勻，稀釋至1頭份/ml，每批疫苗免疫山羊和綿羊各3只，每只羊胸腹部皮內接種疫苗1頭份，分2點注射，每點0.5ml，免疫前測定體溫，設立同條件對照山羊和綿羊各3只，免疫14日后，以相同劑量、經胸腹部皮內再免疫接種1次。接種后再觀察14天，每日測量體溫，觀察臨床癥狀，并進行詳細記錄。山羊和綿羊經頸部胸腹部皮內注射接種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗后，觀察至第14天，再次以相同接種方式接種該疫苗，二次接種后再次臨床觀察14 天，免疫羊和對照羊均體溫正常，采食、精神狀態(tài)良好，未見不良反應。
胸腹部皮內注射接種羊出現痘腫反應見表8。
表8 單劑量重復胸腹部皮內接種羊痘腫反應
備注：痘腫均為無色或粉紅色，無紫色、水腫、結痂等反應。
4.靶動物一次超劑量接種安全性試驗
選取健康、易感山羊、綿羊各15只，各隨機分為3組，5只/組，取小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗3瓶，復溶后混勻，稀釋至10頭份/ml，每批疫苗免疫山羊和綿羊各5只，每只羊頸部皮下注射小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗10頭份，設立同條件對照山羊和綿羊各3只，免疫前測定體溫，免疫后觀察14天，每日測量體溫，觀察臨床癥狀，并進行詳細記錄。
選取健康、易感山羊、綿羊各9只，各隨機分為3組，3只/組，取小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗3瓶，復溶后混勻，稀釋至4頭份/ml，每只羊胸腹部皮內接種疫苗1ml，每只2點，分2點注射，每點0.5ml，設立同條件對照山羊和綿羊各3只，免疫前測定體溫，免疫后觀察14天，每日測量體溫，觀察臨床癥狀，并進行詳細記錄。胸腹部皮內接種羊痘腫反應見表9。
山羊和綿羊經頸部皮下注射和胸腹部皮內注射超劑量接種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗后，連續(xù)觀察14天，免疫羊體溫正常，采食、精神狀態(tài)良好，未見其他不良反應。
表9 4頭份胸腹部皮內接種羊痘腫反應
備注：痘腫均為無色或粉紅色，無紫色、水腫、結痂等反應。
5.懷孕靶動物一次超劑量接種安全性試驗
選取懷孕2-3個月健康易感山羊和綿羊各9只，各隨機分為3組，3只/組，取小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗3瓶，復溶后混勻，稀釋至4頭份/ml，每只羊胸腹部皮內接種疫苗1ml，分2點注射，每點0.5ml，每只羊胸腹部皮內接種疫苗1ml，分2點注射，每點0.5ml，設立同條件對照山羊和綿羊各3只，免疫后觀察14天，觀察臨床癥狀，并進行詳細記錄。觀察接種后有無不良反應或流產、死胎現象。
懷孕2-3個月健康易感山羊和綿羊經胸腹部皮內注射接種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗1頭份，接種后觀察14天，未見異常臨床癥狀，免疫后無流產或死胎現象發(fā)生，跟蹤觀察至懷孕母羊分娩，接種母羊所產羊羔數和對照母羊所產羊羔數無明顯差異，接種母羊所產羊羔均正常。接種羊均有痘腫反應。為避免因測溫引起機械性流產，故未測體溫。
懷孕羊胸腹部皮內接種二聯苗后的痘腫反應見表10，懷孕羊胸腹部皮內接種二聯活疫苗后產羔數見表11。
表10 懷孕羊胸腹部皮內接種二聯苗后的痘腫反應
備注：痘腫均為無色或粉紅色，無紫色、水腫、結痂等反應。
表11 懷孕羊胸腹部皮內接種二聯活疫苗后產羔數
6.羔羊一次單劑量接種的安全性試驗
選取健康、易感1月齡山羊羔、綿羊羔各9只，各隨機分為3組，3只/組，取小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗3瓶，復溶后混勻，稀釋至1頭份/ml，每只羊胸腹部皮內接種疫苗1ml，分2點注射，每點0.5ml，每只羊接種疫苗1頭份，設立同條件對照山羊和綿羊各3只，免疫當天測定體溫，免疫后觀察14天，每日測量體溫，觀察臨床癥狀，并進行詳細記錄。1月齡山羊羔、綿羊羔經胸腹部皮內接種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗，1頭份/只，接種后觀察至第14天，所有免疫羔羊體溫正常，未見異常臨床癥狀，與對照相比，日增重無明顯差異。胸腹部皮內接種羊痘腫反應見表12。
表12 羔羊胸腹部皮內接種二聯活疫苗后的痘腫反應
備注：痘腫均為無色或粉紅色，無紫色、水腫、結痂等反應。
7.結論
(1)小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗單劑量經胸腹部皮內接種12月齡左右健康易感山羊和綿羊，所有動物精神食欲均正常，未見異常臨床癥狀。所有接種動物和對照動物均健活，經胸腹部皮內接種山羊的痘腫直徑為1.2～3.2cm。痘腫為無色或粉紅色痘腫，無紫色、結痂、水腫等反應。
(2)小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗單劑量重復經胸腹部皮內接種12月齡左右健康易感山羊和綿羊，所有動物精神食欲均正常，未見異常臨床癥狀。經胸腹部皮內接種羊的痘腫直徑為2.1～3.4cm，痘腫為無色或粉紅色痘腫，無紫色、結痂、水腫等反應。所有接種動物和對照動物健活。
(3)將小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗以4頭份經皮內接種1～8月齡健康易感山羊和綿羊，除個別動物體溫出現一過性升高外，未見其他異常臨床癥狀。經胸腹部皮內接種山羊的痘腫直徑為1.6～3.8cm，痘腫為無色或粉紅色痘腫，無紫色、結痂、水腫等反應。所有接種動物和對照動物健活。
經頸部皮下接種小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗10頭份，接種羊未見其他異常臨床癥狀。
(4)小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗按1倍使用劑量經胸腹部皮內接種懷孕山羊和綿羊，接種后懷孕母羊未發(fā)生流產、死胎等異常臨床反應；觀察至母羊分娩，所產羔羊數量與對照無明顯差異，所產羔羊均健活，增重與對照無差異。經胸腹部皮內接種母羊的痘腫直徑為1.6-3.3cm。痘腫為無色或粉紅色痘腫，無紫色、結痂、水腫等反應。
(5)小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗按1倍使用劑量經胸腹部皮內接種羔羊，除個別動物體溫出現一過性升高外，未見其他異常臨床癥狀。經胸腹部皮內接種羊的痘腫直徑為1.2-2.9cm，痘腫為無色或粉紅色痘腫，無紫色、結痂、水腫等反應。
本發(fā)明進行的以上小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗接種靶動物及非靶動物的安全性試驗，試驗數據表明，疫苗對不同品種及不同日齡的羊安全性均良好；可以用于臨床預防羊的小反芻獸疫和羊痘。
實施例7
——疫苗的效力檢驗
1.小反芻獸疫部分效力檢驗
本發(fā)明采用中和抗體測定方法進行效力檢驗，將二聯苗的接種劑量確定為0.1頭份，接種羊數采用小反芻獸疫活疫苗效力檢驗的羊數，即5只山羊；同時設立對照羊2只，接種途徑采用皮內接種；山羊痘觀察日期為15日，小反芻獸疫免疫期為21日。山羊痘效力判定標準與現有山羊痘單苗標準一致。小反芻獸疫部分判定標準與已批準的小反芻獸疫活疫苗標準一致。小反芻獸疫中和抗體效價判定標準為將100％細胞孔不出現細胞病變的血清最高稀釋度作為中和抗體效價，效價標準為不低于1:10。該標準高于OIE規(guī)定的PPR活疫苗標準。
為了驗證效力檢驗標準的可靠性，開展了疫苗PPRV部分的免疫攻毒試驗。將采用Clone9毒株生產的3批小反芻獸疫活疫苗和3批小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗分別按101、102、103、104TCID50PPR病毒劑量免疫山羊，免疫后采血測定PPRV中和抗體，并用強毒進行攻擊，結果表明：
免疫劑量與攻毒保護的關系為：10TCID50免疫組攻毒保護率為76.7％；102TCID50免疫組攻毒保護率為96.7％；103TCID50以上免疫組攻毒保護率為100％。
中和抗體效價與攻毒保護的關系為：
抗體效價<1:4，攻毒保護率為0％；
抗體效價為1:5，攻毒保護結果為1/9保護，攻毒保護率為11％；
抗體效價為1:10，攻毒保護結果為8/8保護，攻毒保護率為100％；
抗體效價1:20以上，攻毒保護結果為103/103保護，攻毒保護率為100％。
免疫劑量與中和抗體及攻毒保護率關系為：
10TCID50免疫組23/30免疫羊中和抗體效價＞1:10，抗體陽性率為76.7％；攻毒保護率為76.7％。
102TCID50劑量免疫組28/30免疫羊中和抗體效價＞1:10，抗體陽性率為93.3％；攻毒保護率為96.7％。
103TCID50以上劑量免疫組60/60免疫羊中和抗體效價＞1:10，抗體陽性率為100％，攻毒保護率為100％。
攻毒保護試驗結果證實將疫苗中PPRV病毒含量規(guī)定為不低于103TCID50/頭份；免疫山羊血清中和抗體效價不低于1:10的效力標準是可靠的。
2.羊痘部分效力檢驗
小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗羊痘部分免疫攻毒保護試驗：
將3批疫苗分別按104.5TCID50/只、103.5TCID50/只、102.5TCID50/只、101.5TCID50/只4個劑量(按羊痘病毒含量)免疫山羊，免疫后21天采血測定羊痘中和抗體，并進行羊痘病毒強毒攻擊試驗。
羊痘攻毒試驗結果表明，小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗免疫山羊后，其中和抗體水平和免疫攻毒保護雖然有一定的相關性，但不呈正相關，無法根據疫苗免疫山羊后的羊痘病毒中和抗體水平進行效力評價。
小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗中羊痘病毒含量與羊痘免疫攻毒保護呈正相關，以102.5TCID50及以上劑量免疫山羊，對羊痘強毒攻擊產生100％的保護，確定羊痘部分最小免疫劑量為102.5TCID50。在進行效力檢驗時，可以通過測定羊痘病毒含量的方法進行效力檢驗?！吨袊F藥典》規(guī)定羊痘活疫苗病毒含量應不低于103.5TCID50/頭份，根據聯苗質量標準不應低于單苗的規(guī)定，本發(fā)明確定小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗中羊痘病毒含量應不低于103.5TCID50/頭份。
羊痘攻毒方法如下：攻毒劑量為1000ID50/只，攻毒方式為山羊后腿內側皮內接種，攻毒后第10日經剖檢進行結果判定，免疫組山羊應至少有4只不發(fā)痘或僅在注射點出現原發(fā)痘。對照組山羊應至少4/5發(fā)病。發(fā)病判定標準為：同時符合下列情況之二者，判為發(fā)病。(1)體溫升高持續(xù)2-3日，食欲減少，精神沉郁。(2)除注射點形成痘腫外，在身體其他部位出現痘腫；或注射點痘腫直徑大于4cm，出現紫紅色、嚴重水腫、化膿、結痂等。
羊痘活疫苗采用觀察免疫羊痘腫情況判斷疫苗效力。本發(fā)明以0.1頭份免疫山羊5只，在接種后5-7日，至少有4只山羊出現直徑為0.5-3cm微紅色痘腫反應，持續(xù)4-7日，逐漸消退，發(fā)痘羊精神、食欲均正常。確定該方法為本動物效力檢驗方法。
小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗羊痘部分免疫攻毒保護試驗
將3批疫苗分別按 4個劑量免疫山羊，免疫后21天采血測定羊痘中和抗體，并進行羊痘病毒強毒攻擊試驗。
結果表明，羊痘部分104.5TCID50免疫山羊，對羊痘強毒攻擊產生100％的保護；以103.5TCID50免疫山羊，對羊痘強毒攻擊產生100％的保護；以102.5TCID50免疫山羊，對羊痘強毒攻擊產生100％的保護；以101.5TCID50免疫山羊，對羊痘強毒攻擊產生67％的保護。
實施例8
——小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗最小免疫劑量
將3批疫苗分別按104TCID50/只、103TCID50/只、102TCID50/只、10TCID50/只免疫山羊，免疫后21天采血測定PPRV中和抗體，并進行小反芻獸疫病毒強毒攻擊試驗。PPRV中和抗體測定結果和PPRV攻毒保護結果表明，小反芻獸疫、山羊痘二聯活疫苗小反芻獸疫部分以104TCID50免疫山羊，免疫羊中和抗體均在1:160以上，對PPRV強毒的攻擊產生100％的保護；以103TCID50免疫山羊，免疫羊中和抗體均在1:160以上，對PPRV強毒的攻擊產生100％的保護；以102TCID50免疫山羊，免疫羊93％中和抗體均在1:10以上，對PPRV強毒的攻擊產生93％的保護；以10TCID50免疫山羊，免疫羊73％中和抗體在1:10以上，對PPRV強毒的攻擊產生73％的保護。確定PPRV最小免疫劑量為103TCID50。