分枝桿菌抗原組合物的制作方法

文檔序號(hào)：12615730閱讀：311來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>醫(yī)藥醫(yī)療技術(shù)的改進(jìn);醫(yī)療器械制造及應(yīng)用技術(shù)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包含Rv1196相關(guān)抗原且具有低離子強(qiáng)度的免疫原性組合物。本發(fā)明也涉及進(jìn)一步包含一種或多種免疫刺激劑的這類免疫原性組合物。還提供了用于制備這類免疫原性組合物的方法和相關(guān)的試劑盒。

背景技術(shù)：

結(jié)核病(TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和其他分枝桿菌種的感染引起的慢性傳染性疾病。它是世界上發(fā)展中國家的一種主要疾病，并成為發(fā)達(dá)區(qū)域日益嚴(yán)重的問題。超過20億人被認(rèn)為感染了TB桿菌，每年新增約940萬TB病例和170萬死亡病例。其中10%感染TB桿菌的人會(huì)發(fā)展活動(dòng)性TB，每位患有活動(dòng)性TB的人平均每年感染10-15個(gè)其他人。盡管在全球的每年發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到頂峰，但是由于人口增長，死亡數(shù)和病例數(shù)依然在上升(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。

分枝桿菌蛋白R(shí)v1196(描述為，例如，Dillon等人 Infection and Immunity 1999 67(6):2941-2950中的名稱Mtb39a)或其片段或衍生物是具有用于治療或預(yù)防結(jié)核病的潛在益處的蛋白抗原。Rv1196是高度保守的，在H37Rv、C、Haarlem、CDC1551、94-M4241A、98-R604INH-RIF-EM、KZN605、KZN1435、KZN4207、KZNR506菌株間具有100％序列同一性，F(xiàn)11菌株具有單一點(diǎn)突變Q30K。Rv1196是融合蛋白抗原Mtb72f和M72 (描述于，例如，國際專利申請(qǐng)WO2006/117240)的組分。

為了確保能維持免疫原性，蛋白抗原的配制極端重要。有時(shí)使用免疫刺激劑以改善針對(duì)任何給定抗原而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。然而，在免疫原性組合物中包含佐劑會(huì)增加成分制備的復(fù)雜性以及組合物的分布和配制的復(fù)雜性。配制者必須考慮每種佐劑成分以及抗原性成分的制備。具體而言，應(yīng)當(dāng)考慮抗原性成分與佐劑成分的相容性。這尤其是在預(yù)期將凍干抗原或抗原制劑與佐劑制劑重構(gòu)的情況下。在這種情況下，重要的是，佐劑制劑的緩沖液對(duì)于抗原而言是合適的并且抗原的免疫原性或溶解度不會(huì)受到佐劑的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人已經(jīng)首次鑒定Rv1196相關(guān)抗原對(duì)鹽的存在特別敏感。不受理論的限制，據(jù)信Rv1196相關(guān)抗原受被稱為“鹽析”的現(xiàn)象的不利影響，該現(xiàn)象可以被定義為通過蛋白與鹽如氯化鈉的相互作用而從其溶液中沉淀。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氯化鈉濃度低至150mM時(shí)，這些抗原就會(huì)聚集和沉淀。因此，包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物的穩(wěn)定性令人驚訝地可以通過降低氯化鈉濃度而改善。

因此，本發(fā)明提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物的導(dǎo)電率是13 mS/cm或更低。

額外提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物中的鹽濃度是130 mM或更低。

本發(fā)明還提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物中的氯化鈉濃度是130 mM或更低。

附圖簡(jiǎn)述

圖1. QS21裂解活性曲線

圖2. 在不同ASA制劑中，每種3D-MPL同類物(congener)的百分比

圖3. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的濁度測(cè)定

圖4. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的DLS

圖5. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的DLS

圖6. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的濁度測(cè)定

圖7. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的抗原穩(wěn)定性

圖8a-8d. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的SEC-HPLC分析

圖9. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的抗原性

圖10. NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的導(dǎo)電率

圖11. 使用本發(fā)明的免疫原性組合物在小鼠中誘導(dǎo)CD4 T細(xì)胞應(yīng)答

圖12. 使用本發(fā)明的免疫原性組合物在小鼠中誘導(dǎo)CD8 T細(xì)胞應(yīng)答

圖13. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的濁度測(cè)定

圖14. 儲(chǔ)存后具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的DLS

圖15. 儲(chǔ)存后具有不同的NaCl濃度的免疫原性組合物的抗原性。

序列標(biāo)識(shí)符簡(jiǎn)述

SEQ ID No:1 來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv1196蛋白的氨基酸序列

SEQ ID No:2 編碼來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv1196蛋白的核苷酸序列

SEQ ID No:3 來自結(jié)核分枝桿菌F11的Rv1196蛋白的氨基酸序列

SEQ ID No:4 編碼來自結(jié)核分枝桿菌F11的Rv1196蛋白的核苷酸序列

SEQ ID No:5 M72蛋白的氨基酸序列

SEQ ID No:6 編碼M72蛋白的核苷酸序列

SEQ ID No:7 具有2個(gè)N-末端His 殘基的M72蛋白的氨基酸序列

SEQ ID No:8 編碼具有2個(gè)N-末端His 殘基的M72蛋白的核苷酸序列

SEQ ID No: 9 Mtb72f蛋白的氨基酸序列

SEQ ID No: 10 編碼Mtb72f蛋白的核苷酸序列

SEQ ID No: 11 具有六個(gè)N-末端His 殘基的Mtb72f蛋白的氨基酸序列

SEQ ID No: 12 編碼具有六個(gè)N-末端His 殘基的Mtb72f蛋白的核苷酸序列

SEQ ID No: 13 CpG寡核苷酸1的核苷酸序列(CpG 1826)

SEQ ID No: 14 CpG寡核苷酸2的核苷酸序列(CpG 1758)

SEQ ID No: 15 CpG寡核苷酸3的核苷酸序列

SEQ ID No: 16 CpG寡核苷酸4的核苷酸序列(CpG 2006)

SEQ ID No: 17 CpG寡核苷酸5的核苷酸序列(CpG 1686)。

具體實(shí)施方式

在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物的導(dǎo)電率是13 mS/cm或更低。具體而言，本發(fā)明提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物的導(dǎo)電率是12 mS/cm或更低，例如10 mS/cm或更低、8 mS/cm或更低、6 mS/cm或更低、5 mS/cm或更低、4 mS/cm或更低或3 mS/cm或更低。在特定的實(shí)施方案中，免疫原性組合物的導(dǎo)電率是2.5 mS/cm或更低，如2.25 mS/cm或更低或2.0 mS/cm或更低。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方案中，免疫原性組合物的導(dǎo)電率是1.5至2.5 mS/cm。

在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物中的鹽濃度是130 mM或更低。具體而言，本發(fā)明提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物中的鹽濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低、80 mM或更低、70 mM或更低、60 mM或更低、50 mM或更低、或40 mM或更低。在特定的實(shí)施方案中，所述組合物中的鹽濃度是35 mM或更低，如30 mM或更低或25 mM或更低。在進(jìn)一步特定實(shí)施方案中，所述組合物中的鹽濃度是20至40 mM，如25至35 mM。

在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度是130 mM或更低。具體而言，本發(fā)明提供包含Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低、80 mM或更低、70 mM或更低、60 mM或更低、50 mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或15 mM或更低。在特定的實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物中的氯化鈉濃度是10 mM或更低，如7.5 mM或更低。合適地，免疫原性組合物中的氯化鈉濃度或等于或低于5 mM。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方案中，免疫原性組合物基本不含氯化鈉?；静缓侵嘎然c濃度為或非常接近0 mM(如3 mM或更低、2 mM或更低或1 mM 或更低)。

合適地，免疫原性組合物中的CaCl₂濃度將是40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低、15 mM或更低或10 mM或更低。

合適地，免疫原性組合物中的MgSO₄濃度將是80 mM或更低、60 mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或10 mM或更低。

合適地，免疫原性組合物中的NH₄⁺、Mg²⁺和Ca²⁺離子總濃度將是80 mM或更低、60 mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或10 mM或更低。

本發(fā)明的免疫原性組合物將是含水制劑。

本發(fā)明的免疫原性組合物的導(dǎo)電率可以使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，例如，使用專用的導(dǎo)電率儀或其他具有測(cè)量導(dǎo)電率能力的儀器來進(jìn)行測(cè)量。一種合適的儀器是來自Malvern Instruments (UK)的Zetasizer Nano ZS。

使用已知技術(shù)和試劑盒，技術(shù)人員可以容易地測(cè)試鈉離子(Na⁺)和氯離子(Cl^-)的濃度。例如，可以使用試劑盒例如來自Biosupply的鈉的酶學(xué)測(cè)定試劑盒(Sodium Enzymatic Assay Kit)(目錄號(hào)：BQ011EAEL)來測(cè)定鈉?？梢允褂迷噭┖欣鐏碜訠iosupply的氯的酶學(xué)測(cè)定試劑盒(Chloride Enzymatic Assay Kit) (目錄號(hào)：BQ006EAEL)來測(cè)定氯。

結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道途徑感染個(gè)體。肺泡巨噬細(xì)胞吞噬該細(xì)菌，但它能夠通過抑制具有酸性溶酶體的吞噬體融合而存活和增殖。隨后發(fā)生涉及CD4+和CD8+ T細(xì)胞的復(fù)雜免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致肉芽腫的形成。結(jié)核分枝桿菌成功作為病原體的關(guān)鍵在于該分離但未根除的細(xì)菌可長期存在，使得個(gè)體容易在隨后發(fā)展為活動(dòng)性TB這一事實(shí)。

在感染后的第一年，少于5%的感染個(gè)體會(huì)發(fā)展活動(dòng)性TB。該肉芽腫可存在數(shù)十年，并被認(rèn)為在缺乏氧和營養(yǎng)素的休眠狀態(tài)下包含活結(jié)核分枝桿菌。然而，最近表明，大部分處于休眠狀態(tài)的細(xì)菌位于遍布體內(nèi)的非巨噬細(xì)胞的細(xì)胞類型中(Locht等人, Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11):1665-1677)。當(dāng)宿主的天然免疫和病原體之間的平衡發(fā)生變化時(shí)(例如由于免疫抑制事件)則發(fā)生活動(dòng)性TB的發(fā)展(Anderson P Trends in Microbiology 2007 15(1):7-13; Ehlers S Infection 2009 37(2):87-95)。

也已提出描述潛伏TB和活動(dòng)性TB之間的平衡的動(dòng)力學(xué)假設(shè)(Cardana P-J Inflammation & Allergy – Drug Targets 2006 6:27-39; Cardana P-J Infection2009 37(2):80-86)。

盡管感染在相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)可以是無癥狀的，但是活動(dòng)性疾病最常顯現(xiàn)為肺的急性炎癥，從而導(dǎo)致疲勞、體重下降、發(fā)燒和持續(xù)咳嗽。如果未經(jīng)治療，通常可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥和死亡。

結(jié)核病通?？刹捎瞄L期抗生素療法進(jìn)行控制，盡管該種治療并不足以防止該疾病的擴(kuò)散?；钴S地感染的個(gè)體可以是很大程度上無癥狀的，但在一定時(shí)間具有傳染性。此外，盡管對(duì)治療方案的依從性是關(guān)鍵的，但是患者的行為很難監(jiān)測(cè)。一些患者并未完成治療周期，這可能導(dǎo)致無效治療和耐藥性的形成。

多重耐藥性TB (MDR-TB)是一種對(duì)一線藥物沒有應(yīng)答的形式。所有TB病例中有3.3%是MDR-TB，每年估計(jì)有440,000新MDR-TB病例發(fā)生。當(dāng)耐受一線藥物之上發(fā)生耐受二線藥物時(shí)，產(chǎn)生廣泛耐藥TB(XDR-TB)。已經(jīng)在58個(gè)國家中驗(yàn)證了幾乎無法治療的XDR-TB(世界衛(wèi)生組織 Tuberculosis Facts 2010)。

即使完成抗生素治療的整個(gè)療程，結(jié)核分枝桿菌的感染可能無法從感染個(gè)體根除，并可保留為能夠再活化的潛伏感染。為了控制結(jié)核病擴(kuò)散，對(duì)疾病的有效疫苗接種計(jì)劃和準(zhǔn)確早期診斷是最為重要的。

目前，用活菌接種是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫最廣泛使用的方法。用于該目的的最常用的分枝桿菌是卡介桿菌(BCG)，這是60多年前第一個(gè)開發(fā)的牛分枝桿菌的無毒性菌株。然而，BCG的安全性和效力成為爭(zhēng)論的來源-盡管在兒童中顯示了對(duì)嚴(yán)重疾病的保護(hù)，但是BCG并不能預(yù)防成年人中潛伏TB的形成或者肺部疾病的再活化。此外，在一些國家，例如美國，并未用這種藥劑來給普通人群接種。

有多種蛋白在分枝桿菌感染早期被強(qiáng)烈表達(dá)，據(jù)顯示它們可在動(dòng)物接種模型中提供保護(hù)效力。然而，用感染早期高度表達(dá)的抗原接種可能無法提供處理感染后期的最佳免疫應(yīng)答。對(duì)潛伏性感染的充分控制可能需要T細(xì)胞，其特異性針對(duì)在該時(shí)期表達(dá)的特定抗原。直接靶向持續(xù)休眠菌的暴露后疫苗可能有助于保護(hù)免于TB再活化，從而強(qiáng)化TB控制，或者甚至能清除感染。因此，靶向潛伏TB的疫苗可以顯著和經(jīng)濟(jì)地降低全球TB感染率。

基于后期抗原的亞基疫苗還可與早期抗原聯(lián)合使用以提供多階段疫苗?？商娲?，早期和/或后期抗原可用于補(bǔ)充和改善BCG接種(通過促進(jìn)BCG應(yīng)答或者通過形成高級(jí)重組BCG菌株)。

蛋白抗原Rv1196具有治療和預(yù)防結(jié)核病的潛在益處。Rv1196描述為，例如，Dillon等人 Infection and Immunity 1999 67(6):2941-2950)中的名稱Mtb39a。Rv1196蛋白是高度保守的，與H37Rv、C、Haarlem、CDC1551、KZN605、KZN1435和KZN4207菌株具有100%序列同一性，F(xiàn)11菌株具有單一點(diǎn)突變(Q30K)。

蛋白抗原Mtb72f和M72是包含Rv1196的融合蛋白并且具有治療或預(yù)防結(jié)核病的潛在益處。Mtb72f已顯示在許多動(dòng)物模型中提供保護(hù)(參見例如：Brandt等人Infect. Immun.2004 72(11):6622-6632; Skeiky等人J. Immunol. 2004 172:7618-7628; Tsenova等人Infect. Immun. 2006 74(4):2392-2401; Reed等人PNAS 2009 106(7):2301-2306)。Mtb72f也已經(jīng)是臨床研究的主題(Von Eschen等人 2009 Human Vaccines 5(7):475-482)。M72是改進(jìn)的抗原，其相對(duì)于Mtb72f包括單一的絲氨酸至丙氨酸的突變，導(dǎo)致改進(jìn)的穩(wěn)定性特征。M72相關(guān)抗原也已經(jīng)顯示在潛伏性TB模型中是有價(jià)值的(國際專利申請(qǐng)WO2006/117240)。

如本文所用術(shù)語“Rv1196相關(guān)抗原”指SEQ ID No:1所示Rv1196蛋白及其免疫原性衍生物。如本文所用術(shù)語“衍生物”指相對(duì)于參考序列，修飾的抗原。免疫原性衍生物與參考序列足夠相似，足以保留參考序列的免疫原性特性，且仍然能夠允許增強(qiáng)針對(duì)參考序列的免疫應(yīng)答。衍生物可以，例如，包含參考序列的修飾版本，或者可以由參考序列的修飾版本組成。

Rv1196相關(guān)抗原可以，例如含有小于1000個(gè)氨基酸殘基，如小于900個(gè)氨基酸殘基，特別是小于800個(gè)氨基酸殘基。

T細(xì)胞表位是被T細(xì)胞(例如，CD4+或CD8+ T細(xì)胞)識(shí)別的氨基酸的短連續(xù)片段。T細(xì)胞表位的鑒定可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的表位定位實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)(參見，例如Paul, Fundamental Immunology,第3版, 243-247 (1993); Beiβbarth等人Bioinformatics2005 21(Suppl. 1):i29-i37)。在不同的遠(yuǎn)系交配群體(例如人)中，不同的HLA類型表示該特定表位可能不被該群體所有成員所識(shí)別。由于T細(xì)胞應(yīng)答在結(jié)核病中的關(guān)鍵參與，為了使識(shí)別的水平和免疫應(yīng)答的規(guī)模最大化，Rv1196的免疫原性衍生物期望地是含有完整的大多數(shù)(或適當(dāng)?shù)厮?T細(xì)胞表位的那種。

技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或少量百分比的氨基酸的Rv1196蛋白的單獨(dú)取代、缺失或添加是“免疫原性衍生物”，其中一種或多種改變導(dǎo)致以功能類似的氨基酸取代氨基酸或者基本不影響免疫原性功能的殘基的取代/缺失/添加。

提供功能類似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域眾所周知的?？傮w而言，該種保守取代將落入下文限定的氨基酸分組之一，盡管在一些情況下，也可能有其他取代而基本不影響該抗原的免疫原性特性。以下八組各包含了彼此可進(jìn)行典型保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A), 甘氨酸(G);

2)天冬氨酸(D), 谷氨酸(E);

3)天冬酰胺(N), 谷氨酰胺(Q);

4)精氨酸(R), 賴氨酸(K);

5)異亮氨酸(I), 亮氨酸(L),甲硫氨酸(M), 纈氨酸(V);

6)苯丙氨酸(F), 酪氨酸(Y), 色氨酸 (W);

7)絲氨酸(S), 蘇氨酸(T); 以及

8)半胱氨酸(C), 甲硫氨酸(M)

(參見例如，Creighton, Proteins 1984)。

合適地，該種取代不發(fā)生在表位區(qū)域，因此對(duì)該抗原的免疫原性特性不具有明顯影響。

免疫原性衍生物還可包括相對(duì)于參考序列其中插入了另外氨基酸的那些免疫原性衍生物。合適地，該種插入不發(fā)生在表位區(qū)域，因此對(duì)該抗原的免疫原性特性不具有明顯影響。插入的一個(gè)實(shí)例包括一段短的組氨酸殘基(例如，2-6個(gè)殘基)以幫助目的抗原的表達(dá)和/或純化。

免疫原性衍生物包括相對(duì)于參考序列氨基酸已經(jīng)缺失的那些免疫原性衍生物。合適地，該種缺失不發(fā)生在表位區(qū)域，因此對(duì)該抗原的免疫原性特性不具有明顯影響。

技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到特定的免疫原性衍生物可包括取代、缺失和添加(或其任意組合)。

兩個(gè)或更多多肽序列的上下文中的“相同”或百分比“同一性”指，當(dāng)比較和比對(duì)得到比較窗口或指定區(qū)域的最大對(duì)應(yīng)(如采用下列序列比較算法之一或通過人工比對(duì)和目視觀察所測(cè)量)時(shí)，兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列彼此相同或具有一定百分比的相同(即，相對(duì)指定區(qū)域70%同一性，任選地75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性)的氨基酸殘基。該定義還指測(cè)試序列的互補(bǔ)(compliment)。任選地，該同一性存在于長度至少250個(gè)氨基酸的區(qū)域，例如300個(gè)氨基酸或350個(gè)氨基酸。合適地，該比較在對(duì)應(yīng)于參考序列全長的窗口進(jìn)行(相對(duì)于衍生物序列)。

對(duì)于序列比較，將一個(gè)序列作為參考序列，將測(cè)試序列與之比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，在需要時(shí)，指定子序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)?？刹捎媚J(rèn)程序參數(shù)，或指定可選參數(shù)。隨后序列比較算法將根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的百分比序列同一性。

本文所用的“比較窗口”指對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最佳比對(duì)后，其中序列可與相同數(shù)量連續(xù)位置的參考序列比較的區(qū)段。比較序列的比對(duì)的方法已為本領(lǐng)域眾所周知。比較序列最佳比對(duì)可通過下述方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) 的局部同源性算法，通過Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 的同源性比對(duì)算法，通過Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 的相似性搜索法，通過這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(Wisconsin 遺傳學(xué)軟件包中的GAP, BESTFIT, FASTA,以及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)，或者通過人工比對(duì)和目視觀察(參見例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編輯1995增補(bǔ)))。

一種有用算法的實(shí)例為PILEUP。PILEUP采用漸進(jìn)的、成對(duì)比對(duì)建立了來自一組相關(guān)序列的多重序列比對(duì)，從而顯示相關(guān)性和百分比序列同一性。它還繪制了可顯示用于建立比對(duì)的聚類關(guān)系的樹狀圖或系統(tǒng)樹圖。PILEUP采用了簡(jiǎn)化的Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)的漸進(jìn)比對(duì)法。所采用的方法與Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)所描述的方法類似。該程序可對(duì)最高達(dá)300個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)，每個(gè)序列的最大長度為5,000個(gè)核苷酸或氨基酸。該多重比對(duì)程序始于對(duì)兩個(gè)最為相似的序列的成對(duì)比對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)比對(duì)序列的聚類。然后將該聚類與下一個(gè)最相關(guān)的序列或比對(duì)序列的聚類進(jìn)行比對(duì)。兩個(gè)序列聚類通過將兩個(gè)單獨(dú)序列的成對(duì)比對(duì)的簡(jiǎn)單擴(kuò)展進(jìn)行比對(duì)。最終比對(duì)可通過一系列的漸進(jìn)、成對(duì)比對(duì)實(shí)現(xiàn)。該程序通過指定特定的序列及其氨基酸坐標(biāo)為序列比較區(qū)域并指定程序參數(shù)來運(yùn)行。使用PILEUP時(shí)采用下列參數(shù)比較參考序列和其他測(cè)試序列以確定百分比序列同一性關(guān)系：默認(rèn)空位權(quán)重(3.00), 默認(rèn)空位長度權(quán)重(0.10), 以及加權(quán)的末端空位。PILEUP可以從GCG序列分析軟件包例如7.0版中獲取(Devereaux等人，Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984))。

適于確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一實(shí)例為BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschul等人，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心公開獲取(網(wǎng)址在www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度為W的短字來鑒定高得分序列對(duì)(HSPs)，其中該短字與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對(duì)時(shí)匹配或滿足某些正數(shù)值閾值得分T。T指鄰近字得分閾值 (Altschul等人，同前)。這些初始鄰近字采樣數(shù)(word hits)作為種子啟動(dòng)對(duì)包含它們的更長HSPs的搜索。該字采樣數(shù)沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向伸展，直至累計(jì)比對(duì)得分增加。對(duì)核苷酸序列的累計(jì)分?jǐn)?shù)采用參數(shù)M(對(duì)一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)賞分?jǐn)?shù)；總是>0)和N(對(duì)不匹配殘基的懲罰分?jǐn)?shù)；總是<0)進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于氨基酸序列，可使用得分矩陣來計(jì)算累計(jì)分?jǐn)?shù)。以下情況下字采樣數(shù)向各方向的伸展被停止：累計(jì)比對(duì)分?jǐn)?shù)較其最大獲得值小數(shù)量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的累積，累計(jì)分?jǐn)?shù)降至0或以下；或者達(dá)到了任一序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)的默認(rèn)值為字長(w)11，預(yù)期 (E)10，M=5, N=-4，并同時(shí)對(duì)兩條鏈進(jìn)行比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序的默認(rèn)值為字長3，和預(yù)期 (E)10，以及該BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) 的比對(duì)(B) 50, 預(yù)期(E) 10, M=5, N=-4，并對(duì)兩條鏈進(jìn)行比較。

BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列間的相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如，Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法所提供的一種相似性的量度為最小概率總和(P(N))，它對(duì)兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然產(chǎn)生匹配的概率提供了指示。例如，如果測(cè)試核酸與參考核酸之間比較得到的最小概率總和小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001時(shí)，該核酸被認(rèn)為與參考核酸相類似。

在任意情況下，多肽序列的免疫原性衍生物將具有與參考序列基本相同的活性。基本相同的活性指參考序列在PBMC或全血的用特定抗原的體外再刺激測(cè)定(例如，再刺激數(shù)小時(shí)至長達(dá)兩周之間，例如長達(dá)一天、1天至1周或者1至2周的時(shí)間)中活性的至少50%、合適地至少75%且特別是至少90%，其中該測(cè)定通過淋巴組織增殖、培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子生成(通過ELISA、CBA等測(cè)量)或者胞內(nèi)和胞外染色(例如，采用特異性針對(duì)免疫標(biāo)記物的抗體，例如CD3、CD4、CD8、IL2、TNFα、IFNγ、CD40L、CD69等)然后以流式細(xì)胞儀表征T和B細(xì)胞應(yīng)答來測(cè)量細(xì)胞的活化。合適地，基本相同的活性指參考序列在T細(xì)胞增殖和/或IFN-γ生成測(cè)定中的活性的至少50%、合適地至少75%且尤其是至少90%。

合適地，Rv1196相關(guān)抗原將包含，如與SEQ ID No: 1具有至少70%，如至少80%、特別是至少90%、特別是至少95%，例如至少98%、如至少99%同一性的序列。

Rv1196相關(guān)抗原的特定實(shí)例是SEQ ID No: 1所示來自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的Rv1196。隨后，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Rv1196相關(guān)抗原是包含SEQ ID No: 1的蛋白。在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，Rv1196相關(guān)抗原是由SEQ ID No: 1組成的蛋白。

Rv1196相關(guān)抗原的進(jìn)一步實(shí)例是SEQ ID No: 3所示來自結(jié)核分枝桿菌菌株F11的Rv1196。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Rv1196相關(guān)抗原是包含SEQ ID No: 3的蛋白。在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，Rv1196相關(guān)抗原是由SEQ ID No: 3組成的蛋白。

典型地，Rv1196相關(guān)抗原將包含SEQ ID No:1的具有少量缺失插入和/或取代的免疫原性衍生物，如由其組成。實(shí)例是在0-5個(gè)位置具有最多達(dá)5個(gè)殘基缺失，在0-5五個(gè)位置具有最多達(dá)5個(gè)殘基插入和最多達(dá)20個(gè)殘基取代的那些。

Rv1196的其他免疫原性衍生物是包含如由SEQ ID No:1的片段組成的衍生物，所述片段長度為至少250個(gè)氨基酸，例如長度為至少300個(gè)氨基酸或長度為至少350個(gè)氨基酸。

Rv1196的額外免疫原性衍生物是包含如由SEQ ID No:3的片段組成的衍生物，所述片段長度為至少250個(gè)氨基酸，例如長度為至少300個(gè)氨基酸、長度為至少350個(gè)氨基酸或長度為至少380個(gè)氨基酸。

Rv1196相關(guān)抗原可以通過前面描述的方法(例如Dillon等人 Infection and Immunity 1999 67(6):2941-2950; WO2006/117240)、實(shí)施例中提供的那些、或與其類似的方法來制備。

免疫原性組合物可以包含一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的抗原成分。這樣的額外抗原組分本身不需要對(duì)組合物中鹽的存在敏感。

額外的抗原組分可以旨在增強(qiáng)或補(bǔ)充結(jié)核病預(yù)防和治療領(lǐng)域中由Rv1196相關(guān)抗原要求的免疫應(yīng)答，或者額外的抗原可以與其他病原體相關(guān)且旨在為了方便起見用于和Rv1196相關(guān)抗原一起施用。當(dāng)許多抗原組分存在于制劑中時(shí)，這些也可以以個(gè)別多肽或融合蛋白的形式提供。在一些情況下，額外的抗原組分可以作為多核苷酸(或多個(gè)核苷酸)提供。

Rv1196蛋白的特定免疫原性衍生物包括如下融合蛋白，所述融合蛋白與SEQ ID No:1具有至少70％同一性，如至少80％，特別是至少90％，特別是至少95％，例如至少98％，如至少99％。

示例性的含有Rv1196蛋白的融合蛋白包括：M72 (SEQ ID No:5)和其變體，如在N末端具有額外的His殘基的那些(例如，兩個(gè)His殘基，如SEQ ID No:7中所提供的；或5個(gè)或尤其是6個(gè)His殘基的多組氨酸標(biāo)記，其可以用于鎳親和純化)；Mtb72f (SEQ ID No:9)，其中M72中的初始絲氨酸殘基已經(jīng)被突變，如在N末端具有額外的His殘基的Mtb72f蛋白(例如，兩個(gè)His殘基；或5個(gè)或尤其是6個(gè)His殘基的多組氨酸標(biāo)記，其可以用于鎳親和純化)。

在某些實(shí)施方案中，Rv1196相關(guān)抗原包含如下序列，如由如下序列組成，所述序列與SEQ ID No:5具有至少至少90％同一性，特別是至少95％，例如至少98％，如至少99％。在其他實(shí)施方案中，Rv1196相關(guān)抗原包含如下序列，如由如下序列組成，所述序列與SEQ ID No:7具有至少至少90％同一性，特別是至少95％，例如至少98％，如至少99％。

眾所周知的是，對(duì)于胃腸外施用，溶液應(yīng)當(dāng)具有藥學(xué)上可接受的重量摩爾滲透壓濃度，以避免細(xì)胞變形或裂解。藥學(xué)上可接受的重量摩爾滲透壓濃度將通常是指溶液將具有約等滲或輕度高滲的重量摩爾滲透壓濃度。合適地，本發(fā)明的免疫原性組合物將具有250至750 mOsm/kg范圍內(nèi)的重量摩爾滲透壓濃度，例如，重量摩爾滲透壓濃度可以在250至550 mOsm/kg的范圍內(nèi)，如280至500 mOsm/kg的范圍內(nèi)。

可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，例如通過使用商業(yè)上獲得的滲壓計(jì)，例如從Advanced Instruments Inc. (USA)可獲得的Advanced? Model 2020測(cè)量重量摩爾滲透壓濃度。

“等滲劑”是生理上可耐受的并賦予制劑合適漲度的化合物，以防跨越與制劑接觸的細(xì)胞膜的水的凈流動(dòng)。

通常，氯化鈉(NaCl)用作漲度劑。本發(fā)明人已經(jīng)首次顯示Rv1196相關(guān)抗原對(duì)“鹽析”特別敏感，鹽析是指溶液中的蛋白在含高濃度鹽的溶液中聚集或凝結(jié)的過程。因此，提供了可替代的方式以確保本發(fā)明的免疫原性組合物具有藥學(xué)上可接受的重量摩爾滲透壓濃度。

在特定的實(shí)施方案中，提供進(jìn)一步包含非離子型漲度劑的免疫原性組合物。用于免疫原性組合物中的非離子型漲度劑需要自身是藥學(xué)上可接受的，例如適用于人類，并且與Rv1196相關(guān)抗原相容并且進(jìn)一步與其他成分如一種或多種免疫刺激劑相容。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，合適的非離子型漲度劑是多元醇、糖類(尤其是蔗糖、果糖、右旋糖或葡萄糖)或氨基酸如甘氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，多元醇是糖醇，尤其是C3-6糖醇。示例性的糖醇包括甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、山梨醇、甘露醇、衛(wèi)矛醇和艾杜糖醇。在該實(shí)施方案的特定實(shí)例中，合適的非離子型漲度劑是山梨醇。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以通過使用不同漲度劑的混合物獲得適當(dāng)?shù)闹亓磕枬B透壓濃度。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中的非離子型漲度劑合并蔗糖和/或山梨醇。

在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物中多元醇的合適濃度為約2.5至約15% (w/v)，尤其是約2.5至約10% (w/v)例如約3至約7 % (w/v)，如約4至約6% (w/v)。在該實(shí)施方案的特定實(shí)例中，多元醇是山梨醇。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含蔗糖和山梨醇。在這樣的情況下，免疫原性組合物可以合適地含有約2.5至約15％(w/v)的蔗糖，和約2.5至約15％(w/v)的山梨醇，特別是約2.5至約10％(w/v)的蔗糖和約2.5至約10％(w/v)的山梨醇，例如，約3至約7％(w/v)的蔗糖，和約3至約7％ (w/v)的山梨醇，例如約4至約6％(w/v)的蔗糖和約4至約6％(w/v)的山梨醇。

免疫原性組合物的pH應(yīng)該適合用于腸胃外施用。通常，pH將在6.0至9.0的范圍內(nèi)。合適地，pH將在7.0至9.0的范圍內(nèi)，特別是7.25至8.75，例如7.5至8.5，特別是pH 7.75至8.25。約8.0的pH是特別感興趣的。

可以通過使用緩沖劑，包括例如Tris或磷酸鹽緩沖劑控制pH。

在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含一種或多種免疫刺激劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激劑可以是皂苷。用于本發(fā)明的尤其合適的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是分離自南美樹Quillaja saponaria Molina的一種皂苷制劑，首次由Dalsgaard等人描述于1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung，第44卷, Springer Verlag, Berlin, 第243-254頁)，其具有佐劑活性。Quil A的純化部分已通過HPLC分離，其保留佐劑活性，而沒有與Quil A (WO88/09336)例如QS7和QS21 (也稱為QA7和QA21)相關(guān)的毒性。QS21是源自Quillaja saponaria Molina的一種天然皂苷，其誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、Th1細(xì)胞和主要IgG2a抗體應(yīng)答。QS21是本發(fā)明的上下文中的優(yōu)選皂苷。

在本發(fā)明的合適形式中，免疫原性組合物中的皂苷佐劑是saponaria Molina Quil A的衍生物，尤其是Quil A的免疫活性部分，如QS17或QS21，合適地是QS21。

理想的是，在反應(yīng)原性較低的組合物中提供QS21，其中它被外源固醇例如膽固醇猝滅。存在著其中QS21被膽固醇猝滅的反應(yīng)原性較低的組合物的若干種特定形式。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，皂苷/固醇是脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的形式(如在WO96/33739中所述，實(shí)施例1)。在該實(shí)施方案中，脂質(zhì)體合適地含有中性脂質(zhì)，例如磷脂酰膽堿，其在室溫下合適地為非晶性的，例如卵黃磷脂酰膽堿、二油?；字Ｄ憠A(DOPC)或二月桂基磷脂酰膽堿。脂質(zhì)體也可含有帶電荷的脂質(zhì)，其對(duì)于由飽和脂質(zhì)構(gòu)成的脂質(zhì)體而言能增加脂質(zhì)體-QS21結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在這些情況下，帶電荷脂質(zhì)的量合適地為1-20% w/w，如5-10%。固醇與磷脂的比例為1-50% (mol/mol)，合適地為20-25%。

合適的固醇包括β-谷固醇、豆固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇和膽固醇。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含膽固醇作為固醇。這些固醇是本領(lǐng)域眾所周知的，例如膽固醇公開于默克索引(Merck Index, 第11版, 第341頁)，是存在于動(dòng)物脂肪中的天然存在的固醇。

當(dāng)活性皂苷部分是QS21時(shí)，QS21:固醇的比例通常為約1:100至1:1 (w/w)，合適地1:10至1:1 (w/w)，特別1:5至1:1 (w/w)。存在適當(dāng)過量的固醇，QS21:固醇的比例為至少1:2 (w/w)。在一個(gè)實(shí)施方案中，QS21:固醇的比例為1:5 (w/w)。固醇合適地為膽固醇。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含免疫刺激劑，其是Toll-樣受體4 (TLR4)激動(dòng)劑?！癟LR激動(dòng)劑”是指能通過TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)的成分，或者是作為直接配體或者間接通過產(chǎn)生內(nèi)源或外源配體(Sabroe等人, J Immunol 2003 p1630-5)。TLR4激動(dòng)劑能通過TLR-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。TLR4激動(dòng)劑的合適實(shí)例是脂多糖，合適地是脂質(zhì)A的無毒衍生物，尤其是單磷酰脂質(zhì)A或更尤其是3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A (3D-MPL)。

3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.售賣，名稱是MPL，并且在全文中都稱為MPL或3D-MPL，參見例如美國專利號(hào)4,436,727; 4,877,611; 4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促進(jìn)具有IFN-γ (Th1)表型的CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答。可根據(jù)GB2220211A所公開的方法產(chǎn)生3D-MPL。從化學(xué)上說，它是具有3、4、5或6條?；湹?-脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A的混合物。在本發(fā)明的組合物中，小顆粒3D-MPL可用于制備免疫原性組合物。小顆粒3D-MPL的粒徑使其可通過0.22 um濾器進(jìn)行除菌過濾。這樣的制劑描述于WO 94/21292。合適地，粉末狀3D-MPL用于制備本發(fā)明的免疫原性組合物。

可使用的其他TLR4激動(dòng)劑是氨基葡糖苷磷酸烷基酯(AGP)，例如公開于WO98/50399或美國專利號(hào)6,303,347 (也公開了AGP的制備方法)的那些，合適地是RC527或RC529或美國專利號(hào)6,764,840所公開的AGP的藥學(xué)上可接受的鹽。一些AGP是TLR4激動(dòng)劑，而一些則是TLR4拮抗劑。

其他合適的TLR4激動(dòng)劑描述于WO2003/011223和WO2003/099195，如WO2003/011223的第4-5頁或WO2003/099195的第3-4頁上公開的化合物I、化合物II和化合物III，尤其是公開于WO2003/011223的那些化合物ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764。例如，一種合適的TLR-4激動(dòng)劑是ER804057。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，免疫原性組合物同時(shí)包含皂苷和TLR4激動(dòng)劑。在一個(gè)特定的實(shí)例中，免疫原性組合物包含QS21和3D-MPL。

每份人用劑量的免疫原性組合物中可以使用的TLR-4激動(dòng)劑如脂多糖如3D-MPL的量為1至100 ug?？墒褂玫?D-MPL的水平為約50 ug，例如40至60 ug，合適地為45至55 ug或49至51 ug或50 ug。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，免疫原性組合物的人用劑量包含3D-MPL的水平為約25 ug，例如20至30 ug，合適地為21至29 ug或22至28 ug或23至27 ug或24至26 ug或25 ug。

每份人用劑量的免疫原性組合物中可以使用的皂苷如QS21的量為1至100 ug?？墒褂玫腝S21水平為約50ug，例如40至60 ug，合適地為45至55 ug或49至51 ug或50 ug。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，免疫原性組合物的人用劑量包含QS21的水平為約25 ug，例如20至30 ug，合適地為21至29 ug或22至28 ug或23至27 ug或24至26 ug或25 ug。

當(dāng)TLR4激動(dòng)劑和皂苷同時(shí)存在于免疫原性組合物中時(shí)，TLR4激動(dòng)劑與皂苷的重量比合適地為1:5至5:1，合適地為1:2 至 2:1，如約1:1。例如，在每份人用劑量的免疫原性組合物中，當(dāng)3D-MPL含量為50ug或25ug時(shí)，合適地QS21的含量也可分別為50ug或25ug。本發(fā)明的某些免疫原性組合物包含量為1至100 ug QS21和3D-MPL /每個(gè)人用劑量，例如量為10至75 ug/每個(gè)人用劑量。本發(fā)明的免疫原性組合物可以合適地包含QS21和3D-MPL，其量為15至35 ug/每人用劑量，如20至30 ug/每人用劑量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激劑是TLR9激動(dòng)劑，例如WO 2008/142133所給出的那些。在特定的實(shí)例中，所述TLR9激動(dòng)劑是免疫刺激性寡核苷酸，尤其是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸。這樣的寡核苷酸是眾所周知的并描述于例如WO96/02555、WO99/33488和US5,865,462。用于本文所述的免疫原性組合物的合適的TLR9激動(dòng)劑是含有CpG的寡核苷酸，任選含有被至少3個(gè)、合適地為至少6個(gè)或更多個(gè)核苷酸分隔的兩個(gè)或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鳥嘌呤核苷酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵是二硫代磷酸酯鍵，或可能是硫代磷酸酯鍵，盡管磷酸二酯鍵和其他核苷酸間鍵也可使用，包括具有混合核苷酸間鍵的寡核苷酸。產(chǎn)生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯寡核苷酸的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。考慮了包含不同核苷酸間鍵的寡核苷酸，例如混合硫代磷酸磷酸二酯類?？墒褂媚芊€(wěn)定寡核苷酸的其他核苷酸間鍵。

適合本文所述的免疫原性組合物所包含的CpG寡核苷酸的實(shí)例具有以下序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些序列含有經(jīng)硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵。

可替代的CpG寡核苷酸可包含上述序列，因?yàn)槠渲兴鼈兛删哂胁贿B續(xù)缺失或添加。

在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激劑是母育酚。母育酚是本領(lǐng)域眾所周知的并描述于EP0382271。在特定的實(shí)施方案中，母育酚是α-生育酚或其衍生物如α-生育酚琥珀酸酯(也稱為維生素E琥珀酸酯)。

本發(fā)明也提供本發(fā)明免疫原性組合物的制備方法，所述方法包括以下步驟：

a. 凍干Rv1196相關(guān)抗原；和

b. 用水溶液重構(gòu)步驟a)的凍干的Rv1196相關(guān)抗原，其中所述溶液的導(dǎo)電率是13 mS/cm或更低。

在某些實(shí)施方案中，所述水溶液的導(dǎo)電率是12 mS/cm或更低，例如10 mS/cm或更低，8 mS/cm或更低，6 mS/cm或更低，5 mS/cm或更低，4 mS/cm或更低，或3 mS/cm或更低。在特定的實(shí)施方案中，所述水溶液的導(dǎo)電率是2.5 mS/cm或更低，如2.25 mS/cm或更低，或2.0 mS/cm或更低。

合適地，所述水溶液的導(dǎo)電率使得當(dāng)重構(gòu)凍干抗原時(shí)獲得的溶液的導(dǎo)電率是13 mS/cm或更低，如12 mS/cm或更低，例如10 mS/cm或更低，8 mS/cm或更低，6 mS/cm或更低，5 mS/cm或更低，4 mS/cm或更低，或3 mS/cm或更低。在特定的實(shí)施方案中，所述獲得的溶液的導(dǎo)電率是2.5 mS/cm或更低，如2.25 mS/cm或更低，或2.0 mS/cm或更低。

進(jìn)一步提供本發(fā)明免疫原性組合物的制備方法，所述方法包括以下步驟：

a. 凍干Rv1196相關(guān)抗原；和

b. 用水溶液重構(gòu)步驟a)的凍干的Rv1196相關(guān)抗原，其中所述溶液中的鹽濃度是130 mM或更低。

在某些實(shí)施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在特定的實(shí)施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，如30 mM或更低或25 mM或更低。

合適地，所述水溶液中的鹽濃度使得當(dāng)重構(gòu)凍干抗原時(shí)獲得的溶液的鹽濃度是130 mM或更低，如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在特定的實(shí)施方案中，所述獲得的溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，如30 mM或更低，或25 mM或更低。

額外地提供本發(fā)明免疫原性組合物的制備方法，所述方法包括以下步驟：

a. 凍干Rv1196相關(guān)抗原；和

b. 用水溶液重構(gòu)步驟a)的凍干的Rv1196相關(guān)抗原，其中所述溶液中的氯化鈉濃度是130 mM或更低。

在某些實(shí)施方案中，所述水溶液中的氯化鈉濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在特定的實(shí)施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，如30 mM或更低，20 mM或更低，或15 mM或更低。合適地，水溶液中的氯化鈉濃度或等于或低于5 mM。

合適地，所述水溶液中的氯化鈉濃度使得當(dāng)重構(gòu)凍干抗原時(shí)獲得的溶液的氯化鈉濃度是130 mM或更低，如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在特定的實(shí)施方案中，所述獲得的溶液中的氯化鈉濃度是35 mM或更低，如30 mM或更低，或25 mM或更低。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)的水溶液(上述)包含皂苷和/或TLR4激動(dòng)劑，例如QS21和/或3D-MPL。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，皂苷和/或TLR4激動(dòng)劑在脂質(zhì)體制劑中。在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液包含在脂質(zhì)體制劑中的TLR4激動(dòng)劑和皂苷，以及本文所述的非離子型漲度劑，如多元醇。尤其是水溶液可以包含山梨醇。

還提供試劑盒，所述試劑盒包含：

a. 凍干的Rv1196相關(guān)抗原；和

b. 水溶液，其中所述溶液的導(dǎo)電率是13 mS/cm或更低。

額外地提供試劑盒，所述試劑盒包含：

a. 凍干的Rv1196相關(guān)抗原；和

b. 水溶液，其中所述溶液中的鹽濃度是130 mM或更低。

進(jìn)一步地提供試劑盒，所述試劑盒包含：

a. 凍干的Rv1196相關(guān)抗原；和

b. 水溶液，其中所述溶液中的氯化鈉濃度是130 mM或更低。

試劑盒可以適于提供單一劑量的免疫原性組合物，如單人劑量，或多劑量的免疫原性組合物。

用于本發(fā)明試劑盒的水溶液可以是本文所定義的任何水溶液。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，水溶液包含呈脂質(zhì)體形式的TLR4激動(dòng)劑和/或皂苷。在特定的實(shí)施方案中，TLR4激動(dòng)劑是3D-MPL并且皂苷是QS21。本文所用的水溶液可包含漲度劑，例如多元醇，如山梨醇。

關(guān)于上面提到的用于產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原性組合物的試劑盒和方法，可以指出的是，如果存在的話，一種或多種免疫刺激劑和一種或多種漲度劑可以根據(jù)需要與抗原共同凍干或含在水溶液中。水溶液可以簡(jiǎn)單地是注射用水，且免疫原性組合物的所有其他組分與抗原共同凍干。通常，至少一些一種或多種免疫刺激劑和一種或多種漲度劑在水溶液中提供，如果某些組分與凍干相容性較差，如脂質(zhì)體，那么這是特別合適的。在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液包含免疫刺激劑。在第二個(gè)實(shí)施方案中，水溶液包括漲度劑，例如非離子漲度劑，如多元醇，特別是山梨醇。在第三個(gè)實(shí)施方案中，水溶液包含免疫刺激劑和漲度劑，如多元醇，特別是山梨醇。

試劑盒可以進(jìn)一步包括指示使用水溶液重構(gòu)凍干Rv1196相關(guān)抗原的說明。

本發(fā)明的免疫原性組合物可以用于藥物中，特別是用于預(yù)防、治療或改善分枝桿菌的感染，如結(jié)核分枝桿菌的感染。免疫原性組合物將提供用于施用于人，盡管它們也可能在獸藥中如施用于牛中是有價(jià)值的。

提供了本發(fā)明的免疫原性組合物在制備藥物中的用途，所述藥物特別用于預(yù)防、治療或改善分枝桿菌的感染，如結(jié)核分枝桿菌的感染。

還提供了用于預(yù)防、治療或改善分枝桿菌的感染，如結(jié)核分枝桿菌的感染的方法，所述方法包括施用安全和有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物。

可以出于下述目的提供免疫原性組合物：

-治療活動(dòng)性結(jié)核；

-預(yù)防活動(dòng)性結(jié)核，如通過施用于未感染的受試者，或者具有潛伏感染的受試者；

-治療潛伏結(jié)核；

-預(yù)防潛伏結(jié)核，如通過施用于未感染的受試者；或

-預(yù)防或延緩結(jié)核病的再活化，特別是TB再活化的延緩，例如延緩數(shù)月、數(shù)年或甚至無限期。

術(shù)語“活動(dòng)性感染”指具有已顯現(xiàn)的疾病癥狀和/或損傷(合適地具有顯現(xiàn)的疾病癥狀)的感染，例如，結(jié)核分枝桿菌感染。

術(shù)語“非活動(dòng)性感染”、“休眠感染”或“潛伏感染”指未顯示疾病癥狀和/或損傷(合適地未顯示疾病癥狀)的感染，例如，結(jié)核分枝桿菌感染。具有潛伏感染的受試者將合適地是測(cè)試為陽性感染的受試者，如通過基于PPD或T細(xì)胞的測(cè)定，但所述受試者還沒有表現(xiàn)出疾病癥狀和/或與活動(dòng)性感染相關(guān)的損傷。

術(shù)語“原發(fā)結(jié)核病”指在感染(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)后直接形成的臨床疾病，例如，疾病癥狀的顯現(xiàn)。參見Harrison’s Principles of Internal Medicine, 第150章, pp. 953-966 (第16版，Braunwald, 等人編輯， 2005)。

術(shù)語“繼發(fā)性結(jié)核病”或“原發(fā)后結(jié)核病”指休眠、非活動(dòng)性或潛伏性感染(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)的再活化。參見Harrison’s Principles of Internal Medicine, 第150章, pp. 953-966 (第16版，Braunwald, 等人編輯， 2005)。

術(shù)語“結(jié)核病再活化”指感染測(cè)試呈陽性(例如，在結(jié)核菌素皮試中呈陽性，合適地在體外基于T細(xì)胞的測(cè)定中呈陽性)但沒有明顯的疾病癥狀的個(gè)體隨后顯現(xiàn)疾病癥狀。合適地，個(gè)體將沒有再暴露于感染。該陽性診斷測(cè)試表明該個(gè)體被感染，然而，該個(gè)體可能曾顯示或未曾顯示已進(jìn)行過充分治療以將結(jié)核病帶入非活動(dòng)性或潛伏狀態(tài)的活動(dòng)性疾病的癥狀。

合適地，將免疫原性組合物施用于未感染的受試者或具有分枝桿菌潛伏感染、如結(jié)核分枝桿菌感染的受試者。

施用的免疫原性組合物的體積將根據(jù)許多其他因素而變化，如特定遞送途徑，例如肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)途徑。通常，用于人的單一注射(單位劑量)施用的體積將是50 μl至1 ml，如100 μl至750 μl，特別是400至600 μl，例如約500 μl。

單一劑量內(nèi)含有的Rv1196相關(guān)抗原的量取決于臨床需要，但是單一人劑量將通常是1至100 μg，如5至50 μg，例如5至20 μg。單一人劑量可以含有約10 μg的Rv1196相關(guān)抗原。

合適地，本發(fā)明的組合物將是穩(wěn)定的，其中是指在25℃儲(chǔ)存24小時(shí)的期間過程中，如通過本文中描述的技術(shù)所測(cè)量的抗原性保留儲(chǔ)存前抗原性的至少80％。期望地，在25℃儲(chǔ)存24小時(shí)的期間后，抗原性將保留至少85％，如至少90％，特別是至少95％。對(duì)于特別感興趣的組合物，在30℃儲(chǔ)存24小時(shí)的期間后，保留組合物的至少80％，例如至少85％，至少90％，特別是至少95％的抗原性。

現(xiàn)在借助以下非限制性實(shí)例將進(jìn)一步描述本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1：佐劑組合物ASA (山梨醇)的制備

制備佐劑組合物，其包含使用山梨醇作為漲度劑的脂質(zhì)體制劑中的3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A和QS21。其制備如下：

A.脂質(zhì)體的制備方法：

將脂質(zhì)(DOPC)、膽固醇和3-脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A的有機(jī)溶液中的混合物真空干燥。然后加入水溶液(磷酸鹽緩沖鹽水[100 mM NaCl、50 mM磷酸鹽pH 6.1])并攪拌容器直到所有脂質(zhì)呈懸浮狀態(tài)。用高剪切混合器將該懸浮液預(yù)均質(zhì)，再進(jìn)行高壓均質(zhì)，直到脂質(zhì)體大小降低到經(jīng)DLS測(cè)定約為90nm±10nm。然后將脂質(zhì)體除菌過濾。

B. ASA制劑：

步驟1：濃縮脂質(zhì)體的稀釋

當(dāng)稀釋10倍時(shí)，將Na₂/K磷酸鹽緩沖液100 mM pH 6.1加入到注射用水中，在最終制劑中達(dá)到10mM磷酸鹽緩沖液濃度。再加入30% (w/v)山梨醇的注射用水(WFI)溶液，在最終制劑中達(dá)到4.7%的濃度–將其在室溫下攪拌15-45分鐘。

再將濃縮脂質(zhì)體(分別由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、膽固醇和3D-MPL制成)加入到該混合物中，在最終制劑中達(dá)到100 ug/ml 3D-MPL的濃度。

然后將混合物在室溫下攪拌15-45分鐘。

步驟2：加入QS21

使用蠕動(dòng)泵，將QS21貯液加入到稀釋的脂質(zhì)體中，同時(shí)磁力攪拌，在最終制劑中達(dá)到100 ug/ml的濃度。將混合物攪拌15-45分鐘。

最終ASA(山梨醇)制劑中含有2 mg DOPC 、500 ug 膽固醇、100 ug 3D-MPL/ml和100 ug QS21/ml、4.7%山梨醇以及5 mM氯化鈉和10 mM磷酸鹽。

步驟3：檢查pH為6.1± 0.1

步驟4：除菌過濾

使用來自PALL Corporation的聚醚砜(PES)濾器進(jìn)行除菌過濾。

步驟5：在+2℃至+8℃儲(chǔ)存

獲得佐劑組合物，其包含在脂質(zhì)體制劑中的3-脫-O-?；疢PL和QS21并含有作為漲度劑的山梨醇(稱為ASA (山梨醇))，然后儲(chǔ)存在4℃。

實(shí)施例2：佐劑組合物ASA (150 mM NaCl)的制備

使用作為漲度劑的氯化鈉制備佐劑組合物，其包含脂質(zhì)體制劑中的3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A和QS21。

A. 脂質(zhì)體的制備方法：

將脂質(zhì)(DOPC)、膽固醇和3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)的有機(jī)溶液的混合物真空干燥。再加入磷酸鹽緩沖鹽水(100 mM NaCl、50 mM磷酸鹽pH 6.1)并攪拌容器直到所有脂質(zhì)呈懸浮狀態(tài)。再用高剪切混合器將該懸浮液預(yù)均質(zhì)，然后進(jìn)行高壓均質(zhì)，直到脂質(zhì)體大小降低到經(jīng)DLS測(cè)定約為90 nm ± 10 nm。然后將脂質(zhì)體在0.22 um PES膜上除菌過濾。

B. ASA制劑：

步驟1：濃縮脂質(zhì)體的稀釋

當(dāng)稀釋10倍時(shí)，將Na₂/K磷酸鹽緩沖液100mM pH6.45和NaCl 1.5M加入到注射用水中，在最終制劑中分別達(dá)到10mM磷酸鹽和NaCl 150mM的濃度。將該混合物在室溫下攪拌5分鐘。再將濃縮脂質(zhì)體(分別由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、膽固醇和3D-MPL制成)加入到該混合物中，在最終制劑中達(dá)到100 ug/ml 3D-MPL的濃度。然后將混合物在室溫下攪拌5-15分鐘。

步驟2：加入QS21

將QS21貯液加入到稀釋的脂質(zhì)體中，同時(shí)磁力攪拌，在最終制劑中達(dá)到100 ug/ml的濃度。將混合物在室溫下攪拌。

步驟3：檢查pH目的為6.1±0.1

步驟4：除菌過濾

使用來自PALL Corporation的聚醚砜(PES)濾器上進(jìn)行除菌過濾。

步驟5：在+2℃至+8℃儲(chǔ)存

ASA(150 mM NaCl)的最終組合物是2 mg DOPC、500 ug 膽固醇、100 ug 3-脫-O-酰化MPL、100 ug QS21/ml、10 mM磷酸鹽和150 mM NaCl。

實(shí)施例3：QS21裂解活性

已知QS21能裂解紅血細(xì)胞(RBC)。測(cè)試實(shí)施例1中制備的ASA (山梨醇)佐劑組合物，以確保QS21的裂解活性以與包含150mM NaCl的當(dāng)量佐劑組合物(ASA (150mM NaCl))中所觀察到的同樣方式被猝滅。

通過溶血測(cè)定，使用雞紅血細(xì)胞(chicken Red Blood cell, RBC)測(cè)定QS21的裂解活性。將RBC在550g于4℃離心。棄去上清液。將沉淀小心重懸于PBS緩沖液中達(dá)原先體積并且重復(fù)同樣操作，直到上清液不再呈紅色(通常3次)。如果不直接使用的話，將沉淀儲(chǔ)存于4℃持續(xù)3-4天(并在使用當(dāng)天再次洗滌)，或者如果在同一天使用的話，將其在緩沖液中稀釋約10倍。

臨時(shí)在ASA緩沖液(在測(cè)試ASA樣品后在鹽或在山梨醇緩沖液中)中制作QS21劑量范圍曲線并且制備佐劑樣品(含50 ug或90 ug QS21當(dāng)量，即相當(dāng)于500 ul或900 ul ASA當(dāng)量)。在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中用充足緩沖液(含或不含山梨醇，隨所測(cè)試樣品的緩沖液而定)將終體積調(diào)節(jié)至900ul。因?yàn)槠錇槿樯?，ASA干擾光密度(OD)。因此制備ASA“空白”并從ASA測(cè)試樣品的OD值中減去“空白”O(jiān)D。這些空白相當(dāng)于與樣品中測(cè)試的體積相同的ASA體積，但用緩沖液調(diào)節(jié)至1ml。這些空白中不加RBC。然后將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與RBC一起(將100 ul稀釋RBC加入到900 ul標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中)在室溫下(RT)孵育30分鐘。再將樣品在900g離心5分鐘。離心后在540nm處測(cè)定光密度。

通過限值試驗(yàn)(limit test)進(jìn)行裂解活性的測(cè)定。

1. 檢測(cè)限值(LOD)定義為導(dǎo)致下列OD的最低QS21濃度：

-比基礎(chǔ)水平更高(OD>0.1)

-比緩沖液(“0 ug”QS21)的OD高約3倍

-在曲線的上升部分

-對(duì)每次試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定

2. 如果佐劑樣品的OD大于OD_LOD，則佐劑樣品中QS21的裂解活性始終是陽性的。

實(shí)例QS21曲線

*測(cè)試的50ug QS21當(dāng)量。150mM氯化鈉緩沖液。

上述數(shù)據(jù)圖示于圖1中。

該測(cè)定的檢測(cè)限值是0.9ug QS21，并且OD為0.12。

對(duì)于所測(cè)試的50 ug QS21當(dāng)量而言，估計(jì)在包含150mM氯化鈉的佐劑組合物中QS21的猝滅大于98.2%。在所測(cè)試的90 ug當(dāng)量的情況下，結(jié)論大于99%。

然后將QS21猝滅與包含山梨醇和僅含5mM氯化鈉的當(dāng)量佐劑組合物進(jìn)行比較。在4℃儲(chǔ)存ASA之后或在加速穩(wěn)定(7天，在37℃)之后產(chǎn)生數(shù)據(jù)。對(duì)于山梨醇中的ASA，在含山梨醇的緩沖液中得到QS21標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)試50 ug QS21等量，除了*測(cè)試90 ug QS21等量之外。

結(jié)論是QS21在低氯化鈉緩沖液中被足夠地猝滅。

實(shí)施例4：MPL同類物

從化學(xué)上說，3D-MPL是具有主要的4、5或6條酰化鏈的3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A的混合物。每個(gè)單獨(dú)的3D-MPL分子都稱為同類物。重要的是，同類物組成保持恒定，在同類物比例上沒有變化。也重要的是，所用的任何緩沖液都能使同類物組成與用于制備佐劑組合物的濃縮脂質(zhì)體中的組成相同。

如圖2所示，在3D-MPL濃縮脂質(zhì)體(濃縮脂質(zhì)體LIP07-217，圖2的第1欄)、包含3D-MPL脂質(zhì)體和QS21的150mM NaCl緩沖液中的佐劑組合物(佐劑150mM NaCl或ASA (150mM NaCl), 第2欄)，以及包含3D-MPL脂質(zhì)體和QS21的山梨醇和5mM NaCl緩沖液中的佐劑組合物(佐劑山梨醇，或ASA (山梨醇), 第3-7欄)中，檢查同類物組成。

也在制備和在37℃維持后第0天和第7天在兩批次的ASA (山梨醇)佐劑中檢查同類物組成，以確保隨時(shí)間無變化(參見圖2的最后4欄)。

通過IP-HPLC-Fluo檢測(cè)(ARD)，在濃縮脂質(zhì)體或ASA (山梨醇)樣品中測(cè)定MPL的4-、5-和6-?；愇锏南鄬?duì)分布。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都用丹酰肼衍生，其在二糖骨架上引入Fluo-活性生色團(tuán)。在C18反相柱上，用叔丁基氫氧化銨(TBAOH)作為離子對(duì)試劑，分析衍生樣品。在不同組(四?；?、五酰基和六?；?中洗脫含有相同數(shù)量的脂?；耐愇铩Ｍㄟ^將各組的峰面積與所有MPL同類物的總峰面積進(jìn)行比較，推導(dǎo)出同類物的分布。

圖2顯示各同類物的百分比。在佐劑緩沖液之間，未發(fā)現(xiàn)同類物組成的顯著差異，并且同類物組成在山梨醇緩沖液中隨時(shí)間推移而保持不變。

實(shí)施例5：佐劑組合物ASA (山梨醇-2)的制備

使用作為漲度劑的山梨醇制備佐劑組合物，其包含脂質(zhì)體制劑中的以相對(duì)于實(shí)施例1中降低水平的3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A和QS21。其制備如下：

通過用含有10mM磷酸鹽、5 mM NaCl、4.7％山梨醇 pH 6.1的溶液1:1稀釋根據(jù)實(shí)施例1制備的ASA(山梨醇)而制備佐劑。

最終ASA(山梨醇– 2)制劑含有1 mg DOPC、250 ug 膽固醇、50 ug 3D-MPL/ml和50 ug QS21/ml、4.7%山梨醇、5 mM氯化鈉和10 mM磷酸鹽。

實(shí)施例6：佐劑組合物ASA (山梨醇-3)的制備

A. 脂質(zhì)體的制備方法：

將脂質(zhì)(DOPC)、膽固醇和3-脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A的有機(jī)溶液中的混合物真空干燥。然后加入水溶液(磷酸鹽緩沖鹽水[100 mM NaCl、50 mM磷酸鹽pH 6.1])并攪拌容器直到所有脂質(zhì)呈懸浮狀態(tài)。再用高剪切混合器將該懸浮液預(yù)均質(zhì)，然后進(jìn)行高壓均質(zhì)，直到脂質(zhì)體大小降低到經(jīng)DLS測(cè)定約為90 nm ± 10 nm。然后將脂質(zhì)體除菌過濾。

B. ASA制劑：

步驟1：濃縮脂質(zhì)體的稀釋

再將濃縮脂質(zhì)體(分別由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、膽固醇和3D-MPL制成)加入到該混合物中，在最終制劑中達(dá)到50 ug/ml 3D-MPL的濃度。

然后將混合物在室溫下攪拌15-45分鐘。

步驟2：加入QS21

使用蠕動(dòng)泵，將QS21貯液加入到稀釋的脂質(zhì)體中，同時(shí)磁力攪拌，在最終制劑中達(dá)到50 ug/ml的濃度。將混合物攪拌15分鐘。

最終ASA制劑含有1 mg DOPC、250 ug 膽固醇、50 ug 3D-MPL/ml和50 ug QS21/ml、4.7%山梨醇和2.5 mM氯化鈉、10 mM磷酸鹽。

步驟3：檢查pH為6.1± 0.1

步驟4：除菌過濾

使用來自PALL Corporation的聚醚砜(PES)濾器進(jìn)行除菌過濾。

步驟5：在+2℃至+8℃儲(chǔ)存

獲得佐劑組合物，其中包含在脂質(zhì)體制劑中的3-脫-O-酰化MPL和QS21并含有作為漲度劑的山梨醇(稱為ASA (山梨醇-3))，然后儲(chǔ)存在4℃。

實(shí)施例7：佐劑組合物ASA (150 mM NaCl-2)的制備

使用作為漲度劑的氯化鈉制備佐劑組合物，其包含脂質(zhì)體制劑中的以相對(duì)于實(shí)施例2中降低水平的3-脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A和QS21。其制備如下：

A. 脂質(zhì)體的制備方法：

將脂質(zhì)(DOPC)、膽固醇和3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)的有機(jī)溶液中的混合物真空干燥。再加入磷酸鹽緩沖鹽水(100 mM NaCl、50 mM磷酸鹽pH 6.1)并攪拌容器直到所有脂質(zhì)呈懸浮狀態(tài)。再用高剪切混合器將該懸浮液預(yù)均質(zhì)，然后進(jìn)行高壓均質(zhì)，直到脂質(zhì)體大小降低到經(jīng)DLS測(cè)定約為90 nm ± 10 nm。然后將脂質(zhì)體在0.22 um PES膜上除菌過濾。

B. ASA制劑：

步驟1：濃縮脂質(zhì)體的稀釋

當(dāng)稀釋10倍時(shí)，將Na₂/K磷酸鹽緩沖液100mM pH6.45和NaCl 1.5M加入到注射用水中，在最終制劑中分別達(dá)到10mM磷酸鹽和NaCl 150mM的濃度。將該混合物在室溫下攪拌5分鐘。再將濃縮脂質(zhì)體(分別由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、膽固醇和3D-MPL制成)加入到該混合物中，在最終制劑中達(dá)到50 ug/ml 3D-MPL的濃度。然后將所得混合物在室溫下攪拌5-15分鐘。

步驟2：加入QS21

將QS21貯液加入到稀釋的脂質(zhì)體中，同時(shí)磁力攪拌，在最終制劑中達(dá)到50 ug/ml的濃度。將混合物在室溫下攪拌。

步驟3：檢查pH目的為6.1±0.1

步驟4：除菌過濾

使用來自PALL Corporation的聚醚砜(PES)濾器進(jìn)行除菌過濾。

步驟5：在+2℃至+8℃儲(chǔ)存

ASA(150 mM NaCl – 2)的最終組合物是1 mg DOPC、250 ug 膽固醇、50 ug 3-脫-O-?；疢PL、50 ug QS21/ml、10 mM磷酸鹽和150 mM NaCl。

實(shí)施例8：在pH 6.1、7.5和8.5的具有不同鹽濃度的包含Rv1196的組合物中研究“鹽析”。

研究如大小所評(píng)價(jià)的氯化鈉濃度和pH對(duì)Rv1196抗原穩(wěn)定性的影響。

方法

從Corixa公司獲得Rv1196蛋白(SEQ ID No:1)，且在三種含有0、150和450 mM的最終氯化鈉濃度的不同緩沖液(10mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.1，20mM Tris緩沖液，pH 7.5和20mM Tris緩沖液，pH 8.5)中稀釋至100 ug/ml的濃度。

在分析之前，樣品在4℃或25℃儲(chǔ)存24小時(shí)。

使用從Thermo Fischer Scientific獲得的Nepheloskan? Ascent進(jìn)行濁度測(cè)定法。在從Corning Inc (USA)獲得的UV 透明Costar?微板中進(jìn)行分析。

使用來自Wyatt儀器的Dynapro酶標(biāo)儀進(jìn)行DLS。使用830 nm的激光波長和50 mW的功率操作儀器。在22℃的溫度下以150℃檢測(cè)散射光。通過儀器軟件計(jì)算平均流體動(dòng)力學(xué)直徑和多分散指數(shù)(pI)。

結(jié)果

該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)于圖3和4中。

濁度測(cè)定法表明隨著鹽濃度增加的澄清度降低的總體趨勢(shì)，表明Rv1196對(duì)于鹽濃度是敏感的。

對(duì)于大多數(shù)DLS樣品，儀器無法確定特定的顆粒大小(在圖4中顯示為NV)。盡管如此，當(dāng)獲得可比較的數(shù)據(jù)(即pH 8.5，0或150 nM NaCl)時(shí)，很明顯，氯化鈉濃度影響Rv1196免疫原性組合物中測(cè)量的顆粒大小。

實(shí)施例9：蛋白抗原的制備

具有兩個(gè)N末端His殘基的M72(SEQ ID No:7)

M72表達(dá)載體的構(gòu)建

通過將編碼Mtb32a的C末端片段的開放閱讀框(ORF)串聯(lián)地順序連接至Mtb39a的全長ORF(以其C末端跟著Mtb32a的N末端部分)而生成編碼在N末端具有額外的6-His標(biāo)記的Mtb72f 的氨基酸序列的質(zhì)粒。通過使用含有獨(dú)特限制性位點(diǎn)(EcoRⅠ和EcoRV)且在C末端沒有終止密碼子(在Mtb32a和Mtb39a的C末端片段的情況下)的序列特異寡核苷酸用于從結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來完成這一點(diǎn)。使用該載體作為模板，通過位點(diǎn)定向誘變進(jìn)行Ser706至Ala的突變。通過DNA測(cè)序驗(yàn)證插入片段的正確方向以及突變Ser706Ala。

為了獲得編碼M72(其在N末端僅具有2個(gè)His殘基)的載體，利用商業(yè)的位點(diǎn)定向誘變系統(tǒng)缺失四個(gè)His。序列驗(yàn)證后，通過酶促反應(yīng)從質(zhì)粒切下編碼M72的序列，凝膠純化，且連接到pET載體中。然后序列驗(yàn)證重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒編碼在T7啟動(dòng)子控制下的M72。在表達(dá)宿主中從基因組整合體驅(qū)動(dòng)T7 RNA聚合酶的表達(dá)，且使用基于lac操縱子的系統(tǒng)(lacI)和IPTG化學(xué)誘導(dǎo)信號(hào)進(jìn)行誘導(dǎo)。為表達(dá)質(zhì)粒提供卡那霉素抗性。

使用電穿孔法將編碼在T7啟動(dòng)子控制下的M72融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的HMS174(DE3)菌株中。在兩條鏈上測(cè)序M72插入片段的編碼序列和側(cè)翼區(qū)，且發(fā)現(xiàn)與從初始質(zhì)粒構(gòu)建體確定的序列相同。

發(fā)酵

在室溫下融化一小瓶沉淀的工作菌種。通過用4.9 ml預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基混合工作菌種而制備預(yù)稀釋物。使用1 ml預(yù)稀釋物接種液體預(yù)培養(yǎng)物，所述液體預(yù)培養(yǎng)物由400 ml補(bǔ)充50 mg/l硫酸卡那霉素和10 g/l葡萄糖的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基組成。

預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基組成

(1)用HCl(37％)溶液將pH調(diào)節(jié)至1.50；溶液過濾通過0.22 um；

(2)溶液過濾通過0.22 um。

在30℃攪拌(200 RPM)下在2升搖瓶中培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物，直到OD_650nm達(dá)到2至4的值(近似培養(yǎng)時(shí)間：16小時(shí))。在該階段，用52 ml液體預(yù)培養(yǎng)物接種含有45升補(bǔ)充34 mg/l硫酸卡那霉素的培養(yǎng)基的72升(總體積)發(fā)酵罐。

培養(yǎng)基組成

(1) 溶液過濾通過0.22 um

(2) 用NaOH (25%)溶液將pH調(diào)節(jié)至11.0；溶液過濾通過0.22 um。

在生長階段期間，通過定期加入25% (v/v) NH₄OH和25% (v/v) H₃PO₄而將pH保持在6.8 ± 0.2。在30℃培養(yǎng)16小時(shí)后，開始用補(bǔ)料培養(yǎng)基分批補(bǔ)料。

補(bǔ)料培養(yǎng)基組成

(1)溶液過濾通過0.22 um

(2)用NaOH (25%)溶液將pH調(diào)節(jié)至11.0；溶液過濾通過0.22 um。

將溫度保持在30℃持續(xù)進(jìn)一步2小時(shí)，然后升高至37℃，直到發(fā)酵結(jié)束。通過攪拌和壓力的反饋控制將氣流恒定設(shè)置至75 l/min且將溶解氧保持在17％飽和度。根據(jù)需要自動(dòng)添加少量消泡劑溶液。至OD_650nm達(dá)到50 (±5)值的時(shí)間，添加1 mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以誘導(dǎo)M72的表達(dá)。從開始誘導(dǎo)的時(shí)間點(diǎn)5小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。在輕微攪拌下使細(xì)胞培養(yǎng)物向下冷卻至15℃且離心(在4℃)以獲得細(xì)胞沉淀，此后將其以等分試樣儲(chǔ)存于-20℃。

包涵體的分離

在室溫下解凍從收獲物收集的細(xì)胞沉淀，且用高壓均質(zhì)器在裂解緩沖液(10 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0)中破碎。此后，將細(xì)胞裂解物離心且用含有尿素、Tris和NaCl的洗滌緩沖液洗滌獲得的細(xì)胞沉淀(或包涵體，IB)。用含有8M尿素的增溶緩沖液使IB溶解且過濾通過0.2 um膜。首先使用Q Sepharose Fast Flow (QSFF)柱通過陰離子交換層析純化該過濾的溶液。用6 M尿素, 20 mM雙三羥甲基氨基甲烷丙烷, 90 mM NaCl, pH 7.0溶液進(jìn)行M72的洗脫。

通過羥基磷灰石層析法(HA)進(jìn)一步純化收集的M72，用6 M尿素, 20 mM雙三羥甲基氨基甲烷丙烷, 250 mM NaCl, pH 7.0溶液將其進(jìn)行洗脫。用30 kDa膜盒濃縮收集的級(jí)分且針對(duì)20 mM Tris, pH 7.5進(jìn)行滲濾。M72然后除菌過濾通過0.22 um膜。然后純化的容積物等分且儲(chǔ)存在-70℃。

實(shí)施例10：在pH 6.1、7.5和8.5的具有不同鹽濃度的包含M72的組合物中研究“鹽析”。

研究如大小和抗原性所評(píng)價(jià)的氯化鈉濃度和pH對(duì)M72抗原穩(wěn)定性的影響。

方法

將純化的大量抗原(具有兩個(gè)N末端His殘基的M72，SEQ ID No:7，如實(shí)施例9中所制備的)在三種含有0、50、150、300和450 mM的最終氯化鈉濃度的不同緩沖液(10mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.1，20mM Tris緩沖液，pH 7.5和20mM Tris緩沖液，pH 8.5)中稀釋至100 ug/ml的濃度。

樣品立即進(jìn)行分析(T0)，在分析前過夜儲(chǔ)存在4℃(T0 O/N)，或在分析前在25℃下儲(chǔ)存24小時(shí) (T24h25℃)。

使用來自Malvern Instruments (UK)的Malvern Zetasizer Nano ZS進(jìn)行DLS。使用633 nm的激光波長和4 mW的功率操作儀器。在22℃的溫度下以173℃檢測(cè)散射光。通過儀器軟件計(jì)算Z-平均直徑(ZAV)和多分散指數(shù)(pI)。

使用從Thermo Fischer Scientific 獲得的Nepheloskan? Ascent進(jìn)行濁度測(cè)定。在從Corning Inc (USA)獲得的UV 透明Costar?微板中進(jìn)行分析。

通過夾心ELISA定量抗原性，其中抗原通過M72特異性兔多克隆抗體捕獲且隨后通過M72(Mtb39)特異性小鼠單克隆抗體顯現(xiàn)。所有測(cè)量值基于用于制備測(cè)試的制劑的純化的大量蛋白相對(duì)于預(yù)期抗原性表示。

結(jié)果

該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)于圖5至7中。

結(jié)果首次表明含有Rv1196相關(guān)抗原、特別是M72的溶液的穩(wěn)定性對(duì)于pH和氯化鈉濃度都是敏感的。當(dāng)pH越低時(shí)，氯化鈉對(duì)抗原大小和抗原性的影響都更顯著。

甚至在沒有氯化鈉的情況下，抗原大小和抗原性在pH 6.1時(shí)也是不穩(wěn)定的。添加pH 6.1的50mM氯化鈉導(dǎo)致大小從35 nm(在T0時(shí)的0 mM氯化鈉)增加至58 nm(T0)或在25℃24小時(shí)后的79 nm。

在25℃時(shí)pH 7.5或8.5時(shí)，特別是在沒有氯化鈉或在50 mM的氯化鈉濃度的情況下，抗原大小和抗原性經(jīng)24小時(shí)是相對(duì)穩(wěn)定的。盡管如此，氯化鈉濃度增加至150 mM或更高導(dǎo)致明顯的抗原大小的增加和抗原性的降低。

因此，本發(fā)明的益處延伸到含有Rv1196相關(guān)抗原的序列，而不僅僅是Rv1196抗原序列本身。

實(shí)施例11：使用山梨醇作為漲度劑在包含M72、免疫刺激劑的組合物中防止“鹽析”

為了比較含有150 mM NaCl的免疫原性組合物與使用山梨醇作為漲度劑的組合物的穩(wěn)定性，使用SEC-HPLC和ELISA監(jiān)測(cè)多份樣品。

方法

制備三個(gè)不同的凍干餅，使得當(dāng)與來自實(shí)施例5和7的適當(dāng)?shù)淖魟┲苿┫嘟M合時(shí)，將獲得期望的pH：

(a)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 –目標(biāo)為在重構(gòu)疫苗中的pH 8.5

將15.75% (w/v)蔗糖溶液(制備在注射用水中)添加至注射用水中以達(dá)到6.3％的蔗糖濃度。然后添加3% (w/v)Tween80溶液(制備在注射用水中)以達(dá)到0.025%的濃度。然后添加Tris-HCl緩沖液1 M pH 8.8以達(dá)到50 mM Tris緩沖液濃度。將混合物在室溫下磁力攪拌5分鐘。然后添加純化的大量抗原(具有兩個(gè)N末端His殘基的M72，SEQ ID No:7，如實(shí)施例9中制備的)以達(dá)到25 ug/ml的蛋白濃度。將混合物在室溫下磁力攪拌10分鐘。檢查pH且發(fā)現(xiàn)為8.8。

將0.5 ml獲得的混合物填充在3 ml玻璃小瓶中，然后冷凍干燥。

(b)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 –目標(biāo)為在重構(gòu)疫苗中的pH 8.0

將15.75% (w/v)蔗糖溶液(制備在注射用水中)添加至注射用水中以達(dá)到6.3％的蔗糖濃度。然后添加3% (w/v)Tween80溶液(制備在注射用水中)以達(dá)到0.025%的濃度。然后添加Tris-HCl緩沖液1 M pH 8.8以達(dá)到20 mM Tris緩沖液濃度。將混合物在室溫下磁力攪拌5分鐘。然后添加純化的大量抗原(具有兩個(gè)N末端His殘基的M72，SEQ ID No:7，如實(shí)施例9中制備的)以達(dá)到25 ug/ml的蛋白濃度。將混合物在室溫下磁力攪拌10分鐘。檢查pH且發(fā)現(xiàn)為8.8。

將0.5 ml獲得的混合物填充在3 ml玻璃小瓶中，然后冷凍干燥。

(c)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 –目標(biāo)為在重構(gòu)疫苗中的pH 7.5

將15.75% (w/v)蔗糖溶液(制備在注射用水中)添加至注射用水中以達(dá)到6.3％的蔗糖濃度。然后添加3% (w/v)Tween80溶液(制備在注射用水中)以達(dá)到0.025%的濃度。然后添加Tris-HCl緩沖液1 M pH 8.8以達(dá)到12.5 mM Tris緩沖液濃度。將混合物在室溫下磁力攪拌5分鐘。然后添加純化的大量抗原(具有兩個(gè)N末端His殘基的M72，SEQ ID No:7，如實(shí)施例9中制備的)以達(dá)到25 ug/ml的蛋白濃度。將混合物在室溫下磁力攪拌10分鐘。檢查pH且發(fā)現(xiàn)為8.8。

將0.5 ml獲得的混合物填充在3 ml玻璃小瓶中，然后冷凍干燥。

用625 ul實(shí)施例5和7中制備的佐劑溶液重構(gòu)上述的凍干餅。用佐劑溶液重構(gòu)后，獲得下列免疫原性組合物：

(i)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 – ASA(150 mM NaCl – 2) pH 8.5

10 ug抗原(20 ug/ml)

5% w/v蔗糖

40 mM Tris

0.02% w/v Tween80

500 ug DOPC

125 ug膽固醇

25 ug 3D-MPL

25 ug QS21

150 mM NaCl

10 mM磷酸鹽

pH 8.5

(ii)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 – ASA(150 mM NaCl – 2) pH 8.0

10 ug抗原(20 ug/ml)

5% w/v蔗糖

16 mM Tris

0.02% w/v Tween80

500 ug DOPC

125 ug膽固醇

25 ug 3D-MPL

25 ug QS21

150 mM NaCl

10 mM磷酸鹽

pH 8.0

(iii)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 – ASA(150 mM NaCl – 2) pH 7.5

10 ug抗原(20 ug/ml)

5% w/v蔗糖

12.5 mM Tris

0.02% w/v Tween80

500 ug DOPC

125 ug膽固醇

25 ug 3D-MPL

25 ug QS21

150 mM NaCl

10 mM磷酸鹽

pH 7.5

(iv)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 – ASA(山梨醇– 2) pH 8.5

10 ug抗原(20 ug/ml)

5% w/v蔗糖

40 mM Tris

0.02% w/v Tween80

500 ug DOPC

125 ug膽固醇

25 ug 3D-MPL

25 ug QS21

5 mM NaCl

4.7% w/v山梨醇

10 mM磷酸鹽

pH 8.5

(v)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 – ASA(山梨醇– 2) pH 8.0

10 ug抗原(20 ug/ml)

5% w/v蔗糖

16 mM Tris

0.02% w/v Tween80

500 ug DOPC

125 ug膽固醇

25 ug 3D-MPL

25 ug QS21

5 mM NaCl

4.7% w/v山梨醇

10 mM磷酸鹽

pH 8.0

(vi)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 – ASA(山梨醇– 2) pH 7.5

10 ug抗原(20 ug/ml)

5% w/v蔗糖

12.5 mM Tris

0.02% w/v Tween80

500 ug DOPC

125 ug膽固醇

25 ug 3D-MPL

25 ug QS21

5 mM NaCl

4.7% w/v山梨醇

10 mM磷酸鹽

pH 7.5。

樣品分析

在25℃或30℃儲(chǔ)存(T0、T6h和T24h)后表征上述重構(gòu)的免疫原性組合物。

通過注射在20 mM Tris緩沖液pH 8.5中平衡的TOSOH TSK-Gel5000Pwxl (ID 7.8 mm x 30 cm)上、通過210 nm 的UV 檢測(cè)且0.5 ml/min 的流速進(jìn)行SEC-HPLC分析。

結(jié)果

結(jié)果顯示在圖8a-8d和9中。

在使用山梨醇作為漲度劑在各自pH(即pH 7.5、8.0和8.5)下在低鹽組合物中重構(gòu)后，SEC-HPLC概況是穩(wěn)定的。這可能與含有150 mM NaCl的免疫原性組合物的SEC-HPLC概況形成對(duì)比，其顯示出獲得的初始概況和在25℃或30℃儲(chǔ)存后的那些之間的明顯變化。當(dāng)150 mM NaCl組合物的pH降低時(shí)，這種變化變得更加強(qiáng)烈。

在抗原性方面，可以得出同樣的結(jié)論，其中在使用山梨醇作為漲度劑在30℃下在各自pH(即pH 7.5、8.0和8.5)下在低鹽組合物中重構(gòu)長達(dá)24h后，回收率維持高度穩(wěn)定。

實(shí)施例12：本發(fā)明的免疫原性組合物導(dǎo)電率測(cè)定

測(cè)量一系列本發(fā)明的免疫原性組合物的導(dǎo)電率且與對(duì)照氯化鈉溶液的導(dǎo)電率和含有常規(guī)量氯化鈉的免疫原性組合物進(jìn)行比較。

方法

通過在注射用水中稀釋從1500 mM氯化鈉原液制備一系列氯化鈉濃度為0、75、100、150、250和300 mM的標(biāo)準(zhǔn)品。

根據(jù)實(shí)施例9中提供的程序使用具有兩個(gè)N末端His殘基的M72制備免疫原性組合物。為了研究來自抗原本身和純化的容積物中任何剩余材料的貢獻(xiàn)，還通過排除抗原成分而制備安慰劑凍干餅。

使用Malvern Zetasizer Nano和成倍的毛細(xì)管小室中的1.5 ml每種樣品，應(yīng)用30至150 V的電壓(通過儀器自動(dòng)測(cè)定)且測(cè)定導(dǎo)電率。

結(jié)果

氯化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的導(dǎo)電率

在圖10中提供了基于該數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)試溶液的導(dǎo)電率

從上面的數(shù)據(jù)可以看出，利用150 mM NaCl的溶液的導(dǎo)電率顯著大于最少利用NaCl的溶液的導(dǎo)電率。

純化的容積物中抗原和任何組分的影響是最小的，因?yàn)榘参縿┲苿┡c它們的含有Rv1196相關(guān)抗原的對(duì)應(yīng)物具有相當(dāng)?shù)膶?dǎo)電率。

實(shí)施例13：本發(fā)明的免疫原性組合物的免疫原性測(cè)試

本實(shí)施例的目的在于確定為了改進(jìn)蛋白穩(wěn)定性，改變制劑以減少本發(fā)明的免疫原性組合物中鹽的量是否對(duì)體內(nèi)免疫原性具有影響。

方法

評(píng)價(jià)四種免疫原性組合物：

1. 具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 pH 8.5/ASA (150 mM NaCl – 2)

2. 具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 pH 8.5/ASA (山梨醇 – 2)

3. 具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 pH 8/ASA (山梨醇 – 2)

4. 具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 pH 7.5/ASA (山梨醇 – 2)

在C57BL/6小鼠中評(píng)價(jià)含有這些抗原的組合物的免疫原性。對(duì)于四種組合物中的每一種，用50 ul佐劑溶液中的1 ug抗原(通過實(shí)施例11中提供的程序制備)在第0天、第14天和第28天肌內(nèi)注射30只C57BL/6小鼠3次。在最后免疫后6天(6dPIII)測(cè)量引起的M72特異性T細(xì)胞應(yīng)答(CD4和CD8)。

對(duì)于M72特異性細(xì)胞應(yīng)答的測(cè)定，從30只小鼠/組收集外周血淋巴細(xì)胞且合并(5只小鼠的6份合并物/組)。進(jìn)行紅血細(xì)胞裂解，然后將細(xì)胞體外鋪板。用一組覆蓋M72序列(沒有N末端His殘基)的重疊肽(具有11個(gè)氨基酸重疊的15聚體肽，1 ug/ml/肽)將細(xì)胞在體外再刺激。使用培養(yǎng)基中剩余的細(xì)胞(無肽刺激)來確定背景響應(yīng)。與肽合并物共培養(yǎng)后兩個(gè)小時(shí)，將布雷菲德菌素A添加至孔中(以抑制細(xì)胞因子分泌)，且將細(xì)胞在4℃儲(chǔ)存過夜。隨后針對(duì)下列標(biāo)記將細(xì)胞染色：CD4、CD8、IL-2、IFN-γ和TNF-α。

結(jié)果

圖11和12中的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)分別代表在第三次免疫后六天來自5只小鼠的外周血淋巴細(xì)胞的合并物的減去背景的M72特異性CD4或CD8 T細(xì)胞應(yīng)答。應(yīng)答表示為對(duì)M72肽合并物刺激應(yīng)答的產(chǎn)生IFN-γ和/或IL-2和/或TNF-α的CD4 T細(xì)胞的百分比。條代表每個(gè)組的應(yīng)答的中值。

圖11和12中的結(jié)果顯示，在用每種試驗(yàn)制劑3次免疫后誘導(dǎo)了相當(dāng)?shù)腃D4和CD8 T細(xì)胞應(yīng)答。因此，可以得出結(jié)論，本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的鹽量的降低沒有導(dǎo)致誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答的妥協(xié)。

實(shí)施例14：在pH 6.1和8.0的具有CaCl₂或MgSO₄的包含M72的組合物中研究“鹽析”。

為了研究其他鹽對(duì)M72抗原穩(wěn)定性的影響，用一系列濃度的CaCl₂或MgSO₄且在不同pH水平制備溶液。目視檢查被用作穩(wěn)定性的讀出值。

方法

將純化的大量抗原(具有兩個(gè)N末端His殘基的M72，SEQ ID No:7)在兩種含有指定量鹽(0 mM; 150 mM或300 mM NaCl; 40 mM, 80 mM或160 mM CaCl₂; 87.5 mM, 175 mM或430 mM MgSO₄)的緩沖液(10mM琥珀酸鹽緩沖液，pH 6.1和10 mM Tris緩沖液，pH 8.0)中稀釋至100 ug/ml的濃度。

樣品在制備后直接進(jìn)行分析。

使用Mettler Toledo導(dǎo)電率儀和未硅化處理的玻璃小瓶中的6 ml每份樣品，測(cè)定導(dǎo)電率。

結(jié)果

結(jié)果表明，含有Rv1196相關(guān)抗原的溶液可以對(duì)除氯化鈉以外的鹽是敏感的。CaCl₂或MgSO₄的影響似乎比對(duì)于相當(dāng)濃度或?qū)щ娐实穆然c更加明顯。

實(shí)施例15：在pH 6.1、7.5和8.5的具有不同鹽濃度的包含Mtb72f的組合物中研究“鹽析”。

研究如大小所評(píng)價(jià)的氯化鈉濃度和pH對(duì)Mtb72f抗原穩(wěn)定性的影響。

方法

將純化的大量抗原(具有6個(gè)His殘基的Mtb72f，SEQ ID No:11)在三種含有0、150和450 mM的最終氯化鈉濃度的不同緩沖液(10mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.1，20mM Tris緩沖液，pH 7.5和20mM Tris緩沖液，pH 8.5)中稀釋至100 ug/ml的濃度。

在分析之前，樣品在4℃或25℃儲(chǔ)存24小時(shí)。

使用從Thermo Fischer Scientific 獲得的Nepheloskan? Ascent進(jìn)行濁度測(cè)定。在從Corning Inc (USA)獲得的UV 透明Costar?微板中進(jìn)行分析。

結(jié)果

該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)于圖13和14中。

DLS和濁度測(cè)定法都表明Mtb72f以與前面實(shí)施例中所示的M72相似的方式對(duì)鹽濃度和pH敏感的總趨勢(shì)。因此，本發(fā)明的益處適用于Rv1196相關(guān)抗原，而不僅僅是Rv1196序列本身。

在許多DLS樣品的情況下，儀器測(cè)定無法確定特定的顆粒大小(在圖14中顯示為NV)。

實(shí)施例16：使用山梨醇作為漲度劑在包含M72、免疫刺激劑的組合物中防止“鹽析”

為了比較含有150 mM NaCl的免疫原性組合物與使用山梨醇作為漲度劑的組合物的穩(wěn)定性，使用可替代的ELISA監(jiān)測(cè)樣品。

方法

如實(shí)施例11中所述制備凍干餅(具體而言方法(a)，使得當(dāng)與來自實(shí)施例7的適當(dāng)?shù)淖魟┲苿┫嘟M合時(shí)，將獲得8.5的pH。

用625 ul實(shí)施例7中制備的佐劑溶液重構(gòu)上述的凍干餅。用佐劑溶液重構(gòu)后，獲得下列免疫原性組合物：

(i)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 – ASA(150 mM NaCl – 2) pH 8.5

10 ug抗原(20 ug/ml)

5% w/v蔗糖

40 mM Tris

0.02% w/v Tween80

500 ug DOPC

125 ug膽固醇

25 ug 3D-MPL

25 ug QS21

150 mM NaCl

10 mM磷酸鹽

pH 8.5

(ii)具有兩個(gè)N末端His殘基的M72 – ASA(山梨醇– 2) pH 8.5

10 ug抗原(20 ug/ml)

5% w/v蔗糖

40 mM Tris

0.02% w/v Tween80

500 ug DOPC

125 ug膽固醇

25 ug 3D-MPL

25 ug QS21

5 mM NaCl

4.7% w/v山梨醇

10 mM磷酸鹽

pH 8.5。

在30℃儲(chǔ)存(T24h)后表征上述重構(gòu)的免疫原性組合物且與臨時(shí)制備的樣品(T0)進(jìn)行比較。

通過間接夾心ELISA定量抗原性，其中抗原通過M72特異性兔多克隆抗體捕獲且隨后通過M72(Mtb39)特異性小鼠單克隆抗體顯現(xiàn)。簡(jiǎn)而言之，將板用在Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水中1/8000稀釋的抗-M72兔多克隆抗體在4℃包被過夜，且洗滌四次后將板用飽和緩沖液(PBS, 0.1% Tween 20, 1% BSA)在37℃封閉1小時(shí)。洗滌步驟后，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(M72純化容積物：1950 ug/ml)、內(nèi)部對(duì)照(M72：1768 ug/ml)和樣品以約0.25μg/ml的濃度上樣至板的第一列中的孔，且然后從孔1到12在飽和緩沖液(PBS, 0.025% Tween 20)中進(jìn)行2倍系列稀釋，且在37℃下孵育1h30。在洗滌步驟之后，然后免疫復(fù)合物在飽和緩沖液(PBS, 0.025% Tween 20)中與1/1000稀釋的抗M72小鼠單克隆抗體在37℃孵育1h。洗滌四次后，以1/1000的稀釋度將生物素化的兔抗小鼠多克隆抗體添加至飽和緩沖液(PBS, 0.025% Tween 20)中。洗滌四次后，通過添加在飽和緩沖液(PBS, 0.025% Tween 20)中1/4000稀釋的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶而擴(kuò)增信號(hào)。洗滌四次后，通過在RT鄰苯二胺二鹽酸鹽(orthophenylene diamine dihydrochlorid, OPDA) 15min而顯現(xiàn)信號(hào)，且通過添加HCl 1M而終止反應(yīng)。顯色與結(jié)合的抗-M72抗體的量成正比，且在490 nm和620 nm進(jìn)行測(cè)量。使用PBS, 0.025% Tween 20進(jìn)行所有洗滌步驟。

所有測(cè)量值基于用于制備測(cè)試的制劑的純化的大量蛋白相對(duì)于預(yù)期抗原性表示。

結(jié)果

結(jié)果顯示在圖15中。菱形表明對(duì)于三份試驗(yàn)樣品中每一份的特定測(cè)量值，線表明平均值。

使用山梨醇作為漲度劑在30℃在pH 8.5最長達(dá)24h在低鹽組合物中重構(gòu)后，抗原回收率在很大程度上是穩(wěn)定的。在24小時(shí)后ASA(山梨醇-2)中的回收率為83.5％(T0 87.1%，意味著維持95.9％的相對(duì)抗原性)，而24小時(shí)后 ASA(NaCl-2)中的回收率為54.5%(T0 81.0%，意味著儲(chǔ)存后維持僅67.3%的相對(duì)抗原性)。

總之，實(shí)施例8首次表明由pH和NaCl濃度導(dǎo)致的對(duì)含有Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物的穩(wěn)定性的不利影響。實(shí)施例14將該工作延伸，以顯示其他鹽也可以對(duì)含有Rv1196相關(guān)抗原的免疫原性組合物的穩(wěn)定性具有不利影響，實(shí)施例10、11、12、15和16表明該影響也適用于其他序列。

用非離子漲度劑重新配制免疫原性組合物解決了抗原穩(wěn)定性問題。此外，實(shí)施例3、4、13和16表明從免疫原性制劑去除基本上所有NaCl且用作為漲度劑的山梨醇將其替代對(duì)刺激T細(xì)胞應(yīng)答沒有不利影響。

免疫原性組合物的穩(wěn)定性是關(guān)鍵的，且在制冷方法可能不容易獲得的偏僻地方時(shí)特別具有挑戰(zhàn)性。通過降低免疫原性組合物中鹽的存在，本發(fā)明人已經(jīng)能夠降低當(dāng)儲(chǔ)存免疫原性組合物時(shí)觀察到的變化的程度。

在整個(gè)說明書和隨附權(quán)利要求書中，除非上下文另外需要，用語“包含(comprise)”及其變體“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將理解為暗示包含所述整數(shù)、節(jié)距、整數(shù)組或節(jié)距組，但不排除任意其他的整數(shù)、節(jié)距、整數(shù)組或節(jié)距組。

本文引用的所有文獻(xiàn)，包括專利和專利申請(qǐng)完整地通過引用并入。

序列表

<110> GlaxoSmithKline Biologicals sa

Godart, Stephane

Laanan, Amina

Lemoine, Dominique

<120> 分枝桿菌抗原組合物

<130> VB64442A

<150> US61/422723

<151> 2010-12-14

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> 結(jié)核分枝桿菌H37Rv

<400> 1

Met Val Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met

1 5 10 15

Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Gln Met Trp

20 25 30

Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser

35 40 45

Val Val Trp Gly Leu Thr Val Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly

50 55 60

Leu Met Val Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr

65 70 75 80

Ala Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala

85 90 95

Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala

100 105 110

Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met Ile Leu Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly

115 120 125

Gln Asn Thr Pro Ala Ile Ala Val Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met

130 135 140

Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala

145 150 155 160

Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr

165 170 175

Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser

180 185 190

Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leu Met Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu

195 200 205

Gln Gln Leu Ala Gln Pro Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu

210 215 220

Gly Gly Leu Trp Lys Thr Val Ser Pro His Arg Ser Pro Ile Ser Asn

225 230 235 240

Met Val Ser Met Ala Asn Asn His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly Val

245 250 255

Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser Ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala

260 265 270

Ala Ala Ala Gln Ala Val Gln Thr Ala Ala Gln Asn Gly Val Arg Ala

275 280 285

Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly

290 295 300

Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val

305 310 315 320

Pro Gln Ala Trp Ala Ala Ala Asn Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg

325 330 335

Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly

340 345 350

Gln Met Leu Gly Gly Leu Pro Val Gly Gln Met Gly Ala Arg Ala Gly

355 360 365

Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu Arg Val Pro Pro Arg Pro Tyr Val Met

370 375 380

Pro His Ser Pro Ala Ala Gly

385 390

<210> 2

<211> 1173

<212> DNA

<213> 結(jié)核分枝桿菌H37Rv

<400> 2

atggtggatt tcggggcgtt accaccggag atcaactccg cgaggatgta cgccggcccg 60

ggttcggcct cgctggtggc cgcggctcag atgtgggaca gcgtggcgag tgacctgttt 120

tcggccgcgt cggcgtttca gtcggtggtc tggggtctga cggtggggtc gtggataggt 180

tcgtcggcgg gtctgatggt ggcggcggcc tcgccgtatg tggcgtggat gagcgtcacc 240

gcggggcagg ccgagctgac cgccgcccag gtccgggttg ctgcggcggc ctacgagacg 300

gcgtatgggc tgacggtgcc cccgccggtg atcgccgaga accgtgctga actgatgatt 360

ctgatagcga ccaacctctt ggggcaaaac accccggcga tcgcggtcaa cgaggccgaa 420

tacggcgaga tgtgggccca agacgccgcc gcgatgtttg gctacgccgc ggcgacggcg 480

acggcgacgg cgacgttgct gccgttcgag gaggcgccgg agatgaccag cgcgggtggg 540

ctcctcgagc aggccgccgc ggtcgaggag gcctccgaca ccgccgcggc gaaccagttg 600

atgaacaatg tgccccaggc gctgcaacag ctggcccagc ccacgcaggg caccacgcct 660

tcttccaagc tgggtggcct gtggaagacg gtctcgccgc atcggtcgcc gatcagcaac 720

atggtgtcga tggccaacaa ccacatgtcg atgaccaact cgggtgtgtc gatgaccaac 780

accttgagct cgatgttgaa gggctttgct ccggcggcgg ccgcccaggc cgtgcaaacc 840

gcggcgcaaa acggggtccg ggcgatgagc tcgctgggca gctcgctggg ttcttcgggt 900

ctgggcggtg gggtggccgc caacttgggt cgggcggcct cggtcggttc gttgtcggtg 960

ccgcaggcct gggccgcggc caaccaggca gtcaccccgg cggcgcgggc gctgccgctg 1020

accagcctga ccagcgccgc ggaaagaggg cccgggcaga tgctgggcgg gctgccggtg 1080

gggcagatgg gcgccagggc cggtggtggg ctcagtggtg tgctgcgtgt tccgccgcga 1140

ccctatgtga tgccgcattc tccggcggcc ggc 1173

<210> 3

<211> 391

<212> PRT

<213> 結(jié)核分枝桿菌F11

<400> 3

Met Val Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met

1 5 10 15

Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Lys Met Trp

20 25 30

Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser

35 40 45

Val Val Trp Gly Leu Thr Val Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly

50 55 60

Leu Met Val Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr

65 70 75 80

Ala Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala

85 90 95

Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala

100 105 110

Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met Ile Leu Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly

115 120 125

Gln Asn Thr Pro Ala Ile Ala Val Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met

130 135 140

Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala

145 150 155 160

Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr

165 170 175

Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser

180 185 190

Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leu Met Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu

195 200 205

Gln Gln Leu Ala Gln Pro Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu

210 215 220

Gly Gly Leu Trp Lys Thr Val Ser Pro His Arg Ser Pro Ile Ser Asn

225 230 235 240

Met Val Ser Met Ala Asn Asn His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly Val

245 250 255

Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser Ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala

260 265 270

Ala Ala Ala Gln Ala Val Gln Thr Ala Ala Gln Asn Gly Val Arg Ala

275 280 285

Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly

290 295 300

Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val

305 310 315 320

Pro Gln Ala Trp Ala Ala Ala Asn Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg

325 330 335

Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly

340 345 350

Gln Met Leu Gly Gly Leu Pro Val Gly Gln Met Gly Ala Arg Ala Gly

355 360 365

Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu Arg Val Pro Pro Arg Pro Tyr Val Met

370 375 380

Pro His Ser Pro Ala Ala Gly

385 390

<210> 4

<211> 1173

<212> DNA

<213> 結(jié)核分枝桿菌F11

<400> 4

atggtggatt tcggggcgtt accaccggag atcaactccg cgaggatgta tgccggcccg 60

ggttcggcct cgctggtggc cgccgcgaag atgtgggaca gcgtggcgag tgacctgttt 120