專利名稱：抗原組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的適于胃腸道外和粘膜給藥的抗原組合物，它包含在水性介質(zhì)中的抗原和糖類，其中的糖類呈現(xiàn)其具有酸性部分的衍生物形式，優(yōu)選以羧酸衍生物的形式存在。抗原組合物呈現(xiàn)穩(wěn)定的固體形式，在加入液體賦形劑和佐劑進行重建后，經(jīng)過胃腸道外和粘膜給藥，可在體液中快速溶解，從而釋放重建的疫苗進入人體。特別地，凍干制劑由含有抗原的粉末或餅狀物組成，優(yōu)選呈現(xiàn)無定形物狀態(tài)(玻璃狀)，通過干燥或升化，優(yōu)選通過冷凍干燥來升化液體溶液或懸浮液而得到這種制劑。
當(dāng)前，在制藥領(lǐng)域中，人們對能確保加工和貯藏時期蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的制劑很關(guān)注。含水液體制劑是在制造過程中最容易也是最經(jīng)濟和易于操作的，也很方便的適于最終用戶使用?？墒?，在液體制劑中發(fā)生化學(xué)或物理降解是普遍發(fā)生的現(xiàn)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的破壞，例如化學(xué)變性和降解，而這經(jīng)常是不可逆的。
這些問題可以通過穩(wěn)定的蛋白質(zhì)混合物的干燥固體，尤其是(但不是唯一的)穩(wěn)定的凍干蛋白質(zhì)混合物來克服。穩(wěn)定的凍干制劑及其在制備過程中已經(jīng)出現(xiàn)的問題已有所描述(Carpenter，J.1997，Pharmaceutical Res.14，969-975)。這種制劑必須是能保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、所屬產(chǎn)品的構(gòu)型、產(chǎn)品強度(特別是對于胃腸道外給藥)，和呈現(xiàn)優(yōu)美的餅狀物結(jié)構(gòu)。相似的考慮也適于其他固體制劑，例如真空干燥的或噴霧干燥的粉末。必須重視幾個必要條件，其中重要的一個是保證等滲性，這對于用于胃腸道外給藥是關(guān)鍵的，特別是蛋白質(zhì)質(zhì)量較低時，以疫苗制劑為例，每瓶包含大約50μg的蛋白質(zhì)，總量大約15mg。鹽特別是NaCl，用于調(diào)節(jié)混合物的等滲性，但是因為其降低了溶液的凝固點，使制劑變得很難凝固(由于很低的凝固點)，同時增加升華時去除水分的時間。多元醇和糖類，例如甘露醇或乳糖已被成功地用于獲得等滲性混合物的餅狀物(M.C.Lai和E.M.Topp，J.of Pharm.Sci.，1999，88，489-500)。
當(dāng)混合物含有高濃度的鹽時，在凍干過程中出現(xiàn)了一個重要問題，例如在高濃度鹽溶液中純化蛋白質(zhì)時。另外，在一些情況下，蛋白質(zhì)也需要高鹽濃度以保持在溶液中和/或避免出現(xiàn)聚結(jié)和沉淀現(xiàn)象。當(dāng)鹽是NaCl時更容易出現(xiàn)這些問題，這是因為溶液中的NaCl使共晶熔點降低和使制劑難于完全凍干。
一些方案被推薦使用，但不是都很滿意。糖類濃度的增加與以下幾方面相關(guān)，i)滲透壓增加，ii)與胃腸道外給藥的不相容性，和iii)自身重建的問題，例如當(dāng)重建液體自身已是等滲的時。其他可選擇的，向制劑中加入少量的甘露醇使結(jié)晶變得容易，使制劑成堅固的結(jié)晶網(wǎng)狀的餅狀物(Kim，A.等J.Pharmaceutical Sc.1998，87，931-935)。不能適用于很高濃度的鹽溶液中，例如高于15mM到大約30mM的NaCl。向制劑中加入高分子量的非生物降解性聚合物質(zhì)(如Taylor，L.和Zographi，G.，在J.Pharmaceutical Sc.1998，87，1615-1621中所描述的)，要考慮到與藥物組合物的不相容性或疫苗的安全性問題。
本發(fā)明為這些制劑提供了一種選擇，它沒有上面所說的缺點。本發(fā)明在于發(fā)現(xiàn)了可在高鹽濃度下貯存的具有穩(wěn)定固體形式的抗原組合物，而高濃度的鹽通常會妨礙具有可接受結(jié)構(gòu)的干燥粉末或凍干餅狀物的形成。具體而言，本發(fā)明在于發(fā)現(xiàn)了可與含有高濃度NaCl(尤其高于30mM)的抗體組合物的干燥或凍干物相配伍的適宜賦形劑(即填充劑)。盡管本發(fā)明所用的賦形劑或填充劑帶有離子電荷，但仍是有利的，在高濃度的鹽存在下，它們有助于增強填充劑分子之間的分子間作用，從而形成餅狀制劑并長時間保持穩(wěn)定。
本發(fā)明更進一步地提供了固體形式的抗原組合物，例如凍干的、噴霧干燥的或噴霧冷凍干燥的或真空干燥形式和重建的液體形式。依照本發(fā)明，更進一步地提供了制備本發(fā)明的組合物的工藝包括混合組合物的成分，和冷凍這些成分和干燥冷凍后的混合物，或?qū)⒒旌衔飮婌F(例如在熱空氣中)，或?qū)⒒旌衔镎婵崭稍?，或噴霧冷凍干燥。
在一個實施方案中，本發(fā)明的固體制劑是凍干的多孔形式，稱為“餅狀物”，或其磨碎形式，該制劑在處理和貯存過程中是穩(wěn)定的，與胃腸道外給藥相容并只有很少的殘留水分。本發(fā)明的疫苗餅狀物是通過升華疫苗的水溶液或懸浮液而形成的，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中升華是通過冷凍干燥進行的。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的固體制劑是干燥的粉末，特別是噴霧干燥或噴霧冷凍干燥或真空干燥的粉末，其中含有較低的殘留水分。
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個目的是提供新的適合冷凍干燥、噴霧干燥或真空干燥的抗原組合物，其中含有在水性介質(zhì)中的抗原、糖類或其具有酸性部分(moiety)的衍生物和任選的防腐劑。在一個優(yōu)選的實方案中，水溶性抗原介質(zhì)包含濃度至少為15mM，優(yōu)選至少30mM的NaCl。代表性的水溶性抗原溶液或懸浮液將是經(jīng)緩沖的，或pH值被調(diào)節(jié)到與胃腸道外或粘膜給藥相一致的pH。優(yōu)選的固體制劑包括至少一種抗原，其含量按重量計為約0.00001％到約5％。更優(yōu)選抗原的量按重量計為約0.001％到約1％。還更優(yōu)選抗原的量按重量計為約0.01％到約0.05％。典型地，溶液中NaCl的濃度范圍為約15mM到約150mM。優(yōu)選NaCl的濃度至少為20mM，更優(yōu)選至少為約30mM。填充材料(bulking material)按重量計為約50％到約99.99999％，優(yōu)選為從60％到約90％。
本發(fā)明的填充劑在高濃度的NaCl存在下可保持餅狀物的化學(xué)和物理的穩(wěn)定性，防止餅狀物萎縮。也提供對于抗原的保護。填充劑是糖類或它們的衍生物，優(yōu)選為無定形或結(jié)晶態(tài)，更優(yōu)選無定形。依照本發(fā)明，優(yōu)選的糖類是糖類或其具有很高分子間相互作用力的衍生物(糖類的熔點越高，晶體的分子間相互作用力越大)，從而可以獲得固體形式，特別是餅狀物結(jié)構(gòu)，來對抗在冷凍干燥過程中出現(xiàn)的坍塌現(xiàn)象。優(yōu)選使用高分子量的糖類。
糖類衍生物優(yōu)選具有反應(yīng)性官能團，例如氨基部分或酸性部分。因此，本發(fā)明優(yōu)選使用具有酸性部分，也就是作為質(zhì)子供體的部分的糖類衍生物。酸性部分可以是單酸或多酸。可以提到的特別的酸性部分包括-O-P(O)(OH)2(磷酸酯)、-O-P(O)-O-P(O)(OH)2(二磷酸酯)、-O-P(O)-O-P(O)-O-P(O)(OH)2(三磷酸酯)、-SO4H(硫酸酯)和-CO2H(羧酸)。優(yōu)選的酸性部分是羧酸。糖類衍生物可任選與糖類例如蔗糖聯(lián)合使用。
糖類或糖類衍生物可任選地是一水化合物或多水化合物(二水化合物、三水化合物等)。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所用的糖類是其羧酸衍生物的形式。優(yōu)選地，是以其羧酸鹽的衍生物的形式來使用。因此，本發(fā)明的一方面提供了適于冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧冷凍干燥或真空干燥的抗原組合物，其中包括在水性介質(zhì)中的抗原、糖類和任選的防腐劑，其中糖類是以其羧酸衍生物形式存在。
更優(yōu)選所使用的糖類衍生物是其鹽形式，優(yōu)選鈣或鈉鹽，更優(yōu)選為鈉鹽。
適于本發(fā)明的糖類的非限制性例子包括下面物質(zhì)的羧酸衍生物蔗糖，麥芽糖，海藻糖，棉子糖，乳糖，果糖，半乳糖，甘露糖，麥芽酮糖，異麥芽酮糖，半乳糖果糖，或右旋糖。優(yōu)選的填充劑是乳糖醇，山梨糖醇，葡萄糖，半乳糖和半乳糖醇即乳糖酸，葡糖酸，葡糖醛酸，半乳糖醛酸，和半乳糖二酸的羧酸衍生物。可以是它們的無水或水合形式(見表1)。甚至更優(yōu)選的，可優(yōu)選使用乳糖酸(如

圖1所示)、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸，更優(yōu)選地，是有利于形成糖-糖分子間相互作用的鹽形式。鈉或鈣鹽是優(yōu)選的。最優(yōu)選的填充劑是乳糖醛酸鈉。典型地，所使用的糖類衍生物的濃度大約為80mM或更高(冷凍干燥之前的液體混合物)。這樣就可提供可接受的餅狀物結(jié)構(gòu)并使其長期保持穩(wěn)定。
表1.糖類及其羧酸及鹽類衍生物表1顯示，與相應(yīng)的非離子型分子相比，在離子型分子的晶狀固體晶疇中，分子和分子間的相互作用力較高(由很高的熔點來證明)。
任何可接受的餅狀物結(jié)構(gòu)是指符合任何，優(yōu)選符合所有的下列標(biāo)準-餅狀物的體積與冷凍干燥步驟前的初始液體體積相似；-餅狀物的大小(size)與冷凍干燥之前的液體相似。換句話說，與冷凍干燥之前最初的液體相比餅狀物僅出現(xiàn)盡可能少量的收縮。
-餅狀物的外觀呈均質(zhì)性(homogeous)。
餅狀物的尺寸和體積的測量依照下面實施例部分第3.2段所描述的方法進行。
此外，可接受的餅狀物結(jié)構(gòu)也可理解為經(jīng)過一星期37℃的加速穩(wěn)定試驗后其形狀、尺寸和顏色沒有變化的團塊，或者經(jīng)過至少六個月的實時穩(wěn)定性試驗(優(yōu)選至少一年，理想的是至少兩年)其形狀、尺寸和顏色無任何變化的團塊。
防腐劑選自抗氧化劑、自由基清除劑和還原劑。優(yōu)選為抗氧化劑，例如沒食子酸烷基酯，丁基化的羥基茴香醚，丁基化的羥基甲苯，去甲二氫愈創(chuàng)木酸和生育酚，抗壞血酸，異抗壞血酸，亞硫酸的鉀和鈉鹽，甲醛合次硫酸鈉，檸檬酸，乙二胺四乙酸和它的鹽，卵磷脂，酒石酸，硫二丙酸。
可以使用制藥領(lǐng)域中任何普通的冷凍干燥、真空干燥或噴霧干燥、噴霧冷凍干燥技術(shù)來制備本發(fā)明的抗原組合物。例如，冷凍干燥技術(shù)和其他合適的賦形劑的詳細資料，可參見Cameron等，″Good Pharmaceutical freeza-dryingPractice″，Interpharm，Buffalo Grove(1997)。相應(yīng)地，本發(fā)明另一方面提供在此所定義的抗原組合物的制備方法，包括混合含有NaCl抗原的溶液、填充劑和任選的緩沖溶液和防腐劑，然后冷凍干燥、真空干燥或噴霧干燥、噴霧冷凍干燥所得的混合物。盡管本發(fā)明方法包括在環(huán)境溫度下的蒸發(fā)作用，依照本發(fā)明的優(yōu)選方法是玻瓶冷凍干燥方法。例如，在一個工藝中，包括將無菌過濾的抗原組合物無菌填充到無菌玻瓶中，接著通過冷凍干燥進行升華。將無菌的冷凍干燥用的橡皮塞部分插入玻瓶中，然后，將玻瓶冷凍，舉例來說，溫度從-195.8℃到-5℃，優(yōu)選在-80℃到-10℃之間，然后在冷凍狀態(tài)下進行真空干燥。在干燥之后，在從冷凍干燥裝置取出玻瓶之前，完全插入塞子。
依照本發(fā)明的一個優(yōu)選方法是噴霧干燥方法，采用或不采用同軸加壓空氣(或惰氣)，通過噴霧噴嘴用泵輸送液體組合物來獲得很小的組合物液滴。這樣的液滴在大量通氣的區(qū)域形成(溫度在+20℃到+250℃之間)，這樣通過蒸發(fā)作用獲得快速干燥，在通過旋風(fēng)分離器分離后獲得干燥的粉末。
依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選方法是噴霧冷凍干燥方法，采用或不采用同軸加壓空氣(或惰氣)，通過噴霧噴嘴用泵輸送液體組合物來獲得很小的組合物液滴。這樣的液滴在很冷的室中形成(溫度在-5℃到-195.8℃之間)，這樣獲得對液滴的快速冷凍，在隨后的標(biāo)準冷凍干燥過程后獲得干燥的冷凍物。
依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選方法是真空干燥方法。這一方法包括將組合物的無菌濾過溶液無菌填充到無菌玻瓶中。將無菌的冷凍干燥用的橡皮塞部分插入玻瓶，然后對玻瓶施加受控的真空進行蒸發(fā)，一直到最后干燥。在從冷凍干燥設(shè)備取出玻瓶之前，完全插入塞子。
對冷凍干燥或烘干過程加以控制，以保證餅狀物中的殘留水分的濃度小于3％，優(yōu)選小于2％，更優(yōu)選為大約1％或更低。包封于其中的抗原在給藥中保持生物學(xué)的活性，也就是說能夠誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)?？梢灶A(yù)見的是，本發(fā)明的組合物可用于配制來源廣泛的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括人、細菌、或病毒的核酸，病原體衍生的抗原或抗原制品，腫瘤來源的抗原或抗原制品，宿主衍生的抗原，包括GnRH和IgE肽，重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽，和嵌合體融合蛋白。
優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗制劑包含能引起抗人病原體的免疫反應(yīng)的抗原或抗原組合物，所說的抗原或抗原組合物源自HIV-1(例如Tat、nef、gp120或gp160)，人類皰疹病毒例如gD或它的衍生物或即刻早期蛋白(例如來自HSVl或HSV2的ICP27)，巨細胞病毒((尤其是人類)(例如gB或它的衍生物)，EB病毒(例如gp350或它的衍生物)，水痘-帶狀皰疹病毒(例如gpI、II和IE63)，或者來自于肝炎病毒例如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或它的衍生物)，甲型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或來自其他的病毒病原體例如副粘病毒呼吸道合胞病毒(例如F和G蛋白或它的衍生物)，副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16、18，..)，蟲媒病毒(例如黃熱病病毒、登革熱病毒、蜱傳播的腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒(全部存活或滅活的病毒，裂解流感病毒，生長在雞蛋或MDCK細胞中，或Vero細胞或全流感病毒體(例如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所描述的)或純化或其重組蛋白，例如HA、NP、NA、或M蛋白，或它們的組合)，或衍生于細菌性病原體例如奈瑟氏菌屬，包括淋病奈瑟氏菌和髓膜炎奈瑟氏菌(例如莢膜多糖和它的軛合物，轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白，乳鐵蛋白結(jié)合蛋白，Pilc，粘附素)；致熱螺旋體(例如M蛋白或其片段，C5A蛋白酶，脂磷壁酸)，S.agalactiae，S.mutans；H.ducreyi；莫拉氏菌屬，包括粘膜炎莫拉氏菌，也已知為卡他布蘭漢氏球菌(例如高和低分子量的細菌細胞表面配基和玻璃酸酶)；博德特氏菌屬，包括百日咳博德特氏菌(例如百日咳桿菌粘附素，百日咳毒素或它們的衍生物，如絲狀的紅血球凝聚素，腺苷酸環(huán)化酶，噬菌體傘毛)，副百日咳博德特氏菌和支氣管膿毒素博德特氏菌；分枝桿菌屬，包括結(jié)核病分枝桿菌(例如ESAT6，抗原85A，-B或-C)，牛分枝桿菌，麻風(fēng)分枝桿菌，M.avium，副結(jié)核分枝桿菌，齒垢分枝桿菌；軍團桿菌屬，包括嗜肺軍團菌；埃希氏桿菌屬，包括腸源性結(jié)腸埃希氏桿菌屬(例如定居因子，不耐熱毒素或它們的衍生物，耐熱毒素或它的衍生物)，腸出血性大腸桿菌，致病性大腸桿菌(例如志賀樣毒素或它的衍生物)；弧菌屬，包括霍亂弧菌例如霍亂毒素或它的衍生物)；志賀氏菌屬，包括索氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、弗氏志賀氏菌；耶爾森菌屬，包括結(jié)腸耶爾菌素(例如Yop蛋白)，黑死病耶爾菌素，偽肺結(jié)核耶爾菌素；彎曲桿菌屬，包括空腸彎曲桿菌(例如毒素、粘附素和透明質(zhì)酸酶)和結(jié)腸彎曲桿菌；沙門氏菌屬，包括傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌，李斯特菌屬，包括產(chǎn)單核細胞李斯特菌；螺桿菌屬，包括幽門螺桿菌(例如尿素酶，過氧化物酶，形成空泡的毒素)；假單胞菌屬，包括銅綠假單胞菌；葡萄球菌屬，包括金黃色葡萄球菌，上皮葡萄球菌；腸道球菌屬，包括糞腸球菌、屎腸球菌；梭菌屬，包括破傷風(fēng)梭菌(例如破傷風(fēng)毒素和它的衍生物)，肉毒梭菌(例如肉毒桿菌毒素和它的衍生物)，艱難梭菌(例如梭菌毒素A或B和它們的衍生物)；桿菌屬，包括炭疽桿菌(例如肉毒桿菌毒素和它的衍生物)；棒狀桿菌屬，包括白喉棒桿菌(例如白喉毒素和它的衍生物)；包柔氏螺旋體屬，包括布氏疏螺旋體(例如OspA、OspC、ObpA、DbpB)，嘎氏疏螺旋體(例如OspA、OspC、ObpA、DbpB)，安德森疏螺旋體(例如OspA、OspC、ObpA、DbpB)，赫氏蜱疏螺旋體；埃里希氏體屬，包括馬埃利希氏體和人類細胞性埃利希體病試劑；立克次體，包括立氏立克次體；衣原體屬，包括砂眼衣原體(例如MOMP，肝素結(jié)合蛋白)，肺炎衣原體(例如MOMP，肝素結(jié)合蛋白)，鸚鵡熱衣原體；細螺旋體屬，包括問號鉤端螺旋體；密螺旋體屬，包括蒼白密螺旋體(例如罕見外膜蛋白)，齒垢密螺旋體，豬痢疾密螺旋體；或者衍生自寄生蟲例如原形體，包括惡性瘧原蟲；弓形體屬，包括Tgondii(例如SAG2，SAG3，Tg34)；內(nèi)變形蟲屬，包括痢疾阿米巴；巴貝蟲屬，包括B.microti；錐蟲屬，包括T.cruzi；賈第蟲屬，包括賈第蟲屬；Leshmania spp.，包括L.major；肺囊蟲，包括P.carinii；毛滴蟲屬，包括T.vaginalis；Schisostoma spp.，包括S.mansoni，或衍生自酵母例如假絲酵母屬，包括白體假絲酵母；隱球菌屬，包括新型細球菌隱球菌，在本發(fā)明一個優(yōu)選方面，用于口服給藥的快速溶解的疫苗餅狀物不包含輪狀病毒。
優(yōu)選的細菌性疫苗包括衍生自鏈球菌屬，包括肺炎鏈球菌的抗原(例如莢膜多糖和它的軛合物PsaA、PspA，鏈球菌溶血素，膽堿結(jié)合蛋白)和蛋白抗原肺炎球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，MicrobialPathogenesis，25，337-342)，及其突變?nèi)ザ镜难苌?WO90/06951；WO99/03884)。其他優(yōu)選的細菌性疫苗包括衍生自嗜血桿菌屬的抗原，該嗜血桿菌包括流感嗜血桿菌型B(例如PRP和它的軛合物)，非可分型(non-typeable)的流感嗜血桿菌，例如OMP26，高分子量的細菌細胞表面配基，P5，P6，蛋白質(zhì)D和脂蛋白D，和絲束蛋白和絲束蛋白衍生肽(US 5,843,464)或多備份(multiple copy)形式變異體或其融合蛋白。其他優(yōu)選的細菌性疫苗包括衍生自粘膜炎莫拉氏菌(包括它的外膜囊泡，和OMP106(W097/41731))和腦膜炎奈瑟氏球菌B(包括它的外膜囊泡，和NspA(WO 96/29412)的抗原。
乙型肝炎表面抗原的衍生物是本領(lǐng)域熟知的，包括尤其是那些在歐洲專利申請EP-A-414374；EP-A-0304578，和EP 198-474中描述的PreS1、PreS2 S抗原。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面中，疫苗制劑包含HIV-1抗原、gpl20，特別是在CHO細胞中表達的抗原。在更進一步的實施方案中，本發(fā)明的疫苗制劑是包含如上文所述的gD2t。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，疫苗包含源于人乳頭瘤病毒(HPV)的抗原，它被認為是負責(zé)生殖器疣(HPV 6或HPV 11等)，和HPV病子宮頸癌的病毒(HPV16、HPV18等)。
特別優(yōu)選的預(yù)防或治療生殖器疣的疫苗形式包括LI微粒或衣殼體，和一種或多種選自HPV6和HPV 11蛋白質(zhì)E6、E7、LI和L2的抗原的融合蛋白。最優(yōu)選的融合蛋白形式是L2E7，例如在WO 96/26277披露的，和在GB9717953.5(PCT/EP98/05285)中披露的蛋白質(zhì)D(1/3)-E7。
優(yōu)選的用于預(yù)防和治療HPV子宮頸感染或癌的疫苗組合物包含HPV 16或18抗原。例如，L1或L2抗原單體，或病毒樣微粒(VLP)形式的LI或L2抗原或者單獨出現(xiàn)在VLP或病毒衣殼體結(jié)構(gòu)中的L1獨自蛋白。這樣的抗原、微粒樣病毒和病毒衣殼體是已知的。例如可以參見WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184。也可以包括單獨或作為融合蛋白形式的早期蛋白質(zhì)，例如優(yōu)選自E7、E2或E5；特別優(yōu)選的示例包括包含L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。
特別優(yōu)選的HPV16抗原包含早期蛋白E6或E7，所述E6或E7與來自HPV16的蛋白質(zhì)D載體融合形成蛋白質(zhì)D-E6或E7或它們的組合；或L2與E6或E7的組合(WO 96/26277)。另外，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可呈單一分子的形式，優(yōu)選的是蛋白質(zhì)D-E6/E7融合體。這樣的疫苗可任選地包含來自HPV18的E6和/或E7蛋白，優(yōu)選地以蛋白質(zhì)D-E6或蛋白質(zhì)D-E7融合蛋白或蛋白質(zhì)D E6/E7融合蛋白的形式。
本發(fā)明的疫苗還可以包含來自于其他HPV株的抗原，優(yōu)選來自于HPV 6、11、31、33或45株。
本發(fā)明的疫苗更進一步包含來自可引起瘧疾的寄生蟲抗原。例如，優(yōu)選的抗原來自鐮刀狀瘧原蟲包括RTS、S和TRAP。RTS是雜合體蛋白質(zhì)，其基本上包括鐮刀狀瘧原蟲的環(huán)孢(CS)蛋白的所有C-端部分，所述C-端部分通過乙型肝炎表面抗原上preS2部分的4個氨基酸與乙型肝炎病毒的表面(S)抗原結(jié)合。它的完整結(jié)構(gòu)在國際專利申請PCT/EP92/02591中被披露，(WO93/10152享有UK專利申請9124390.7的優(yōu)先權(quán))。在酵母中表達時，RTS以脂蛋白微粒形式生成，當(dāng)與來自HBV的S抗原共同表達時，形成已知的RTS、S的混合顆粒。TRAP在國際專利申請PCT/GB89/00895中被描述，公開于WO90/01496。本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案是瘧疾疫苗，其中的抗原制品包含RTS、S和TRAP抗原的組合?？赡茏鳛槎嗉壇懠惨呙绲暮蜻x成分的其他瘧原蟲抗體，包括鐮刀狀瘧原蟲MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其瘧原蟲類似物。
所述制劑也可以包含抗癌抗原，并可用于治療癌癥的免疫療法中。例如，這種佐劑制劑被發(fā)現(xiàn)可與腫瘤排異抗原一起應(yīng)用，所述腫瘤例如前列腺癌、乳癌、結(jié)腸直腸的癌、肺癌，胰癌、腎臟癌或黑素瘤癌。示例抗原包括MAGE1和MAGE3或者用于治療黑素瘤的其他MAGE抗原，PRAME，BAGE或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，628-636頁；Van den Eynde等，International Journal of Clinical & Laboratory Research(1997發(fā)表)；Correale等(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，p293。確實，這些抗原在許多腫瘤類型(例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌)中被表達。其他的腫瘤特異性抗原包括但不限于前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu，KSA(GA733)，MUC-1，PRAME，癌胚抗原(CEA)，PSCA(PNAS 95(4)1735-17401998)，PSMA，P501S(Wo98/37814中的113序列號IO)即已知為PS108或前列腺蛋白(WO 98/50567)。另一個腫瘤抗原是前列腺特異性絲氨酸蛋白酶(前列腺酶，胰蛋白酶樣)披露在Ferguson，等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，3114-3119)和國際專利申請WO 98/12302(相應(yīng)的已授權(quán)專利US 5,955,306)、WO98/20117(相應(yīng)的已授權(quán)專利US 5,840,871和US5,786,148)(前列腺特異性激肽釋放酶)和WO00/04149(P703P)。其他前列腺特異性抗原已知來自Wo98/37418，和WO/004149。另一個抗原是STEAP PNAS96 14523 145287-121999。用于本發(fā)明中的其他與腫瘤相關(guān)的抗原包括Plu-1，J Biol.Chem 274(22)15633-15645，1999；HASH-2(WO01/62778)，cripto(Salomon等Bioessays 199，21 61-70，US5654140)Criptin美國專利5 981 215。其他與治療癌癥疫苗特別相關(guān)的抗原還包括酪氨酸酶和生存素。
其他適合本發(fā)明使用的腫瘤特異性抗原包括但不限于腫瘤特異性神經(jīng)節(jié)苷脂例如GM2和GM3或其載體蛋白共軛物；或所說的抗原是自身肽激素例如完整長度的促性腺激素釋放激素(GnRH，WO 95/20600)，短的10個氨基酸肽，用于治療多種癌癥，或用于免疫去勢(immunocastration)。
可以預(yù)見的是，本發(fā)明的組合物可用于配制含有來源于疏螺旋體屬的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括核酸、病原體衍生的抗原或抗原制品、重組形成的蛋白質(zhì)或肽和嵌合體融合蛋白。特別的抗原是OspA。OspA可以是脂質(zhì)化(lipidated)形式的具有宿主細胞(E.Coli)優(yōu)點的完全成熟的蛋白，被稱為(Lipo-OspA)或者是未脂質(zhì)化的衍生物。這樣的未脂質(zhì)化的衍生物包括未脂質(zhì)化的NS1-OspA融合蛋白，其具有流感病毒上非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)和完整OspA蛋白的第一個81-N端氨基酸，而另一種MDP-OspA是非脂質(zhì)化形式的攜帶3個額外N-氨基末端氨基酸的OspA。
本發(fā)明的疫苗可以用于預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)。這樣的疫苗將包含變應(yīng)原特異性(例如Der pl)和變應(yīng)原非特異性抗原(例如源于人IgE的肽，包括但不限于stanworth十肽(EP 0 477 231B1))。
在使用過程中但是在給藥前，一般可在藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中重建本發(fā)明的組合物。藥學(xué)上可接受的稀釋劑的例子包括水和鹽水。優(yōu)選在給患者服藥前對組合物或疫苗進行重建。優(yōu)選溶解餅狀物的時間小于10秒，更優(yōu)選小于5秒，優(yōu)選小于3秒，最優(yōu)選小于1秒。
在本發(fā)明的一些實施方案中，抗原可用藥學(xué)上的載體進行配制。本發(fā)明的疫苗可使用的藥用載體包括本領(lǐng)域已知適合口服給藥的、特別適合于嬰兒的載體。
本發(fā)明的病毒也可配制于基于脂質(zhì)的載體中，例如病毒體或脂質(zhì)體、水包油乳液或載體微粒中。
有利地，其他免疫興奮劑包括皂角苷衍生物，例如QS21和單磷酸類脂A，尤其是3-去-O-?；瘑瘟姿犷愔珹(3D-MPL)。作為佐劑的純化皂角苷在WO98/56415中有所描述。皂角苷和單磷酸類脂A可單獨或結(jié)合應(yīng)用(舉例來說可見于WO 94/00153中)，也可與其他試劑一起配置在佐劑系統(tǒng)中。3D-MPL是由Ribi Iinmunochem(Montana)生產(chǎn)的佐劑，其生產(chǎn)工藝在GB 2122204有所描述。
氫氧化鋁是本發(fā)明疫苗組合物中特別優(yōu)選的成分。
本發(fā)明的抗原組合物溶液和在重建后獲得的溶液是等滲溶液。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明組合物的pH值從大約6到大約10，優(yōu)選從大約7到大約9。本發(fā)明的抗原組合物可在經(jīng)粘膜或胃腸道外，優(yōu)選胃腸道外，最優(yōu)選經(jīng)靜脈、皮下或肌肉注射給藥時重建。不管用什么方法，如果需要的話可以是其他適當(dāng)?shù)膭┬?例如鼻腔噴霧和其他粘膜制劑)。
當(dāng)供非腸道給藥時，本發(fā)明的組合物可被包裝在合適的藥用裝置，例如注射器、玻瓶或安瓿中，這樣加入稀釋劑或載體就可原位配制含有活性組分的適宜立即給予患者的水溶液形式。這樣的裝置形成了本發(fā)明的一個方面。在粘膜給藥時，凍干的或干燥的制劑可以以密封于藥用泡罩包裝中的片劑形式提供。
本發(fā)明的另一方面提供包含減毒的活細菌或病毒、或活的病毒或細菌載體的組合物，其中組合物是本發(fā)明的凍干固體或干燥固體，可在給藥時快速溶解。
可采用已知技術(shù)配制和使用本發(fā)明疫苗，其中使用適量的活病毒有效地抗感染并且對接受疫苗者沒有明顯的不良反應(yīng)?；畈《镜暮线m用量通常是每劑量104到107ffu。疫苗的典型劑量可以是每劑量包含105到106ffu，也可以在一段時間給若干劑量，例如間隔兩個月給予2個劑量。然而，可以給予2個以上的劑量，例如3或4個劑量的方法，尤其是在發(fā)展中國家。劑量的間隔期可以多于或少于兩個月?？梢酝ㄟ^對抗體滴度的標(biāo)準研究和其他對受試者有影響的反應(yīng)，來確定單/多劑量方案的最佳活病毒量、最佳給藥次數(shù)。
可對每一疫苗劑量中的蛋白質(zhì)量加以選擇，該量應(yīng)能誘導(dǎo)典型的接受疫苗者的免疫保護性反應(yīng)，但沒有明顯的不良反應(yīng)。這取決于所用的特定免疫原及其表現(xiàn)。一般地，每劑量預(yù)期包含1-1000μg的蛋白質(zhì)，優(yōu)選1-500μg，更優(yōu)選1-100μg，最優(yōu)選1到50μg。可采用觀察接受疫苗者出現(xiàn)適當(dāng)免疫反應(yīng)的標(biāo)準試驗，來確定具體疫苗的最佳用量。在最初的接種疫苗之后，受試者需要一個或多個間隔開的促升免疫。
本發(fā)明通過下列實施例進行詳細說明。
實施例I最大濃度的PO4-NaCl緩沖溶液獲得可接受的凍干餅狀物，使用標(biāo)準的冷凍干燥糖類1.1.導(dǎo)言在一個標(biāo)準的凍干循環(huán)中采用多種濃度的磷酸鹽(PO4)/NaCl緩沖溶液。
磷酸鹽-NaCl緩沖溶液可相當(dāng)于簡單的磷酸鹽緩沖液(無NaCl)。
在配制過程中，為了使每種緩沖劑經(jīng)類似稀釋后具有相當(dāng)?shù)臐B透壓(包括糖類貢獻的滲透壓)，應(yīng)對濃度加以調(diào)節(jié)。在從此以后呈現(xiàn)的本發(fā)明的表格中，存在于最終制劑中的濃度是恰好在冷凍干燥步驟之前得到的。
1.2.結(jié)果依照實施例3.2.中列出的標(biāo)準來評定餅狀物的外觀1.2.1蔗糖(3.15％)組合物
1.2.2麥芽糖(3.15％)組合物
1.2.3海藻糖(3.15％)組合物
1.2.4棉子糖(3.15％)組合物
1.2.5結(jié)論制劑中的磷酸鹽(PO4)/NaCl與冷凍干燥不相容。確實，在濃度超過2mMPO4/30mMNaCl時，所得的餅狀物結(jié)構(gòu)是不可接受的。當(dāng)采用PO4/NaCl緩沖液時，蔗糖、麥芽糖、海藻糖和棉子糖得到相同的結(jié)果。
很清楚NaCl對冷凍干燥中不好的結(jié)果負責(zé)任。確實，使用PO4(無NaCl)的緩沖液會達到高得多濃度-最高達120mM PO4，對于棉子糖-最高達90mM PO4，在蔗糖中-最高達60mM PO4，對于麥芽糖和海藻糖1.3.蔗糖分子排列有美感的外觀圖2顯示在無NaCl存在時無定形蔗糖分子排列有美感的外觀。沒有顯示殘留的水分子。
凍干的餅狀物結(jié)構(gòu)基本上是基于“糖-糖”分子相互作用構(gòu)建的。所述分子間的相互作用是分子定向、分子構(gòu)象和成分原子的原子半徑的結(jié)果。
無定形結(jié)構(gòu)(分子間的高度無序(deorder))的分子間相互作用比晶體結(jié)構(gòu)(分子間的高度有序)要弱。
比較起來，圖3顯示了在有60mMNaCl存在時，90mM蔗糖的無定形分子排列有美感的外觀。沒有顯示殘留水分子。
氯化鈉的離子相互作用干擾了“糖-糖”分子間相互作用。實施例I中的結(jié)果顯示，NaCl的存在減弱了“糖-糖”分子間相互作用。
實施例II在給定的固定PO4(4mM)-NaCl(60mM)濃度下，對能形成可接受的凍干餅狀物的幾種糖類(或賦形劑)進行評價。
這些試驗的目標(biāo)值設(shè)定在一定的PO4(6mM)-NaCl(60mM)濃度下，如實施例I所示，該NaCl濃度導(dǎo)致不可接受的凍干餅狀物結(jié)構(gòu)，通常在純化后在最終的抗原溶液中達到這個結(jié)構(gòu)。
試驗1除了常規(guī)蔗糖以外，采用具有羧酸官能團的糖類分子固結(jié)餅狀物結(jié)構(gòu)。乳糖酸如圖一所示。
試驗2使用具有羧酸官能團的糖類分子來固結(jié)餅狀物的結(jié)構(gòu)(在沒有蔗糖的情況下)。
這樣，在乳糖酸系列中，它們的鹽(Na、Ca、或Tris抗衡離子)的性質(zhì)在“糖-糖”分子間的相互作用中扮演重要角色。Tris分子較大(相對于Na)，所以將“糖類”分子彼此推開，減弱了“糖-糖”相互作用(相對于Na)。
在固定的NaCl濃度時
在遞降的NaCl濃度時
試驗3使用具有羧酸官能團的糖類分子來固結(jié)餅狀物的結(jié)構(gòu)，采用糖類的不同羧酸的衍生物。
實施例III原料和方法1.抗原組合物的制備通過無菌操作，逐步地依次加入并混合正確定量的無菌水、無菌的濃縮的糖類溶液、無菌的濃縮的緩沖液、無菌的濃縮的鹽溶液和無菌的濃縮的抗原溶液，制得配方的大量混合物。
將配制好的大量混合物分裝入適于冷凍干燥的小玻瓶中(典型地在3ml有機硅玻璃小瓶中裝有0.5ml所述混合物)。
將冷凍干燥橡皮塞放置在小瓶上(部分密封的)。
2.冷凍干燥將含有0.5ml配制好的疫苗的小瓶放置在預(yù)冷(-69℃)冷凍的干燥器(Martin-Christ或Usifroid)中，同時監(jiān)測和調(diào)節(jié)冷凍干燥條件，以盡可能遵循下述時間—溫度曲線
在真空操作結(jié)束時，通過推壓塞子將小瓶完全密封。
然后用鋁制瓶帽密封塞子。
在分析或使用前，將凍干的玻璃瓶放置在+4℃儲存。
3.對餅狀物的外觀檢查3.1.在37℃下加速的穩(wěn)定性將含有制劑的十個凍干玻瓶放置在通風(fēng)櫥(37℃)中一個星期，然后儲藏在+4℃。然后檢查餅狀物。
3.2.餅狀物檢查在對凍干的餅狀物進行冷凍干燥和加速的穩(wěn)定性試驗(在37℃7天)后，進行目檢。
測量餅狀物的尺寸來評估收縮百分率，然后依照不同類別進行分類-收縮 意思是指餅狀物的最初尺寸(高度或直徑)至少減少20％-輕微收縮 意思是指餅狀物的最初尺寸(高度或直徑)至多減少20％-合格 意思是指在凍干后和在37℃一周后餅狀物的最初尺寸(高度或直徑)至多減少20％，同時在37℃下一星期后也沒有發(fā)生顏色改變-不合格 意思是指僅僅在凍干后或者在37℃下一周后餅狀物的最初尺寸(高度或直徑)至少減少了20％，或者在37℃下一星期后發(fā)生顏色改變將刻度尺置于玻瓶底面，并通過玻璃觀測餅狀物直徑(或高度)來測量餅的側(cè)面。
4.緩沖劑選用磷酸鹽-NaCl緩沖劑(在室內(nèi)也稱為“磷酸鹽10-150”)，因為大多數(shù)抗原是在這樣的緩沖溶液中純化的。需要指出的是，我們使用NaH2PO4+K2HPO4的組合。通過稱量準確的NaH2PO4/K2HPO4的比例，以獲得所需pH值。這樣，不用HCl或NaOH來調(diào)節(jié)緩沖劑的pH值。
逐漸減少的數(shù)量在配制過程中使用0.4、0.3、0.2、0.1和0.05ml的緩沖劑。最終的填充體積總是0.5ml。
不含NaCl的選擇磷酸鹽緩沖劑，使其與磷酸鹽-NaCl緩沖劑相當(dāng)。開始是150mM的溶液，在配制過程中使用逐漸減少的數(shù)量0.4、0.3、0.2、0.1和0.05ml。
滲透壓通過Friske型1/10滲壓計來進行測量。
權(quán)利要求
1.一種適合冷凍干燥、噴霧干燥，噴霧冷凍干燥或真空干燥的抗原組合物，它含有在水性介質(zhì)中的抗原、糖類和任選的防腐劑，其中糖類呈具有酸性部分的衍生物形式。
2.如權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中所述的糖類以其羧酸衍生物形式存在。
3.如權(quán)利要求2所述的抗原組合物，其中所述的羧酸衍生物選自乳糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸或半乳糖二酸。
4.如權(quán)利要求1到3中任意一項所述的抗原組合物，其中水性介質(zhì)包含濃度至少為30mM的NaCl。
5.如權(quán)利要求1到4中任意一項所述的抗原組合物，它以經(jīng)噴霧干燥、真空干燥或冷凍干燥的形式存在。
6.如權(quán)利要求5所述的抗原組合物，它以重建的形式存在。
7.如權(quán)利要求6所述的抗原組合物，其中所述的重建的組合物中包含佐劑。
8.如權(quán)利要求7所述的抗原組合物，其中所述的佐劑選自水包油乳液、3D-MPL、CpG、QS21或它們中的兩種或更多種的混合物。
9.如權(quán)利要求1到8中任意一項所述的抗原組合物，其中所述的抗原或抗原組合物源自于下面包含下列的組人類免疫缺陷病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，單純皰疹病毒類型1，單純皰疹病毒類型2，人巨細胞病毒，登革熱病毒，甲、乙、丙或戊型肝炎病毒，呼吸道合胞病毒，人乳頭瘤病毒，流感病毒，Hib，腦膜炎病毒，沙門氏菌，奈瑟氏菌，包柔氏螺旋體菌，衣原體，博德特氏菌，瘧原蟲或弓形蟲，stanworth十肽；或與腫瘤相關(guān)的抗原(TMA)，MAGE，BAGE，GAGE，MUC-1，Her-2neu，LnRH，CEA，PSA，KSA，或PRAME，Cripto，HASH2，前列腺酶，前列腺蛋白。
10.制備權(quán)利要求1到4所述的抗原組合物的方法，包括混合組合物的成分和使混合物經(jīng)受冷凍干燥、真空干燥或噴霧干燥的過程。
11.制備權(quán)利要求4的抗原組合物的方法，包括混合組合物的成分，和冷凍這些成分并干燥冷凍后的混合物或?qū)@些成分進行噴霧。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型的適于胃腸道外和粘膜給藥的抗原組合物，包含在水性介質(zhì)中的抗原和糖類，其中的糖類呈具有酸性部分的衍生物形式，優(yōu)選呈羧酸衍生物的形式。抗原組合物呈穩(wěn)定的固體形式，在加入液體賦形劑和佐劑進行重建后，經(jīng)過胃腸道外和粘膜給藥，可在體液中快速溶解，從而釋放重建的疫苗進入人體。特別地，凍干制劑由含有抗原的粉末或餅狀物組成，優(yōu)選呈無定形物狀態(tài)(玻璃狀)，通過干燥或升化液體溶液或懸浮液得到這種制劑，優(yōu)選通過冷凍干燥來進行升化。
文檔編號A61K9/19GK1674867SQ03818902
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月13日
發(fā)明者V·范德韋爾德 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司