本發(fā)明具體涉及新材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種有機(jī)-無機(jī)雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著材料科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的飛速發(fā)展，生物醫(yī)用材料的研究取得了很大的進(jìn)步，但仍面臨各種挑戰(zhàn)，一些根本性的問題沒有解決，除了生物相容性問題，生物材料應(yīng)用的主要障礙還有感染問題。世界上約64%的院內(nèi)獲得性感染是由植入體或醫(yī)療器械上黏附病原菌引起的，如今這一比例還在進(jìn)一步提高，因此抗菌材料和制品的開發(fā)受到越來越多的關(guān)注，所以對(duì)于如何有效防止細(xì)菌粘附生物材料表面已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)課題。通過對(duì)各種醫(yī)用裝置的表面修飾，在保持原有性能的條件下，改善生物醫(yī)用裝置生物相容性成為現(xiàn)代醫(yī)療裝置應(yīng)用中的重要問題。

細(xì)菌粘附感染是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，材料表面粘附一直是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的關(guān)鍵問題。由于細(xì)胞表面存在范德華力、靜電、氫鍵、離子和親疏水等多種多樣的相互作用，粘附不可避免。粘附感染發(fā)生的一般過程是：細(xì)菌的黏附；繁殖，形成菌落；分泌胞外基質(zhì)，菌落通過胞外基質(zhì)連接在一起，形成生物膜(biofilm)，生物膜釋放浮游菌體和毒素，引發(fā)感染，也容易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性。生物膜由于其致密的物理結(jié)構(gòu)，可以制止人體免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞的吞噬作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)在生物膜內(nèi)的細(xì)菌相比自由狀態(tài)的細(xì)菌抵抗能力增加了1000倍。通過對(duì)各種醫(yī)用裝置的表面修飾，在保持原有性能的條件下，改善生物醫(yī)用裝置生物相容性成為現(xiàn)代醫(yī)療裝置應(yīng)用中的重要問題。臨床處理的方式往往是再次手術(shù)取出植入體，清洗或者更換新的植入體，這樣的處理方式不但增加病人的痛苦，而且增加病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此尋求一種簡單長效的細(xì)菌和酶響應(yīng)抗菌涂層具有重要的意義。而層層自組裝技術(shù)具有簡單、易于操作的特點(diǎn)，并且使膜層具有其組分的復(fù)合功能，通過對(duì)基材的預(yù)處理解決了涂層溶脹帶來的穩(wěn)定性問題，通過透明質(zhì)酸酶和細(xì)菌響應(yīng)的抗菌作用獲得可控釋放抗菌藥物的聚合物涂層的，并兼具抗細(xì)菌黏附和殺菌的性能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷及不足。本發(fā)明提供了一種有機(jī)-無機(jī)雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜的制備方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種有機(jī)-無機(jī)雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜的制備方法，包括以下步驟：

（1）基材的表面預(yù)處理：將洗凈的基材置于5mg/ml的聚乙烯亞胺（PEI）水溶液中，浸泡，獲得表面胺基化的基材；

（2）制備慶大霉素預(yù)負(fù)載的蒙脫土水溶液；

（3）將上述表面胺基化的基材放入慶大霉素預(yù)負(fù)載的蒙脫土水溶液中浸泡，然后用pH值相同洗液清洗，用氮?dú)獯蹈?，放入含有透明質(zhì)酸溶液浸泡6-8min，用相同pH值的洗液清洗2-3分鐘，氮?dú)獯蹈桑瓿梢粋€(gè)雙層膜的制備，重復(fù)以上操作，直到完成整個(gè)多層膜涂層的制備；

（4）以透明質(zhì)酸酶或大腸桿菌響應(yīng)抗菌獲得所述的一種有機(jī)-無機(jī)雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜涂層。

所述的基材為玻璃、石英、硅片、聚酯膜中的一種。

所述的步驟（2）制備慶大霉素預(yù)負(fù)載的蒙脫土水溶液包括以下步驟：在pH=4.0的水中，磁力攪拌，緩慢加入100mg蒙脫土，濃度為1mg/ml，磁力攪拌溶解并靜置一星期，超聲24h，緩慢加入100mg 慶大霉素，濃度為1mg/ml，繼續(xù)攪拌2h，即得蒙脫土與慶大霉素的負(fù)載液。

所述的步驟（1）中洗凈的基材置于5mg/ml的聚乙烯亞胺（PEI）水溶液中浸泡1-4h。

所述的步驟（3）中重復(fù)6、9、12或15次操作，制得6、9、12或15個(gè)雙層膜涂層的制備。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種有機(jī)-無機(jī)雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜的制備方法，本發(fā)明涂層溶液配制簡便，能實(shí)現(xiàn)無污染操作，可采用旋涂、浸涂、噴涂等可工業(yè)實(shí)現(xiàn)的方式，適用范圍廣，能夠?qū)哂袕?fù)雜體型結(jié)構(gòu)的生物醫(yī)用裝置進(jìn)行涂層修飾；涂層可改善醫(yī)用裝置表面的多種抗菌性能，潤滑性，生物相容性，在人體環(huán)境下以水凝膠的形式存在，這種性質(zhì)使生物材料表面潤滑，減少材料表面和粘膜組織之間的摩接阻力；涂層材料化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐疲勞、剪切，能適應(yīng)人體的內(nèi)環(huán)境；涂層能夠?qū)崿F(xiàn)廣譜的多功能抗菌的能力。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。

制備慶大霉素預(yù)負(fù)載的蒙脫土水溶液：

在250ml燒杯中溶于100mL水中(pH=4.0)，磁力攪拌，緩慢加入100mg蒙脫土，濃度為1mg/ml，磁力攪拌溶解并靜置一星期，超聲24h，緩慢加入100mg 慶大霉素，濃度為1mg/ml，繼續(xù)攪拌2h，即為蒙脫土與慶大霉素的負(fù)載液。

實(shí)施例1：

PET片經(jīng)刀片裁剪成1.5×2.5cm²大小，作為基材使用，用水超聲清洗，N₂吹干。用鑷子夾住清洗過的PET先在5mg/ml的PEI中處理30min，在5mg/ml的PEI中處理30min，然后浸入涂膜液中5s，取出，使表面的液體均勻覆蓋，然后放置于玻璃平板上，室溫干燥24h，然后用刀片剝離PET片，繼續(xù)真空烘箱室溫干燥12h，收集樣品。然后涂層在1mg/ml的透明質(zhì)酸中浸泡4h，得到的復(fù)合材料，然后用乙醇和清水清洗數(shù)次，室溫干燥24h。斷面場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡測(cè)試涂層的厚度為3.56±0.45μm。透射電鏡結(jié)果表明：膜層表面很低的粗糙度。

以175u單位的透明質(zhì)酸酶加入磷酸緩釋液中，慶大霉素藥物的釋放效果比僅在磷酸緩釋液的緩釋效果好。在一定溫度下，以10^4的大腸桿菌加入磷酸緩釋液中，慶大霉素藥物的釋放效果比僅在磷酸緩釋液的緩釋效果好。透明質(zhì)酸和大腸桿菌增加慶大霉素等抗菌藥物的釋放，具有透明質(zhì)酸和大腸桿菌的向影響，獲得一種有機(jī)-無機(jī)雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜涂層。搖瓶培養(yǎng)和稀釋涂平板法測(cè)試膜層的殺菌性能，結(jié)果顯示該膜層能在10min殺死100%的大腸桿菌和100%的金黃色葡萄球菌。采用MTT和FDA實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過TCPS的92%，因此具有良好的細(xì)胞相容性。

實(shí)施例2：

配制1mg/mL的負(fù)載慶大霉素的蒙脫土溶于100mL水中，磁力攪拌，測(cè)定pH值為2.5。取100ml超純水于燒杯中，調(diào)節(jié)到相同的pH值，標(biāo)為洗液1。配制1mg/mL的透明質(zhì)酸溶解于100mL水中，磁力攪拌，測(cè)定pH值為2.50。取100ml超純水于燒杯中，調(diào)節(jié)到相同的pH值，標(biāo)為洗液2。將經(jīng)過預(yù)處理以后的基材加入,負(fù)載慶大霉素的蒙脫土溶液中浸泡6~8min,取出，放入洗液1中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入透明質(zhì)酸溶液中浸泡6~8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個(gè)雙層膜的制備。分別制備6、9、12、15雙層。

斷面場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡測(cè)試涂層的厚度為3.34±0.48μm。靜態(tài)接觸角研究發(fā)現(xiàn)涂膜后親水性顯著增加。原子力顯微鏡觀察形貌發(fā)現(xiàn)表面具有很低的粗糙度，RMS為3.27±0.32 nm。利用透射電鏡觀察涂層表面，結(jié)果顯示膜層表面較均勻，涂層對(duì)大腸桿菌的有抑菌效果，產(chǎn)生抑菌環(huán)，均能在30min內(nèi)殺滅90%的濃度為10⁴ CFU/mL的金黃色葡萄球菌。搖瓶培養(yǎng)和稀釋涂平板法測(cè)試膜層的殺菌性能，結(jié)果顯示該膜層能在24 h殺死92%的大腸桿菌和100%的金黃色葡萄球菌。涂層對(duì)成纖維細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過TCPS的89%，因此具有良好的細(xì)胞相容性。

實(shí)施例3：

配制1mg/mL的負(fù)載慶大霉素的蒙脫土溶于100mL水中，磁力攪拌，測(cè)定pH值為2.5。取100ml超純水于燒杯中，調(diào)節(jié)到相同的pH值，標(biāo)為洗液1。配制1mg/mL的透明質(zhì)酸溶解于100mL水中，磁力攪拌，測(cè)定pH值為2.50。取100ml超純水于燒杯中，調(diào)節(jié)到相同的pH值，標(biāo)為洗液2。將經(jīng)過預(yù)處理以后的基材加入,負(fù)載慶大霉素的蒙脫土溶液中浸泡6~8min,取出，放入洗液1中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入透明質(zhì)酸溶液中浸泡6~8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個(gè)雙層膜的制備。分別制備6、9、12、15雙層。

以80u單位透明質(zhì)酸酶加入磷酸緩釋液中，慶大霉素藥物的釋放效果比僅在磷酸緩釋液的緩釋效果好。在一定溫度下，以10^4的大腸桿菌加入磷酸緩釋液中，慶大霉素藥物的釋放效果比僅在磷酸緩釋液的緩釋效果好。透明質(zhì)酸和大腸桿菌增加慶大霉素等抗菌藥物的釋放，具有透明質(zhì)酸和大腸桿菌的向影響，獲得一種有機(jī)-無機(jī)雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜涂層。搖瓶培養(yǎng)和稀釋涂平板法測(cè)試膜層的殺菌性能，結(jié)果顯示該膜層能在10min殺死100%的大腸桿菌和100%的金黃色葡萄球菌。采用MTT和FDA實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過TCPS的92%，因此具有良好的細(xì)胞相容性。

實(shí)施例4：

PET片經(jīng)刀片裁剪成1.5×2.5cm²大小，作為基材使用，用水超聲清洗，N₂吹干。用鑷子夾住清洗過的PET先在5mg/ml的PEI中處理30min，在5mg/ml的PEI中處理30min，然后浸入蒙脫土中6-8分鐘，使表面的液體均勻覆蓋，至于pH相同的洗液中1-2分鐘，放入透明質(zhì)酸溶液6-8分鐘，至于pH相同的洗液中1-2分鐘，得到的復(fù)合材料，用N₂吹干。至此完成一個(gè)雙層膜的制備。分別制備6、9、12、15雙層。

透射電鏡結(jié)果表明：結(jié)果顯示膜層表面較均勻，膜層表面很低的粗糙度；靜態(tài)接觸角測(cè)試膜層顯示出一定的親水性；原子力顯微鏡觀察形貌發(fā)現(xiàn)表面具有很低的粗糙度。涂層對(duì)大腸桿菌的有抑菌效果，產(chǎn)生抑菌環(huán)，搖瓶培養(yǎng)和稀釋涂平板法測(cè)試膜層的殺菌性能，結(jié)果顯示該膜層能在10min殺死100%的大腸桿菌和100%的金黃色葡萄球菌。抗細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)和響應(yīng)涂層相比，降低了100%的大腸桿菌黏附和98%的金黃色葡萄球菌的黏附。通過細(xì)菌死活染色觀察到在涂層表面，99.9%以上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌被殺死（紅色），因此可以看出涂層具有高效的殺菌作用。用MTT和FDA實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過TCPS的82%，因此具有良好的細(xì)胞相容性。涂層對(duì)成纖維細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過TCPS的89%，因此具有良好的細(xì)胞相容性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。