本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是骨組織修復(fù)材料制備技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架及其制備方法。

背景技術(shù)：

由于外傷、腫瘤切除、手術(shù)等導(dǎo)致的大塊骨缺損，常需植骨修復(fù)。傳統(tǒng)骨移植方法包括自體骨移植和異體骨移植兩種。自體骨移植一般采用患者自身髂骨移植，雖然免疫反應(yīng)較低，但來源有限，且對供骨區(qū)造成了新的創(chuàng)傷，隨之產(chǎn)生一些并發(fā)癥；異體骨移植不受大小形狀等限制，但會引起較強的免疫反應(yīng)，愈合時間也較緩慢，且近年來發(fā)現(xiàn)其交叉感染及晚期感染率大大增加，來源亦相對有限。

組織工程支架是一種重要的替代治療措施，有望最終解決這個問題。傳統(tǒng)的多孔支架制作技術(shù)有顆粒濾除法、熔融成型法、乳液冷凍干燥法、高壓氣體膨脹法、纖維立體交織法、相分離法等；其關(guān)鍵性不足是支架孔隙貫通程度不夠、孔隙率與孔分布可控性較差，既影響支架性能，也不利于細胞生長和組織血管化。骨組織工程涉及支架、成骨細胞、骨誘導(dǎo)和促骨生成因子刺激以及合適的生物力學(xué)環(huán)境等多重因素，對力學(xué)強度、孔隙率、孔隙聯(lián)通程度具有很高的要求。3D打印技術(shù)可在很大程度上實現(xiàn)支架的孔隙率、孔徑、孔容積、空間排列和其他表面特性的可控性，因此可能實現(xiàn)優(yōu)良骨組織工程支架的制備。但是目前通過3D打印制備所得的骨修復(fù)支架的功能較為單一，不具備抗菌性能，往往導(dǎo)致其在應(yīng)用中容易受細菌感染而導(dǎo)致一系列炎癥及并發(fā)癥的發(fā)生。

抗菌肽可以對多種類病原體，具有廣譜抗菌活性，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌、陰性菌，對真菌也有很強的抑制作用，尤為重要的是抗菌肽對多藥物耐受的細菌具有明顯的殺滅作用包括甲氯亞林耐受的金黃色葡萄球菌和萬古霉素耐受的腸球菌?？咕耐ㄟ^在細菌的細胞膜積累并發(fā)生構(gòu)象的變化進而破壞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外流，細菌細胞破裂，也可能同時存在一些胞內(nèi)抗菌機制，如抑制核酸合成，干擾蛋白質(zhì)和抑制細胞膜合成等。而且抗菌肽的抗菌過程迅速，在接觸微生物數(shù)秒里就能發(fā)生，這是傳統(tǒng)抗生素?zé)o法相比擬的。此外，抗菌肽多數(shù)都是帶有正電荷的，而細菌的細胞膜富含磷脂酰甘油或絲氨酸磷脂之類的磷脂而使其帶有負電荷，所以兩者之間極易發(fā)生電荷作用，進而使抗菌肽產(chǎn)生殺滅細菌的生物學(xué)效應(yīng)。而哺乳類動物的細胞膜主要由兩性離子組成，細胞膜上不存在甾醇類分子使抗菌肽不易對哺乳動物細胞產(chǎn)生傷害，抗菌肽的高特異性也決定了其臨床引用具有較高的安全性。

其中抗菌肽LL－37 廣譜抗菌，對細菌、真菌、病毒、支原體均有抑制作用。尤其可以抑制創(chuàng)傷常見的感染菌種，如甲類鏈球菌( Group A Streptococcus) 、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)等。此外，抗菌肽LL－37可以參與到血管的形成，有助于骨缺損部位的血管化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的骨修復(fù)制備技術(shù)所制得的骨修復(fù)支架孔隙貫通程度不高、孔隙率與孔分布可控性較差，以及通過3D打印技術(shù)所制備的骨修復(fù)支架的功能單一不具備抗菌性能和促血管化能力的不足，提供一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架及其制備方法，該種骨修復(fù)支架具有良好的生物相容性和抗菌性能，且具有良好的成骨能力、骨傳導(dǎo)能力和血管化能力。本發(fā)明通過以聚己內(nèi)酯為基質(zhì)材料制利用3D打印技術(shù)備出聚己內(nèi)酯骨修支架，再通過表面修飾的方法將生物抗菌肽LL-37固定在支架表面上，整個制備過程耗時短，方法簡單，容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，而且支架的大小及外形可以根據(jù)受損部位去定制。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架由通過3D打印所制得的聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架和修飾在其表面上的抗菌肽LL37組成。

進一步的，所述的具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架按重量份數(shù)計由聚己內(nèi)酯10份、聚多巴胺0.1-0.5份和抗菌肽LL－37 0.01-0.05份組成。

優(yōu)選的，所述的聚己內(nèi)酯的分子量為1×10⁶，購自Sigma試劑公司，抗菌肽LL37購自美國BeadTech公司。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的另一技術(shù)方案為：一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架的制備方法，所述的制備方法通過以下步驟實現(xiàn)：聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架的打印及支架表面聚巴胺修飾；抗菌肽LL－37的固定。

進一步的，所述聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架的打印及支架表面聚巴胺修飾具體步驟為：（1）打印收集平臺的準備：將鹽酸多巴胺溶解于pH為8.5的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸緩沖溶液中，配制成濃度為10mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，然后將鹽酸多巴胺溶液置于一次性培養(yǎng)皿中，然后將盛有鹽酸多巴胺溶液的一次性培養(yǎng)皿置于3D打印機的接收平臺上，并有膠帶固定；（2）骨修復(fù)支架的打?。簩⒕奂簝?nèi)酯卷材放入至3D打印機的進料口中，設(shè)置打印溫度為75℃，打印速度為2-3 分鐘每層，打印層數(shù)為4-8層，打印起始位置設(shè)為收集平臺的正中間；（3）打印完成后，將所得的骨修復(fù)支架連同一次性培養(yǎng)皿一并移出3D打印機，將一次性培養(yǎng)皿中的鹽酸多巴胺溶液全部棄去，然后再添加鹽酸多巴胺溶液至浸沒骨修復(fù)支架，于無菌超凈臺中放置3-4小時，最后將支架移出一次性培養(yǎng)皿，用蒸餾水沖洗，備用。

更進一步的，所述抗菌肽LL－37的固定具體如下：（1）將抗菌肽LL37溶解于pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，輕柔攪拌1小時，配制成濃度為10~50μg/mL的抗菌肽LL37溶液，然后放置于無菌環(huán)境下備用；（2）將經(jīng)聚多巴胺表面修飾處理的骨修復(fù)支架，浸泡于抗菌肽LL37溶液中置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育12-18小時, 然后用滅菌的去離子水沖洗，置于-80℃真空冷凍干燥機中冷凍干燥。即得一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架。

更進一步的，所述的聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架的打印中的3D打印機為采用熔融沉積成型（FDM）工作原理的3D打印機，購自3D systems公司，型號為3D systems Cubepro。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明所制得的骨修復(fù)支架對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均有較強的抑菌作用，且起效快（接觸細菌后24小時，抑菌率均能達95%以上），能有效降低骨修復(fù)支架在植入時受細菌或真菌感染的風(fēng)險；

（2）本發(fā)明通過3D打印制備出聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架，再通過聚多巴胺對其進行表面修飾，因為聚多巴胺存在大量的活潑氨基和羥基，使支架的表面活性位點增加，從而提高支架對細胞及蛋白質(zhì)的黏附作用，使營養(yǎng)物質(zhì)或生長因子在支架的表面積聚，有利于受損部位骨組織的再生；

（3）本發(fā)明所制得的骨修復(fù)支架是以聚己內(nèi)酯為基質(zhì)材料通過3D打印技術(shù)所制得，經(jīng)聚多巴胺表面修飾后，再將抗菌肽LL-37固定在其表面，相比于負載型的抗菌骨修復(fù)支架，該種骨修復(fù)支架的抗菌時效較長，不存在抗菌成分釋放而導(dǎo)致抗菌性能下降的問題。此外通過表面固定的方法，能有效解決抗菌肽LL-37因為局部濃度過高而引起對宿主細胞的毒性作用、發(fā)生溶血現(xiàn)象。

（4）本發(fā)明通過將抗菌肽LL-37 固定在骨修支架上，使骨修復(fù)支架具有良好的抗菌性能外，還賦予支架具有良好的血管化能力，血管生成是復(fù)雜的多步驟過程，涉及到細胞、可溶性因子、細胞外成分之間的相互作用。創(chuàng)傷修復(fù)過程中，血管生成不足會直接導(dǎo)致局部微循環(huán)障礙、組織缺血和缺氧壞死。因此，血管形成是創(chuàng)傷修復(fù)中的重要環(huán)節(jié)，而LL－37被證實參與了血管形成過程。LL－37通過甲?；臉邮荏w－1(FPRL1)介導(dǎo)可刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的增殖，而且細胞增殖程度與LL－37 的濃度呈正相關(guān)。

附圖說明

圖1為實施例1～3與對比例的抗菌能力評價實驗結(jié)果對比圖；

圖2為實施例1～3與對比例的細胞毒性評價實驗結(jié)果對比圖；

圖3為實施例1～3與對比例的蛋白吸附能力評價結(jié)果對比圖；

圖4為實施例1～3與對比例的堿性磷酸酶檢測結(jié)果對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的說明。

實施例1

本發(fā)明的技術(shù)方案為一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架由通過3D打印所制得的聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架和修飾在其表面上的抗菌肽LL37組成；所述的一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架按重量份數(shù)計由聚己內(nèi)酯10份、聚多巴胺0.1-0.5份和抗菌肽LL－37 0.01-0.05份組成。更進一步，所述的聚己內(nèi)酯的分子量為1×10⁶，購自Sigma試劑公司，抗菌肽LL37購自美國BeadTech公司。

實施例2

本發(fā)明的技術(shù)方案為一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架為多層柱狀結(jié)構(gòu)，由通過3D打印所制得的聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架和修飾在其表面上的抗菌肽LL37組成；所述的一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架按重量份數(shù)計由聚己內(nèi)酯10份、聚多巴胺0.3份和抗菌肽LL－37 0.03份組成。更進一步，所述的聚己內(nèi)酯的分子量為1×10⁶，購自Sigma試劑公司，抗菌肽LL37購自美國BeadTech公司。

實施例3

本發(fā)明的技術(shù)方案為一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架為多層柱狀結(jié)構(gòu)，由通過3D打印所制得的聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架和修飾在其表面上的抗菌肽LL37組成；所述的一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架按重量份數(shù)計由聚己內(nèi)酯10份、聚多巴胺0.5份和抗菌肽LL－37 0.05份組成。更進一步，所述的聚己內(nèi)酯的分子量為1×10⁶，購自Sigma試劑公司，抗菌肽LL37購自美國BeadTech公司。

實施例4

實施例1～實施例3任一例一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架，其制備方法的具體步驟如下：

1.聚己內(nèi)酯骨修復(fù)支架的打印及支架表面聚巴胺修飾具體步驟為：

（1）打印收集平臺的準備：將鹽酸多巴胺溶解于pH為8.5的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸緩沖溶液中，配制成濃度為10mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，然后將鹽酸多巴胺溶液置于一次性培養(yǎng)皿中，然后將盛有鹽酸多巴胺溶液的一次性培養(yǎng)皿置于3D打印機的接收平臺上，并有膠帶固定；

（2）骨修復(fù)支架的打?。簩⒕奂簝?nèi)酯卷材放入至3D打印機的進料口中，設(shè)置打印溫度為75℃，打印速度為2-3 分鐘每層，打印層數(shù)為4-8層，打印起始位置設(shè)為收集平臺的正中間；

（3）打印完成后，將所得的骨修復(fù)支架連同一次性培養(yǎng)皿一并移出3D打印機，將一次性培養(yǎng)皿中的鹽酸多巴胺溶液全部棄去，然后再添加鹽酸多巴胺溶液至浸沒骨修復(fù)支架，于無菌超凈臺中放置3-4小時，最后將支架移出一次性培養(yǎng)皿，用蒸餾水沖洗，備用。

2.抗菌肽LL-37的固定：

（1）將抗菌肽LL37溶解于pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，輕柔攪拌1小時，配制成濃度為10~50μg/mL的抗菌肽LL37溶液，然后放置于無菌環(huán)境下備用；

（2）將經(jīng)聚多巴胺表面修飾處理的骨修復(fù)支架，浸泡于抗菌肽LL37溶液中置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育12-18小時, 然后用滅菌的去離子水沖洗，置于-80℃真空冷凍干燥機中冷凍干燥。即得一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架。

實施例5

對比例：一種3D打印所制得的聚己內(nèi)酯支架（參考申請?zhí)枮镃N201510188649.5所公開的一種FDM技術(shù)3D打印的人體可吸收增強型骨固定結(jié)構(gòu)材料及其制備方法所公開的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3所得的一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架，采用實施例4的方法制備而成。

將上述實施例1～3所制備的具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架與對比例進行抗菌能力評價實驗，對比實施例1~3和對比例對大腸桿菌、金華葡萄球菌和白色念珠菌接觸24小時后的抑菌效果。實驗結(jié)果如圖1示。

從結(jié)果可見實施例1~3在與大腸桿菌、金華葡萄球菌和白色念珠菌接觸24小時后抑菌率均能達到95%以上，而對比例均小于20%，證明實施例1~3均具有強效，作用時間快的廣譜抗菌性能。

實施例6

對比例：一種3D打印所制得的聚己內(nèi)酯支架（參考申請?zhí)枮镃N201510188649.5所公開的一種FDM技術(shù)3D打印的人體可吸收增強型骨固定結(jié)構(gòu)材料及其制備方法所公開的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3所得的一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架，采用實施例4的方法制備而成。

將上述實施例1～3所制備的具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架與對比例進行細胞毒性評價實驗（按國標GB/T 16886.5-2003進行實驗），對比實施例1~3和對比例對。實驗結(jié)果如圖2示。

細胞毒性檢測結(jié)果顯示實施例1~3在與成骨細胞MG-63共培養(yǎng)3天和7天后其對應(yīng)的細胞相對增殖率均在90%以上，細胞毒性評級為0級，證明其具有良好的細胞形容性，而對比例與人成纖維細胞共培養(yǎng)24小時和48小時后其對應(yīng)細胞相對增殖率均在70%左右，細胞毒性評級為3級，具有嚴重的細胞毒性。此外，共培養(yǎng)時間的延長實施例1~3的相對相比增殖率均有明顯提高，實施例2和3在7天后其細胞相對增殖率均較陰性組要高（均高于100%），證明采用本發(fā)明所公開的制備方法所制得的骨修復(fù)支架能促進成骨細胞MG-63的生長，有利于骨缺損部位新骨組織的生長。

實施例7

對比例：一種3D打印所制得的聚己內(nèi)酯支架（參考申請?zhí)枮镃N201510188649.5所公開的一種FDM技術(shù)3D打印的人體可吸收增強型骨固定結(jié)構(gòu)材料及其制備方法所公開的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3所得的一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架，采用實施例4的方法制備而成。

以BSA為模型蛋白，利用BCA蛋白吸附能力測試法評價實施例1～3所制備的具誘導(dǎo)修復(fù)作用的軟骨修復(fù)水凝膠與對比例的蛋白吸附能力。試驗結(jié)果如圖3示。

蛋白吸附能力結(jié)果顯示實施例1~3的蛋白吸附能力均較對比例要高，這與利于生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)在其上黏附，為成骨細胞在其上面生長提供一個良好的微環(huán)境，有利于。

實施例8

對比例：一種3D打印所制得的聚己內(nèi)酯支架（參考申請?zhí)枮镃N201510188649.5所公開的一種FDM技術(shù)3D打印的人體可吸收增強型骨固定結(jié)構(gòu)材料及其制備方法所公開的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3所得的一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架，采用實施例4的方法制備而成。

將上述實施例1～3所制備的具誘導(dǎo)修復(fù)作用的軟骨修復(fù)水凝膠與對比例分別與MG-63（人成骨肉瘤細胞）進行共培養(yǎng)7天后對其堿性磷酸酶值進行檢測，對比實驗組和對比例的骨誘導(dǎo)能力。實驗結(jié)果如圖4所示：

堿性磷酸酶（alkaline phosphate ALP）是分化成骨細胞的標志物，能促進骨基質(zhì)的礦化。從上圖可知，與對比例相比，實施例1~3的ALP值明顯較對比例要高。由此可見，通過本發(fā)明所公開的一種具有抗菌性能的3D打印骨修復(fù)支架具有較高的骨誘導(dǎo)能力和骨傳導(dǎo)能力。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定；對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉；凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。