本發(fā)明涉及一種組織工程脫細(xì)胞血管支架的制備方法。

背景技術(shù)：

心血管疾病是人類健康的第一殺手，其中半數(shù)以上患者治療的首選是血管移植，但由于部分患者受自身血管來源的限制而難以實施。異體或異種血管曾經(jīng)作為自體血管的替代物，用于修復(fù)病變或缺失的血管，但潛在的疾病傳播風(fēng)險、急性免疫排斥反應(yīng)及有限的供體來源又限制了其在移植中應(yīng)用。組織工程技術(shù)的發(fā)展為人體血管缺損修復(fù)和重建提供了新的解決方案，目前已開發(fā)出了多種合成的可降解材料用于構(gòu)建組織工程支架，并應(yīng)用于臨床，取得了良好的效果。組織工程血管是一種用組織工程學(xué)方法構(gòu)建的具有良好生物相容性和力學(xué)特性的血管替代物，其基本的構(gòu)件是血管支架材料、種子細(xì)胞和信號因子，而血管支架的研究一直是目前血管組織工程研究領(lǐng)域的難點和重點。其中，天然生物支架材料利用自體或者異體血管進(jìn)行脫細(xì)胞處理，獲得細(xì)胞外基質(zhì)，由于這些胞外基質(zhì)與細(xì)胞親和力強(qiáng)，能為細(xì)胞生長、繁殖、分化提供近似體內(nèi)組織發(fā)育環(huán)境，且生物相容性、順應(yīng)性均較好，免疫排斥也較低，因此有潛力應(yīng)用到組織工程化血管中。

然而，這些異體或異種來源的脫細(xì)胞支架應(yīng)用到小口徑(內(nèi)徑小于6mm)血管移植時，在口徑小、張力大的血管環(huán)境中存在著力學(xué)性能不足而導(dǎo)致嚴(yán)重動脈瘤等問題。因此，要實現(xiàn)脫細(xì)胞血管支架在小口徑組織工程化血管中的廣泛應(yīng)用，必須解決支架力學(xué)性能不足的問題。熔融紡絲和濕法紡絲等技術(shù)可以利用一些生物相容性較好的高分子材料制備出具有較好力學(xué)性能的支架，這種支架的纖維直徑和纖維取向可控，能夠在血流方向和血管徑向提供較好的力學(xué)支持，從而滿足體內(nèi)血流刺激對力學(xué)性能的要求，因此在組織工程化血管研究中受到重視。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述存在問題，將脫細(xì)胞的組織工程化血管和用熔融紡絲等技術(shù)制備的力學(xué)支架相結(jié)合，發(fā)明一種可以有效增強(qiáng)力學(xué)性能的組織工程脫細(xì)胞血管支架的制備方法，本方法制備的脫細(xì)胞血管支架具有力學(xué)性能顯著增強(qiáng)、體內(nèi)移植后免疫反應(yīng)低、可以設(shè)計不同形態(tài)的血管支架以滿足實際臨床應(yīng)用的特點。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種組織工程脫細(xì)胞血管支架的制備方法，包括以下步驟：

1)以生物可降解高分子材料為原料，在醫(yī)用硅膠管上采用熔融紡絲或濕法紡絲技術(shù)制備微米級或納米級的有序網(wǎng)狀血管支架，所述有序網(wǎng)狀血管支架的纖維在硅膠管外螺旋式纏繞，纖維之間的角度為45°，網(wǎng)狀血管支架層的厚度為600μm，血管支架的直徑為2mm；

2)將上述帶硅膠管的纖維支架植入到兔子或大鼠實驗動物皮下部位2周到3個月，宿主啟動免疫反應(yīng)機(jī)制并使成纖維細(xì)胞等向支架上遷移，最終形成一個由宿主細(xì)胞及胞外基質(zhì)包裹的組織工程化血管支架；

3)將上述組織工程化血管支架取出，移除硅膠管后，對其外層的血管材料進(jìn)行如下處理：用75wt％的酒精消毒20min，轉(zhuǎn)移至超凈臺操作，用1wt％的十二烷基磺酸鈉(SDS)在搖床上震蕩12h后，用雙蒸餾水(DDH₂O)將SDS完全洗去，用100U的DNA酶和40U的RNA酶搖床震蕩處理24h，用DDH₂O將酶完全洗去，得到組織工程脫細(xì)胞血管支架。

所述生物可降解高分子材料為聚己內(nèi)酯(PCL)、聚L-丙交酯-co-己內(nèi)酯(PLCL)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚羥基脂肪酸酯(PHA)和聚氨酯(PU)中的一種或兩種及以上任意比例的混合物。

一種所制備的組織工程脫細(xì)胞血管支架的應(yīng)用，用于實驗動物的血管移植。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、多層相互交聯(lián)的網(wǎng)狀高分子支架充分改善了原有脫細(xì)胞血管支架的力學(xué)性能，成功解決了血管移植后的動脈瘤等問題；2、本方法在宿主動物體內(nèi)構(gòu)建由免疫機(jī)制引起的遷移細(xì)胞形成的支架血管，再進(jìn)行脫細(xì)胞處理，既保留了網(wǎng)狀支架以改善血管力學(xué)性能，又降低移植后的免疫反應(yīng)，并且充分利用了細(xì)胞外基質(zhì)提供細(xì)胞再生的良好環(huán)境；3、本方法還可以通過設(shè)計不同形狀和大小的支架來制備不同的脫細(xì)胞血管支架，以應(yīng)用于不同的血管移植條件。

附圖說明：

圖1為脫細(xì)胞血管立體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為脫細(xì)胞血管支架剖面結(jié)構(gòu)放大示意圖。

圖中：1，免疫包裹材料；2，高分子纖維；3，醫(yī)用硅膠管。

具體實施方式

實施例1：

一種組織工程脫細(xì)胞血管支架的制備方法，采用熔融紡絲技術(shù)以PCL為原料制備，包括以下步驟：

1)將20克分子量為8000的PCL加入到熔融紡絲機(jī)的料筒中，將料筒升溫到210℃并保持1h，調(diào)整料筒針頭與外徑為2mm的醫(yī)用硅膠管的距離為1cm，設(shè)定料筒推進(jìn)流速為0.5mL/h，接收硅膠管轉(zhuǎn)速為300rpm，水平移動速度為10mm/s，移動距離為10cm，紡絲時間為12min，得到在硅膠管外纖維呈螺旋式纏繞的有序網(wǎng)狀血管支架；

2)將上述帶有硅膠管的PCL有序網(wǎng)狀血管支架剪為每段2cm，用環(huán)氧乙烷滅菌，將大鼠麻醉后，背部兩側(cè)剃光成長6cm、寬2cm矩形面，用剪刀剪開1cm長切口，用平頭剪刀將皮層與肌肉組織分離出長4cm、寬1cm、深0.3cm的空腔，將PCL纖維支架平整埋入到空腔中，將切口縫合后消毒，在皮下埋植一個月后，將大鼠麻醉后，在植入支架材料的另一側(cè)脫毛切口，將材料與周圍組織剝離后取出，剔除多余的結(jié)締組織后得到一個由宿主細(xì)胞及胞外基質(zhì)包裹的組織工程化血管支架；

3)將上述得到的血管支架用75wt％的酒精消毒20min，轉(zhuǎn)移至超凈臺操作，用1wt％的十二烷基磺酸鈉(SDS)處理12h后，用雙蒸餾水(DDH₂O)將SDS完全洗去，用100U的DNA酶和40U的RNA酶處理處理24h，用DDH₂O將酶完全洗去，得到脫細(xì)胞血管支架，放入磷酸緩沖鹽溶液中備用，所述磷酸緩沖鹽溶液的組成：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L；溶液pH為7.2～7.4。

所制備的組織工程脫細(xì)胞血管支架用于實驗動物的血管移植，方法如下：將得到的脫細(xì)胞血管支架進(jìn)行大鼠腹主動脈血管移植實驗，通過蘇木素伊紅染色和免疫熒光染色評價其組織相容性和血管再生情況，通過小動物多普勒超聲成像儀檢測血管再大鼠體內(nèi)的形態(tài)和通暢性，對移植血管取材后進(jìn)行力學(xué)性能評價。組織學(xué)染色分析可見該脫細(xì)胞血管支架與機(jī)體之間沒有明顯免疫排斥反應(yīng)，組織相容性良好；多普勒超聲成像顯示血管形態(tài)保持正常，血流通暢；力學(xué)測試結(jié)果表明，該脫細(xì)胞組織工程化血管支架的爆破壓、拉伸強(qiáng)度等力學(xué)性能可以滿足生理所需。

實施例2：

一種組織工程脫細(xì)胞血管支架的制備方法，采用濕法紡絲技術(shù)以PLCL為原料制備，包括以下步驟：

1)將1克PLCL溶解到10mL六氟異丙醇中，室溫攪拌至全部溶解，將直徑為2mm的醫(yī)用硅膠管與旋轉(zhuǎn)電機(jī)相連，將PLCL溶液吸入注射器中，注射器針頭置入到乙醇凝固浴中距離硅膠管1cm位置。設(shè)定溶液流速為2ml/h，接收硅膠管轉(zhuǎn)速為500rpm，紡絲時間為40min，得到在硅膠管外纖維呈螺旋式纏繞的有序網(wǎng)狀血管支架，制備完成后將血管支架真空干燥備用；

2)將上述得到的內(nèi)徑為2mm的有序網(wǎng)狀血管支架裁剪成長為3cm的血管支架，用75wt％醫(yī)用酒精滅菌后用無菌生理鹽水置換備用，將兔子麻醉后，背部兩側(cè)剃光成長6cm、寬4cm的矩形面，用剪刀剪開1cm長切口，用平頭剪刀將皮層與肌肉組織分離出長4cm、寬1cm、深0.3cm的空腔，將剪好的纖維支架材料平整放入到空腔中，將切口縫合后消毒，在皮下埋植時間達(dá)到3個星期后，將兔麻醉后，在植入支架的另一側(cè)脫毛切口，將支架與周圍組織剝離后取出；

3)將得到的血管支架用75wt％的酒精消毒20min，轉(zhuǎn)移至超凈臺操作，用1wt％的十二烷基磺酸鈉(SDS)處理12h后，用雙蒸餾水(DDH₂O)將SDS完全洗去，用100U的DNA酶和40U的RNA酶處理處理24h，用雙蒸餾水(DDH₂O)將酶完全洗去，得到脫細(xì)胞血管支架，放入磷酸緩沖鹽溶液中備用(組成同實施例1)。

所制備的組織工程脫細(xì)胞血管支架用于實驗動物的血管移植，方法如下：將得到的脫細(xì)胞血管支架進(jìn)行家兔頸動脈血管移植實驗，通過蘇木素伊紅染色和免疫熒光染色評價其組織相容性和血管再生情況，通過小動物多普勒超聲成像儀檢測血管再大鼠體內(nèi)的形態(tài)和通暢性，對移植血管取材后進(jìn)行力學(xué)性能評價。組織學(xué)染色分析可見該脫細(xì)胞血管支架與機(jī)體之間沒有明顯免疫排斥反應(yīng)，組織相容性良好；多普勒超聲成像顯示血管形態(tài)保持正常，血流通暢；力學(xué)測試結(jié)果表明該脫細(xì)胞組織工程化血管支架的爆破壓、拉伸強(qiáng)度等力學(xué)性能可以滿足生理所需。