一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法,包括如下步驟：耳軟骨細(xì)胞體外大量擴(kuò)增培養(yǎng)；復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片的制備；制作特殊形態(tài)的PCL(三維打印)內(nèi)核；復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片與材料的三明治模式的制備；復(fù)合物(膜片+內(nèi)核)植入動(dòng)物肌肉內(nèi)的手術(shù)。本發(fā)明將三維打印的材料作為內(nèi)核支架，細(xì)胞膜片包裹材料后可以避免支架材料與體內(nèi)組織直接接觸，從而降低支架材料在體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)，提高體內(nèi)軟骨再生的成功率。另外，通過三維打印，我們可以制作具有各種特殊形態(tài)的內(nèi)核材料并構(gòu)建出與其對(duì)應(yīng)的組織工程軟骨；同時(shí)通過調(diào)整打印層高，網(wǎng)格密度，走針方式等途徑以及膜片疊加層數(shù)的不同使所構(gòu)建的軟骨具有不同的力學(xué)強(qiáng)度，且能達(dá)到較高水平。
【專利說明】
一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物組織領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片技術(shù)結(jié)合PCL內(nèi)核材料在體內(nèi)構(gòu)建具有特殊形態(tài)的組織工程軟骨的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，在大動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建大面積且具有一定力學(xué)強(qiáng)度的組織工程軟骨成為一大難題而無法滿足臨床上的某些需求，比如:長(zhǎng)段氣管缺損的修復(fù)。近年來組織工程技術(shù)的興起和快速發(fā)展為其提供了一條新思路，它采用自體細(xì)胞及材料支架預(yù)構(gòu)建出具有特定形狀的組織工程化軟骨。但現(xiàn)有的構(gòu)建組織工程軟骨的方法由于在有效塑形，力學(xué)強(qiáng)度及免疫反應(yīng)等方面存在諸多問題，所以尚未取得突破性進(jìn)展。
[0003]現(xiàn)有研究指出，老化的軟骨細(xì)胞在“細(xì)胞堆積”的培養(yǎng)狀態(tài)下會(huì)出現(xiàn)再分化，重新表達(dá)軟骨細(xì)胞特征表型并分泌特征性的軟骨外基質(zhì)。同時(shí)有研究報(bào)道，單純利用軟骨細(xì)胞體外復(fù)層培養(yǎng)可以構(gòu)建片狀軟骨。由于該方法構(gòu)建的軟骨組織不含支架材料，均為自體成分可以避免非細(xì)胞因素在體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)，所以是一種適用于大動(dòng)物體內(nèi)軟骨再生的構(gòu)建方法。但是，由此產(chǎn)生的軟骨并無特定形狀，同時(shí)力學(xué)強(qiáng)度較差，往往不能滿足應(yīng)用的要求。
[0004]然而，現(xiàn)已有許多生物材料在形態(tài)控制，力學(xué)強(qiáng)度及免疫反應(yīng)等方面具有良好的特性。例如，聚已內(nèi)酯(PCL)是由ε_(tái)己內(nèi)酯經(jīng)過開環(huán)聚合而成的一種新型聚合物，它不僅具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性及易加工等特點(diǎn)，同時(shí)它易塑形，并且力學(xué)性能良好，可以通過調(diào)整PCL三維打印層高，網(wǎng)格密度及走針方式等途徑使其力學(xué)強(qiáng)度達(dá)到較大水平。通過其與復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片疊加的三明治模式形成具有特殊形態(tài)的組織工程軟骨，可有效的形態(tài)控制解決力學(xué)強(qiáng)度及免疫反應(yīng)等方面的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，用以克服上述技術(shù)缺陷。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，具體步驟如下:
[0007]S1、耳軟骨細(xì)胞體外大量擴(kuò)增培養(yǎng):
[0008]S11、無菌條件下切取耳廓軟骨，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min后，用1mM磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，沉淀軟骨塊，除去胰蛋白酶；
[0009]SI 2、加入0.15%Π型膠原酶，以軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度，0.22微米針式濾器過濾，置于37°C恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化6?8h，直至大部分軟骨塊被消化后，獲得消化液；
[0010]S13、將所得的消化液用100微米細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，1500r/min，離心5min，沉淀的細(xì)胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基重懸后，以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，并檢查軟骨細(xì)胞活力；
[0011]S14、在倒置顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至lxlOVcm2的濃度接種在10mm培養(yǎng)皿上，在37°C，5 %⑶2，飽和濕度條件下，用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)擴(kuò)增，待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)至70 % -80 %融合時(shí)進(jìn)行傳代；
[0012]S2、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片的制備:
[0013]S21、在原代細(xì)胞接種時(shí)留取3-4個(gè)培養(yǎng)皿以3.0 X 104/cm2細(xì)胞密度接種軟骨細(xì)胞，這些培養(yǎng)皿的細(xì)胞作為基礎(chǔ)皿，以軟骨組織培養(yǎng)液在37°C，5%⑶2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，3天后首次換液，以后隔日換液，直到構(gòu)建復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片；
[0014]S22、其余原代細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80 %融合后傳代，傳代后的細(xì)胞用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，直至傳至P3代軟骨細(xì)胞；
[0015]S23、將P3代細(xì)胞消化，離心，重懸，以8X105/cm2濃度接種于之前留取的基礎(chǔ)皿上，以軟骨組織培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液;培養(yǎng)4周后，于培養(yǎng)皿中揭起一直徑10mm的復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片；
[0016]S3、制作具有特殊形態(tài)的PCL內(nèi)核及內(nèi)支撐:
[0017]S31、將PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術(shù)結(jié)合三維電腦打印技術(shù)制成的具有特殊形態(tài)的材料支架，得到PCL內(nèi)核;可通過調(diào)整內(nèi)核材料的三維打印層高，網(wǎng)格密度，走針方式等途徑改變內(nèi)核的力學(xué)強(qiáng)度。
[0018]S32、將PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術(shù)結(jié)合三維電腦打印技術(shù)制成的無孔的具有特殊形態(tài)的支架，得到內(nèi)支撐；
[0019]S4、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片與內(nèi)核材料的三明治模式復(fù)合物的制備:
[0020]采用復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片、內(nèi)核材料、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片的模式做成具有特殊形態(tài)的膜片/材料復(fù)合物，并在周邊用縫線將三層固定；
[0021]S5、復(fù)合物植入動(dòng)物肌肉的手術(shù):
[0022]在將膜片/內(nèi)核材料復(fù)合物植入到動(dòng)物肌肉環(huán)境時(shí)，先分離出一塊帶血供的薄層筋膜組織包裹內(nèi)支撐，再將體外構(gòu)建的復(fù)合物附于其上。
[0023]進(jìn)一步，在上述步驟S1.3及步驟S2.2中，所述的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液配方為:在高糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone ,Thermo ,U.S.A)基礎(chǔ)上再加入 10% 的胎牛血清(Hyclone ,Thermo ,U.S.A) ,Antib1tic soIut1n(Hyclone ,Thermo ,U.S.A) lml/lOOml，以及2ng/mlbFGF。
[0024]進(jìn)一步，在上述步驟S2.1及步驟S2.3中，所述的軟骨組織培養(yǎng)液配方為:在高糖DMEM的配方為:在高糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone，Thermo，U.S.Α)基礎(chǔ)上再加入10 %的胎牛血清(Hyclone,Thermo,U.S.A),Antib1tic soIut1n(Hyclone,Thermo,U.S.A)lml/100ml，以及l(fā)Ong/ml TGF-βΙ。
[0025]進(jìn)一步，在上述步驟S1.1中，無菌條件下切取耳廓軟骨，仔細(xì)剝離表面的軟骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的組織塊，氯霉素沖洗液沖洗3遍。
[0026]進(jìn)一步，在上述步驟S2.3中，將P3代細(xì)胞以8 X 105/cm2濃度接種于高密度培養(yǎng)的原代細(xì)胞上，以軟骨組織培養(yǎng)液培養(yǎng)4周后即可構(gòu)建出復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片。
[0027]進(jìn)一步，在上述步驟S3中，制備的PCL內(nèi)核網(wǎng)格間距2mm，層高0.1mm，可通過調(diào)整三維電腦打印的設(shè)置，控制內(nèi)核具體形狀，同時(shí)改變內(nèi)核網(wǎng)格的層高，網(wǎng)格間距，走針方式。PCL內(nèi)支撐管為三維打印的無孔材料支架，用做體內(nèi)移植時(shí)作為組織工程軟骨的內(nèi)支撐。
[0028]進(jìn)一步，在上述步驟S5中，復(fù)合物植入時(shí)用氯氨酮(5mg/kg)和速眠新(0.05-lml/kg)肌注麻醉，氣管插管固定。行頸部正中切口切開頸前皮膚，解剖出一塊帶血供的薄層筋膜組織包裹內(nèi)支撐，再將體外構(gòu)建的具有特殊形態(tài)的復(fù)合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，之后附于其上。解剖同側(cè)頸闊肌，將肌肉附于復(fù)合物表面，再用6-0可吸收縫線對(duì)合肌肉兩側(cè)緣將復(fù)合物包裹入內(nèi)，仔細(xì)止血后逐層縫合關(guān)閉切口，8周后取材。術(shù)后待麻醉蘇醒，拔除氣管插管，情況平穩(wěn)后送回飼養(yǎng)室密切觀察，術(shù)后三天內(nèi)肌注青霉素。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解內(nèi)核材料除了可用聚羥基乙酸(PGA)之外，還包括藥學(xué)上可接受的、生物相容性良好的可降解材料，可選自下組:聚乳酸(PLA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細(xì)胞基質(zhì)，及這些成分的各種組合等。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比較本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明應(yīng)用帶PCL內(nèi)核的軟骨復(fù)層細(xì)胞膜片可以在體內(nèi)構(gòu)建具有特殊形態(tài)的組織工程軟骨，既可降低支架材料在體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)，同時(shí)對(duì)體內(nèi)構(gòu)建的組織工程軟骨可以進(jìn)行有效的塑形。另外，它提高了構(gòu)建軟骨的生物力學(xué)強(qiáng)度，足以滿足氣管支撐功能來對(duì)抗氣管缺損修復(fù)術(shù)后的各種應(yīng)力。
[0031]本發(fā)明擬采用的PCL內(nèi)核在構(gòu)建管狀等特殊形態(tài)的軟骨具有顯著優(yōu)勢(shì):(1斤(^作為內(nèi)核起支架作用，可以避免支架材料與體內(nèi)組織直接接觸，降低支架材料在體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)，提高體內(nèi)軟骨再生的成功率。(2)軟骨在體內(nèi)的成熟的過程中，PCL材料能不斷降解，可避免硬質(zhì)材料長(zhǎng)期存在可能引起的不良反應(yīng)；(3)該支架在常規(guī)加熱(約60°C)加壓的條件下可通過模具精確塑形，冷卻到室溫或體溫后形態(tài)維持不變，顯然有利于形態(tài)精確控制及維持；(4)該支架可通過三維打印制備，網(wǎng)孔大小，網(wǎng)格厚度、走針方式等關(guān)鍵參數(shù)均可精確調(diào)控。
[0032]本發(fā)明擬采用的復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片技術(shù)在體外構(gòu)建的軟骨組織不含支架材料，可以避免非細(xì)胞因素在體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)，提高體內(nèi)軟骨再生的成功率。此外，該技術(shù)中可將軟骨細(xì)胞大量擴(kuò)增培養(yǎng)，對(duì)原代軟骨細(xì)胞，即自體軟骨組織的需求量明顯降低。
[0033]本發(fā)明構(gòu)建出的具有確定形態(tài)且足夠生物力學(xué)強(qiáng)度的組織工程軟骨，以滿足臨床上對(duì)組織工程軟骨的各種需求，這為組織工程氣管等向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化探索新的思路與方法。
【附圖說明】
[0034]圖1為復(fù)合物(膜片+內(nèi)核)制備過程；
[0035]圖中，A，B為管狀PCL內(nèi)核的正面觀及側(cè)面觀;C為體外培養(yǎng)四周的復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片;D，E，F(xiàn)為復(fù)合物的正面觀，側(cè)面觀及底面觀。
【具體實(shí)施方式】
[0036]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0037]軟骨形成細(xì)胞
[0038]本發(fā)明中軟骨形成細(xì)胞的來源沒有特別限制，可以是人或動(dòng)物的軟骨細(xì)胞，可來源于關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨、耳軟骨、鼻中隔軟骨、氣管軟骨等各種軟骨組織;也可以是具有軟骨分化潛能的人或動(dòng)物其它種類細(xì)胞，可來源于骨髓、脂肪、肌肉、皮膚等組織。一種優(yōu)選的來源是來自人或動(dòng)物的耳軟骨或關(guān)節(jié)軟骨。
[0039]分離獲得軟骨細(xì)胞的方法是文獻(xiàn)多次報(bào)道的公認(rèn)方法。一種優(yōu)選的方法是全麻或局麻下無菌切取軟骨組織，經(jīng)磷酸緩沖液(PBS)清洗后，加入3倍軟骨體積的膠原酶溶液(濃度一般在0.5-3mg/ml，以PBS或培養(yǎng)液配制)，37°C恒溫振蕩消化4_20小時(shí)(依軟骨組織的來源及消化進(jìn)展程度而定)，過濾收集軟骨細(xì)胞懸液，離心、洗滌、臺(tái)盼藍(lán)染色、顯微鏡下計(jì)數(shù)，原代軟骨細(xì)胞活力一般應(yīng)在80%以上。將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞的方法也是本領(lǐng)域常規(guī)的方法。
[0040]軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代方法和培養(yǎng)液也是本領(lǐng)域中熟知的。一種優(yōu)選的方法是將軟骨細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于):I )F-12培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基+5%-20%胎牛血清;2)F-12培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基+5%-20%自體(或異體)人血清；3)F-12/DMEM培養(yǎng)基(1:1)+2%-20%胎牛血清或人血清。一類特別優(yōu)選的軟骨細(xì)胞是體外分離培養(yǎng)的原代-第3代的軟骨細(xì)胞。此時(shí)的軟骨細(xì)胞功能和活力均良好，具有很強(qiáng)的軟骨形成能力，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色證明有II型膠原表達(dá)，RT-PCR及原位雜交檢測(cè)證明有II型膠原及蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表達(dá)。
[0041]生物可降解內(nèi)核材料
[0042]可用于構(gòu)建本發(fā)明組織工程化軟骨的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于):
[0043](a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸(PHB)、聚酸酐(口015^]1117(114(168)、聚偶磷氮(。015^1108。113261168)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿燒(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、聚對(duì)二氧六環(huán)酮(po Iyd1xanone)等；
[0044]( b )天然可降解材料，例如膠原(c ο 11 a g e η )、明膠(g e I a t i η )、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽以及各種脫細(xì)胞基質(zhì)等；
[0045](C)上述材料的共聚物或復(fù)合型材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料，以及固體材料與可注射性材料的復(fù)合材料。
[0046]優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復(fù)合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原等。當(dāng)材料為固體型材料時(shí)，可以直接將材料預(yù)制成需要的大小與形狀，也可以通過計(jì)算機(jī)輔助及快速成型技術(shù)定制的模型對(duì)材料進(jìn)行精確的塑性。
[0047]實(shí)施例
[0048]S1、羊耳軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)；
[0049]S1.1、無菌切取山羊約2cmX 2cm大小的耳軟骨片，將其剪碎成Imm3軟骨塊，用氯霉素溶液反復(fù)沖洗后加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min，以去除軟骨組織外的纖維結(jié)締組織，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，沉淀軟骨塊，除去膜蛋白酶；
[0050]S1.2、加入0.15%Π型膠原酶，以軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度，0.22微米針式濾器過濾，立即使用，置于37°C恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化6?8h;
[0051]S1.3、直至大部分軟骨塊被消化后，獲得的消化液用100微米細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，1500r/min，離心5min，沉淀的細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%三抗的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基重懸，所得細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，并檢查軟骨細(xì)胞活力，在倒置顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至lxl04/cm2的濃度接種在10mm培養(yǎng)皿上，在37°C，5%C02，飽和濕度條件下，用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)擴(kuò)增，待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)進(jìn)行傳代(圖一A、B)；
[0052]S2、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片的制備
[0053]S2.1、在原代細(xì)胞接種時(shí)留取3-4個(gè)培養(yǎng)皿(10mm)以3.0 X 104/cm2細(xì)胞密度接種軟骨細(xì)胞，這些培養(yǎng)皿的細(xì)胞作為基礎(chǔ)皿，以軟骨組織培養(yǎng)液37 °C，5 % C02，飽和濕度條件下培養(yǎng)，3天后首次換液，以后隔日換液，直到構(gòu)建復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片；
[0054]S2.2其余原代細(xì)胞生長(zhǎng)近70-80%融合后傳代，傳代后的細(xì)胞用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，直至傳至P3代軟骨細(xì)胞；
[0055]S2.3、將P3代細(xì)胞消化，離心，重懸，以8 X 1Vcm2濃度接種于之前留取的基礎(chǔ)皿上，以軟骨組織培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液;培養(yǎng)4周后，于培養(yǎng)皿中揭起一直徑10mm的復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片(圖1中的C);
[0056]S3、制作管狀PCL內(nèi)核及內(nèi)支撐管;PCL內(nèi)核是PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術(shù)結(jié)合三維電腦打印技術(shù)制成的網(wǎng)格狀多孔管狀支架，可通過調(diào)整內(nèi)核材料的三維打印層高，網(wǎng)格密度，走針方式等途徑改變內(nèi)核的力學(xué)強(qiáng)度。PCL內(nèi)支撐管為同樣方法制備的無孔的管狀支架。
[0057]S4、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片與管狀材料的三明治模式復(fù)合物的制備;采用復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片、管狀材料、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片的模式做成管狀膜片/材料復(fù)合物，并在周邊用縫線將三層固定(圖1中的D，E，F(xiàn));
[0058]S5、以PCL管作為內(nèi)支撐管，將管狀膜片/PCL復(fù)合物植入到羊氣管旁肌肉內(nèi)的手術(shù);在將管狀膜片/PCL內(nèi)核材料復(fù)合物植入到動(dòng)物頸部肌肉環(huán)境時(shí)，先分離出一塊帶血供的薄層筋膜組織包裹內(nèi)支撐管，再將體外構(gòu)建的管狀復(fù)合物附于其上。8周后取材進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)評(píng)估。
[0059]結(jié)果表明，大體觀可見已經(jīng)形成管狀軟骨，且其內(nèi)外表面均為瓷白色，均質(zhì)成熟軟骨。組織學(xué)檢測(cè)HE染色顯示，形成的軟骨組織均勻分布陷窩樣結(jié)構(gòu)，并且并未出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。力學(xué)強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果證明，其可達(dá)到較大水平。
[0060]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、耳軟骨細(xì)胞體外大量擴(kuò)增培養(yǎng): S11、無菌條件下切取耳廓軟骨，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min后，用1mM磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，沉淀軟骨塊，除去胰蛋白酶； SI2、加入0.15%Π型膠原酶，以軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度，0.22微米針式濾器過濾，置于37°C恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化6?8h，直至大部分軟骨塊被消化后，獲得消化液； 513、將所得的消化液用100微米細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，1500r/miη，離心5miη，沉淀的細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%三抗的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基重懸后，以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，并檢查軟骨細(xì)胞活力； 514、在倒置顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至lX104/cm2的濃度接種在10mm培養(yǎng)皿上，在37°C，5 %⑶2，飽和濕度條件下，用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)擴(kuò)增，待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)至70 % -80 %融合時(shí)進(jìn)行傳代； 52、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片的制備: 521、在原代細(xì)胞接種時(shí)留取3-4個(gè)培養(yǎng)皿以3.0X 104/cm2細(xì)胞密度接種軟骨細(xì)胞，以軟骨組織培養(yǎng)液在37°C，5%⑶2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，3天后首次換液，以后隔日換液，直到構(gòu)建復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片； 522、其余原代細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%融合后傳代，傳代后的細(xì)胞用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，直至傳至P3代軟骨細(xì)胞； 523、將P3代軟骨細(xì)胞消化，離心，重懸，以8X 105/cm2濃度接種于之前留取的基礎(chǔ)皿上，以軟骨組織培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液;培養(yǎng)4周后，于培養(yǎng)皿中揭起一直徑10mm的復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片； 53、制作具有特殊形態(tài)的PCL內(nèi)核及內(nèi)支撐管: 531、將PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術(shù)結(jié)合三維電腦打印技術(shù)制成的具有特殊形態(tài)的材料支架，得到PCL內(nèi)核； 532、將PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術(shù)結(jié)合三維電腦打印技術(shù)制成無孔的具有特殊形態(tài)的支架，得到內(nèi)支撐管； 54、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片與內(nèi)核材料的三明治模式復(fù)合物的制備: 采用復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片、內(nèi)核材料、復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片的模式做成具有特殊形態(tài)的膜片/材料復(fù)合物，并在周邊用縫線將三層固定； 55、復(fù)合物植入動(dòng)物肌肉的手術(shù): 在將具有特殊形態(tài)的膜片/內(nèi)核材料復(fù)合物植入到動(dòng)物肌肉環(huán)境時(shí)，先分離出一塊帶血供的薄層筋膜組織包裹內(nèi)支撐，再將體外構(gòu)建的復(fù)合物附于其上。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，所述的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液配方為:在高糖DMEM培養(yǎng)液基礎(chǔ)上再加入10%的胎牛血清，Antib1ti csolut1n lml/100ml，以及2ng/mlbFGF03.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，所述的軟骨組織培養(yǎng)液配方為:在高糖DMEM培養(yǎng)液基礎(chǔ)上再加入10%的胎牛血清，Antib1ti csolut1nlml/lOOml，以及 10ng/ml TGF-βΙ。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟S1.1中，無菌條件下切取耳廓軟骨，仔細(xì)剝離表面的軟骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的組織塊，氯霉素沖洗液沖洗3遍。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟S2.3中，將P3代細(xì)胞以8 X 105/cm2濃度接種于高密度培養(yǎng)的原代細(xì)胞上，以軟骨組織培養(yǎng)液培養(yǎng)4周后即可構(gòu)建出復(fù)層軟骨細(xì)胞膜片。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟S3中，制備的PCL內(nèi)核的網(wǎng)格間距2mm，層高0.Immο7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，所述步驟S5中，復(fù)合物植入時(shí)用5mg/kg的氯氨酮和0.05-lml/kg的速眠新肌注麻醉后，通過氣管插管固定。
【文檔編號(hào)】A61L27/50GK105854085SQ201610261335
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月25日
【發(fā)明人】曹誼林, 周廣東, 李丹, 殷宗琦, 劉浥, 劉豫
【申請(qǐng)人】上海國(guó)睿生命科技有限公司