本發(fā)明屬于牙種植體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含抗菌肽的生物活性表面的牙種植體制備方法。

背景技術(shù)：

隨著牙種植體技術(shù)的不斷發(fā)展，和被醫(yī)患者廣泛的認(rèn)可，也是近年口腔醫(yī)學(xué)里發(fā)展最快的一個專業(yè)，不斷取得突破性進(jìn)展，正在為更多的牙疾患者提供專業(yè)幫助。然而，不得不承認(rèn)的另一現(xiàn)狀是，現(xiàn)有的介入裝置植入體內(nèi)后很容易發(fā)生感染。主要的感染機(jī)制是進(jìn)入體內(nèi)的細(xì)菌首先粘附在材料表面，由于體內(nèi)豐富的營養(yǎng)環(huán)境，細(xì)菌發(fā)生繁殖，形成了一層保護(hù)性的生物膜。生物膜的存在使得醫(yī)用裝置引發(fā)的感染尤為難治。

Roos.Jansaker等對種植術(shù)后患者進(jìn)行多年的隨訪，以存在探診出血同時未出現(xiàn)骨質(zhì)喪失為診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床病例統(tǒng)計，結(jié)果顯示，種植體周黏膜炎的發(fā)病率約為79％；甚至有研究表明，約有超過90％的種植體出現(xiàn)過探診出血。而種植體周圍炎可導(dǎo)致種植體周骨組織的缺損、喪失，如不及時治療可導(dǎo)致種植體的松動脫落。

生物活性肽是蛋白質(zhì)中20個天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱，是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物?；钚噪木哂卸喾N人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用。

由于牙種植體表面的主要成分通常處理為帶負(fù)電狀態(tài)。并將含有電正性基團(tuán)的聚合物如殼聚糖與牙種植體表面有較好的黏附作用。另外含有與羥基互為氫鍵給體/受體的基團(tuán)的聚合物，如海藻酸鈉、羥丙基纖維素等也可能與牙種植體表面有一定的黏附作用。

所以，牙種植體對材料的表面性質(zhì)要求非常高。因此，探索新型的牙種植體表面改性方法逐漸成為了種植領(lǐng)域的科研方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：公開一種含抗菌肽的生物活性表面的牙種植體制備方法，其所述抗菌肽層為覆蓋于表面為二氧化鈦納米管陣列層的牙種植體表面的，且由正電荷殼聚糖層和負(fù)電荷AMP復(fù)合物交替組裝，外層負(fù)載硫酸軟骨素層-抗菌肽層。

對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的含抗菌肽的生物活性表面的牙種植體制備方法，其中，所述抗菌肽層的制備方法包括以下操作步驟：

(1)將表面為二氧化鈦納米管陣列層的牙種植體清洗備用；

(2)制備0.5～5mg/ml的殼聚糖溶液：濃度為1mg/mlAMP復(fù)合物溶液；

(3)將步驟(1)所述的牙種植體浸沒于步驟(2)所得殼聚糖溶液中10～20min，以使牙種植體表面帶上正電荷；再用去離子水充分清洗；

(4)將步驟(3)所述的牙種植體浸沒于濃度為1mg/mlAMP復(fù)合物溶液中5～10min，以使牙種植體表面帶上負(fù)電荷；再用去離子水充分清洗；

根據(jù)需要組裝的層數(shù)，重復(fù)步驟(3)、(4)和(3)即可得到帶有不同層數(shù)涂層的牙種植體；

(5)將步驟(4)所述的牙種植體在濃度為2mg/mL的硫酸軟骨素硫酸鈉鹽溶液中浸泡5～15min，溶液體系控制pH值為6，再用去離子水充分清洗后自然干燥；再將涂覆有硫酸軟骨素的牙種植體浸泡于pH值為7，濃度為0.5mg/mL的抗菌肽溶液中5～15min，再用去離子水充分清洗后自然干燥，獲得涂覆有硫酸軟骨素層-抗菌肽層復(fù)合層的材料。

上述技術(shù)方案中，所述AMP為陽離子抗菌短肽，英文名稱:cationic antimicrobial peptides。

對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的含抗菌肽的生物活性表面的牙種植體制備方法，其中，所述的清洗是指去離子水，乙醇和丙酮超聲清洗，用氮氣吹干后，放于真空干燥箱中，在60℃的條件下干燥24小時。

對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的含抗菌肽的生物活性表面的牙種植體制備方法，其中，所述的殼聚糖的脫乙酰度為50～98％，Mw為100～1500kDa。

對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的含抗菌肽的生物活性表面的牙種植體制備方法，其中，所述的殼聚糖溶液為將殼聚糖溶解在0.3～3％的乙酸溶液中，配成0.5～5mg/ml的殼聚糖溶液，將所得溶液與液體石蠟混合，體積比為0.1～0.4，并加入體積濃度為0.5～1％的司盤80，同時加入分散劑硬脂酸鎂，司盤80與硬脂酸鎂的質(zhì)量比為2～4∶1，攪拌所得油包水乳液，向其中加入5～10mg/ml的交聯(lián)劑香草醛1ml，40℃～60℃攪拌狀態(tài)下反應(yīng)4～6小時后；靜置取上清液；再將所得的殼聚糖微粒以水懸浮，添加少量的冰醋酸溶液，磁力攪拌器攪拌條件下，再加入NaCl，使其終濃度達(dá)到0.15M；該溶液帶正電荷。

對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的含抗菌肽的生物活性表面的牙種植體制備方法，其中，所述靜置取上清液是指，靜置12小時以上分離油水相，取下層水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8～9，離心除去沉淀物，取上清液得到殼聚糖微粒懸浮液。

對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的含抗菌肽的生物活性表面的牙種植體制備方法，其中，所述濃度為lmg/ml的AMP復(fù)合物溶液的配置方法為：秤取50mg AMP復(fù)合物粉末加至50ml的滅菌后去離子水中，攪拌充分至完全溶解，加冰醋酸調(diào)pH為5.0，此溶液帶有正電荷。

本發(fā)明的創(chuàng)新特征是：

本發(fā)明所制備的帶有不同層數(shù)涂層的牙種植體。其涂層主要依靠陽離子與陰離子相互之間的靜電引力，在種植體固體表面形成有序排列的分子涂層，因為殼聚糖和AMP復(fù)合物層是具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。由于表層硫酸軟骨素層-抗菌肽層復(fù)合層結(jié)構(gòu)的存在，具有持久、高效的殺菌、抗感染能力，其抗菌、抗凋亡活性，能夠支持多種細(xì)胞(如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞)的粘附、存活、生長與分化，具有廣闊的應(yīng)用前景。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行等同替換或改變均屬于本發(fā)明保護(hù)范疇。

配置濃度為lmg/ml的AMP復(fù)合物溶液；

秤取50mg AMP復(fù)合物粉末加至50ml的滅菌后去離子水中，攪拌充分至完全溶解，加冰醋酸調(diào)pH為5.0，此溶液帶有正電荷。AMP復(fù)合物配置濃度為0.5mg/mL抗菌肽溶液

稱取5mg抗菌肽，將其溶解于10mL去離子水中，制備成pH值為7，濃度為0.5mg/mL抗菌肽溶液。

實施例1

(1)將表面為二氧化鈦納米管陣列層的牙種植體，依次用去離子水，乙醇和丙酮超聲清洗，用氮氣吹干后，放于真空干燥箱中，在60℃的條件下干燥24小時，放置備用；

(2)將殼聚糖溶解在0.3％的乙酸溶液中，配成0.5mg/ml的殼聚糖溶液，所述的殼聚糖的脫乙酰度為50％，Mw為1000kDa。

(3)將步驟(2)所得溶液與液體石蠟混合，體積比為0.1，并加入體積濃度為0.5％的司盤80，同時加入分散劑硬脂酸鎂，司盤80與硬脂酸鎂的質(zhì)量比為2∶1，室溫下攪拌1小時以上，形成均勻的油包水乳液；

(4)在將步驟(3)所得油包水乳液中加入5mg/ml的交聯(lián)劑香草醛1ml，40℃攪拌狀態(tài)下反應(yīng)4小時，得到殼聚糖微粒；

(5)將步驟(4)所得產(chǎn)物靜置12小時以上分離油水相，取下層水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8，離心除去沉淀物，取上清液得到殼聚糖微粒懸浮液

(6)向去離子水中加入步驟(5)所得的殼聚糖微粒懸浮液，添加lml的冰醋酸溶液，磁力攪拌器攪拌條件下，再加入NaCl，使其終濃度達(dá)到0.15M；該溶液帶正電荷；

實施例2

(1)將表面為二氧化鈦納米管陣列層的牙種植體，依次用去離子水，乙醇和丙酮超聲清洗，用氮氣吹干后，放于真空干燥箱中，在60℃的條件下干燥24小時，放置備用；

(2)將殼聚糖溶解在3％的乙酸溶液中，配成5mg/ml的殼聚糖溶液，所述的殼聚糖的脫乙酰度為98％，Mw為1500kDa。

(3)將步驟(2)所得溶液與液體石蠟混合，體積比為0.4，并加入體積濃度為1％的司盤80，同時加入分散劑硬脂酸鎂，司盤80與硬脂酸鎂的質(zhì)量比為4∶1，室溫下攪拌1小時以上，形成均勻的油包水乳液；

(4)在將步驟(3)所得油包水乳液中加入10mg/ml的交聯(lián)劑香草醛1ml，60℃攪拌狀態(tài)下反應(yīng)6小時，得到殼聚糖微粒；

(5)將步驟(4)所得產(chǎn)物靜置12小時以上分離油水相，取下層水溶液，調(diào)節(jié)pH值為9，離心除去沉淀物，取上清液得到殼聚糖微粒懸浮液

(6)向去離子水中加入步驟(5)所得的殼聚糖微粒懸浮液，添加lml的冰醋酸溶液，磁力攪拌器攪拌條件下，再加入NaCl，使其終濃度達(dá)到0.15M；該溶液帶正電荷；

實施例3

將實施例1中步驟(1)處理得到的牙種植體浸沒于上文實施例1和2所述的殼聚糖溶液中10～20min，以使牙種植體表面帶上正電荷；再用去離子水充分清洗；

將上述清洗后的牙種植體浸沒于上文所述的濃度為1mg/mlAMP復(fù)合物溶液中10～20min，以使牙種植體表面帶上負(fù)電荷；再用去離子水充分清洗；

處理得到的牙種植體浸沒于上文實施例1和2所述的殼聚糖溶液中10～20min，以使牙種植體表面帶上正電荷；再用去離子水充分清洗；

根據(jù)需要組裝的層數(shù)，重復(fù)實施例3的步驟2次以上，即可得到帶有不同層數(shù)涂層的牙種植體。

實施例4

將實施例3中根據(jù)需要組裝不同層數(shù)涂層的牙種植體，在濃度為2mg/mL的硫酸軟骨素硫酸鈉鹽溶液(帶有負(fù)電荷的多糖溶液)中浸泡10～20min，溶液體系控制pH值為6，再用去離子水充分清洗后自然干燥；

將涂覆該有硫酸軟骨素的材料浸泡于pH值為7，濃度為0.5mg/mL的抗菌肽溶液中15min，再用去離子水充分清洗后自然干燥，獲得涂覆有硫酸軟骨素層-抗菌肽層復(fù)合層的材料。

針對上述方法制備獲得的牙種植體，進(jìn)行表面接觸角分析，其結(jié)果從親水性和潤濕性上也證實了涂層的存在。根據(jù)分析可知，本發(fā)明所制備的帶有不同層數(shù)涂層的牙種植體。其涂層主要依靠陽離子與陰離子相互之間的靜電引力，在種植體固體表面形成有序排列的分子涂層，因為殼聚糖和AMP復(fù)合物是具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。由于表層硫酸軟骨素層-抗菌肽層復(fù)合層結(jié)構(gòu)的存在，具有持久、高效的殺菌、抗感染能力，其抗菌、抗凋亡活性，能夠支持多種細(xì)胞(如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞)的粘附、存活、生長與分化，具有廣闊的應(yīng)用前景。