本發(fā)明涉及鹽酸石蒜堿(lycorinechloride)的一種新用途，具體涉及鹽酸石蒜堿在治療肺纖維化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺纖維化的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括吸煙，空氣污染，自身免疫性疾病，病毒，不當(dāng)?shù)闹委煼椒ǖ?。如：sars病毒可使部分患者發(fā)生纖維化，治療過程中大量抗菌素的使用可加速纖維化的進程，導(dǎo)致嚴(yán)重后遺癥。特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis,ipf)是肺纖維化疾病中最常見、最嚴(yán)重、也是最難治的一種疾病，這是一種進行性發(fā)展、致死性的、病因不明的間質(zhì)性肺疾病。其特征是肌纖母細胞大量聚集和膠原等細胞外基質(zhì)(ecm)過度積累而形成的散布在肺間質(zhì)中并不斷擴展的纖維化灶(fibroblastfoci)。在低倍鏡下，肺組織表現(xiàn)異質(zhì)性，即正常組織中夾雜病變區(qū)域(包括間質(zhì)炎癥,纖維化和蜂窩樣改變)，組織病理呈現(xiàn)普通型間質(zhì)性肺炎(usualinterstitialpneumonia，uip)特征。纖維化灶處，肺泡和肺間質(zhì)組織發(fā)生異常重構(gòu)，隨著病情的發(fā)展，纖維化灶的數(shù)量增多，區(qū)域連續(xù)擴大，患者肺通氣功能損害嚴(yán)重，出現(xiàn)進行性呼吸困難，最終將導(dǎo)致死亡。傳統(tǒng)臨床治療以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，但效果均不理想且有嚴(yán)重副作用；近些年嘗試的三藥聯(lián)用(prednisone、azathioprine和nac)也被證實增加死亡危險和住院率。ipf是一種在世界范圍內(nèi)都難以治療的疾病，預(yù)后極差，其平均生存率只有2.8年，約70％～80％的病人在確診后的5年內(nèi)死去，死亡程度甚至比很多癌癥更高。伴隨近年經(jīng)濟建設(shè)發(fā)展而來對環(huán)境的影響，肺纖維化的發(fā)病率在包括中國和美國在內(nèi)的很多國家中處于持續(xù)增長狀態(tài)。由于肺纖維化的發(fā)病機制尚未闡明，目前臨床缺乏有效的藥物和治療手段延長患者生命或提高其生活質(zhì)量。因此闡明纖維化的發(fā)生發(fā)展機制是提高其防治水平的關(guān)鍵，同時也有利于探索新的潛在的藥物靶點，對于開發(fā)有效抗纖維化治療方法具有重要的社會意義和醫(yī)學(xué)意義。肺纖維化成因復(fù)雜，tgf-β是目前已知最重要的一類促肺纖維化因子，在肺纖維化發(fā)病過程中起著重要的中心調(diào)控作用。tgf-β1是一個多功能的生長因子，以組織特異，或細胞特異的方式參與調(diào)控生命過程。tgf-β1在組織損傷修復(fù)過程中起非常重要的作用，通過誘導(dǎo)下游smad或非smad信號途徑的活化，從而促進纖維化的發(fā)生發(fā)展。tgf-β1在調(diào)控上皮細胞損傷和凋亡，myofibroblasts增殖、分化和遷移，增加myofibroblasts群規(guī)模,促進ecm的合成等肺纖維化的各個過程中顯示重要的促進作用。目前已經(jīng)有實驗證明過表達tgf-β1的轉(zhuǎn)基因小鼠可自發(fā)形成肺纖維化。很多分子和信號參與調(diào)節(jié)tgf-β1信號通路，如：ctgf,integrin,erkmapk,通過局部特異性的影響tgf-β1的活化，配體-受體相互作用，以及通路中酪氨酸激酶的活性，調(diào)節(jié)tgf-β1的功能。tgf-β及其下游信號在ipf的發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用，使之成為一個有吸引力的治療目標(biāo)。然而，由于tgf-β在正常組織穩(wěn)態(tài)中的多效性，使得在治療中完全抑制tgf-β將會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。確定和靶向tgf-β信號的組織或疾病特異性的調(diào)控機制是近年來肺纖維藥物研發(fā)重點。例如整合素αvβ6在肺纖維化發(fā)病時表達上調(diào)，可在肺局部微環(huán)境中結(jié)合并激活tgf-β前體。低劑量的整合素αvβ6抗體并不影響肺泡炎癥細胞數(shù)以及巨噬細胞活化標(biāo)志物，但可顯著抑制膠原沉積以及肺纖維化。相關(guān)問題的闡述有利于肺纖維化機制深入研究，同時可調(diào)節(jié)tgf-β1功能的天然藥物活性小分子的發(fā)現(xiàn)將對肺纖維化乃至多種臟器纖維化藥物治療的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。盡管近年來在肺纖維化的治療領(lǐng)域已經(jīng)取得了諸多進展，但是許多治療方案仍然無法獲得令人滿意的療效。在世界范圍，尤其是中國，肺纖維化的治療仍然是臨床上亟待解決的課題之一。因此，本領(lǐng)域非常需要多種藥物來治療肺纖維化。目前，本領(lǐng)域中用于抑制tgf-β，從而抑制肺纖維化的治療選擇非常有限。石蒜堿是存在于石蒜科植物石蒜的鱗莖內(nèi)的生物堿。隨著近年來對石蒜屬生物堿藥用的不斷研究，發(fā)現(xiàn)了許多新的治療作用。這些生物堿，如鹽酸石蒜堿，不僅具有抗炎、抗菌、抗癌作用，還具有抑制膽堿酯酶和興奮神經(jīng)肌肉作用，在醫(yī)學(xué)上被用于心血管疾病及老年癡呆癥的治療。截至目前，尚無鹽酸石蒜堿能夠抑制tgf-β信號通路以及減緩肺纖維化的相關(guān)報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明公開的鹽酸石蒜堿在制備治療肺纖維化的組合物的用途。本發(fā)明公開的鹽酸石蒜堿在制備治療肺纖維化的組合物的用途，鹽酸石蒜堿的用量為10mg/kg。本發(fā)明公開的鹽酸石蒜堿減緩博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，為治療、緩解或改善纖維化肺疾病或癥狀提供巨大的應(yīng)用前景。本發(fā)明公開的鹽酸石蒜堿在制備治療肺纖維化的組合物的用途，制備藥物、保健品、或功能性食品的應(yīng)用。本發(fā)明公開的鹽酸石蒜堿在制備治療肺纖維化的組合物的用途，賦形劑或載體為制藥或食品領(lǐng)域中常用的賦形劑或載體，如稀釋劑，崩解劑，潤滑劑。本發(fā)明公開的鹽酸石蒜堿在制備治療肺纖維化的組合物的用途，通過口服或注射形式使用。附圖說明圖1:鹽酸石蒜堿抑制tgf-β1誘導(dǎo)的肌纖維母細胞分化圖2：鹽酸石蒜堿減輕博萊霉素所誘導(dǎo)的羥脯氨酸合成具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇抑改?紐約，冷泉港實驗室出版社，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。實施例1鹽酸石蒜堿抑制tgf-β1誘導(dǎo)的肌成纖維母細胞分化本實例所用細胞為小鼠肺成纖維細胞系mlg，從americantypeculturecollection(atcc)獲得。mlg成纖維細胞長滿后，0.1％血清處理24小時后，加入5ng/mltgf-β1蛋白和終濃度為5μmol/l鹽酸石蒜堿或相同體積dmso對照。處理12小時收集rna進行實時熒光定量pcr檢測α-sma；處理24小時后收集細胞利用westernblotting檢測α-sma蛋白的表達。實時熒光定量pcr是指從細胞中利用trizol(invitrogen)制備總rna，利用thermoscriptrt-pcr試劑盒(invitrogen)合成cdna，使用sybrgreen試劑盒(roche)檢測α-sma的表達?；蛳鄬Ρ磉_利用2-δ(δct)方法進行計算，β-actin作為內(nèi)參。各基因引物列于表二。westernblotting檢測是指細胞用ripa裂解液裂解獲得細胞總蛋白。利用bca系統(tǒng)(pierce)測定蛋白濃度。細胞蛋白中加入samplebuffer，100度變性，利用sds-page膠分離蛋白。將蛋白濕轉(zhuǎn)到pvdf膜(roche)上，牛奶封閉后，一抗4度孵育過夜，含0.1％的tbs溶液洗后，hrp酶標(biāo)二抗室溫孵育2小時。利用ecl系統(tǒng)(pierce)檢測蛋白表達量。用于westernblotting的一抗：α-sma和β-actin(sigma)。我們發(fā)現(xiàn)在tgf-β1處理小鼠肺成纖維細胞這一體外模型下，鹽酸石蒜堿能夠明顯抑制tgf-β1所誘導(dǎo)的α-smamrna和蛋白的表達(表三，圖1)，表明鹽酸石蒜堿能抑制tgf-β1誘導(dǎo)的肌成纖維母細胞分化。圖1為鹽酸石蒜堿抑制tgf-β1誘導(dǎo)的肌纖維母細胞分化。小鼠成纖維細胞mlg長滿后，0.1％血清處理24小時后，加入5ng/mltgf-β1蛋白和終濃度為5μmol/l鹽酸石蒜堿或相同體積dmso對照，之后檢測肌纖維母細胞中a-sma(a)mrna和(b)蛋白的水平。表二引物序列基因前引物后引物α-smagctggtgatgatgctcccagcccattccaaccattactccβ-actinaggccaaccgtgaaaagatgagagcatagccctcgtagatgg表三鹽酸石蒜堿抑制tgf-β1誘導(dǎo)的α-smamrna表達實施例2鹽酸石蒜堿減緩博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化肺纖維化動物模型制備是指雄性c57bl/6j(周齡8-10周)野生型小鼠，以7.5％水合氯醛按0.6ml/100g腹腔(i.p.)注射麻醉小鼠，氣管內(nèi)注射博萊霉素2.5u/kg。具體方案如下：稱量體重并記錄后將小鼠固定于操作臺，頸部用70％酒精消毒，利用手術(shù)刀在小鼠頸部垂直劃開大約1cm長，利用顯微鑷分離組織暴露氣管，將注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，然后按2.5u/kg的計量緩慢注入與其體重相適應(yīng)體積的博萊霉素生理鹽水溶液，立即將動物直立并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。鹽酸石蒜堿治療是指在博萊霉素處理第7-14天時，通過腹腔注射10mg/kg鹽酸石蒜堿，以相應(yīng)溶劑羧甲基纖維素鈉(cmc-na)作為對照；博萊霉素處理14天后，檢測肺纖維化及膠原含量。羥脯氨酸含量測定是指小鼠在博萊霉素注射14天處死小鼠，取右肺，剔除支氣管，放于5ml安瓿瓶，烘干，酸水解，調(diào)整其ph到6.5-8.0，過濾殘渣，pbs調(diào)整其總體積為10ml，取50μl樣品，加入350μl去離子水，加入200μl氯胺t(chloraminet)溶液室溫孵育20分鐘；加入200μl高氯酸(perchloricacid)室溫孵育5分鐘；加入200μl對二甲氨基苯甲醛(p-dmab)65℃孵育20分鐘。取200μl至96孔板中測定樣品557nm的吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而利用標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式求得所測樣品羥脯氨酸濃度cs。按以下公式換算為全部右肺所含羥脯氨酸的量w：w＝cs×8(所測樣品稀釋倍數(shù))×10(樣品總體積)。博萊霉素(2.5u/kg)處理c57bl/6j小鼠誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生，處理后第7-14天經(jīng)腹腔注射鹽酸石蒜堿或相對應(yīng)的溶劑cmc-na，小鼠在博萊霉素處理14天后取肺組織觀察纖維化程度(圖2a)。對小鼠肺組織切片進行h&e染色，發(fā)現(xiàn)注射鹽酸石蒜堿的小鼠肺纖維化程度低于注射cmc-na的小鼠(圖2b)。與注射cmc-na的小鼠相比，注射鹽酸石蒜堿的小鼠肺組織中羥脯氨酸的含量明顯降低(表四，圖2c)，這說明鹽酸石蒜堿確實能夠減輕博萊霉素所誘導(dǎo)的膠原含量。圖2為鹽酸石蒜堿減輕博萊霉素所誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。(圖2a)鹽酸石蒜堿處理小鼠的圖示。2.5u/kg博萊霉素處理c57bl/6j小鼠后，第7-14天經(jīng)腹腔注射10mg/kg鹽酸石蒜堿或相對應(yīng)的溶劑羧甲基纖維素鈉(cmc-na)，博萊霉素處理14天后取樣檢測；(圖2b)h&e染色驗證新橙皮苷抑制博萊霉素誘導(dǎo)的進行性肺組織纖維化。標(biāo)尺：100μm；(圖2c)羥脯氨酸檢測驗證鹽酸石蒜堿抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺組織中膠原合成。*,p<0.05，即統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。表四鹽酸石蒜堿抑制博萊霉素誘導(dǎo)的羥脯氨酸(微克/右肺)實施例3鹽酸石蒜堿的制劑鹽酸石蒜堿片劑鹽酸石蒜堿5mg,淀粉92g,硬脂酸鎂3g制備工藝：取鹽酸石蒜堿過100目篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，壓片，即得。鹽酸石蒜堿膠囊鹽酸石蒜堿5mg,預(yù)膠化淀粉92g,硬脂酸鎂3g制備工藝：取鹽酸石蒜堿過100目篩，加預(yù)膠化淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，裝膠囊，即得。鹽酸石蒜堿注射液鹽酸石蒜堿43mg，注射用氯化鈉7mg制備工藝：取鹽酸石蒜堿過100目篩，加1.9ml注射用水溶解，加入注射用氯化鈉至等滲，調(diào)節(jié)ph值至8.0，濾過，冷藏24小時，加注射用水至規(guī)定量，濾過，灌封，滅菌，即得。當(dāng)前第1頁12