本發(fā)明涉及化學(xué)物質(zhì)在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。更具體的說是人參皂苷作為乙酰肝素酶抑制劑的應(yīng)用，也涉及人參皂苷在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景乙酰肝素酶(Heparanase，HPSE-1)是一種哺乳動物的β-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，是迄今被發(fā)現(xiàn)的唯一能切割乙酰硫酸肝素(HS)的內(nèi)切酶，乙酰肝素酶從特定位點切斷HS鏈產(chǎn)生約5-7kD的片段。乙酰肝素酶通過切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)上的HS鏈以促進(jìn)細(xì)胞的遷移和浸潤過程。乙酰肝素酶在肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。同時，HPSE還能將HS鏈上結(jié)合的VEGF、bFGF、HGF等血管新生促進(jìn)因子釋放到腫瘤細(xì)胞的附近，誘導(dǎo)腫瘤組織的血管新生。因此乙酰肝素酶的拮抗劑能夠抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。多種乙酰肝素酶的拮抗劑正處于研發(fā)階段?？贵w和疫苗類拮抗劑生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，還經(jīng)常引起劇烈的免疫反應(yīng)?，F(xiàn)有的抑制劑如肝素類似物和硫酸化多糖，很難制備單體并常常伴隨抗凝血作用。PI-88是澳大利亞Progen公司生產(chǎn)的乙酰肝素酶抑制劑，相對分子質(zhì)量為2300,是高度硫酸化的甘露聚糖寡聚糖的混合物，是有前景的抗腫瘤候選藥物，其作為抗腫瘤藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床研究。與這些物質(zhì)相比小分子抑制劑制備簡單、產(chǎn)品純度高、藥物傳遞方便、半衰期長等優(yōu)點，是現(xiàn)代抑制劑類藥物研發(fā)的熱點。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有乙酰肝素酶拮抗劑作為抗腫瘤藥物所存在的問題，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了人參皂苷作為乙酰肝素酶抑制劑的應(yīng)用，進(jìn)一步涉及其作為乙酰肝素酶抑制劑在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤包括：結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌。本發(fā)明還公開了一種用于腫瘤分子靶向治療的藥物組合物，其包含人參皂苷及藥學(xué)上可接受的載體。所述人參皂苷選自和乙酰肝素酶蛋白存在相互作用的人參皂苷。優(yōu)選的，所述人參皂苷選自人參皂苷Rk1、(20S)-人參皂苷Rh2、人參皂苷Rk2、(20R)-人參皂苷PPT、(20S)-人參皂苷PPD、(20S)-人參皂苷PPT、(20R)-人參皂苷PPD、人參皂苷Rh3、(20S)-人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh4。最優(yōu)選的，所述人參皂苷為人參皂苷Rk1。本發(fā)明還公開了一種用于肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌靶向治療的藥物組合物，其包含人參皂苷及藥學(xué)上可接受的載體。所述的藥物組合物中，所述人參皂苷選自人參皂苷Rk1、(20S)-人參皂苷Rh2、人參皂苷Rk2、(20R)-人參皂苷PPT、(20S)-人參皂苷PPD、(20S)-人參皂苷PPT、(20R)-人參皂苷PPD、人參皂苷Rh3、(20S)-人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh4。本發(fā)明中，人參皂苷Rk1，化學(xué)名是3β,6α,12β-trihydroxydammar-20(21),24-diene-6-O-β-D-glucopyranoside，分子式C42H70O12，分子量767.0無臭，白色粉末狀?？扇苡诩状肌⒁掖?，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：494753-69-4，結(jié)構(gòu)式為：(20S)-人參皂苷Rh2，化學(xué)名是3-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，分子式：C36H62O8，分子量：622.4，無臭，白色粉末狀?？扇苡诩状?、乙醇，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：78214-33-2，結(jié)構(gòu)式為：人參皂苷Rk2，化學(xué)名是3-O-β-D-glucopyranosyl-20(-H2O)-cis-protopanaxadio，分子式：C36H60O7，分子量：604.4，無臭，白色粉末狀。可溶于甲醇、乙醇，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：364779-14-6，結(jié)構(gòu)式為：(20R)-人參皂苷PPT，化學(xué)名是20(R)-protopanaxatriol，分子式：C30H52O4，分子量：476.7，無臭，白色粉末狀。可溶于甲醇、乙醇，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：1453-93-6，結(jié)構(gòu)式為：(20S)-人參皂苷PPD，化學(xué)名是20(S)-protopanaxadiol，分子式：C30H52O3，分子量：460.7，無臭，白色粉末狀。可溶于甲醇、乙醇，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：30636-90-9，結(jié)構(gòu)式為：(20S)-人參皂苷PPT，化學(xué)名是20(S)-protopanaxatriol，分子式：C30H52O4，分子量：476.7，無臭，白色粉末狀?？扇苡诩状?、乙醇，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：34080-08-5，結(jié)構(gòu)式為：(20R)-人參皂苷PPD，化學(xué)名是20(R)-protopanaxadiol，分子式：C30H52O3，分子量：460.7，無臭，白色粉末狀?？扇苡诩状?、乙醇，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：7755-01-3，結(jié)構(gòu)式為：人參皂苷Rh3，化學(xué)名是3-O-β-D-glucopyranosyl-20(-H2O)-cis-protopanaxadiol，分子式：C36H60O7，分子量：604.4，無臭，白色粉末狀?？扇苡诩状肌⒁掖?，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：105558-26-7，結(jié)構(gòu)式為：(20S)-人參皂苷Rh1，化學(xué)名是6-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol，分子式：C36H62O9，分子量：638.4，無臭，白色粉末狀。可溶于甲醇、乙醇，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：63223-86-9，結(jié)構(gòu)式為：人參皂苷Rh4，化學(xué)名是β-D-Glucopyranoside,(3β,6α,12β,20E)-3,12-dihydroxydammara-20(22),24-dien-6-yl，分子式：C36H60O8，分子量：620.87，無臭，白色粉末狀?？扇苡诩状?、乙醇，微溶與乙酸乙酯，水溶性較差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS號：174721-08-5，結(jié)構(gòu)式為：因此，基于天然化合物開發(fā)腫瘤分子靶向治療藥物，既有優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，也對天然化合物的應(yīng)用轉(zhuǎn)化有推進(jìn)作用。人參自古是補虛調(diào)神之良藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載人參“主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，……開心益智”。人參皂苷Rk1是鮮人參在加工成紅參時，由某些二醇組皂苷受熱降解后生成的一種珍貴的次生苷，在紅參中的含量很低，但它是人參的有效活性成分之一，有廣泛較強(qiáng)的藥理活性。目前，針對人參皂苷Rk1以及其它種類人參皂苷(包括原人參二醇皂苷及原人參三醇皂苷)尚無作為乙酰肝素酶抑制劑應(yīng)用的報道，本發(fā)明將在乙酰肝素酶抑制劑用于癌癥的治療上具有重大意義。附圖說明圖1為人參皂苷Rk1處理細(xì)胞后乙酰肝素酶成熟體含量的柱狀圖；圖2為人參皂苷Rk1殺傷腫瘤細(xì)胞時細(xì)胞生存率柱狀圖；圖3為人參皂苷Rk1有效降低人源肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力實驗結(jié)果圖。具體實施方式實施例1安全性評價本發(fā)明的非臨床安全性評價的研究結(jié)果如下：1、小鼠口服急性毒性試驗在最大給藥濃度和最大給藥容量條件，小鼠口服灌胃給予人參皂苷Rk112g/kgwt.，連續(xù)觀察14天，動物未見死亡及異常毒性反應(yīng)。表明人參皂苷Rk1小鼠灌胃的最大耐受量為12g/kgwt.。2、Beagle犬口服急性毒性試驗在最大給藥濃度和最大給藥容量條件，Beagle犬口服灌胃給予人參皂苷Rk12g/kgwt.，連續(xù)觀察14天，動物未見死亡及異常毒性反應(yīng)。表明人參皂苷Rk1Beagle犬灌胃的最大耐受量為2g/kgwt.。3、大鼠灌胃給藥的長期毒性人參皂苷Rk1(100mg/kgwt.、300mg/kgwt.和500mg/kgwt.)SD大鼠連續(xù)口服灌胃三個月后停藥恢復(fù)四周長期毒性試驗。結(jié)果顯示：①一般情況：在給藥和恢復(fù)期間，攝食飲水正常，體重增加，動物皮毛光滑，行為活動正常；②血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)：在給藥結(jié)束和恢復(fù)期后，動物血液學(xué)和血液生化學(xué)各指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)波動，未見明顯異常；③骨髓和尿常規(guī)指標(biāo)：在給藥結(jié)束和恢復(fù)期后，動物骨髓和尿常規(guī)各指標(biāo)未見明顯異常；④組織病理學(xué)指標(biāo)：在給藥結(jié)束和恢復(fù)期后，動物各臟器肉眼未見明顯異常，臟器重量和臟器系數(shù)與對照組相比未見顯著差異，各臟器病理未見明顯異常改變。結(jié)果表明，SD大鼠長期給藥人參皂苷Rk1未見明顯毒性反應(yīng)。4、對Beagle犬灌胃給藥的長期毒性試驗人參皂苷Rk1(50mg/kgwt.、100mg/kgwt.和150mg/kgwt.)Beagle犬連續(xù)口服灌胃三個月后停藥恢復(fù)四周長期毒性試驗。結(jié)果顯示：①一般情況：在給藥和恢復(fù)期間，攝食、飲水和體溫正常，體重增加，動物皮毛光滑，行為活動正常；②血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)：在給藥結(jié)束和恢復(fù)期后，動物血液學(xué)和血液生化學(xué)各指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)波動，未見明顯異常；③心電圖指標(biāo)：在給藥結(jié)束和恢復(fù)期后，動物心電圖各指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)波動，未見明顯異常；④骨髓和眼科檢查：在給藥結(jié)束和恢復(fù)期后，動物骨髓細(xì)胞和各分類細(xì)胞未見異常；眼科檢查各組動物眼底血管紋路清晰無出血滲出，視乳頭無水腫，動靜脈管徑比正常；⑤免疫學(xué)和尿糞檢測指標(biāo)：在給藥結(jié)束和恢復(fù)期后，動物免疫學(xué)和尿糞檢測各指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)波動，未見明顯異常；⑥組織病理學(xué)指標(biāo)：在給藥結(jié)束和恢復(fù)期后，動物各臟器肉眼未見明顯異常，臟器重量和臟器系數(shù)與對照組相比未見顯著差異，各臟器病理未見明顯異常改變。結(jié)果表明，Beagle犬長期給藥人參皂苷Rk1未見明顯毒性反應(yīng)。5、一般藥理學(xué)試驗麻醉Beagle犬口服灌胃人參皂苷Rk1(25mg/kgwt.、50mg/kgwt.、100mg/kgwt.)后，Beagle犬的血壓(舒張壓、收縮壓)、心率無明顯影響，P波、T波、R波和QRS間期、PR間期、Q-T間期、呼吸頻率以及呼吸幅度也無明顯影響。人參皂苷Rk1(150mg/kgwt.、300mg/kgwt.和500mg/kgwt.)對小鼠Irwin’s行為試驗評分及爬桿試驗評分均無明顯影響。表明人參皂苷Rk1在試驗條件下不影響動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)。6、致突變試驗哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞(CHL)染色體畸變試驗、Ames試驗和小鼠微核試驗顯示，人參皂苷Rk1無致突變作用。實施例2藥效學(xué)本發(fā)明的研究結(jié)果如下：1、人參皂苷Rk1下調(diào)乙酰肝素酶成熟體含量材料：人源肺癌細(xì)胞A549，乙酰肝素酶特異性抗體(SantaCruz)，人參皂苷Rk1(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>99％)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(BioRad)。方法：培養(yǎng)人源肺癌細(xì)胞A549至對數(shù)生長期，以2.0×106個/板傳代于100mm細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基中加入人參皂苷Rk1乙醇溶液至人參皂苷Rk1的終濃度分別為1、2、3、4、5μg/mL(儲存液為1mg/mL的人參皂苷Rk1乙醇溶液)，37℃、5％CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)4h，收集細(xì)胞，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳——免疫印記檢測，結(jié)果如圖1所示，隨著人參皂苷Rk1濃度的加大，乙酰肝素酶成熟體的含量呈濃度依賴的方式降低。2、多種人參皂苷均能結(jié)合乙酰肝素酶通過分子模擬對各種人參皂苷與乙酰肝素酶蛋白的結(jié)合能力進(jìn)行分析表明多種人參皂苷均可以與乙酰肝素酶蛋白結(jié)合(分子模擬方法基于LamarckianGeneticAlgorithm(ScrippsResearchInstitute,LaJolla,CA,USA)在AutoDock中完成，結(jié)合自由能和解離常數(shù)由工作站生成)，結(jié)果見表1。表1人參皂苷與乙酰肝素酶蛋白結(jié)合自由能及解離常數(shù)人參皂苷結(jié)合自由能(kcal/mol)解離常數(shù)(μM)人參皂苷Rk1-7.962.13(20S)-人參皂苷PPD-7.714.91(20R)-人參皂苷PPT-7.626.28(20S)-人參皂苷PPT-6.979.15(20R)-人參皂苷PPD-6.9212.55人參皂苷Rh3-6.6222.91(20S)-人參皂苷Rh1-6.5626.09人參皂苷Rh4-6.5241.51(20S)-人參皂苷Rh2-5.9151.05人參皂苷Rk2-5.7157.623、人參皂苷Rk1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡材料：人源肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，人肝癌細(xì)胞系HepG2，人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，人乙酰肝素酶特異性抗體(SantaCruz)，CCK8試劑盒(Sigma)，人參皂苷Rk1(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>99％)。方法：將4種腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，8000個/孔傳代于96空培養(yǎng)板中，37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基中加入人參皂苷Rk1乙醇溶液至人參皂苷Rk1的終濃度分別為1、2、5、10、15、25、50μg/mL(儲存液為1mg/mL的人參皂苷Rk1乙醇溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，使用CCK8試劑盒對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果如圖2所示，人參皂苷Rk1對多種腫瘤細(xì)胞均具有殺傷作用。4、人參皂苷Rk1抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移材料：人源肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，matrigel基質(zhì)膠(BD)，transwell小室(corning)，人參皂苷Rk1(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>99％)。方法：使用DMEM培養(yǎng)基按1：5(v/v)稀釋matrgel基質(zhì)膠，100μL每孔加入transwell小室上室，37℃、5％CO2放置過夜。將培養(yǎng)至對數(shù)期的A549細(xì)胞消化，稀釋至細(xì)胞濃度5×105個/mL，100μL每孔加入transwell小室上室，在下室中加入500μL含10％胎牛血清(v/v)的DMEM培養(yǎng)基。實驗組加入人參皂苷Rk1乙醇溶液至終濃度5μg/mL(儲存液為1mg/mL的人參皂苷Rk1乙醇溶液)，陰性對照組加入等體積乙醇，37℃、5％CO2培養(yǎng)48h。清除上室中的細(xì)胞以及基質(zhì)膠，對下室中的細(xì)胞進(jìn)行甲醇固定、結(jié)晶紫染色，光鏡下觀察。實驗結(jié)果表明，5μg/mL人參皂苷Rk1有效降低人源肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力(圖3)。5、乙酰肝素酶在腫瘤組織的表達(dá)水平人腫瘤組織芯片購買于上海上海芯超生物科技有限公司(肝細(xì)胞癌：HLivH180Su06；胃癌：HStmA180Su09；結(jié)腸直腸癌：HColA180Su11；胰腺癌：PanA150CS02；食管癌：HEsoS180Su06；卵巢癌：HUteA060CS01；乳腺癌：HBreD145Su01；宮頸癌：HUteA060CS01；前列腺癌：HProA180PG03)，并利用免疫組織化學(xué)檢測乙酰肝素酶在腫瘤組織中的表達(dá)水平。并使用乙酰肝素酶特異性抗體(一抗、二抗均為SantaCruz公司免疫組織化學(xué)用途抗體)，使用AEC顯色系統(tǒng)(sigma)對組織切片進(jìn)行染色。在顯微鏡高倍視野(×200)，計陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞<5％為0分，6％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，>76％為4分。再按染色強(qiáng)度分為0～3分，兩者相乘的結(jié)果對腫瘤組織進(jìn)行評分，0～1為-，2～4為+，5～8為++，9～12為+++。乙酰肝素酶在腫瘤組織的表達(dá)水平如表2所示。乙酰肝素酶在腫瘤組織中呈現(xiàn)中高水平表達(dá)，所述腫瘤包括：結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌。表2乙酰肝素酶在腫瘤組織中的表達(dá)水平當(dāng)前第1頁1 2 3