本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及人參皂苷Rg1及其活性代謝產(chǎn)物原人參三醇PPT作為非經(jīng)典炎癥小體抑制劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

感染性休克亦稱膿毒性休克是指由微生物及其毒素產(chǎn)物引起的膿毒病綜合征伴休克。感染灶中的微生物及其毒素激活宿主的各種細(xì)胞和體液系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子和內(nèi)源性介質(zhì)作用于機(jī)體的各種器官，導(dǎo)致器官功能障礙甚至衰竭。病原菌入侵機(jī)體釋放出內(nèi)毒素誘發(fā)感染性休克，細(xì)菌內(nèi)毒素可通過激活炎癥小體的第一信號使炎癥因子的表達(dá)量增加；進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)毒素可以激活炎癥小體的第二信號使caspase-11/4/5剪切活化從而使炎癥因子的分泌量增加同時誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，細(xì)胞焦亡即細(xì)胞釋放出大量的乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性增加，從而細(xì)胞的死亡率增加。細(xì)胞焦亡本質(zhì)上是一種程序性細(xì)胞壞死，細(xì)胞膜形成孔洞，細(xì)胞逐漸膨脹至細(xì)胞膜破裂，最終導(dǎo)致大量細(xì)胞內(nèi)容物釋放，激活劇烈的炎癥反應(yīng)。免疫細(xì)胞大量焦亡，免疫系統(tǒng)坍塌，造成多器官損傷，進(jìn)而導(dǎo)致感染性休克。因此抑制細(xì)胞焦亡在感染性休克的治療過程中具有重要意義。

參麥注射液的主要成分人參具有抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能等多方面的作用。目前從人參中提取出的有效成分有皂苷糖類和蛋白質(zhì)，人參皂苷為人參的主要有效成分之一。CN200710009171.0公開了人參皂苷Rg1治療、預(yù)防阿爾茨海默病的用途；CN200810103061.5公開了人參皂苷Rg1、Rh1、ppt在抗認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶功能障礙的用途；CN201110022884.7公開了人參皂苷Rg1在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用；CN201410751138.5公開了人參皂苷Rg1作為CCL2-CCR2信號通路抑制劑及中樞抗炎藥物的應(yīng)用；CN201410378683.4公開了人參皂苷Rg1預(yù)防或治療心肌缺血的藥物中的應(yīng)用；CN201410565911.9公開了人參皂苷Rg1在制備治療膽汁酸升高制劑中的應(yīng)用；CN201410707438.3公開了原人參三醇在預(yù)防和改善代謝性疾病的作用；CN201610427621.7公開了胡椒堿在因感染而引起引起細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物的應(yīng)用；CN200810228187.5公開了人參皂苷Re的抗休克作用；CN201410638185.9公開了一種治療感染性休克并發(fā)多器官功能不全綜合征的中藥組合物。以上相關(guān)專利揭示了人參皂苷在抗炎、抗心血管及代謝相關(guān)疾病中的應(yīng)用，以及其它藥物通過抑制細(xì)胞焦亡保護(hù)組織器官在感染性疾病中的應(yīng)用。人參皂苷Rg1及其活性代謝產(chǎn)物PPT抑制細(xì)胞焦亡，目前尚未見報道。本專利首次公開人參皂苷Rg1及其代謝產(chǎn)物PPT作為新型的非經(jīng)典炎癥小體通路中caspase11抑制劑抑制細(xì)胞焦亡的應(yīng)用，及利用該機(jī)制將Rg1及PPT制備成為抗感染性休克藥物的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在公開人參皂苷Rg1及其活性代謝產(chǎn)物PPT作為新型的非經(jīng)典炎癥小體通路中caspase11抑制劑抑制細(xì)胞焦亡的應(yīng)用。所述的人參皂苷Rg1及其活性代謝產(chǎn)物PPT通過抑制caspase-11的剪切活化，增加細(xì)胞的存活率降低胞內(nèi)LPS產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞焦亡；所述的人參皂苷Rg1及其活性代謝產(chǎn)物PPT通過降低血清中IL-1β和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的釋放量，提高感染性休克小鼠的存活率。

附圖說明

圖1：人參皂苷Rg1及原人參三醇PPT抑制LPS誘導(dǎo)的非經(jīng)典炎癥小體通路中caspase-11的剪切活化。

圖2：人參皂苷單體Rg1及原人參三醇PPT能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的BMDMs細(xì)胞死亡率。

圖3：人參皂苷單體Rg1及原人參三醇PPT能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的BMDMs細(xì)胞毒性。

圖4：人參皂苷單體Rg1及其原人參三醇PPT能夠顯著降低感染性休克小鼠血清中IL-1b的分泌量。

圖5：灌胃給予人參皂苷單體Rg1及原人參三醇PPT能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的感染性休克小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的量。

圖6：灌胃給予人參皂苷單體Rg1及原人參三醇PPT能夠顯著增加LPS誘導(dǎo)的感染性休克小鼠的存活率。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.Western Blot實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：

C57BL/6雄性小鼠購自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，室內(nèi)保持溫度(25℃)濕度(60％)恒定，保持自由飲水飲食，并保證12h晝/12h夜日照循環(huán)；LPS(Lipopolysaccharides from Escherichia coli0111：B4)100mg購于Sigma；轉(zhuǎn)染試劑FugeneHD Transfection Reagent購于Promega；人參皂苷Rg1及原人參三醇PPT均購于吉林大學(xué)；生理鹽水購于安徽雙鶴藥業(yè)有限公司；THP-1細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫，于37℃，5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％小牛血清的1640(Gibco)；胎牛血清(Fetal bovine serum)購于Hyclone(Logan，Utah，USA)；胰蛋白酶(Trypsin)購于Amersco(Solon，Ohio，USA)；CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)購于日本同仁化學(xué)研究所；小鼠IL-1βELISA試劑盒購自依科賽生物科技有限公司；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；caspase-11抗體購自CellSignalingTechnology，Inc(CST)公司、GAPDH抗體購自Bioworld公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

實(shí)驗(yàn)方法：

將C57BL/6雄性小鼠脫頸處死，于75％乙醇中浸泡消毒5min后去皮剪取后肢，將后肢浸泡于75％乙醇中消毒5min，剔除后肢肌肉組織，在關(guān)節(jié)處剪斷腿骨，用含有1640培養(yǎng)基的注射器將腿骨內(nèi)細(xì)胞沖出來收集到50mlEP管中，將提取的細(xì)胞400g離心5min，用含20％L929上清和10％小牛血清的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞按1.3*10⁷/孔的密度點(diǎn)到10cm大皿中，三天后換一次培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)三天后成功分化成巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組空白對照組、FugeneHD(0.25％)+LPS(2ug/ml)模型組、人參皂苷Rg1預(yù)給藥+FugeneHD(0.25％)+LPS(2ug/ml)、人參皂苷PPT預(yù)給藥+FugeneHD(0.25％)+LPS(2ug/ml)。預(yù)給藥組分別預(yù)給人參皂苷Rg1、Ppt 5uM 6h，然后復(fù)合1ug/ml LPS刺激6h，撤藥后用轉(zhuǎn)染試劑0.25％體積比的FugeneHD將2ug/mlLPS轉(zhuǎn)入BMDM細(xì)胞12h達(dá)到藥物作用時間構(gòu)建成細(xì)胞焦亡模型。PBS洗滌細(xì)胞一次后，置于冰板上，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下收集，5000rpm×5min離心得到細(xì)胞沉淀，每20μL細(xì)胞壓積中加入150μL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min后，超聲破碎5次，每次2s，15000rpm×10min離心得到上清即為提取到的總蛋白樣品。BCA法測定蛋白含量。蛋白樣品按體積比3∶1加入上樣緩沖液并煮沸5min。制備12％SDS-PAGE，對樣品進(jìn)行電泳分離。電泳分離后，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜在含5％脫脂奶粉的TBST溶液中封閉1h后，4℃孵育一抗過夜，相應(yīng)二抗室溫孵育1h，ECL顯影，Bio-Rad凝膠成像儀成像。

實(shí)施例2.細(xì)胞增殖與活性檢測實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)方法：

BMDM細(xì)胞的提取、分化、給藥同實(shí)施例4。將細(xì)胞按2*10⁵/孔的密度點(diǎn)到96孔板中，三天后換一次培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)三天后成功分化成巨噬細(xì)胞。細(xì)胞分組空白對照組、FugeneHD(0.25％)+LPS(2ug/ml)模型組、人參皂苷Rg1預(yù)給藥+FugeneHD(0.25％)+LPS(2ug/ml)、人參皂苷PPT預(yù)給藥+FugeneHD(0.25％)+LPS(2ug/ml)。預(yù)給藥組分別預(yù)給人參皂苷Rg1、PPT 5uM 6h，然后復(fù)合1ug/ml LPS刺激6h，撤藥后用轉(zhuǎn)染試劑FugeneHD將2ug/mlLPS轉(zhuǎn)入BMDM細(xì)胞12h后將孔里的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入到空白的96孔板中。按CCK-8說明書將CCK-8工作液加入含有細(xì)胞的96孔板中，CCK-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的橙色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。達(dá)到作用時間后置于酶標(biāo)儀檢測。細(xì)胞存活率通過以下公式計算：

細(xì)胞活力＝[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100％

實(shí)施例3.細(xì)胞毒性檢測實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)方法：

BMDM細(xì)胞的提取、分化、給藥同實(shí)施例4。給藥達(dá)到藥物作用時間后將96孔板中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入新的96孔板中。按照乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書將工作液加入含有培養(yǎng)基的96孔板中，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD⁺被還原生成NADH，NADH和INT被硫辛酰胺脫氫酶催化反應(yīng)生成NAD⁺和強(qiáng)生色物甲臜，在490nm波長下產(chǎn)生吸收峰，從而可以通過比色來定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關(guān)。達(dá)到作用時間后置于酶標(biāo)儀檢測。細(xì)胞存活率通過以下公式計算：

細(xì)胞毒性＝(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100％

實(shí)施例4.血清中IL-1β含量測定實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)方法：

小鼠的飼養(yǎng)條件和給藥條件同實(shí)施例1，小鼠血液的采取和處理方法同實(shí)施例2。血清用生理鹽水按1∶4比例稀釋，按照小鼠IL-1βELISA試劑盒說明書逐步加入工作液，達(dá)到作用時間后取出置于酶標(biāo)儀檢測其在450nm波長的OD值。在450nm處的吸光度值與IL-1β的濃度呈正相關(guān)，根據(jù)吸光度值就可以計算出相應(yīng)IL-1β的濃度。

實(shí)施例5.血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量測定實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)方法：

小鼠的飼養(yǎng)條件和給藥條件同實(shí)施例1。在小鼠腹腔注射LPS 6h時間點(diǎn)通過眼眶靜脈取血，然后脫頸處死，解剖取出各組織于-80℃貯存。取出的血液靜置2h后，6000rpm離心10min，取出上層血清。血清用生理鹽水按1∶1比例稀釋，送于中大醫(yī)院檢驗(yàn)科測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量。

實(shí)施例6.小鼠存活率實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)方法：

C57BL/6雄性六周齡小鼠飼養(yǎng)條件：室內(nèi)保持溫度(25℃)濕度(60％)恒定，保持自由飲水飲食，并保證12h晝/12h夜日照循環(huán)。按體重隨機(jī)分成四組每組10只，即空白對照組、LPS感染性休克模型組、Rg1預(yù)給藥+LPS、PPT預(yù)給藥+LPS。Rg1、PPT預(yù)給藥組提前三天每只小鼠按20mg/kg的劑量灌胃給予人參皂苷Rg1、PPT，第四天繼續(xù)灌胃給予人參皂苷Rg1、PPT30min后每只小鼠按30mg/kg劑量腹腔注射LPS，LPS模型組同樣30mg/kg劑量腹腔注射LPS。然后在2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、96h時間點(diǎn)觀察小鼠的存活率。