本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術：

腎纖維化(包括腎間質纖維化和腎小球硬化)是各種原因引起的腎臟損害最后階段的主要病理基礎，腎纖維化發(fā)生機制較為復雜，與多種因素有關，其中主要與細胞外基質細胞產生細胞的增殖和活化，血管活性物質、細胞因子以及細胞外基質轉換失衡有關，腎間質纖維化幾乎是所以原發(fā)或繼發(fā)腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同途徑。急需研發(fā)高效低毒的抗腎纖維化藥物。

腎纖維化的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物有重要價值。

本發(fā)明涉及的化合物I是一個2009年發(fā)表(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗腎纖維化活性進行了評價，其具有抗腎纖維化活性。

技術實現要素：

本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質量百分數分別為90％和10％。

本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。

藥效學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗腎纖維化作用。本發(fā)明的藥學上可接受的鹽具有同樣的藥效。

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。

具體實施方式

實施例1化合物Atropurpuran的制備

化合物Atropurpuran(I)的制備方法參照Pei Tang等人發(fā)表的文獻(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的方法。

實施例2 Atropurpuran的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(312mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌6h。6h之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(309mg，74％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.86(s,1H),5.23(s,1H),4.87(s,1H),4.83(s,1H),4.39(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,1H),3.58(s,2H),3.01(s,1H),2.27(s,1H),2.15(d,J＝6.3Hz,2H),2.09–2.00(m,5H),1.78(dd,J＝35.2,19.2Hz,2H),1.71–1.65(m,1H),1.41(s,2H),0.99(s,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.55(s),203.16(s),150.94(s),125.16(s),111.66(s),78.63(s),71.39(s),57.77(s),47.73(s),40.79(s),34.58(s),33.01(s),32.69(s),29.25(s),29.34(s),26.52(s),24.23(s),22.30(s),20.64(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₂₂H₂₈BrO₃:419.1222；found 419.1226.

實施例3 Atropurpuran的O-(咪唑基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于12mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和咪唑(3480mg，40mmol)，混合物加熱回流4h。反應結束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.7，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的棕色固體(156mg,77％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.83(s,1H),7.89(s,1H),7.15(s,1H),6.75(s,1H),5.16(s,1H),4.75(s,1H),4.67(d,J＝10.5Hz,2H),4.15(s,1H),4.03(s,1H),3.91(d,J＝5.5Hz,3H),2.97(s,1H),2.20(s,1H),2.08(d,J＝4.9Hz,2H),2.02–1.93(m,3H),1.81(s,1H),1.76(d,J＝8.0Hz,2H),1.53(d,J＝32.1Hz,4H),0.92(s,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.53(s),203.25(s),150.92(s),139.46(s),128.50(s),125.25(s),119.12(s),111.64(s),78.72(s),67.87(s),57.86(s),47.71(s),43.57(s),40.88(s),34.56(s),32.67(s),29.34(s),29.10(s),26.50(s),24.32(s),22.28(s),20.73(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₂₅H₃₁N₂O₃:407.2335；found:407.2331。

實施例4 Atropurpuran的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的合成

1、Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的合成

將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙醇胺(1051mg，10mmol)，混合物加熱回流1h。反應結束后將反應液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集淺棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的黃色固體(159.5mg,72％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),5.13(s,1H),4.61(d,J＝10.5Hz,2H),4.25(s,1H),3.75(s,1H),3.54(s,2H),3.36(s,4H),2.89(s,1H),2.62(s,2H),2.51(s,4H),2.32(s,2H),2.17(s,1H),2.05(s,1H),1.95(dd,J＝13.4,11.6Hz,4H),1.78(s,1H),1.76–1.69(m,4H),1.44(s,2H),0.89(s,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.46(s),203.18(s),150.85(s),125.18(s),111.57(s),78.65(s),67.01(s),58.86(s),57.79(s),56.41(s),53.21(s),47.64(s),40.81(s),34.49(s),32.60(s),29.27(s),29.03(s),26.43(s),24.25(s),22.21(s),20.66(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₂₆H₃₈N₁O₅:444.2750；found:444.2744。

2、Atropurpuran的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的合成

合成足夠多的Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，將Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(0.222g，0.5mmol)溶于6mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(2.38g，20mmol)，反應物加熱回流3h。將反應物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產物經硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.5，v/v)，得到化合物IV的淡黃色固體(143.7mg，60％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.69(s,1H),5.11(s,1H),4.76(s,1H),4.71(s,1H),4.59(s,1H),3.84(s,1H),3.66(s,4H),3.53(s,2H),2.93(s,1H),2.76(s,2H),2.68(s,2H),2.61(s,2H),2.16(s,1H),2.04(s,1H),1.95(dd,J＝21.9,12.0Hz,4H),1.77(s,1H),1.71(d,J＝5.4Hz,2H),1.46(d,J＝17.9Hz,4H),0.89(s,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.41(s),203.13(s),150.80(s),125.13(s),111.52(s),78.60(s),66.96(s),57.74(s),55.76(s),53.16(s),47.59(s),40.76(s),39.18(s),34.44(s),32.55(s),29.22(s),28.98(s),26.38(s),24.20(s),22.16(s),20.61(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₂₆H₃₆Cl₂N₁O₃:480.2072；found:480.2069。

實施例5組合物對單側輸尿管結扎大鼠腎間質纖維化的影響

1.1材料

貝那普利，北京諾華制藥有限公司生產；羥脯氨酸(HYP)試劑盒，南京建成生物公司；纖維連結蛋白(FN)試劑盒購自上海生物制品所。

組合物的制備：將研磨之后過200目網的90mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網的10mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

實驗動物：普通級Wistar大鼠，雄性，體重150-200g，SD大鼠。

1.2試驗方法與結果

大鼠60只，隨機分6組，即假手術組、模型組、苯那普利灌胃10mg/kg組、組合物灌胃10mg/kg組、化合物III灌胃10mg/kg組、化合物IV灌胃10mg/kg組，動物喂養(yǎng)1周，各大鼠以10％水合氯醛3.0mL/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠右側臥位固定與手術臺上，剪毛后用碘酒、75％酒精消毒手術區(qū)，行左側腹切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側輸尿管，假手術組僅切開腹腔并游離左側輸尿管，但不結扎和剪斷，其他各組大鼠用4-0絲線結扎兩道，上一道結扎點位于左腎下極水平，然后在兩道結扎點剪斷輸尿管，逐層縫合，術后10天10％水合氯醛麻醉后處死各組動物，取血，按纖維連結蛋白測定說明測定說明纖維聯接蛋白(FN)。生理鹽水反復灌洗后留取左側腎臟，腎組織經4％的多聚甲醛緩沖液固定。切取適量腎組織，按羥脯氨酸試劑盒測定說明測定羥脯氨酸。

常規(guī)病理學檢①肉眼觀察：假手術組腎臟顏色鮮紅，表明光滑，包膜光澤，無粘連。模型對照組腎臟體積增大，顏色蒼白，表明呈顆粒狀，類似人體大白腎，少數區(qū)域腎包膜粘連。②光鏡檢查：假手術組腎單位結果清晰，腎小球囊無擴張或炎細胞浸潤。模型對照組大片腎小管壞死，腎間質纖維細胞增生，腎小管擴張，內有大量棕黃色遮光物質或壞死脫落的上皮細胞，腎小球數目減少，部分腎小球纖維化并與包曼氏囊壁粘連，囊腔消失。組合物給藥組病變與模型對照組類似，但均有不同程度的形態(tài)學改善，與模型對照組比較有明顯差異。而化合物III給藥組和化合物IV給藥組與模型對照組無顯著性差異。

表1組合物對單側輸尿管結扎大鼠腎間質纖維化的影響

*p<0.05，與模型組相比較

對各組FN、HYP進行T檢驗。結果見表1，組合物灌胃10mg/kg顯著降低FN、HYP水平(與模型對照組比較，P<0.05)；而化合物III和化合物IV灌胃10mg/kg未能顯著降低FN、HYP水平。

結論：組合物能夠顯著降低腎間質纖維化FN、HYP水平的升高，抑制腎間質纖維化，可以用來制備抗腎纖維化藥物?；衔颕II和化合物IV不能夠顯著降低腎間質纖維化FN、HYP水平的升高，不能抑制腎間質纖維化，不可以用來制備抗腎纖維化藥物。

實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。

實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。