本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及一種由甘松與甘青鐵線蓮的活性藥物及其制備方法。

背景技術(shù)：

哮喘及過敏性哮喘是一種常見病、多發(fā)病，屬于中醫(yī)的“喘證”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，本病的發(fā)生是肺脾腎虛、痰飲內(nèi)伏、痰阻氣道、宣降失常所致。哮喘是一種以嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）、肥大細(xì)胞反應(yīng)為主，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為輔的氣道炎癥性疾病。往往在人的體質(zhì)下降，免疫功能低下時(shí)發(fā)病。其發(fā)病率高居不下，嚴(yán)重危害人類的身體健康。

西醫(yī)治療哮喘的藥物只能起到一時(shí)緩解作用，療效仍不能令病人滿意，很多藥物治療哮喘可使疼痛緩解，但停藥以后又會(huì)反復(fù)發(fā)作，哮喘的治療往往具有持久性和反復(fù)性。感染是肺氣腫病因中最值得注意的因素之一，病毒、細(xì)菌和支原體是本病急性加重的重要因素；職業(yè)性粉塵及化學(xué)物質(zhì)，如煙霧、過敏原、工業(yè)廢氣及室內(nèi)空氣污染等，濃度過大或接觸時(shí)間過長(zhǎng)，均可能產(chǎn)生與吸煙無關(guān)的肺氣腫；大氣中的有害氣體如二氧化硫、二氧化氮、氯氣等損傷氣道粘膜，使纖毛清除功能下降，粘液分泌增加，為細(xì)菌感染增加條件；吸煙是引起肺氣腫原因中最重要的，吸煙者肺氣腫的患病率比不吸煙者高2~8 倍，煙齡越長(zhǎng)，吸煙量越大，肺氣腫患病率越高。目前，各大醫(yī)院迫切需要一種治療哮喘期限短、療效高、反復(fù)率低的藥物。

過敏性哮喘（Bronchial asthma）是以肺部多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)和對(duì)各種激發(fā)因子產(chǎn)生氣道高反應(yīng)為特征的慢性氣道炎癥疾病，在易感者中此種炎癥可引起反復(fù)發(fā)作的氣促、喘息、咳嗽和胸悶等癥狀，氣道對(duì)多種刺激因子反應(yīng)性增高。哮喘的發(fā)展由炎癥前細(xì)胞因子介導(dǎo)，如主要由Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5和IL-13，此外，由Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ抑制Th2細(xì)胞分化，致敏劑誘發(fā)的反應(yīng)還伴隨呼吸道內(nèi)嗜酸細(xì)胞（eosinophil，EOS）的滲出，EOS是哮喘過敏性氣道炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，與哮喘發(fā)病之間存在直接因果關(guān)系。已經(jīng)證實(shí)IFN-γ在胞內(nèi)細(xì)菌感染時(shí)有一定的保護(hù)作用，并參與自身免疫病的發(fā)生，在過敏性哮喘中IFN-γ與氣道單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，并能抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4進(jìn)而抑制IgE的分泌，對(duì)哮喘有一定的保護(hù)作用。IgE水平增高在過敏性哮喘、變應(yīng)性鼻炎等特應(yīng)性疾?。╝topic）中最具特征性，是診斷哮喘與氣道高反應(yīng)性的重要參考指標(biāo)，高水平IgE被認(rèn)為是在非過敏性哮喘中的危險(xiǎn)因素。

甘松，敗醬科Valerianaceae甘松屬Nardostachys DC.植物，共有3種植物，分別是甘松N. chinensis Bet.、匙葉甘松 N. jatamansi ( D. Don) DC. 和大花甘松 N.grandif lora DC.。甘松屬植物均以根及根莖入藥，藥用歷史非常悠久，我國(guó)常見甘松和匙葉甘松兩種，入藥始載于《本草拾遺》，后列入《海南本草》和《開寶本草》，認(rèn)為其具有理氣止痛、開郁醒脾、安神等功效，用于治療脾胃氣滯、脘腹脹痛、霍亂轉(zhuǎn)筋、牙痛、痰眩、癔病癲癇、心悸怔忡、腳氣等多種病癥，是目前敗醬科中唯一被《中國(guó)藥典》收載的藥用植物。

甘松，春、秋二季采挖，除去泥沙和雜質(zhì)，曬干或陰干。本品略呈圓錐形，多彎曲，長(zhǎng)5～18cm。根莖短小，上端有莖、葉殘基，呈狹長(zhǎng)的膜質(zhì)片狀或纖維狀。外層黑棕色，內(nèi)層棕色或黃色。根單一或數(shù)條交結(jié)、分枝或并列，直徑0.3～1cm。表面棕褐色，皺縮，有細(xì)根和須根。質(zhì)松脆，易折斷，斷面粗糙，皮部深棕色，常成裂片狀，木部黃白色。氣特異，味苦而辛，有清涼感。

甘松主要分布于甘肅、四川、云南、西藏等地。味辛、甘，性溫。歸脾、胃經(jīng)。理氣止痛，開郁醒脾，外用祛濕消腫。用于脘腹脹滿，食欲不振，嘔吐；外用治牙痛，腳氣腫毒?！峨u峰普濟(jì)方》記載，松香丸治痰眩：半夏曲、天南星各二兩，甘松一兩，陳橘皮一兩半。上為細(xì)末，水煮面和為丸，如梧桐子大。每服二十丸，生姜湯下，食后?！侗静萸笳妗酚涊d，甘松，雖有類山柰，但山柰氣多辛竄，此則甘多于辛，故書載能入脾開郁也?！侗静輩R言》記載，甘松，醒脾暢胃之藥也。

甘青鐵線蓮，為毛茛科植物甘青鐵線蓮的全株或莖葉，拉丁名：Clematis tangutica （Maxim.）Korsh.[C.orientalis L.var.tangutica Maxim.；C.tangutica（Maxim.）Korsh.var.obtusiuscula Rehd et Wils.]。甘青鐵線蓮，落葉藤本。主根粗壯，木質(zhì)。莖具棱，幼時(shí)被長(zhǎng)柔毛，后脫落。葉對(duì)生，一回羽狀復(fù)葉；葉柄長(zhǎng)2～7.5cm；小葉5～7，葉片淺裂、深裂或全裂，中央裂片較大，側(cè)裂片小，卵狀長(zhǎng)圓形、狹長(zhǎng)圓形或披針形，長(zhǎng)3～4cm，寬0.5～1.5cm，先端鈍，有短尖頭，基部楔形，邊緣有不整齊缺刻狀鋸齒，上面有毛或無毛，下面有疏長(zhǎng)毛?；▎紊袝r(shí)為單聚傘花序，有3朵花，腋生；花序梗粗壯，長(zhǎng)4.5～20cm，有毛；花兩性；萼片4，狹卵形、橢圓狀長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)1.5～3.5cm，黃色外面帶紫色，斜上展，先端漸尖或急尖，外面邊緣被短絨毛，中間被柔毛，內(nèi)面無毛或近無毛；花瓣無；雄蕊多數(shù)，花絲下面稍扁平，被開展的柔毛，花藥無毛；心皮多數(shù)，密生柔毛。瘦果倒卵形，長(zhǎng)約4mm，有長(zhǎng)柔毛，宿存花術(shù)羽毛狀，長(zhǎng)達(dá)4cm，花期6～9月，果期7～10月。

甘青鐵線蓮在我國(guó)分布于甘肅南部和東部（海拔1800～3700m）、新疆（海拔2160～2700m）、西藏（海拔3150～4900m）、四川西部（海拔1920～3800m）、青海（海拔1370～2700m）。生高原草地或灌叢中?！缎氯A本草綱要》記載：甘青鐵線蓮有利水、健胃、消積之功，治消化不良，痞塊食積，腹瀉，并有排膿、除瘡等作用。

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)是甘肅省道地藥材的主要研究單位，本申請(qǐng)的發(fā)明人在承擔(dān)國(guó)家級(jí)科研項(xiàng)目2014地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目的研究過程中，對(duì)甘肅省的道地藥材進(jìn)行了大量的研究工作，尤其是對(duì)甘肅省地道藥材的藥對(duì)配伍使用方面做了深入的研究，甘松與甘青鐵線蓮均甘肅省道地藥材，現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)甘松和甘青鐵線蓮的單獨(dú)研究已有不少的報(bào)道，但尚未見對(duì)兩者配伍研究的報(bào)道，發(fā)明人在對(duì)甘松與甘青鐵線蓮藥對(duì)配伍研究的過程中，意外發(fā)現(xiàn)，將甘松和甘青鐵線蓮配伍使用，在特定的制備方法下，對(duì)哮喘有特別好的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種甘松與甘青鐵線蓮的藥物。

本發(fā)明的另一目的是提供該藥物的制備方法。

本發(fā)明還提供了該藥物的檢測(cè)方法。

本發(fā)明還提供了該藥物的制藥用途。

本發(fā)明的目的是由以下方式實(shí)現(xiàn)的：

一種治療過敏性哮喘的藥物，該藥物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青鐵線蓮1～2重量份。

該藥物是優(yōu)選由以下重量份的原料制成的：甘松2重量份，甘青鐵線蓮1重量份。

該藥物是優(yōu)選還可以由以下重量份的原料制成的：甘松1重量份，甘青鐵線蓮2重量份。

該藥物是優(yōu)選還可以由以下重量份的原料制成的：甘松1重量份，甘青鐵線蓮1重量份。

所述的藥物可以制備成片劑、丸劑、散劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、口服液。

所述的藥物采用如下方法制備：

（1）取甘松、甘青鐵線蓮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，裝入膠囊即得。

所述治療過敏性哮喘的藥物的檢測(cè)方法，該藥物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青鐵線蓮1～2重量份；該藥物采用如下方法制備：

（1）取甘松、甘青鐵線蓮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，裝入膠囊即得；

其檢測(cè)方法為：采用高效液相色譜法進(jìn)行甘松根酮的含量測(cè)定：

（1）色譜條件：色譜柱：Agilent zorbax-C₁₈；流動(dòng)相：比例為33:67的乙腈-0.05%磷酸溶液；柱溫：30℃；流速：1mL/min；Waters 2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)條件：漂移管溫度：43℃；霧化器溫度：35℃；氮?dú)鈮毫Γ?5Psi；進(jìn)樣量：10μL；

（2）對(duì)照品溶液制備：精密稱取80℃干燥至恒重的甘松根酮對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1mL含1mg的對(duì)照品溶液；

（3）供試品溶液的制備：供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加熱水50mL，振搖使溶解，分別用60mL、40mL、40mL、40mL的水飽和的正丁醇振搖提取四次，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次40mL，棄去氨液，回收正丁醇至干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，通過D₁₀₁大孔吸附樹脂柱，以水50mL洗脫，棄去水液；再用40％乙醇50mL洗脫，棄去40％乙醇洗脫液，繼用70％乙醇150mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并移至2mL的量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；

（4）測(cè)定：分別精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)。

所述治療過敏性哮喘的藥物的檢測(cè)方法，該藥物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青鐵線蓮1～2重量份；該藥物采用如下方法制備：

（1）取甘松、甘青鐵線蓮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，裝入膠囊即得。

其檢測(cè)方法為：采用氣相色譜法對(duì)甘松薁醇、角鯊烯進(jìn)行含量測(cè)定：

（1）色譜條件：色譜柱：HP-5型毛細(xì)管柱；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器；載氣：N₂，流量：35mL·mL^-1；氫氣流量：50mL·mL^-1；空氣流量：480mL·min^-1；分流比：9：1；進(jìn)樣口溫度：270℃，檢測(cè)器溫度320℃；程序升溫：初始60℃，每分鐘10℃升至140℃，每分鐘20℃升至280℃，保持6min；內(nèi)標(biāo)法；

（2）內(nèi)標(biāo)溶液的制備：取環(huán)己酮適量，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1mL含15.0mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液；

（3）供試品溶液的制備：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻；

（4）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取甘松薁醇對(duì)照品、角鯊烯對(duì)照品適量，加無水乙醇溶解并稀釋制成含甘松薁醇0.350mg·mL^-1及角鯊烯0.850mg·mL^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用；

（5）測(cè)定：分別精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)。

一種由甘松、甘青鐵線蓮制成的藥物在制備治療支氣管哮喘藥物中的應(yīng)用，該藥物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青鐵線蓮1～2重量份。

一種由甘松、甘青鐵線蓮制成的藥物在制備治療黃褐斑藥物中的應(yīng)用，該藥物是由以下重量份的原料制成的：甘松1～2重量份，甘青鐵線蓮1～2重量份。

實(shí)驗(yàn)一：對(duì)延緩過敏性哮喘的處方與活性部位的藥效學(xué)篩選實(shí)驗(yàn)研究

1 材料

1.1 藥物與試劑

1.1.1 藥物甲：

藥物處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：

（1）取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物甲。

1.1.2 藥物乙：

藥物處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，干燥，即得藥物乙。；

1.1.3 藥物丙：

藥物處方：甘青鐵線蓮1000g

制備方法：

（1）取甘青鐵線蓮1000g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物丙；

1.1.4 藥物丁：

藥物處方：甘松1000g

制備方法：

（1）取甘松1000g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物丁。

醋酸地塞米松片：規(guī)格0.75mg/片，批號(hào)：160523421，浙江仙琚制藥股份有限公司；卵白蛋白OVA，上海撫生生物科技有限公司；氫氧化鋁Al(OH)₃，上海躍江鈦白化工制品有限公司；其他試劑均為市售分析純。血清總IgE免疫放射分析測(cè)定盒，上海放射免疫分析技術(shù)研究有限公司，批號(hào)20160510；IL-4、IL-5、IFN-γ放免試劑盒，上海放射免疫分析技術(shù)研究有限公司，批號(hào)20160314。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（甘）2011-0001-0001011；實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（甘）2011-0001-0000314；飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下，12h明暗交替，（22±2）℃，自由攝食飲水。動(dòng)物在上述環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器

全自動(dòng)生化儀，濟(jì)南格利特科技有限公司；403C壓縮空氣式霧化器，北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn)；CKX41SF倒置顯微鏡，蘇州景通儀器顯微鏡公司；Invitvogcn細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海微科生物技術(shù)有限公司。

方法

2.1 模型建立及給藥方法

取84只大鼠隨機(jī)分成7組，每組12只。分別為：空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，地塞米松組0.65 mg/kg，藥物甲組5.0 g/kg、藥物乙組5.0 g/kg、藥物丙組5.0 g/kg、藥物丁組5.0 g/kg；各藥物均以0.5%CMC-Na溶液配置，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組給予等量0.5% CMC-Na溶液。

除正常對(duì)照組外，其余各組在第1天和第7天每只腹腔內(nèi)注射抗原混液（OVA 50mg， 氫氧化鋁100mg，溶于1mL生理鹽水配成混懸液）致敏。第14天開始用1% OVA超聲霧化吸入而激發(fā)，每?jī)商?次，每次60min，共2周。正常對(duì)照組大鼠于第1天和第7天腹腔注射生理鹽水1mL，第14天開始用生理鹽水超聲霧化吸入，每?jī)商?次，每次60min，共2周。地塞米松組和受試藥物組大鼠從第14天開始灌胃相應(yīng)藥物，1mL/100g，共2周。正常對(duì)照組和哮喘模型組大鼠于第14天灌胃等量0.5% CMC-Na溶液，共2周。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 細(xì)胞因子測(cè)定

末次給藥60min后，10%水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，于4 ℃ 3000r/min離心15min分離血清，-70 ℃保存，根據(jù)試劑盒說明方法進(jìn)行IL-4、IL-5和IFN-γ、IgE測(cè)定。

2.2.2 支氣管肺泡灌洗（BALF）及標(biāo)本采集

各組大鼠最后一次激發(fā)1h后，每只大鼠以10%水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血致死。消毒并打開胸腔，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，用灌胃針插入氣管，固定后，行左側(cè)肺肺泡灌洗術(shù)。緩慢注入生理鹽水5mL停留10s，緩慢回抽，重復(fù)3次；回收液約4mL。回收液立即注入EP管，4 ℃1500r/min離心15min，取適量沉淀作細(xì)胞涂片，瑞氏-姬姆薩法染色，按形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）計(jì)數(shù)。余下沉淀用4mL生理鹽水重新稀釋后，進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)。

2.2.3 肺組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

大鼠腹主動(dòng)脈放血處死后，取右肺中葉置于4%的多聚甲醛溶液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，鏡下觀察支氣管肺組織病理特征。根據(jù)病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分：1分（輕度病變），病變區(qū)域約占整個(gè)制片區(qū)域的12%～25%；2分（中度病變），病變區(qū)域約占整個(gè)制片區(qū)域的25%～50%；3分（重度病變），病變區(qū)域約占50%～75%；4分（極重度病變），病變區(qū)域＞75%；0.5分（輕微病變）病變區(qū)域＜12%；各部位無明顯病變?yōu)?分（正常）。

統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），量反應(yīng)資料統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析檢驗(yàn)法，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 藥物對(duì)血清IgE、IL-4、IL-5及IFN-γ的影響

結(jié)果由表1可見，與正常組比較，模型組血清中抗原特異性IgE水平明顯升高，對(duì)血清中IL-4、IL-5和IFN-γ的測(cè)定表明IL-4、IL-5明顯升高，而IFN-γ明顯降低，表現(xiàn)為Th2型的細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)，差異具有顯著意義（P﹤0.01）。

與模型組比較，地塞米松組與藥物甲組的IgE、IL-4、IL-5含有量均明顯降低，IFN-γ顯著升高，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。

與模型組比較，藥物乙組的IgE、IL-4、IL-5含有量均明顯降低，IFN-γ顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。

與模型組比較，藥物丙組和丁組的IgE、IL-4、IL-5含有量也均降低，IFN-γ升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 藥物對(duì)過敏性哮喘大鼠氣道細(xì)胞因子的影響（±s，n=12）

注：與正常組比較，^#P<0.05，^##P <0.01；與模型組比較，^*P<0.05，^**P<0.01

4.2 BALF中白細(xì)胞總數(shù)

結(jié)果由表2可見，與正常組相比，模型組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)升高，差異顯著（P﹤0.01）。與模型組比較，地塞米松組與藥物甲組可降低白細(xì)胞總數(shù)，具有極顯著的差異（P﹤0.01）。與模型組比較，藥物乙組也可降低白細(xì)胞總數(shù)，具有顯著的差異（P﹤0.05）。與模型組比較，藥物丙組和丁組也可降低白細(xì)胞總數(shù)，但不具有顯著的差異（P＞0.05）。

與正常組相比，模型組大鼠BALF中EOS細(xì)胞數(shù)升高，差異顯著（P﹤0.01）；與模型組比較，地塞米松組與藥物甲組可降低EOS細(xì)胞數(shù)，具有極顯著的差異（P﹤0.01）。與模型組比較，藥物乙組也可降低EOS細(xì)胞數(shù)，具有顯著的差異（P﹤0.05）。與模型組比較，藥物丙組和丁組也可降低EOS細(xì)胞數(shù)，但不具有顯著的差異（P＞0.05）

表2藥物粒對(duì)過敏性哮喘大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及EOS的影響（±s，n=12）

^#P與正常組比較P<0.05，^##P與正常組比較P<0.01

*P與模型組比較P<0.05，**P與模型組比較P<0.01

4.3 肺組織形態(tài)學(xué)

結(jié)果由表3與附圖1至附圖7可見，正常對(duì)照組動(dòng)物的鼻中隔黏膜組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肺組織肺泡壁和間質(zhì)充血、有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，炎細(xì)胞類型以嗜酸性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞為主，肺泡腔內(nèi)無滲出物。肺組織明顯肺氣腫，肺泡腔增大，肺泡壁變薄，肺泡有融合現(xiàn)象。支氣管分泌增多，可見輕度或中度淡藍(lán)染色的粘液性分泌物。

地塞米松組大鼠肺泡壁有輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁有輕度充血，肺內(nèi)支氣管分泌增多，病變?cè)u(píng)分與模型組比較，差異極顯著（P﹤0.01）。藥物甲組肺泡壁有輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺內(nèi)小支氣管壁腔內(nèi)可見極少量粘液性分泌物，病變?cè)u(píng)分與模型組比較，差異極顯著（P﹤0.01）。藥物乙組肺泡壁有輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺內(nèi)小支氣管壁腔內(nèi)可見少量粘液性分泌物，病變?cè)u(píng)分與模型組比較，差異顯著（P﹤0.05）。藥物丙組和丁組肺泡壁有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺內(nèi)小支氣管壁腔內(nèi)可見粘液性分泌物，病變?cè)u(píng)分與模型組比較，差異不顯著（P＞0.05）。

表3 藥物對(duì)過敏性哮喘大鼠肺組織病理評(píng)分的影響（±s，n=12）

^#P與正常組比較P<0.05，^##P與正常組比較P<0.01

*P與模型組比較P<0.05，**P與模型組比較P<0.01

5 結(jié)論

本研究通過檢測(cè)過敏性哮喘大鼠血清IL-4、IL-5、IFN-γ和IgE含有量的變化，BALF中白細(xì)胞總數(shù)和EOS細(xì)胞數(shù)變化，反映嗜酸性粒細(xì)胞和炎性因子的狀況，結(jié)果表明，藥物甲能降低過敏性哮喘大鼠血清IL-4、IL-5和IgE含有量，升高IFN-γ水平，降低BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS細(xì)胞數(shù)，與模型對(duì)照組比較有顯著差異（P<0.01）。藥物甲具有減輕大鼠氣道炎性細(xì)胞和EOS浸潤(rùn)，改善哮喘氣道炎癥癥狀，為預(yù)防和治療過敏性哮喘提供了理論依據(jù)。藥物乙也具有良好的作用效果，但效果不如藥物甲的作用效果優(yōu)異。藥物丙和藥物丁也具有一定的作用效果，但不明顯。由此可見，本發(fā)明藥物中兩種藥味之間的配伍精良，缺一不可，特別是在特定的制備方法下，兩種藥味之間的組合產(chǎn)生了明顯的協(xié)同增效作用，產(chǎn)生了一加一大于二的技術(shù)效果。

實(shí)驗(yàn)二：高效液相色譜法測(cè)定藥物中甘松根酮含量

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法檢測(cè)本發(fā)明藥物中甘松根酮含量，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明，此方法精密度、重現(xiàn)性良好，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合要求，測(cè)定迅速、準(zhǔn)確，為制定該制劑專屬性的控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，Waters2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，Eemper色譜工作站； D₁₀₁大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5cm，長(zhǎng)12cm）。

藥物：藥物處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：（1）取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物甲。

甘松根酮對(duì)照品（南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，批號(hào)：1402-20141025）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent zorbax-C₁₈（150×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：比例為33:67的乙腈-0.05%磷酸溶液；柱溫：30℃；流速：1mL/min；Waters 2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)條件：漂移管溫度：43℃；霧化器溫度：35℃；氮?dú)鈮毫Γ?5Psi。

系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

在上述條件下，測(cè)定樣品中甘松根酮的含量，理論板數(shù)以甘松根酮峰計(jì)算大于3000，分離度、拖尾因子符合規(guī)定。

溶液的制備

2.3.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取80℃干燥至恒重的甘松根酮對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1mL含1mg的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

取本品10g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加熱水50mL， 振搖使溶解，分別用60mL、40mL、40mL、40mL的水飽和的正丁醇振搖提取四次，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次40mL，棄去氨液，回收正丁醇至干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，通過D₁₀₁大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5cm，長(zhǎng)12cm），以水50mL洗脫，棄去水液；再用40％乙醇50mL洗脫，棄去40％乙醇洗脫液，繼用70％乙醇150mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并移至2mL的量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3.3 陰性供試品溶液的制備

按處方組成，取除甘松外的其余藥材和輔料按工藝要求制成缺甘松的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性供試品溶液。

空白試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果表明，陰性供試品對(duì)甘松根酮峰無干擾。如附圖8、附圖9和附圖10所示。

線性關(guān)系考察

按“2.3.1” 項(xiàng)下的方法制備甘松根酮對(duì)照品溶液（1.000mg/mL），分別精密吸取對(duì)照品溶液1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，以進(jìn)樣量（μg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：Y = 1.8462X + 6.3245，R=0.9999，結(jié)果表明甘松根酮在0.951μg～18.654μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)與峰面積的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定甘松根酮峰面積的積分值，考察進(jìn)樣精密度。經(jīng)測(cè)定RSD為2.10%，表明本法精密度較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：150125），按“2.3.2項(xiàng)下”甘松根酮的供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣5μL注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，考察其穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果得RSD為2.17%，供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：150125）5份，按“2.3.2項(xiàng)下”甘松根酮的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果表明甘松根酮平均含量為1.09mg/g，RSD為2.19%，說明該法測(cè)定甘松根酮的含量重現(xiàn)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：150125），稱取 5份，每份約5g，精密稱定，分別精密加入濃度為0.58mg/mL甘松根酮對(duì)照品1mL，按“2.4項(xiàng)下”甘松根酮的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定。經(jīng)計(jì)算平均加樣回收率為98.38%，RSD為1.29%，表明該方法回收率良好。

樣品含量測(cè)定

取10批本發(fā)明藥物成品，每批2份，按“2.3.2項(xiàng)下”甘松根酮的的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液5μL與10μL、供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見下表4。

表4 樣品中甘松根酮含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)10批成品中甘松根酮的測(cè)量結(jié)果，初步擬定為本品每g含甘松根酮不得低于1.20mg。

結(jié)論

用本方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，可排除背景干擾，且操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)

確、重現(xiàn)性好，可用于本發(fā)明藥物的檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)三：不同藥物中甘松根酮的含量測(cè)定

1 待測(cè)樣品

1.1 藥物甲：

藥物處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：

（1）取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物甲。

1.2 藥物乙：

藥物處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，干燥，即得藥物乙。；

1.3 藥物丙：

藥物處方：甘青鐵線蓮1000g

制備方法：

（1）取甘青鐵線蓮1000g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物丙；

1.4 藥物?。?/p>

藥物處方：甘松1000g

制備方法：

（1）取甘松1000g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物丁。

2 測(cè)定方法

采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)二提供的高效液相色譜法測(cè)定各個(gè)藥物中的甘松根酮的含量。

3 測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論與結(jié)論

從表5中可以看出，藥物甲中的甘松根酮的含量明顯高于其他藥物，這可能也是藥物甲在治療過敏性哮喘方面的效果優(yōu)于其他藥物的原因。

實(shí)驗(yàn)四：氣相色譜法同步測(cè)定藥物中甘松薁醇、角鯊烯的含量

1儀器與試藥

Agilent7890N氣相色譜儀：FID檢測(cè)器，A.01.12.1色譜工作站；SGH-300高純氫氣發(fā)生器（廣州步步宏科學(xué)儀器設(shè)備有限公司）；色譜柱彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.32μm）；梅特勒－托利多十萬分之一電子分析天平；甘松薁醇對(duì)照品（含量99.9%，上海哈靈生物有限公司）；角鯊烯對(duì)照品（含量99.9%，廣州卡芬生物科技有限公司）。

藥物：處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：

（1）取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得。

試劑：環(huán)己酮，無水乙醇均為色譜純。

2色譜條件

色譜柱：HP-5型毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.32μm）；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），載氣：N₂流量：35mL·mL^-1；氫氣流量：50mL·mL^-1；空氣流量：480mL·min^-1；分流比：9：1；進(jìn)樣口溫度：270℃，檢測(cè)器溫度320℃；程序升溫：初始60℃，每分鐘10℃升至140℃，每分鐘20℃升至280℃，保持6min；內(nèi)標(biāo)法。

3試驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取環(huán)己酮適量，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1g含15.0mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

3.2供試品溶液的制備

精密量取本品1.0g，置10mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。

3.3對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取甘松薁醇對(duì)照品、角鯊烯對(duì)照品適量，加無水乙醇溶解并稀釋制成含甘松薁醇0.350mg·mL^-1及角鯊烯0.850mg·mL^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用；

3.4陰性對(duì)照溶液的制備

取按處方中未加甘松薁醇與角鯊烯的空白溶液，按“3.2”項(xiàng)下制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

3.5線性關(guān)系的考察

分別精密移取0.2、0.5、1.0、1.5、3.5mL對(duì)照品儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液，分別取1μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以甘松薁醇、角鯊烯與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），濃度（C）為橫坐標(biāo)（X），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為：Y（甘松薁醇）=1.1268X－0.0167，R²=0.9999，甘松薁醇濃度在0.095～2.852mg·mL^-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；Y（角鯊烯）=1.1569X+0.0136，R²=0.9999，角鯊烯濃度在0.098～3.269mg·mL^-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

3.6精密度試驗(yàn)

取甘松薁醇濃度為0.230mg·mL^-1和角鯊烯濃度為0.290mg·mL^-1的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別計(jì)算2種成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（A/A內(nèi)標(biāo)），甘松薁醇、角鯊烯的RSD分別為0.18%和0.56%（n=6）。

3.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按樣品測(cè)定項(xiàng)下的方法重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果甘松薁醇、角鯊烯的RSD分別為0.29%、0.75%（n=6）。

3.8穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12h后測(cè)定，結(jié)果按甘松薁醇、角鯊烯的RSD分別為0.45%、0.51%，說明樣品溶液在12h內(nèi)測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定。

3.9加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品溶液9份，并加入適當(dāng)?shù)牡汀⒅?、高?duì)照品溶液，按樣品測(cè)定法測(cè)定甘松薁醇、角鯊烯含量，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。

表6 回收率測(cè)定結(jié)果（n=8，%）

結(jié)果表明，本方法的回收率較好，甘松薁醇的回收率分別在99.6%～100.8%，角鯊烯的回收率在98.6%～101.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.32%與0.75%，本測(cè)定方法能滿足藥物中甘松薁醇與角鯊烯的含量測(cè)定。

3.10耐用性試驗(yàn)

經(jīng)不同色譜柱考察和溶液穩(wěn)定性考察，以及柱溫，進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度考察，表明本方法耐用性良好，適用于藥物中兩組分的含量測(cè)定。

3.11色譜柱的影響

選用3根不同商品規(guī)格的色譜柱，測(cè)定同一批樣品的含量，計(jì)算含量值的RSD%分別為1.2、1.5、1.7。結(jié)果表明，樣品用不同的PEG色譜柱測(cè)定含量，甘松薁醇、角鯊烯與內(nèi)標(biāo)均可有效分離，說明方法耐用性良好。

3.12柱溫的影響

柱溫對(duì)分離的影響主要為影響主峰的出峰時(shí)間，溫度越高，主峰出峰時(shí)間越短，在第一階段為90℃時(shí)，甘松薁醇主峰甘松薁醇與雜質(zhì)峰能保證基線分離，第二階段160℃時(shí)角鯊烯主峰與雜質(zhì)峰能保證基線分離，且各溫度下含量的RSD小于2.0%。

3.13進(jìn)樣口溫度的影響

進(jìn)樣口溫度高于柱溫時(shí)，甘松薁醇與雜質(zhì)峰能夠保證基線分離，角鯊烯與雜質(zhì)分離良好，且各溫度下含量的RSD小于2.0%。

3.14檢測(cè)器溫度的影響

檢測(cè)器溫度高于進(jìn)樣口溫度時(shí)，甘松薁醇與雜質(zhì)峰能夠保證基線分離，角鯊烯與雜質(zhì)分離良好，且各溫度下含量的RSD小于2.0%。

3.15樣品含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，本含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，能更有效地控制產(chǎn)品。因此應(yīng)用該方法對(duì)10批樣品，按照前述方法采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表7。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4討論

4.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在本試驗(yàn)氣相色譜系統(tǒng)下，分別吸取樣品測(cè)定用混合對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各1μL，記錄色譜圖。2種組分與內(nèi)標(biāo)物均能夠較好地分離，陰性無干擾。該系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果見表8。

表8 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

4.2內(nèi)標(biāo)物的選擇

曾試用過環(huán)己酮、萘、聯(lián)苯、水楊酸甲酯等，因樣品揮發(fā)性成分多，結(jié)果以環(huán)己酮的保留時(shí)間及分離效果最合適。

4.3柱溫的選擇

甘松薁醇、環(huán)己酮和角鯊烯的沸點(diǎn)相差比較大，柱溫低時(shí)，角鯊烯的保留時(shí)間過長(zhǎng)，柱溫高時(shí)，甘松薁醇與雜質(zhì)不能有效分離，經(jīng)采用兩段程序升溫方式能滿足兩種成分的同時(shí)分析。

4.4本品的含量限度

由10批次產(chǎn)品測(cè)定結(jié)果，暫定本品的含量限度為：本品每1g含甘松薁醇不得少于0.200mg，含角鯊烯不得少于0.200mg。

本方法對(duì)2種成分同時(shí)進(jìn)行分離與檢測(cè)，方法快速、靈敏，分離度好、專屬性好，能有效地控制藥品。

實(shí)驗(yàn)五：不同藥物中甘松薁醇、角鯊烯的含量測(cè)定

1 待測(cè)樣品

1.1 藥物甲：

藥物處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：

（1）取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物甲。

1.2 藥物乙：

藥物處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，干燥，即得藥物乙。；

1.3 藥物丙：

藥物處方：甘青鐵線蓮1000g

制備方法：

（1）取甘青鐵線蓮1000g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物丙；

1.4 藥物?。?/p>

藥物處方：甘松1000g

制備方法：

（1）取甘松1000g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得藥物丁。

2 測(cè)定方法

采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)四提供的氣相色譜法同步測(cè)定甘松薁醇、角鯊烯的含量的方法，進(jìn)行測(cè)定。

3 測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見表9

表9 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論與結(jié)論

從表9中可以看出，藥物甲中的甘松薁醇、角鯊烯的含量明顯高于其他藥物，這可能也是藥物甲在治療過敏性哮喘方面的效果優(yōu)于其他藥物的原因。

實(shí)驗(yàn)六：安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

1　材料

受試藥物：

處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：

（1）取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得受試藥物。

動(dòng)物：昆明種小鼠，體重18～20g，Wistar大鼠，體重90～100g，均雌雄各半，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（甘）2011-0001-0001011；實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（甘）2011-0001-0000314；飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

2　方法

2.1　急性毒性實(shí)驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)不出LD₅₀，因此測(cè)定受試藥物的最大給藥量。取體重18～20g的小鼠20只，雌雄各半，禁食不禁水15h，以0.4mL/10g的給容積灌胃給予62.5%受試藥物浸膏粉水溶液，每隔4h給藥1次，共給藥2次，兩次累計(jì)給藥劑量為220g生藥/kg.觀察給藥后2h以及7內(nèi)的小鼠反應(yīng)。

2.2　慢性毒性實(shí)驗(yàn)

將購(gòu)入的5周齡大鼠，預(yù)飼養(yǎng)1周再用于正式實(shí)驗(yàn)。大鼠按體重隨機(jī)分成對(duì)照組、受試藥物高劑量組（80g生藥/kg）、低劑量組（20生藥/kg）4組，每組20只，雌雄各半，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，調(diào)室溫18～20℃，濕度40%～60%，自由攝食飲水。

將受試藥物浸膏粉每日上午灌胃給藥，對(duì)照組灌胃等容積的蒸餾水，每周稱1次體重并記錄攝食量，根據(jù)體重的變化重新計(jì)算給藥量。試驗(yàn)期間觀察大鼠外觀、行為、大便等變化。給藥后第14周末，受試藥物高劑量組、受試藥物低劑量組、空白對(duì)照組各隨機(jī)抽取12只大鼠，皆雌雄各半，頸動(dòng)脈采血處死，采血前禁食不禁水16h，檢測(cè)血常規(guī)、血液生化指標(biāo)，進(jìn)行系統(tǒng)尸解，計(jì)算臟器系數(shù)，取材做組織學(xué)檢查。剩余的動(dòng)物停藥正常飼養(yǎng)至18周末，頸動(dòng)脈采血處死，檢測(cè)的項(xiàng)目與14周末時(shí)相同，對(duì)各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。結(jié)合行為體征、外觀形態(tài)的觀察進(jìn)行組間對(duì)比分析，評(píng)價(jià)藥物毒副反應(yīng)。

3　結(jié)果

3.1　急性毒性實(shí)驗(yàn)

給藥后，2h內(nèi)小鼠無呼吸急促，無驚厥，無四肢抽搐無死亡等不良反應(yīng)。10d的觀察內(nèi)均未見異常行為體征，并且無一例死亡。

3.2　慢性毒性實(shí)驗(yàn)

3.2.1　對(duì)大鼠行為體征，體重?cái)z食量的影響

給藥期間及恢復(fù)期對(duì)照組和各給藥組大鼠被毛平順、眼睛紅亮有神、反應(yīng)機(jī)敏、飲食正常、大便無粘液和稀溏等呈現(xiàn)出健康活潑的狀態(tài)，體重、攝食量無明顯差異，隨周齡的增加而增加，增加速度隨周齡的增加而減慢。

3.2.2　對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

血常規(guī)檢測(cè)MK-6318K血細(xì)胞自動(dòng)分析儀計(jì)數(shù)紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞及白細(xì)胞分類、血小板。肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶均采用IFCC推薦法，總膽紅素采用對(duì)氨基苯磺酸重氮鹽法，總蛋白采用雙縮脲法，白蛋白采用溴甲酚綠法進(jìn)行測(cè)定。腎功能指標(biāo)尿素采用Talkes和chubert酶法，肌酐采用苦味酸法進(jìn)行測(cè)定?？偰懝檀疾捎妹阜?，堿性磷酸酶采用IFCC法，血糖采用葡萄糖氧化酶法進(jìn)行測(cè)定。各實(shí)驗(yàn)組各指標(biāo)給藥14周末、恢復(fù)期末都在正常范圍內(nèi)，未見明顯組間差異。結(jié)果見表10～表13。

表10　給藥14周末對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（±s）

表11　第14周末對(duì)大鼠肝功能的影響（±s）

表12　給藥第14周末對(duì)大鼠腎功能的影響（±s）

表13　給藥14周末對(duì)大鼠血糖、膽固醇、堿性磷酸酶的影響（±s）

3.2.3　系統(tǒng)尸解、臟器系數(shù)、組織學(xué)檢查

在14周末及恢復(fù)期各組活殺的動(dòng)物主要臟器肺、心臟、肝、胃、腎臟、前列腺、睪丸、子宮、卵巢、腎上腺、甲狀腺、胸腺各臟器色澤、形態(tài)、位置關(guān)系正常，臟器間無粘連；臟器表面及內(nèi)膜無瘀血、充血、出血點(diǎn)、水腫、糜爛、潰瘍；胸腔、心包腔無積液等病理改變。臟器系數(shù)計(jì)算結(jié)果都在正常范圍之內(nèi)，各組均未見明顯差異。

組織學(xué)檢查：臟器組織用10%甲醛固定、石蠟切片、HE染色、光鏡觀察。鏡下所見：各組均未見異常。組織學(xué)所見異常是偶發(fā)病變，與受試藥無相關(guān)性。

4　結(jié)論

受試藥物毒性較低，安全性高。

實(shí)驗(yàn)七：治療過敏性鼻炎的實(shí)驗(yàn)研究

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)豚鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（210±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（甘）2011-0001-0001011；實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（甘）2011-0001-0000314；飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。在溫度（20±3）℃，相對(duì)濕度（45±15）%的環(huán)境條件下，自由飲水，固體飼料飼養(yǎng)10天后使用。

1.2受試藥品

受試藥物：

處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：

（1）取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得受試藥物。

辛芩顆粒（四川志遠(yuǎn)嘉寶藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；

IgEELISA試劑盒（南京金益柏生物科技有限公司生產(chǎn)）；HAELISA試劑盒（上海慧穎生物科技有限公司生產(chǎn)）；OVA抗原試劑（廣州優(yōu)抗多生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；氫氧化鋁（山東淄博吉領(lǐng)鋁業(yè)有限公司生產(chǎn)）；戊巴比妥鈉（上海靜融生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平（上海丙林電子科技有限公司生產(chǎn)）；超聲振蕩儀（深圳市科工達(dá)超聲設(shè)備有限公司生產(chǎn)）；XT－2000iv全自動(dòng)血液分析儀（北京倍愛康生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)）；KDC－160HR高速冷凍離心機(jī)（鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)）；酶標(biāo)儀（上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1模型的建立

基礎(chǔ)致敏：OVA和Al（OH）₃以1：30的比例溶于生理鹽水，使OVA濃度為0.1%，作為致敏劑。腹腔注射上述溶液1mL，每日1次，連續(xù)12天。空白對(duì)照組以等量生理鹽水溶液代替。局部激發(fā)：間隔6日后，以5%OVA生理鹽水溶液滴鼻激發(fā)，每側(cè)鼻孔滴加50μl，隔日1次，連續(xù)5次?？瞻讓?duì)照組以等量生理鹽水代替。

2.2分組及給藥

將SPF級(jí)豚鼠隨機(jī)分成4組，每組12只，分別為空白對(duì)照組、辛芩顆粒對(duì)照組、模型組、受試藥物組。

將AR級(jí)豚鼠隨機(jī)分成4組，每組12只，分別為空白對(duì)照組、辛芩顆粒對(duì)照組、模型組、受試藥物組。于局部激發(fā)第3次當(dāng)日開始給藥，受試藥物組灌服受試藥物6g/kg，辛芩顆粒對(duì)照組灌服辛芩顆粒6g/kg，空白對(duì)照組與模型組灌服同等容積的生理鹽水。每日1次，連續(xù)6天。

2.3觀測(cè)指標(biāo)

2.3.1行為學(xué)觀察

末次給藥后40min內(nèi)，記錄豚鼠鼻分泌量、噴嚏及搔鼻次數(shù)，采用疊加量化計(jì)分法進(jìn)行計(jì)分。即鼻癢：無撓鼻為0分，輕度撓鼻為1分，頻繁撓鼻為2分，撓鼻不止為3分；噴嚏：30min內(nèi)無噴嚏為0分，打噴嚏1～3個(gè)為1分，4～10個(gè)為2分，＞11個(gè)為3分；鼻涕：無鼻涕為0分，流至前鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。

2.3.2血清生化指標(biāo)

末次給藥1h，戊巴比妥鈉麻醉，肝門靜脈采血用于HA和IgE的測(cè)定。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1對(duì)行為學(xué)的影響

如表14所示，模型組豚鼠出現(xiàn)大量清涕、頻繁噴嚏、劇烈撓鼻等典型AR癥狀，說明造模成功。辛芩顆粒對(duì)照組癥狀積分明顯低于模型組（P＜0.05）。受試藥物組癥狀積分低于模型組，但無顯著性差異（P＞0.05）。

表14 對(duì)AR豚鼠行為學(xué)的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05

3.2對(duì)血清HA和IgE的影響

如表15所示，模型組AR豚鼠血清組胺和IgE水平明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01），辛芩顆粒對(duì)照組AR豚鼠血清組胺和IgE水平低于模型組，差異顯著（P＜0.05）。受試藥物組AR豚鼠血清組胺和IgE也略水平低于模型組，但無顯著意義（P＞0.05）。

表15 對(duì)血清HA和IgE水平的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

3 結(jié)論

受試藥物對(duì)過敏性鼻炎沒有明顯的治療作用。

附圖說明：

附圖1：正常組大鼠大鼠肺組織病理顯微圖（HE×200）

附圖2：模型組大鼠大鼠肺組織病理顯微圖（HE×200）

附圖3：地塞米松組大鼠大鼠肺組織病理顯微圖（HE×200）

附圖4：藥物甲組大鼠大鼠肺組織病理顯微圖（HE×200）

附圖5：藥物乙組大鼠大鼠肺組織病理顯微圖（HE×200）

附圖6：藥物丙組大鼠大鼠肺組織病理顯微圖（HE×200）

附圖7：藥物丁組大鼠大鼠肺組織病理顯微圖（HE×200）

附圖8：對(duì)照品溶液液相色譜圖

附圖9：供試品溶液液相色譜圖

附圖10：陰性供試品溶液液相色譜圖

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：藥物

處方：甘松50g，甘青鐵線蓮50g

制備方法：

（1）取甘松、甘青鐵線蓮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得。

實(shí)施例2：硬膠囊劑

藥物處方：甘松500g，甘青鐵線蓮500g

制備方法：

（1）取甘松500g、甘青鐵線蓮500g，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；

（2）將甘松、甘青鐵線蓮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；

（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；

（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；

（5）將步驟（3）所得乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，裝入硬膠囊，制成1000粒。

采用高效液相色譜法對(duì)甘松根酮進(jìn)行含量測(cè)定：

（1）色譜條件：色譜柱：Agilent zorbax-C₁₈；流動(dòng)相：比例為33:67的乙腈-0.05%磷酸溶液；柱溫：30℃；流速：1mL/min；Waters 2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)條件：漂移管溫度：43℃；霧化器溫度：35℃；氮?dú)鈮毫Γ?5Psi；進(jìn)樣量：10μL；

（2）對(duì)照品溶液制備：精密稱取80℃干燥至恒重的甘松根酮對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1mL含1mg的對(duì)照品溶液；

（3）供試品溶液的制備：供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加熱水50mL，振搖使溶解，分別用60mL、40mL、40mL、40mL的水飽和的正丁醇振搖提取四次，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次40mL，棄去氨液，回收正丁醇至干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，通過D₁₀₁大孔吸附樹脂柱，以水50mL洗脫，棄去水液；再用40％乙醇50mL洗脫，棄去40％乙醇洗脫液，繼用70％乙醇150mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并移至2mL的量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；

（4）測(cè)定：分別精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為甘松根酮的含量為0.1823mg/g。

采用氣相色譜法對(duì)甘松薁醇、角鯊烯進(jìn)行含量測(cè)定：

（1）色譜條件：色譜柱：HP-5型毛細(xì)管柱；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器；載氣：N₂，流量，1.0mL·mL^-1；氫氣流量：50mL·mL^-1；空氣流量：480mL·min^-1；分流比：9：1；進(jìn)樣口溫度：270℃，檢測(cè)器溫度320℃；程序升溫：初始60℃，每分鐘10℃升至140℃，每分鐘20℃升至280℃，保持6min；內(nèi)標(biāo)法；

（2）內(nèi)標(biāo)溶液的制備：取環(huán)己酮適量，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1mL含15.0mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液；

（3）供試品溶液的制備：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻；

（4）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取甘松薁醇對(duì)照品、角鯊烯對(duì)照品適量，加無水乙醇溶解并稀釋制成含甘松薁醇0.350mg·mL^-1及角鯊烯0.850mg·mL^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用；

（5）測(cè)定：分別精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)。

（6）測(cè)定結(jié)果：本品每1g含甘松薁醇為0.225mg，含角鯊烯為0.231mg。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。