本發(fā)明屬于抗肝癌藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及瑤藥白鉆在制備抗肝癌藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
瑤藥白鉆為五味子科植物綠葉五味子(Schisandra viridis A.C.Smith)的藤莖，為廣西壯族自治區(qū)瑤族地區(qū)少數(shù)民族常用藥，具有祛風(fēng)活血，行氣止痛的功效，主治風(fēng)濕骨痛、胃痛、疝氣痛、月經(jīng)不調(diào)、蕁麻疹、帶狀皰疹等。未見瑤藥白鉆用于腫瘤或者肝病治療。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供瑤藥白鉆在制備抗肝癌藥物方面的應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
瑤藥白鉆在制備抗肝癌藥物方面的應(yīng)用。
抗肝癌藥物為抑制肝癌細(xì)胞增殖的藥物。
抗肝癌藥物為口服制劑。
瑤藥白鉆為瑤藥白鉆的水提物。
水提物按以下操作制備：取瑤藥白鉆根莖，加水浸泡后煎煮兩次，合并煎煮濾液，即得。
浸泡采用10倍體積的水，浸泡時(shí)間為1小時(shí)。
煎煮兩次為：第一次煎煮1.5小時(shí)后，用紗布過濾倒入燒杯中，備用；第二次煎煮1小時(shí)，用紗布過濾到燒杯中，備用。
合并煎煮濾液濃縮至1.35g/ml。
為進(jìn)一步發(fā)掘少數(shù)民族常用藥的醫(yī)藥用途，發(fā)明人對瑤藥白鉆進(jìn)行了深入研究，試驗(yàn)表明，瑤藥白鉆水提液具有顯著的抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的效果，該研究結(jié)果預(yù)示瑤藥白鉆可用于制備抗肝癌藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景，為瑤藥白鉆用于腫瘤治療提供了可靠的前期研究基礎(chǔ)，為深度開發(fā)利用瑤藥白鉆提供了新的探索途徑。
附圖說明
圖1是不同濃度含藥血清對肝癌SMMC-7721細(xì)胞抑制作用的趨勢圖。
圖中：上層曲線為正常血清，下層曲線為含藥血清。
具體實(shí)施方式
1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
瑤藥白鉆藥材采集于廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣內(nèi)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為五味子科植物綠葉五味子(Schisandra viridis A.C.Smith)。
實(shí)驗(yàn)動物：SPF級雄性大鼠20只，體重(200±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證：SCXK桂2014-0002。
肝癌SMMC-7721細(xì)胞株購買于齊氏生物科技原代細(xì)胞生物制藥；低內(nèi)毒素胎牛血清(產(chǎn)地：四季青；型號：111202)。
實(shí)驗(yàn)材料：青霉素鏈霉素溶液(索萊寶)、二甲基亞砜(索萊寶)、胰酶細(xì)胞消化液(碧云天)、倒置顯微鏡(德國，萊卡)、全波長酶標(biāo)儀(美國，賽默飛)、高速臺式離心機(jī)(美國，貝克曼)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
1.2.1 藥物提取
取瑤藥白鉆根莖一定量，加水浸泡(10倍體積的水，水面高于中藥)1小時(shí)后煎煮兩次：第一次煎煮1.5小時(shí)后，用紗布過濾倒入燒杯中，備用；第二次煎煮1小時(shí)，用紗布過濾到燒杯中，將兩次煎煮液混合濃縮至1.35g/ml，提取液待用。
1.2.2 含藥血清的制備
選取20只SPF級SD雄性大鼠，隨機(jī)分為兩組，空白對照組、瑤藥白鉆含藥血清組，每組10只。含藥血清實(shí)驗(yàn)組：瑤藥白鉆水提液(27g/kg)每天灌胃給藥兩次，給藥前進(jìn)行大鼠稱重，按照給藥容積20ml/kg給藥，連續(xù)灌胃給藥一周，最后一次給藥45分鐘后，進(jìn)行腹主動脈采血法取血(10％水合氯醛腹部皮下注射麻醉)，將采集的血液在室溫中靜置4h，然后離心機(jī)采用3000rpm轉(zhuǎn)速，離心15min，收集血清，然后將其放在56℃水浴進(jìn)行滅活，滅火時(shí)間30min，用0.22pm微孔濾膜進(jìn)行血清的過濾除菌(此操作在超凈臺內(nèi)進(jìn)行)，處理后的血清轉(zhuǎn)移到干凈試管中，置-20℃溫度條件下保存?zhèn)溆?，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液將含藥血清配制成所需濃度即可。
1.2.3 不同濃度含藥血清對肝癌SMMC-7721細(xì)胞抑制作用
(1)取對數(shù)生長期肝癌SMMC-7721細(xì)胞分為：
空白組：無細(xì)胞+完全培養(yǎng)液(10％胎牛血清+89％DMEM+1％雙抗)；
對照組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(10％胎牛血清+89％DMEM+1％雙抗)；
5％含藥血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(5％含藥血清+94％DMEM+1％雙抗)；
10％含藥血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(10％含藥血清+89％DMEM+1％雙抗)；
15％含藥血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(15％含藥血清+84％DMEM+1％雙抗)；
20％含藥血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(20％含藥血清+79％DMEM+1％雙抗)；
30％含藥血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(30％含藥血清+69％DMEM+1％雙抗)；
5％正常血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(5％正常大鼠血清+94％DMEM+1％雙抗)；
10％正常血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(10％正常大鼠血清+89％DMEM+1％雙抗)；
15％正常血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(15％正常大鼠血清+84％DMEM+1％雙抗)；
20％正常血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(20％正常大鼠血清+79％DMEM+1％雙抗)；
30％正常血清組：2000個(gè)/100μl細(xì)胞數(shù)+完全培養(yǎng)液(30％正常大鼠血清+69％DMEM+1％雙抗)。
(2)各組細(xì)胞置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，移液槍吸棄培養(yǎng)液，吸取100μl PBS清洗96孔板，清洗2次，然后各實(shí)驗(yàn)組加入相對應(yīng)的培養(yǎng)液(不同培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)液/含藥血清培養(yǎng)液/正常血清培養(yǎng)液)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
(3)培育24小時(shí)后每孔加入10μl MTT Solution(5mg/ml)，37℃，5％CO2孵育3-4小時(shí)；小心吸掉上清，盡量避免吸掉紫色沉淀；每孔加入100μlDMSO，震蕩均勻至沉淀完全溶解；測定570nm各孔的吸光值。
1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
細(xì)胞活力＝(加藥細(xì)胞OD-空白OD)/(對照細(xì)胞OD-空白OD)×100％；細(xì)胞活力越強(qiáng)，細(xì)胞抑制率越低，兩者呈反比。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1。結(jié)果顯示：隨著含藥血清濃度的逐漸增加，細(xì)胞活力下降；正常動物血清組也有此趨勢。到達(dá)20％、30％實(shí)驗(yàn)組時(shí)，含藥血清抑制細(xì)胞生長趨勢明顯，正常血清組趨于平穩(wěn)，不再對細(xì)胞生長存在顯著影響，可忽略不計(jì)。
表1 不同含藥血清濃度，細(xì)胞生長情況
1.4 結(jié)論
本研究首次證實(shí)瑤藥白鉆水提液具有顯著的抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的效果，研究結(jié)果可為白鉆治療肝癌及其開發(fā)利用提供前期研究基礎(chǔ)。