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一種提高免疫抑制動物免疫水平的中藥組合物及其提取物和應用的制作方法

文檔序號:12338721閱讀:613來源:國知局
一種提高免疫抑制動物免疫水平的中藥組合物及其提取物和應用的制作方法與工藝

本發(fā)明屬于獸藥技術領域,具體涉及一種提高免疫抑制動物免疫水平的中藥組合物及其提取物和應用。



背景技術:

免疫系統(tǒng)是人和高等動物識別自我和危險信號、引發(fā)免疫應答、發(fā)揮免疫效應和最終維持自身穩(wěn)定的組織系統(tǒng),是機體抵御外界因素侵害的重要屏障,許多致病因素可通過削弱甚至摧毀機體的免疫功能而致病。免疫系統(tǒng)是一個非常復雜的生理系統(tǒng),它能對環(huán)境中千差萬別的、各式各樣的抗原刺激作出相應的反應,這種反應的發(fā)生、發(fā)展、強度和類型又受多種因素的影響和調節(jié),以使反應和諧而協(xié)調的進行,從而維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定性,亦即通過免疫調節(jié)機制來控制免疫應答正常進行。

相反如果動物機體在單一或多種致病因素的共同作用下,免疫系統(tǒng)受到損害,導致機體暫時性的或持久性的免疫應答功能紊亂,以及對疾病表現(xiàn)高度的易感性,說明動物免疫功能異常,即免疫抑制。一旦免疫抑制造成免疫系統(tǒng)崩解,其它病原則會侵危害機體,最終導致死亡等,常被稱為免疫抑制綜合征,具有普遍性、整體性及隱蔽性。當前各種引起免疫抑制的因素廣泛存在于我國畜禽養(yǎng)殖中.是造成特異性免疫失敗(疫苗免疫)及誘發(fā)各種疾病的元兇之一。因此提高免疫抑制動物機體的特異性與非特異性免疫力,減少由于疾病而造成的重大損失。

目前用于臨床治療免疫功能低下疾病的藥物并不多,按有無免疫原性分為具有免疫原性和非免疫原性。具有免疫原性的免疫增強劑有卡介苗、枯草分枝桿菌、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌和細胞因子等,這類增強劑以注射劑型為主,使用受到一定限制,且易引起超敏反應或自身免疫反應等副作用。非免疫原性有鋁劑、左旋咪唑、羊毛脂、維生素和維生素等等。這一類的增強劑效果較弱,常只能增強細胞或體液免疫中的某一方面。

中藥是我國傳統(tǒng)的醫(yī)學瑰寶,一方面,中藥可以增強機體細胞免疫及體液免疫功能,促進淋巴細胞、單核巨噬細胞以及造血干細胞的生理功能;另一方面,中藥也具有免疫抑制功能,能減少炎性因子的釋放,抑制或消除抗體的產(chǎn)生,抑制細胞的增殖等。目前研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)中藥具有免疫雙向調節(jié)功能,使過高或過低的免疫反應恢復正常。這種雙向免疫調節(jié)作用,實際上正體現(xiàn)了中醫(yī)所強調的整體觀與陰陽平衡理論。機體的免疫功能屬于中醫(yī)學正氣的范疇,即機體的抗病防病能力。人體正氣旺盛時,防病抗病能力強,即古人所言:正氣存內、邪不可干;正氣低下時,防病抗病能力下降,邪氣乘虛而入,即古人所言:邪之所湊,其氣必虛。

而且中藥因資源豐富價格低廉毒副作用小無有害殘留等在動物規(guī)?;a(chǎn)中被廣泛重視,隨著中藥研究的發(fā)展,我們已經(jīng)逐步意識到中藥在機體免疫系統(tǒng)調節(jié)方面的作用,因此篩選具有增強畜禽免疫功能的中藥復方有廣闊的應用前景。



技術實現(xiàn)要素:

有鑒于此,本發(fā)明的目的在于:

(1)提供一種提高免疫抑制小鼠免疫水平的中藥組合物;

(2)提供一種提高免疫抑制小鼠免疫水平的中藥組合物的提取物。

為達到上述目的,根據(jù)我國傳統(tǒng)醫(yī)學理論,結合現(xiàn)代醫(yī)學藥理研究和臨床實踐經(jīng)驗而組成的方劑,由黃芪、當歸、白術、甘草、大棗、苦參、金銀花、魚腥草組成。通過探討該復方對免疫抑制小鼠免疫器官、腹腔巨噬細胞吞噬能力、外周血溶血素及免疫球蛋白含量等方面進行研究,本發(fā)明提供如下技術方案:

1、一種提高免疫抑制小鼠免疫水平的中藥組合物,按重量份量計由以下組分組成:黃芪12份、當歸10份、白術10份、甘草8份、大棗5份、苦參3份、金銀花3份、魚腥草3份。

2、由所述的提高免疫抑制小鼠免疫水平的中藥組合物制得的提取物。

優(yōu)選的,所述提取物采用以下方法制得:按照中藥組合物的組成稱取各味藥材,粉碎并過12目篩,加水煎煮3次,合并煎煮液,95~100℃下蒸發(fā)濃縮至濃度為1.0g/ml,即制得提取物。

優(yōu)選的,所述提取物采用以下方法制得:按照中藥組合物的組成稱取各味藥材,粉碎并過12目篩,加入相當于8味藥材總重量6.5倍量的水,浸泡1.0h,煎煮1.0h,過濾,收集濾液,藥渣再加入相當于8味藥材總重量6.5倍量的水,煎煮30min,過濾,收集濾液,藥渣再加入相當于8味藥材總重量6.5倍量的水,煎煮30min,過濾,收集濾液,合并三次濾液,100℃下蒸發(fā)濃縮至濃度為1.0g/ml,即制得提取物。

本發(fā)明的有益效果在于:機體的免疫功能屬于中醫(yī)學正氣的范疇,本發(fā)明主要以黃芪、當歸補氣、補血為主,輔以白術、甘草、大棗補脾益氣、燥濕利水,從而提高機體正氣。該中藥組合物配伍獨特、療效確切、毒副作用低、成本低廉。動物試驗結果顯示,該復方能夠有效提高免疫抑制小鼠的免疫水平,從而為增強畜禽機體的免疫功能提供了更好的備選藥物。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚,本發(fā)明提供如下附圖進行說明:

圖1為各試驗組小鼠死亡率;

圖2為各試驗組小鼠體重變化情況。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

實施例1

小鼠免疫抑制模型的建立

1、試驗方法

用無菌水配制質量濃度為10mg/mL的環(huán)磷酰胺溶液(CY),密封,4℃保存。取70只小鼠,雌雄各半,腹腔注射CY(按小鼠體重每次100mg/kg),1次/d,連用3d,構建小鼠免疫抑制模型。另取20只小鼠為健康對照,腹腔注射生理鹽水(0.2ml/10g)。與正常小鼠比較,若造模小鼠出現(xiàn)嚴重脫毛、精神不振、食欲明顯下降等現(xiàn)象,隨機取其中幾只小鼠進行解剖檢查,發(fā)現(xiàn)脾臟萎縮,肝臟發(fā)白,胸腺受損等,則表明免疫低下小鼠模型建立成功。

2、試驗結果

與空白組比較觀察發(fā)現(xiàn):注射環(huán)磷酰胺組小鼠出現(xiàn)精神不振、被毛逆立、脫毛、食欲下降、體重下降等現(xiàn)象;隨機抽取其中幾只小鼠進行解剖檢查發(fā)現(xiàn):小鼠胸腺、脾臟萎縮,肝臟發(fā)白等,表明免疫低下小鼠模型建立成功。

實施例2

從免疫抑制小鼠免疫器官、腹腔巨噬細胞吞噬能力、外周血溶血素及免疫球蛋白含量等方面進行研究提高免疫抑制小鼠免疫水平的中藥組合物對免疫抑制小鼠的防治作用。

1、試驗方法

(1)中藥組合物的制備

按照中藥組合物的組成稱取黃芪60g、當歸50g、白術50g、甘草40g、大棗25g、苦參15g、金銀花15g、魚腥草15g,粉碎并過12目篩,加入1775g水,浸泡1.0h,煎煮1.0h,過濾,收集濾液,藥渣再加入1775g,煎煮30min,過濾,收集濾液,藥渣再加入1775g的水,煎煮30min,過濾,收集濾液,合并三次濾液,100℃下蒸發(fā)濃縮至濃度為1.0g/ml,即制得提取物。

(2)試驗分組與處理

將建模成功且體重在18-22g之間的小鼠隨機分為陽性藥物組(黃芪多糖30mg/kg灌胃給藥)、中藥復方組(高、中、低劑量組分別按40g/kg、20g/kg、10g/kg灌胃給藥),模型組(灌服生理鹽水,0.2ml/10g),注射生理鹽水的小鼠為空白對照組(灌服生理鹽水,0.2ml/10g),每組10只。連續(xù)灌服7d,每天1次。同時每天定時觀察并記錄小鼠的精神狀況、飲食、死亡等臨床表現(xiàn)等,并于試驗前后記錄小鼠體重、死亡率等。

(3)免疫器官指數(shù)測定

各組分別于給藥7d后稱重,取各組小鼠脾和胸腺稱重,按以下公式計算各組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。

(4)腹腔巨噬細胞吞噬功能

雞BRC懸液的制備

于無菌操作下,肝素抗凝自雞翼下靜脈采血,用生理鹽水洗滌3次,前2次離心速度為1500rpm/min,離心5min,棄去上清液和界面的白細胞層,最后應連續(xù)2次離心,速度2000rpm/min,離心5min,直至雞紅細胞壓積值恒定,用生理鹽水配成5%的雞紅細胞懸液。

腹腔巨噬細胞吞噬功能

各組分別于給藥后7d稱重,并腹腔注射5%雞紅細胞0.5ml,8h后處死小鼠,腹腔注入PBS2ml,輕揉小鼠腹部1min,吸取腹腔液體0.5ml于載玻片上在37℃孵育30min,甲醇固定5min,Giemsa染色,每張涂片油鏡下計數(shù)200個巨噬細胞,按以下公式計算吞噬率和吞噬指數(shù)。

(5)血清溶血素的測定

在給藥第3d時,各組小鼠腹腔注射5%雞紅細胞懸液0.2ml,連續(xù)5d,末次給藥24h,各組小鼠摘眼球采血,3500r/min進行離心分離得血清,于4℃冷藏備用。取部分血清用生理鹽水稀釋100倍,取其1ml與0.5ml 5%雞紅細胞懸液和0.5ml 10%豚鼠補體混勻,對照管以1ml生理鹽水代替,其余步驟同上。上述樣品放置于37℃恒溫箱中30min,于4℃冰箱終止反應,最后2000r/min離心10min,取上清液1mL,放置10min后,以對照管作為空白調零,于540nm處測樣品A值。按以下公式計算HC-50。溶血素半數(shù)溶血值HC50=(樣品吸光度值/雞紅細胞半數(shù)溶血時吸光值)×稀釋倍數(shù)。

(6)中藥復方對免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白IgG、IGM含量的影響

取(5)中分離血清采用酶聯(lián)免疫吸附法進行測定(Mouse IgG ELISA kit,Mouse IgM ELISA kit試劑盒購買于上海瑤韻生物科技有限公司),具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行,如表1。最后用全自動酶標儀在450nm波長處測定吸光度(OD值),根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的回歸方程,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

表1各孔加樣標準

2、試驗結果

(1)臨床表現(xiàn)及死亡率

給藥前,與空白組比較,模型組、陽性藥物組、復方高、中、低劑量組小鼠出現(xiàn)精神不振、被毛逆立、脫毛、食欲下降等臨床表現(xiàn)。給藥第4d發(fā)現(xiàn),復方中劑量組小鼠較其它給藥組小鼠精神好轉,活動量增加,被毛光滑,無掉毛,食欲開始恢復等現(xiàn)象。與給藥組比較,模型組小鼠精神較沉郁,聚堆,被毛逆立,掉毛現(xiàn)象嚴重,食欲減退。據(jù)圖1可知:空白組、陽性藥物組、復方高、中劑量組小鼠死亡率均低于模型組小鼠死亡率;據(jù)圖2可知:試驗期間,各試驗組小鼠體重均增加,與模型組比較,復方中、低劑量組體重增長數(shù)較高。

(2)免疫器官指數(shù)測定

由表2可知,各試驗組小鼠胸腺指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05),無統(tǒng)計學意義;模型組小鼠脾臟指數(shù)為2.49,與空白組比較有顯著差異(P<0.05),與模型組比較,復方中、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)顯著性升高(P<0.05)。

表2中藥復方對小鼠免疫器官的影響

注:同一列肩標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

(3)腹腔巨噬細胞吞噬功能

由表3可知,模型組小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)分別為15.67、0.19,與空白組比較具有顯著性差異(P<0.05);與模型組比較,復方高、中、低劑量組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)均顯著性升高(P<0.05)。

表3中藥復方對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)的影響

注:同一列肩標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

(4)血清溶血素的測定

由表4可知,與模型組相比復方中劑量組小鼠血清溶血素含量極顯著性升高(P<0.05),與空白組比較沒有極顯著性差異(P>0.05)。

表4中藥復方對小鼠血清溶血素的影響

注:同一列肩標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);同一列肩標相同大寫字母表示沒有極顯著差異(P>0.01),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

(5)中藥復方對免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

由表5可知,模型組小鼠血清中IgG、IgM含量與空白組比較,極顯著降低(p<0.01);與模型組比較,中藥復方高、中、劑量組IgG、IgM含量均升高,差異極顯著(p<0.01)。

表5中藥復方對小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

注:同一列肩標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);同一列肩標相同大寫字母表示沒有極顯著差異(P>0.01),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

中草藥具有殘毒低,能夠調節(jié)機體的免疫機能,生產(chǎn)無公害的綠色產(chǎn)品,在畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著越來越重要的作用。本發(fā)明基于以上試驗結果,可以得出結論:當由組方黃芪12份、當歸10份、白術10份、甘草8份、大棗5份、苦參3份、金銀花3份、魚腥草3份中藥組合物制備的提取物對提高免疫抑制小鼠的免疫水平有較好的效果。

最后說明的是,以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制,盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述,但本領域技術人員應當理解,可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變,而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。

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