本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosissyndrome，OP)是以骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加及骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身性骨骼疾病，是嚴(yán)重威脅中老年人健康的一種常見(jiàn)病。目前，全球約有2 億人口患骨質(zhì)疏松癥，OP 在全世界常見(jiàn)病、多發(fā)病中已上升至第七位。我國(guó)老年人居世界首位，現(xiàn)有骨質(zhì)疏松患者9000 萬(wàn)，占總?cè)丝诘?.1%，隨著社會(huì)老齡化的到來(lái)，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率有不斷上升的趨勢(shì)，因此尋找安全、有效治療骨質(zhì)疏松的藥物正日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)和研究的重點(diǎn)。在中醫(yī)治療中骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”“痿痹”等范疇，中醫(yī)上講“腎主骨髓，腎虛則骨失所養(yǎng)致骨痿則骨痛”，腎虛是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的根源，腎虛可損傷脾、肺(相互滋生)、肝(肝腎同源)與精、氣、血等臟器和生存基本物質(zhì)?！夺t(yī)宗必讀.痿》曰“陽(yáng)明虛則血?dú)馍伲荒軡?rùn)養(yǎng)宗筋，故弛縱，宗筋縱則帶脈不能收引，故足痿不用，所以當(dāng)治陽(yáng)明?！碧岢鲎沭裟搜?dú)馍俣鵀樵矗纱颂崾疚覀?，在治療時(shí)除了強(qiáng)壯筋骨外，補(bǔ)氣益血也萬(wàn)萬(wàn)不可忽視，氣血不足無(wú)以化精，精虧則無(wú)以生髓養(yǎng)骨，而致骨質(zhì)疏松癥。

廣西狗牙花：為夾竹桃科狗牙花屬植物廣西狗牙花Ervatamia kwangsiensis Tsiang的根皮、葉。根皮全年可采，洗凈，鮮用；葉鮮用。【性味】苦；辛；性平?！竟δ苤髦巍炕钛雇?。主跌打損傷；骨折腫痛?！驹参镄螒B(tài)】 灌木，高達(dá)5m。除花外無(wú)毛；枝和小枝有皮孔，節(jié)間達(dá)2-3cm。假托葉基部擴(kuò)大而合生，卵圓形，長(zhǎng)達(dá)2mm。葉對(duì)生；葉柄長(zhǎng)5-12mm；葉片堅(jiān)紙質(zhì)，橢圓狀卵圓形，長(zhǎng)5-15cm，寬3-6.5cm，先端短漸尖，基部楔形，表面深綠色，背面淡綠色；中脈在葉面凹陷，在背面凸起；側(cè)脈12-14對(duì)，弧形上升。聚傘花序腋生，通常二歧，生于小枝頂端，有花6-7朵；總花梗長(zhǎng)3-4cm；苞片和小苞片卵圓形；花5數(shù)：花蕾圓筒形；花萼寬鐘形，基部?jī)?nèi)面無(wú)腺體，萼片有緣毛；花冠白色，早落；花冠筒上部向右旋轉(zhuǎn)，裂片基部向左覆蓋，兩面有微柔毛；雄蕊著生于近花喉部；花藥近箭頭形；柱頭2裂。蓇葖雙生，150°叉開(kāi)，長(zhǎng)圓狀披針形，具短喙；果柄長(zhǎng)約1cm，果長(zhǎng)5-6cm。種子在每個(gè)蓇葖內(nèi)有5-6顆?；ㄆ?-9月，果期9-11月。收載于中藥大辭典。

小花鳶尾根：為鳶尾科鳶尾屬植物小花鳶尾Iris speculatrix Hance的根莖及根。9-11月采收，洗凈切段，曬干?！拘晕丁啃粒粶?；有小毒?！竟δ苤髦巍炕钛?zhèn)痛；祛風(fēng)除濕。主跌打損傷；風(fēng)寒濕痹；瘋狗咬傷；蛇傷?！驹参镄螒B(tài)】 小花鳶尾 多年生草本，高30-40cm。植株基部圍有棕褐色的老葉鞘纖維及被針形的鞘狀葉。根莖橫生，較粗壯，環(huán)節(jié)顯著。基生葉劍形或條形，長(zhǎng)10-40cm，寬3-8mm，先端漸尖，基部鞘狀，全緣；莖生葉3-4片，較基生葉短?；ㄇo扁平，有苞片2，披針形；內(nèi)含l-2花；花梗長(zhǎng)3-5.5cm，花謝后彎曲；花藍(lán)紫色或淡藍(lán)色，直徑5-6cm，外輪裂片匙形，有深紫色的環(huán)形斑塊，中脈密具橙黃色須狀附屬物，內(nèi)輪裂片披針形，傾斜；雄蕊3，花藥白色；子房下位，3室，花柱分枝扁平，3分枝，花瓣?duì)?，先?裂，邊緣有齒。蒴果橢圓形，長(zhǎng)5-5，5cm，直徑l-1.5cm，先端有細(xì)長(zhǎng)而尖的喙，熟時(shí)縱裂為3瓣。種子梨形，棕褐色?；ㄆ?-5月，果期7-8月。收載于中藥大辭典。

十三年花：為爵床科馬蘭屬植物銅毛紫云菜Strobilanthes aehobarbus W. W. Smith的根和葉。根、葉全年均可采，洗凈，曬干?！拘晕丁?味淡；微苦；性平?！練w經(jīng)】 心；肺；肝經(jīng)。【功能主治】 清肝利濕；活血散瘀。主濕熱黃疸；目赤腫痛；月經(jīng)不調(diào)；產(chǎn)后腹痛?！驹参镄螒B(tài)】 銅毛紫云菜 多年生灌木狀草本，高約1m。莖直立，多分枝，上部四棱形，節(jié)膨大，扁平，密被棕黃色短毛，雜有白色長(zhǎng)柔毛，尤以嫩枝葉毛密。單葉對(duì)生；有柄；葉片卵圓形或卵形，先端漸尖，基部略不對(duì)稱，鈍圓或心形，邊具疏鈍鋸齒，上面昱綠色，下面暗紫色，兩面被棕黃色短毛和白色長(zhǎng)毛，枝葉上毛如擦脫后呈藍(lán)色。穗狀花序頂生或腋生；苞片葉狀；萼5裂；花紫色；花冠筒狀，先端5裂，二唇形；雄蕊4，二強(qiáng)，花絲基部有江膜質(zhì)相連，花冠內(nèi)面有2行短毛。蒴果。有種子4顆。收載于中藥大辭典。

橙花叔醇（Nerolidol）：CAS號(hào)7212-44-4，分子式C₁₅H₂₆O，分子量222.37。【成分來(lái)源】生姜 Zingiber officinale。

白樺脂酸（Betulinic acid）：CAS號(hào)472-15-1，分子式C₃₀H₄₈O₃，分子量456.71?！旧锘钚浴靠鼓[瘤（W256）。【成分來(lái)源】 大棗Ziziphus jujuba，樹(shù)形杜鵑Rhododendron arboreum，喜樹(shù)Camptotheca acuminata。

2個(gè)原料藥的結(jié)構(gòu)：

白樺脂酸（Betulinic acid） 橙花叔醇（Nerolidol）。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服背景技術(shù)的不足，提供一種有效治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物及其制備方法。

本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

制成該治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：

小花鳶尾根562-568重量份 十三年花500-506重量份 橙花叔醇204-208重量份 廣西狗牙花50-60重量份 白樺脂酸12-14重量份。

優(yōu)選的用于治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物，是由如下重量份的原料藥組成：

小花鳶尾根565重量份 十三年花503重量份 橙花叔醇206重量份 廣西狗牙花55重量份 白樺脂酸13重量份。

一種治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其特征在于藥物組合物可以采用制劑學(xué)的常規(guī)方法制備成片劑或膠囊劑或滴丸。

一種治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其特征在于藥物組合物與化學(xué)藥或中藥組成的治療骨質(zhì)疏松藥物。

一種治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物的制備方法，其特征在于按如下步驟制備：

原料藥的組成和重量份為：小花鳶尾根562-568重量份 十三年花500-506重量份 橙花叔醇204-208重量份 廣西狗牙花50-60重量份 白樺脂酸12-14重量份；

制備方法：

（1）按原料藥配比取小花鳶尾根、十三年花、橙花叔醇、廣西狗牙花、白樺脂酸，混勻，用重量百分比濃度15%乙醇作為溶劑，在28.5℃溫浸提取，提取次數(shù)為9次，每次提取時(shí)間65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的78倍，濾過(guò)，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.14，濾過(guò)，藥液通過(guò)HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度27%乙醇溶液洗脫HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度27%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度58%乙醇作為溶劑，加熱回流提取20次，每次提取時(shí)間為0.7小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的45倍，濾過(guò)，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.05，濾過(guò)，藥液通過(guò)LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度76%乙醇溶液洗脫LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度76%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

優(yōu)選的一種治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物的制備方法，其特征在于按如下步驟制備：

原料藥的組成和重量份為：小花鳶尾根565重量份 十三年花503重量份 橙花叔醇206重量份 廣西狗牙花55重量份 白樺脂酸13重量份；

制備方法：

（1）按原料藥配比取小花鳶尾根、十三年花、橙花叔醇、廣西狗牙花、白樺脂酸，混勻，用重量百分比濃度15%乙醇作為溶劑，在28.5℃溫浸提取，提取次數(shù)為9次，每次提取時(shí)間65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的78倍，濾過(guò)，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.14，濾過(guò)，藥液通過(guò)HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度27%乙醇溶液洗脫HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度27%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度58%乙醇作為溶劑，加熱回流提取20次，每次提取時(shí)間為0.7小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的45倍，濾過(guò)，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.05，濾過(guò)，藥液通過(guò)LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度76%乙醇溶液洗脫LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度76%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

一種治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物的制備方法，其特征在于藥物組合物可以采用制劑學(xué)的常規(guī)方法制備成片劑或膠囊劑或滴丸。

一種治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物的制備方法，其特征在于藥物組合物與化學(xué)藥或中藥組成治療骨質(zhì)疏松藥物。

藥物組合物治療骨質(zhì)疏松療效顯著。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物及其制備方法

治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：小花鳶尾根565g 十三年花503g 橙花叔醇206g 廣西狗牙花55g 白樺脂酸13g；

制備方法：

（1）按原料藥配比取小花鳶尾根、十三年花、橙花叔醇、廣西狗牙花、白樺脂酸，混勻，用重量百分比濃度15%乙醇作為溶劑，在28.5℃溫浸提取，提取次數(shù)為9次，每次提取時(shí)間65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的78倍，濾過(guò)，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.14，濾過(guò)，藥液通過(guò)HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度27%乙醇溶液洗脫HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度27%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度58%乙醇作為溶劑，加熱回流提取20次，每次提取時(shí)間為0.7小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的45倍，濾過(guò)，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.05，濾過(guò)，藥液通過(guò)LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度76%乙醇溶液洗脫LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度76%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

實(shí)施例2：治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物及其制備方法

治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：小花鳶尾根562g 十三年花506g 橙花叔醇204g 廣西狗牙花60g 白樺脂酸12g；

制備方法：

（1）按原料藥配比取小花鳶尾根、十三年花、橙花叔醇、廣西狗牙花、白樺脂酸，混勻，用重量百分比濃度15%乙醇作為溶劑，在28.5℃溫浸提取，提取次數(shù)為9次，每次提取時(shí)間65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的78倍，濾過(guò)，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.14，濾過(guò)，藥液通過(guò)HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度27%乙醇溶液洗脫HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度27%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度58%乙醇作為溶劑，加熱回流提取20次，每次提取時(shí)間為0.7小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的45倍，濾過(guò)，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.05，濾過(guò)，藥液通過(guò)LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度76%乙醇溶液洗脫LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度76%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

實(shí)施例3：治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物及其制備方法

治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：小花鳶尾根568g 十三年花500g 橙花叔醇208g 廣西狗牙花50g 白樺脂酸14g；

制備方法：

（1）按原料藥配比取小花鳶尾根、十三年花、橙花叔醇、廣西狗牙花、白樺脂酸，混勻，用重量百分比濃度15%乙醇作為溶劑，在28.5℃溫浸提取，提取次數(shù)為9次，每次提取時(shí)間65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的78倍，濾過(guò)，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.14，濾過(guò)，藥液通過(guò)HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度27%乙醇溶液洗脫HZ-841大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度27%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度58%乙醇作為溶劑，加熱回流提取20次，每次提取時(shí)間為0.7小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的45倍，濾過(guò)，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.05，濾過(guò)，藥液通過(guò)LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度76%乙醇溶液洗脫LSD280大孔吸附樹(shù)脂柱，收集重量百分比濃度76%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

實(shí)施例4：片劑的制備

取實(shí)施例1藥物組合物444g，加入淀粉258g，混勻，制粒，干燥，加微晶纖維素134g，硬脂酸鎂10g，混勻，壓制成2800片， 即得藥物組合物片劑。

實(shí)施例5：膠囊的制備

取實(shí)施例2藥物組合物223.5g，加入淀粉310.5g，混勻，制粒，干燥，整粒，加入適量硬脂酸鎂，混勻，裝膠囊1600粒，即得藥物組合物膠囊。

實(shí)施例6：滴丸的制備

稱取聚乙二醇 6000 242.5g水浴(80℃)加熱煮熔，加入實(shí)施例3藥物組合物11.2g，充分?jǐn)嚢杈鶆颍砸后w石蠟為冷卻劑，置玻璃管（4*80cm）中，冷卻溫度為3℃，滴口內(nèi)外徑為7.0/2.0(mm/mm)，滴口距液面為2.2cm，滴速以每分51滴為最佳條件，用棉布吸干滴丸表面的冷凝劑，即得藥物組合物滴丸。

實(shí)驗(yàn)例1：治療骨質(zhì)疏松的試驗(yàn)研究

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物

SD 大鼠（二級(jí)），6 月齡，雌性，體重200‐220g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（冀）2003‐1‐003，動(dòng)物飼料亦由該中心提供。

1.1.2 藥物

藥物組合物（實(shí)施例1藥物組合物）；仙靈骨堡膠囊(0.5g/粒)，貴州同濟(jì)堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：060412。臨用前均用蒸餾水配成所需濃度混懸液。

1.1.3 試劑

血清雌二醇放射免疫分析測(cè)試盒，北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；血清降鈣素放射免疫分析測(cè)試盒、血清骨鈣素放射免疫分析測(cè)試盒，均為解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所產(chǎn)品；鈣液體試劑盒，北京中生生物工程高技術(shù)公司產(chǎn)品；甲基丙烯酸甲酯，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；鄰苯二甲酸二丁酯，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；過(guò)氧化苯甲酰，北京金龍化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；血清磷測(cè)試盒、血清堿性磷酸酶測(cè)試盒，均為石家莊市試劑廠產(chǎn)品。

1.1.4 儀器

雙能X線骨密度儀（LUNAR‐DPX，美國(guó)）；722 光柵分光光度計(jì)（上海）；Y-計(jì)數(shù)器（西安）；CMT‐8202 電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（深圳）；Reicheit‐Jung 2040 切片機(jī)（德國(guó)）；Leica Qwin 圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)）；Opton 熒光顯微鏡（德國(guó)）。1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

將40 只6月齡健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為去卵巢模型組、藥物組合物組（藥物組合物0.5g/kg，相當(dāng)于人臨床用量的14倍）及陽(yáng)性藥仙靈骨堡膠囊組（仙靈骨堡膠囊0.6g/kg，相當(dāng)于人臨床用量的14倍），每組10只。另取10只大鼠做同樣操作但不切除卵巢，僅切除一小塊脂肪組織作為假手術(shù)組。

1.2.2 動(dòng)物模型

將大鼠用10%水合氯醛按350mg/kg 腹腔注射麻醉，腹位固定，在背部1/3 處離背正中線1‐2cm處，做lcm 切口，切開(kāi)皮膚，于左右兩肋下沿肩胛線剪開(kāi)腰肌，用鑷子將卵巢和子宮角牽出，在輸卵管處結(jié)扎，將雙側(cè)卵巢摘除，逐層縫合肌肉和皮膚切口，假手術(shù)組只做同樣操作但不切除卵巢，僅切除一小塊脂肪組織。

1.2.3 給藥

術(shù)后將大鼠置屏障系統(tǒng)常規(guī)飼養(yǎng)8周，第9周開(kāi)始灌胃給藥，假手術(shù)組、去卵巢模型組灌胃給予同體積的蒸餾水，連續(xù)6周。各組動(dòng)物于處死前16d 和前3d 分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素(30mg/kg)對(duì)骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 觀察體重變化

記錄試驗(yàn)前與試驗(yàn)后體重，觀察體重變化。

1.3.2 子宮指數(shù)變化觀察

末次給藥后40 分鐘處死動(dòng)物，處死動(dòng)物當(dāng)日稱重，剖取子宮稱重，計(jì)算子宮指數(shù)。子宮指數(shù)=子宮重量／體重×100。

1.3.3 骨密度、骨灰度及骨強(qiáng)度的測(cè)定

剖取左側(cè)股骨、脛骨，剔凈肌肉后用雙能x 線骨密度儀測(cè)骨密度；然后用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測(cè)左側(cè)股骨抗彎強(qiáng)度(最大負(fù)荷，跨距20mm);將左側(cè)脛骨以氯仿：甲醇混合液(2：1)脫脂72小時(shí)，置烘箱中120℃干燥6 小時(shí)，在將干骨置800℃馬福爐內(nèi)灰化6小時(shí)，冷卻后稱灰重。

1.3.4 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)定

取大鼠左側(cè)脛骨近端1/3，去除軟組織，用70%乙醇固定。用乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，每級(jí)各兩次，每次24h。浸透液的配制：I 液：甲基丙烯酸甲酯75ml，鄰苯二甲酸二丁酯25ml；II 液：在I 液的基礎(chǔ)上加過(guò)氧化苯甲酰1g；III 液：在I 液的基礎(chǔ)上加過(guò)氧化苯甲酰2. 5g。以上三液，用磁力攪拌器充分?jǐn)噭?。?biāo)本在I、II、III 液各浸透36h。在青霉素小瓶中注入約5ml 的III 液，將標(biāo)本按同一方向放入瓶中，然后置于40℃烘箱中聚合3‐4 天，待變?yōu)闊o(wú)色透明的堅(jiān)硬包埋塊后，砸碎小瓶，取出包埋塊。修塊后，在切片機(jī)上，用鎢鋼刀分別切出5 μm 的縱向不脫鈣骨切片。一片用二甲苯溶掉樹(shù)脂后，梯度乙醇至水，甲苯胺藍(lán)染色，觀察靜態(tài)指標(biāo)；另一片直接在熒光顯微鏡下做動(dòng)態(tài)指標(biāo)測(cè)定，觀測(cè)指標(biāo)按謝雁鳴等人的方法，采用Leica Qwin 圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量。⑴骨小梁組織形態(tài)計(jì)量：①骨小梁體積百分比(TBV%)：骨小梁體積／被測(cè)骨髓腔總體積*100%，是骨量水平的主要標(biāo)志；②骨小梁吸收表面百分比(TRS%)：不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面／骨小梁表面*100%；③骨小梁形成表面百分比( TFS%)：有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面／骨小梁表面*100%；④活性生成表面百分比(AFS%)：有熒光標(biāo)記帶的骨小梁表面／骨小梁表面*100%；⑤骨小梁礦化率(MAR)：骨小梁表面熒光雙標(biāo)記帶的平均距離／兩次標(biāo)記相隔的天數(shù)；⑥骨小梁骨生成率(BFR)：AFS %*MAR。⑵皮質(zhì)內(nèi)表面形態(tài)計(jì)量：①類骨質(zhì)平均寬度(Osw)：皮質(zhì)內(nèi)表面類骨質(zhì)的平均寬度；②骨皮質(zhì)礦化率(mAR)：皮質(zhì)內(nèi)表面雙標(biāo)記帶的平均距離／兩次標(biāo)記相隔的天數(shù)。采用t 檢驗(yàn)比較各組間差異情況(SPSSII.0 for wlndows)。

1.3.5 血清生化指標(biāo)與骨代謝生化指標(biāo)測(cè)定

取血標(biāo)本分離血清，采用化學(xué)法測(cè)定血中鈣、磷含量，堿性磷酸酶(ALP)活性；用放免法測(cè)定血清雌二醇(E)、骨鈣素(BGP)、降鈣素(CT)含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以i±S 表示，用SPSSII.O 軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)先行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，則樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析( OAOV)，樣本均數(shù)間的兩兩比較采用最小顯著差異(LSD)t 檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 藥物組合物對(duì)去卵巢大鼠體重的影響

試驗(yàn)前假手術(shù)組、去卵巢模型組、藥物組合物組動(dòng)物體重?zé)o顯著差別(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)去卵巢模型組大鼠體重較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，表明切除雙側(cè)卵巢可使大鼠體重增加，即去卵巢具有增重效應(yīng)。藥物組合物組大鼠體重均較去卵巢模型組明顯減輕(P<0.05)，提示藥物組合物具有一定的減緩去卵巢所致的增重效應(yīng)。

2.2 藥物組合物對(duì)去卵巢大鼠子宮指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)去卵巢模型組大鼠子宮指數(shù)較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)，表明切除大鼠雙側(cè)卵巢14 周可引起大鼠子宮萎縮。藥物組合物組大鼠子宮指數(shù)顯著高于去卵巢模型組(p<0.01)，提示藥物組合物能有效減輕去卵巢大鼠子宮萎縮。

2.3 藥物組合物對(duì)去卵巢大鼠骨密度、骨灰重及骨強(qiáng)度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)去卵巢模型組大鼠左側(cè)股骨、脛骨骨密度、脛骨骨灰重及股骨最大負(fù)荷均明顯低于假手術(shù)組(p<0.01)，表明切除大鼠雙側(cè)卵巢14 周已引起大鼠骨質(zhì)疏松。藥物組合物組大鼠左側(cè)股骨、脛骨骨密度、脛骨骨灰重及股骨最大負(fù)荷均明顯較去卵巢模型組升高（p<0. 05 或p<0. 01）。提示藥物組合物能有效預(yù)防去卵巢大鼠骨質(zhì)丟失，提高骨骼負(fù)載能力。

2.4 藥物組合物對(duì)去卵巢大鼠骨組織形態(tài)的影響

2.4.1 對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨量參數(shù)TBV%和骨吸收參數(shù)TRS%的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，去卵巢模型組大鼠TBV%較假手術(shù)組大鼠明顯降低(P<0.01)，TRS%較假手術(shù)組大鼠明顯升高(P<0.01)；藥物組合物組大鼠TBV%明顯較去卵巢模型組大鼠升高(P<0.01)，TRS%明顯較去卵巢模型組大鼠降低（P<O.05 或P<O.01）。

2.4.2 對(duì)去卵巢大鼠脛骨形成參數(shù)TFS%、AFS%、MAR 和BFR 的影晌

實(shí)驗(yàn)結(jié)束從結(jié)果可見(jiàn)，去卵巢模型組大鼠TFS、AFS、MAR 和BFR 均較假手術(shù)組大鼠明顯升高(P<0.01)；藥物組合物組大鼠TFS%、AFS%、MAR、BFR均明顯較去卵巢模型組大鼠降低(P<O.05 或P<O.01)。

2.4.3 對(duì)去卵巢大鼠脛骨Osw、mAR 的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，去卵巢模型組大鼠較假手術(shù)組大鼠Osw、mAR 明顯升高(P<0.01)；藥物組合物組大鼠脛骨Osw、mAR 明顯較去卵巢模型組大鼠降低(P<O.05 或P<O. 01)。

2.5 藥物組合物對(duì)去卵巢大鼠血鈣、血磷及堿性磷酸酶的影響

大鼠切除雙側(cè)卵巢后各組大鼠血鈣含量無(wú)明顯變化(P>0.05)，但血磷含量較假手術(shù)組明顯下降(P<0.01)，藥物組合物組大鼠血磷值均明顯較去卵巢模型組高(P<0.05 或P<0.01)，接近正常水平。各組大鼠堿性磷酸酶(ALP)活性均無(wú)明顯變化(P>0.05)。

2.6 藥物組合物對(duì)去卵巢大鼠血清雌二醇、降鈣素及骨鈣素含量的影響

從結(jié)果可見(jiàn)，去卵巢模型組大鼠血清雌二醇、降鈣素含量明顯較假手術(shù)組降低(P<0.01)，骨鈣素含量明顯較假手術(shù)組升高(P<0.01)，表明去卵巢后大鼠已致激素分泌紊亂。藥物組合物組大鼠血清雌二醇、降鈣素含量明顯較去卵巢模型組升高(P<0.01)，骨鈣素含量明顯較去卵巢模型組降低(P<0.01)。