本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的新用途。

背景技術(shù)：

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指在短期心肌血供間斷一定時間內(nèi)恢復(fù)血供，原缺血心肌在代謝、結(jié)構(gòu)、功能等方面發(fā)生較血供恢復(fù)前更嚴(yán)重甚至不可逆的。目前，在缺血性心臟病的治療過程中，MIRI是阻礙疾病獲得最佳療效的主要難題，在很大程度上削弱了治療的初衷，使很多病人遭受更嚴(yán)重的身體傷害和經(jīng)濟(jì)損失。因此，尋找有效的方法實(shí)現(xiàn)血液再灌注的同時，減輕再灌注損傷勢在必行，而闡明MIRI的發(fā)生機(jī)制是從根本防治此類疾病的基本前提。

經(jīng)過學(xué)者們多年的探索和研究，對MIRI也有了一定程度的認(rèn)識，其基本原理及發(fā)病機(jī)制已有所突破。研究顯示，活性氧自由基的損傷，細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺超載、炎癥級聯(lián)反應(yīng)、血管收縮以及細(xì)胞凋亡等因素均參與了MIRI的發(fā)生和發(fā)展。雖然目前關(guān)于MIRI的報道已有很多，但其發(fā)病機(jī)制過于復(fù)雜，具有多層面、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。人們對MIRI的現(xiàn)有了解相對有限，仍然缺乏相對系統(tǒng)的發(fā)病機(jī)制網(wǎng)絡(luò)和新穎有效的治療方法。

缺血預(yù)處理(Ischemia Preconditioning，IPC)是指心臟在幾回短暫的心肌缺血后能耐受隨后較長期間的缺血損傷，從而達(dá)到減小心梗面積，提高心臟功能恢復(fù)程度以及降低心律失常發(fā)生率的目的。IPC作為一種內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，盡管具有一定的臨床價值，但因道德倫理和使用不便等諸多原因使其臨床運(yùn)用受到限制。因此，常采用藥物預(yù)處理的方法，達(dá)到心肌保護(hù)的作用。由此看來，尋找切實(shí)有效的治療藥物成為防治MIRI的首要任務(wù)。目前，西藥還是治療冠心病的主要藥物，但我國傳統(tǒng)中藥兼?zhèn)浏熜Т_切及副反應(yīng)少等眾多長處優(yōu)勢，因此，開發(fā)具有一定治療效果、作用機(jī)理明確且副反應(yīng)少的治療心血管疾病的中藥，具有重要的研究意義和應(yīng)用價值。另外，中藥單體成分結(jié)構(gòu)明確、研究結(jié)果更易于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)接受，近來愈來愈引起學(xué)者們的廣泛重視，一些中藥單體抗心肌缺血的作用及機(jī)理已被證實(shí)。

植物資源中有許多活性物質(zhì)可以保護(hù)心肌缺血，缺氧，而且一些已開發(fā)用于預(yù)防和治療心血管疾病。黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，大量存在于水果、蔬菜等植物中，有些游離存在于植物中，但有些則以成苷的方式存在，因其結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣的特點(diǎn)而具有抗氧化，抗炎，抗腫瘤，抗癌，以及增強(qiáng)免疫能力等多種藥理作用。且已有研究表明黃酮類化合物對MIRI有一定的防治作用。大量文獻(xiàn)資料表明，口服黃酮類化合物對MIRI有一定的治療作用。由于中藥單體化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，更具藥效靶向性，為了更加深入的研究黃酮類成分對MIRI的藥理作用，課題組對香青蘭中黃酮成分刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷進(jìn)行制備工藝的研究，又首次通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支的方式復(fù)制MIRI模型，對刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷進(jìn)行抗MIRI的作用及機(jī)制的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷在制備保護(hù)心肌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的用途是：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷具有心肌保護(hù)作用活性，該化合物能作為心肌保護(hù)作用先導(dǎo)化合物。從動物整體及細(xì)胞因子水平闡明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對抗心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。

A、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷可抑制大鼠心肌梗死程度以及血清心肌酶的釋放；

B、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷通過糾正急性心肌缺血再灌注損傷過程中能量代謝障礙、抑制氧化損傷、炎癥因子活化及中性粒細(xì)胞浸潤的抗炎作用、緩解急性心肌缺血再灌注損傷時內(nèi)皮功能障礙、調(diào)控凋亡活性基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制發(fā)揮抗急性心肌缺血再灌注損傷的作用；

從動物整體及細(xì)胞因子水平，研究刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對抗心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。通過組織病理形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組心肌纖維斷裂明顯，細(xì)胞腫脹，有大量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷組心肌纖維較為完整，并呈束狀分布，炎癥細(xì)胞浸潤不明顯。采用TTC染色法測定心肌梗死范圍，比色法測定血清心肌酶的活性，結(jié)果表明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷能夠明顯減輕大鼠心肌梗死程度，與模型組比較具有顯著性差異；此外，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷能夠有效降低血清心肌酶的活性，差異具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。分別采用不同的試劑盒測定大鼠心肌組織中能量代謝酶Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase的活性，血清中SOD、GSH-Px、XOD的酶活性、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的水平、炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的含量及中性粒細(xì)胞特異性酶MPO的活性。結(jié)果表明，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對心肌組織中Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase的活性提高具有顯著的作用；能夠顯著升高血清中抗氧化酶活性，降低XOD活性及MDA含量，差異具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)；降低血清中炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α水平(P＜0.05)和MPO的活性(P＜0.05或P＜0.01)。通過ELISA試劑盒檢測血清中內(nèi)皮舒縮因子ET-1、CGRP、TXA₂、PGI₂的水平實(shí)驗(yàn)證明，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷能夠降低血清中內(nèi)皮收縮因子ET-1和TXA₂的含量，提高內(nèi)皮舒張因子CGRP和PGI₂的含量；通過比色法測定血清中NO含量及心肌組織中NOS的活性，結(jié)果表明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對NO水平和NOS活力具有顯著的抑制作用，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。通過檢測心肌細(xì)胞凋亡率、組織中Bcl-2和Bax蛋白及Caspase-3mRNA的表達(dá)，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷各劑量組均明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率，同時提高抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)，而降低促凋亡基因Bax表達(dá)，Bcl-2/Bax比值升高明顯，差異具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，此外，還能夠顯著抑制Caspase-3mRNA的表達(dá)，且高、中劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

附圖說明：

具體實(shí)施方式

圖1 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對IRI大鼠心肌梗死程度的影響(n＝10)

圖1-1中A：假手術(shù)組；B：模型組；C：普奈洛爾組；D：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高劑量組；E：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷中劑量組；F：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷低劑量組。

圖2 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠血清心肌酶活性的影響(n＝10)。

圖3 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠血清氧化應(yīng)激的影響(n＝10)。

圖4 MIRI大鼠心肌組織病理學(xué)觀察(HE×200)。A：假手術(shù)組；B：模型組；C：普萘洛爾組；D：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高劑量組；E：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷中劑量組；E：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷低劑量組；F：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷低劑量組。

圖5 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對IRI大鼠心肌組織中ATPase活性的影響(n＝10)。

圖6 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對IRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的影響(n＝10)。

圖7 IRI大鼠心肌組織中Bcl-2基因表達(dá)(DAB顯色，×200)。

圖8 IRI大鼠心肌組織中Bax基因表達(dá)(DAB顯色，×200)。

圖9 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對IRI大鼠心肌Bcl-2(左)和Bax(右)的影響(n＝10)。

圖10 IRI大鼠心肌組織中caspase-3mRNA表達(dá)(n＝10)。

圖11 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對缺血再灌注損傷大鼠血清促炎因子的影響(n＝10)。

圖12 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對IRI大鼠機(jī)體NO水平及NOS活性的影響(n＝10)。

圖13 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對IRI大鼠血清內(nèi)皮功能因子的影響(n＝10)。

一、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷預(yù)處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷對抗作用及分子機(jī)制研究

前期試驗(yàn)通過從一種植物中分離純化得到刺槐素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷單體；現(xiàn)以刺槐素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷為研究藥物，研究其對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用以及其作用機(jī)制。選用經(jīng)典的在體模型-結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支，對刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制進(jìn)行研究，該模型更接近于臨床發(fā)病的情況，對于藥物的實(shí)際應(yīng)用更具有指導(dǎo)意義和借鑒價值。選用HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化，TTC染色檢測心肌梗死程度，并對血清心肌酶的含量進(jìn)行了檢測，采用宏觀和微觀的方法對刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷抗MIRI的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1動物分組及藥物處理

SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、生理鹽水組、低劑量藥物組、中劑量藥物組、高劑量藥物組，其中3組大鼠于手術(shù)前1周分別灌胃不同劑量的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷(2mg/kg/d、4mg/kg/d、8mg/kg/d)，連用7d；其余各組大鼠術(shù)前分別給予相應(yīng)容積的溶劑，時間同藥物組。

2大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型的建立

將Wistar大鼠用烏來糖以(1g/Kg)劑量麻醉后，立即仰位固定于手術(shù)臺上，將心電圖機(jī)針型電極插入大鼠四肢皮下，記錄正常II導(dǎo)聯(lián)心電圖。調(diào)節(jié)小動物呼吸機(jī)，潮氣量7mL/100g，吸呼比：2∶1，呼吸頻率70次，然后沿胸骨左緣3-4肋間開胸，連接小動物呼吸機(jī)，再次記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖。暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動脈前降支(距左心耳下降2mm水平處)，結(jié)扎后心臟回位，分別于結(jié)扎0min、10min、20min、30min記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖，并于結(jié)扎30min時松開結(jié)扎線，記錄再灌0min、15min、30min、60min、90min、120min II導(dǎo)聯(lián)心電圖，模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎后II導(dǎo)聯(lián)心電圖以ST段明顯抬高表現(xiàn)為心肌缺血成功復(fù)制，放松結(jié)扎線后，抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功復(fù)制。符合該標(biāo)準(zhǔn)者入選實(shí)驗(yàn)。整個實(shí)驗(yàn)過程中用圖像分析軟件記錄分析大鼠肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖S-T段變化，計算各組大鼠ECG在缺血和再灌注時S-T段變化絕對值。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI心電圖S-T段影響見表1。

表1 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI心電圖S-T段的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表1可以看出，各試驗(yàn)組缺血及再灌注時均有S-T段的顯著抬高及下降，提示模型建立成功。與假手術(shù)組相比，模型組缺血前和再灌注后S-T段均明顯升高(P＜0.01)與模型組相比，普萘洛爾組在缺血期和再灌注期的ST段顯著降低(P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中劑量組在缺血期和再灌注期ST段的抬高幅度顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)，低劑量組的ST段降低幅度相對于模型組無顯著性差異。此結(jié)果說明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷預(yù)處理能緩解MIRI過程中心電傳導(dǎo)的異常。

3心肌梗死程度的測定

將心臟冰凍后，從心尖到心基底部平行切成2mm的薄片，置于含有1％TTC的50mM Tris-HCl(pH＝7.4)中37℃避光染色20min，染色過程中不時搖動染液，使之與心肌充分的接觸，保證染色完全。用超純水將心肌切片沖洗3次，然后置于10％甲醛溶液中固定12h，以增強(qiáng)顏色對比。由于非梗死區(qū)心肌細(xì)胞中的脫氫酶可以將TTC還原成紅色，因此，該區(qū)域心肌組織呈現(xiàn)磚紅色；而梗死區(qū)，由于心肌細(xì)胞膜損傷，脫氫酶漏出，不能將TTC還原，故該區(qū)域心肌組織呈現(xiàn)灰白色。使用數(shù)碼照相機(jī)采集圖像，并在圖像分析軟件(Image J)下計算出梗死區(qū)的面積(IS)，用IS×2mm即為梗死區(qū)的體積，心肌梗死程度以IS/AAR(梗死心肌體積/全心體積)來表示。結(jié)果見圖1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠心肌染色正常，沒有呈現(xiàn)白色的區(qū)域，可見其心肌無梗死現(xiàn)象；模型組大鼠心肌梗死嚴(yán)重，特別是結(jié)扎線以下極為明顯。而刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中劑量組能夠顯著的降低心肌梗死程度(P＜0.01，P＜0.05)，達(dá)到保護(hù)心肌的作用，效果呈現(xiàn)劑量依賴性。普萘洛爾組也可顯著降低心肌梗死范圍(P＜0.01)。

4心肌缺血再灌注后心肌酶及氧化酶含量測定

再灌2h結(jié)束后，腹主動脈取血8-10ml，在4℃下，3000rpm離心10min分離血清備用。動脈血血清標(biāo)本-20℃保存。采用試劑盒測定血清心肌酶LDH、CK、CK-MB及AST活性；并測定抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，及氧化產(chǎn)物XOD、MDA的含量。

4.1刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠心肌酶影響見表2，圖2。

表2 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠血清心肌酶的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

與假手術(shù)組相比，模型組心肌酶釋放量顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，普萘洛爾組心肌酶均顯著降低(P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中劑量組心肌酶含量降低顯著(P＜0.01，P＜0.05)，低劑量組對LDH，CK-MB的含量有抑制作用(P＜0.05)，而對AST，CK活力無顯著性影響。從表2-2中可以看出，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中劑量組對CK-MB釋放的抑制作用強(qiáng)于普萘洛爾組。另外，此數(shù)據(jù)同樣提示了刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對心肌酶的抑制作用有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

4.2刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠氧化酶影響見表3，圖3。

表3 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠血清氧化應(yīng)激的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

與假手術(shù)組比較，模型組血清SOD，GSH-Px活性下降顯著(P＜0.01)，而XOD活性及MDA含量顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，普萘洛爾組SOD，GSH-Px活性顯著升高(P＜0.01)，XOD活性及MDA含量顯著降低(P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷各劑量組SOD，GSH-Px活性顯著高于模型組，MDA含量顯著低于模型組(P＜0.01，P＜0.05)，低劑量組能夠明顯提高SOD活性、降低XOD活性(P＜0.05)，而對GSH-Px活性和MDA含量影響不顯著。

5心肌組織HE染色

取心臟下1/3心肌組織中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，從各組取5張石蠟切片，二甲苯脫蠟，HE染色，梯度乙醇脫水，封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。采用評分制評價組織細(xì)胞損傷程度：0分(無損傷)；1分(輕度損傷)：心肌纖維無明顯斷裂，細(xì)胞輪廓清晰，間質(zhì)水腫和局灶性壞死；2分(中度損傷)：心肌纖維出現(xiàn)一定程度的斷裂，彌散性心肌細(xì)胞溶脹和壞死，有少量紅細(xì)胞破裂；3分(嚴(yán)重?fù)p傷)：心肌纖維較大面積斷裂，細(xì)胞輪廓模糊，融合性壞死并伴隨中性粒細(xì)胞浸潤，破裂的紅細(xì)胞分布于細(xì)胞間隙；4分(極嚴(yán)重?fù)p傷)：心肌纖維大量斷裂，細(xì)胞融合性病變壞死，中性粒細(xì)胞大量浸潤及出血嚴(yán)重。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI心肌組織病理學(xué)影響見圖4。

常規(guī)HE染色后在光鏡下可見假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，界限清晰，呈束狀分布，心肌細(xì)胞核形態(tài)正常，無細(xì)胞腫脹和壞死區(qū)，胞漿染色均勻；模型組可見心肌廣泛融合性病變，心肌細(xì)胞腫脹，肌纖維排列紊亂，大片狀出血壞死，細(xì)胞間中性粒細(xì)胞浸潤明顯；普萘洛爾組大鼠輕度水腫，少量炎癥因子的浸潤；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷各藥物組與模型組比較損傷較輕，高劑量組與普萘洛爾組作用相當(dāng)。

6對心肌組織中Ca²⁺的影響

6.1心肌中Ca²⁺含量檢測

在強(qiáng)堿性條件下，鄰甲酚酞絡(luò)合酮法可與鈣離子絡(luò)合酮從而形成穩(wěn)定的有色復(fù)合物，在波長575nm處，其吸光度與樣本中鈣含量成正比，試劑中8-羥基喹啉可消除鎂的干擾，其他金屬由氰化物掩蔽，二甲基亞砜為鄰甲酚酞絡(luò)合酮的穩(wěn)定劑，亦可使輕度脂血標(biāo)本反應(yīng)液澄清，并可消除蛋白影響。按Elizabeth等的方法略作改動。胞漿懸浮于1％HCl中，150W×10s超聲3次，30000×g離心60min，取上清鄰甲酚酞絡(luò)合酮顯色，575nm波長比色。結(jié)果見表4。

表4 對MIRI大鼠Ca²⁺含量的影響(n＝6)

注：與假手術(shù)組比較，++P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

與假手術(shù)組相比，模型組線粒體Ca²⁺濃度顯著升高。與模型組相比，藥物組、以及陽性藥物組均能有效抑制線粒體Ca²⁺濃度升高，藥物低、中劑量也能相應(yīng)的減低Ca²⁺濃度。

6.2大鼠心肌組織中Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性的測定

通過測定無機(jī)磷的量即可以判定ATP酶的活力。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對心肌Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性影響見表5，圖5。

表5 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠心肌組織中ATPase活性的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，++P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

與假手術(shù)組比較，模型組Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase的活性均顯著下降；與模型組比較，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中劑量組能夠顯著提高組織中ATPase活性(P＜0.01或P＜0.05)′，低劑量對ATPase活性的影響不具有顯著性差異；陽性藥對ATPase活性的影響也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

7對心肌細(xì)胞凋亡的影響

用200目尼龍網(wǎng)研磨心肌組織塊，生理鹽水沖洗，將沖洗液收集后離心，棄去上清，向沉淀物中加入0.5％胃蛋白酶2mL，37℃消化30min后，加入生理鹽水稀釋至5mL，用100目尼龍網(wǎng)過濾，將濾液離心，棄去上清。取沉淀物按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測平滑肌細(xì)胞凋亡情況。

7.1刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對心肌細(xì)胞凋亡影響見表6，圖6。

表6 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

與假手術(shù)比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01)，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷組呈劑量依賴性的減少心肌細(xì)胞凋亡率，高、中劑量組具有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05)，此外，普萘洛爾組也能夠明顯降低心肌細(xì)胞的凋亡，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

7.2對凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

采用免疫組化法測定Bcl-2和Bax。步驟如下：石蠟切片脫蠟入水，PBS水化10min；含3％H₂O₂的甲醇溶液室溫孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加正常血清封閉液，室溫孵育30min，甩去多余液體；滴加Bcl-2/Bax單克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS洗5min×3次；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(S-A/HRP)工作液，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下Bcl-2和Bax免疫陽性細(xì)胞胞漿中有呈棕褐色、棕黃色或淡黃色的顆粒物，根據(jù)著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行評分。在200倍視野下，觀察凋亡陽性細(xì)胞分布情況，每張切片于陽性表達(dá)區(qū)隨機(jī)選擇6個無重疊視野，計算免疫陽性細(xì)胞率并評分，免疫陽性細(xì)胞率＝免疫陽性細(xì)胞數(shù)/(免疫陽性細(xì)胞數(shù)+免疫陰性細(xì)胞數(shù))×100％，蛋白陽性表達(dá)結(jié)果采用著色強(qiáng)度積分與陽性細(xì)胞百分率積分相加的方法進(jìn)行統(tǒng)計。評分標(biāo)準(zhǔn)見表7。

表7 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對Bax、Bcl-2表達(dá)的影響見表8，圖7，圖8，圖9。

表8 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠心肌組織中Bcl-2和Bax表達(dá)的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組僅見極少數(shù)散在的Bcl-2和Bax蛋白陽性表達(dá)；模型組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)中Bcl-2和Bax蛋白陽性染色增加，而Bax增加幅度較Bcl-2大，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值降低；與模型組比較，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷能夠增加Bcl-2的表達(dá)而降低Bax的表達(dá)，且隨著劑量的增加Bcl-2的表達(dá)增加而降低Bax的表達(dá)降低，從而使Bcl-2/Bax比值升高；陽性藥組也能夠升高抗凋亡蛋白Bcl-2和降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而使Bcl-2/Bax比值升高，達(dá)到抗凋亡的作用。

7.3對細(xì)胞色素C(CytC)及腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體ANT1(ANT1)的影響：

采用western-blot法檢測心肌細(xì)胞胞漿Cyt C和ANT-1蛋白水平。從-80℃冰箱中取出各組心肌標(biāo)本，加入組織裂解液，冰浴中充分研磨成組織勻漿；15000r·min^-1離心10min，定量測定蛋白濃度；加入上樣緩沖液，95℃水浴變性15min。每孔加100μg胞漿蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，4℃下100V恒壓轉(zhuǎn)膜，室溫下用5％脫脂奶粉封膜2h，分別加入LC3、Beclin-1或內(nèi)參GAPDH一抗，于4℃孵育過夜；洗膜后與辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h；漂洗后ECL發(fā)光，常規(guī)顯影。結(jié)果以目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果見表9。

表9 IRI大鼠心肌組織中Cyt C、ANT-1蛋白表達(dá)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，模型組與假手術(shù)組比較Cyt C及ANT1表達(dá)均顯著增加。與模型組比較，陽性藥物組CytC及ANT1表達(dá)顯著降低；藥物高、中劑量組CytC及ANT1表達(dá)明顯減少，此結(jié)果提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷預(yù)處理能夠通過抑制ANT-1的表達(dá)，來調(diào)節(jié)線粒體釋放Cyt C減少，從而影響線粒體凋亡通路，最終抑制心肌缺血/再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡。

7.4心肌組織中Caspase-3mRNA的檢測

提取心肌組織中RNA，取2μL RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作合成cDNA(65℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min)，測定cDNA濃度并稀釋，保存于-20℃?zhèn)溆?。Caspase-3上游引物：5′-TTGGAGCACTGTAGCACACA-3′，下游引物：5′-ACCACTGAAGGATGGTAGCC-3′；

β-actin上游引物：5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，

下游引物：5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′。

以適量cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)(94℃3min，94℃ 30sec，51℃ 30sec，72℃ 1min，72℃ 5min)。反應(yīng)結(jié)束后取6μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5％瓊脂糖對每個PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在凝膠成像儀上進(jìn)行掃描及定量分析。測定Caspase-3與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的A比值，即為目的基因caspase-3的mRNA相對表達(dá)量。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對Caspase-3mRNA表達(dá)的影響見表10，圖10。

表10 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對各組心肌組織caspase-3 mRNA表達(dá)的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

與假手術(shù)組比較，模型組caspase-3mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較，普萘洛爾組caspase-3mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中劑量組caspase-3mRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)，此結(jié)果提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷預(yù)處理能夠抑制缺血再灌注損傷后caspase-3mRNA的表達(dá)。

8對前炎癥因子的影響

8.1測定血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平

EILSA法檢測血清中IL-1、IL-6和TNF-α的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各細(xì)胞因子水平。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響見表11，圖11。

表11 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對缺血再灌注損傷大鼠血清促炎因子的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

與假手術(shù)組比較，模型組血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量及MPO活性明顯升高(P＜0.01)；與模型組比較，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中劑量組和普萘洛爾組能降低上述炎癥因子水平及炎癥細(xì)胞浸潤程度，差異具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷低劑量對于炎癥因子雖然具有抑制能力，但不顯著，而對MPO的活性則具有明顯的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)。

8.2檢測心肌細(xì)胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)水平

采用western-blot法檢測NF-κB表達(dá)水平。從-80℃冰箱中取出各組心肌標(biāo)本，加入組織裂解液，冰浴中充分研磨成組織勻漿；15000r·min-1離心10min，定量測定蛋白濃度；加入上樣緩沖液，95℃水浴變性15min。每孔加100μg胞漿蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，4℃下100V恒壓轉(zhuǎn)膜，室溫下用5％脫脂奶粉封膜2h，分別加入LC3、Beclin-1或內(nèi)參GAPDH一抗，于4℃孵育過夜；洗膜后與辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h；漂洗后ECL發(fā)光，常規(guī)顯影。結(jié)果以目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果見表12。

表12 IRI大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組NF-κB活性明顯升高；與模型組比較，藥物高、中劑量組和陽性藥組均能降低NF-κB活性，差異具有顯著性；藥物中劑量和低劑量組對于NF-κB活性雖然具有抑制能力，但不顯著。

8.3檢測心肌細(xì)胞胞漿中磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1水平

采用western-blot法檢測磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1表達(dá)水平。從-80℃冰箱中取出各組心肌標(biāo)本，加入組織裂解液，冰浴中充分研磨成組織勻漿；15000r·min-1離心10min，定量測定蛋白濃度；加入上樣緩沖液，95℃水浴變性15min。每孔加100μg胞漿蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，4℃下100V恒壓轉(zhuǎn)膜，室溫下用5％脫脂奶粉封膜2h，分別加入LC3、Beclin-1或內(nèi)參GAPDH一抗，于4℃孵育過夜；洗膜后與辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h；漂洗后ECL發(fā)光，常規(guī)顯影。結(jié)果以目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果見表13。

表13 IRI大鼠心肌組織中磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1蛋白表達(dá)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與假手術(shù)組比較模型組磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1水平均顯著增加。與模型組比較，藥物高、中劑量組與陽性藥物組均磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1水平顯著降低。此結(jié)果提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷預(yù)處理能夠通過激活I(lǐng)κB-α的磷酸化，與NF-κB結(jié)合并使其以無活性的形式存在于胞漿內(nèi)，從而減少細(xì)胞黏附分子COX-2和ICAM-1的磷酸化，來對抗心肌缺血/再灌注引起的損傷。

8.4免疫組化染色分析CD40/CD40L在心肌組織中的表達(dá)水平

CD40/CD40L在心肌組織中的表達(dá)水平檢測采用免疫組化染色進(jìn)行圖像分析。石蠟切片脫蠟入水，PBS水化10min；含3％H2O2的甲醇溶液室溫孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加正常血清封閉液，室溫孵育30min，甩去多余液體；滴加Bcl-2/Bax單克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS洗5min×3次；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(S-A/HRP)工作液，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果見表14。

表14 IRI大鼠心肌組織中CD40/CD40L蛋白表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組僅見極少數(shù)散在的CD40、CD40L蛋白陽性表達(dá)；模型組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)中CD40、CD40L蛋白陽性染色增加，而CD40L增加幅度較CD40大，導(dǎo)致CD40/CD40L比值降低；與模型組比較，藥物組能夠降低CD40L的表達(dá)，且隨著劑量的增加而減少CD40L表達(dá)的程度升高，從而使CD40/CD40L比值升高；陽性藥物組也能夠降低CD40L的表達(dá)，使CD40/CD40L比值升高。提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷可以通過提高CD40/CD40L表達(dá)，抑制無復(fù)流現(xiàn)象，減少細(xì)胞死亡發(fā)生。9對心肌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

采用實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(Real Time RT-PCR)檢測方法測定心肌MMP-2、TIMP-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平。提取心肌組織中RNA，取2μL RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作合成cDNA(65℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min)，測定cDNA濃度并稀釋。以適量cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)(94℃ 3min，94℃ 30sec，51℃ 30sec，72℃ 1min，72℃ 5min)。反應(yīng)結(jié)束后取6μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5％瓊脂糖對每個PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在凝膠成像儀上進(jìn)行掃描及定量分析。結(jié)果見表15。

表15 IRI大鼠心肌組織中MMP-2mRNA、TIMP-2mRNA表達(dá)(n＝10)

與假手術(shù)組比較，模型組MMP-2mRNA表達(dá)顯著增加。與模型組比較，陽性藥物組MMP-2nRNA表達(dá)顯著降低；藥物高、中劑量組MMP-2mRNA表達(dá)明顯減少；TIMP-2mRNA表達(dá)趨勢相反。此結(jié)果提示藥物預(yù)處理能夠通過刺激TIMP-2mRNA表達(dá)，特異性抑制MMP-2酶活性升高造成的心肌損傷。

10對血漿NO、PGI₂、ET等的影響

10.1對心肌組織及血清中NO含量、NOS活力及iNOS水平的影響

心肌組織及血清中NO的測定采用硝酸還原酶法，NO化學(xué)生質(zhì)活波，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)為硝酸鹽(NO₃^-)和亞硝酸鹽(NO₂^-)，而NO₂^-又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO₃^-，本法利用硝酸還原酶特異性將NO₃^-還原為NO₂^-，通過在550nm處測定其吸光度可反映NO的濃度。心肌組織及血清中NOS的測定，按NOS試劑檢測盒說明書所提供的方法進(jìn)行。原理為：NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530nm波長下測定其吸光度，可計算出NOS的活力。iNOS表達(dá)水平采用ELISA方法測定。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對NO、NOS及iNOS水平的影響見表16，圖12。

表16 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠機(jī)體NO水平及NOS活性的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

與假手術(shù)比較，模型組大鼠心肌組織中NO含量及NOS的活性顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷組各劑量及普萘洛爾組可以明顯降低心肌組織中NO的含量和NOS的活性(P＜0.01或P＜0.05)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；其中，各給藥組對iNOS的抑制作用強(qiáng)于tNOS。

11.2對血漿ET、CGRP、TXB₂及6-Keto-PGF1a含量的影響

血漿ET、CGRP、TXB₂及6-Keto-PGF1a含量水平采用采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對ET、CGRP、TXB₂及6-Keto-PGF 1a含量的影響見表17，圖13。

表17 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對MIRI大鼠血清內(nèi)皮功能因子的影響(n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，⁺⁺P＜0.01；與模型組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

與假手術(shù)組相比，模型組血清中縮血管因子ET-1與TXB2含量明顯升高，CGRP與6-Keto-PG含量明顯下降(P＜0.01)。與模型組比較，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷各個劑量組可以明顯降低MIRI大鼠血清ET-1、TXB₂含量(P＜0.01或P＜0.05)，顯著提高M(jìn)IRI大鼠血清CGRP、6-Keto-PGF1a含量(P＜0.01或P＜0.05)。普萘洛爾減少ET-1、TXB₂含量及增加CGRP、6-Keto-PGF1a含量的效果均優(yōu)于刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷藥物組。

11.3免疫組化檢測心肌組織PKCε蛋白表達(dá)

心肌組織PKCε蛋白表達(dá)采用免疫組化方法檢測：取心臟下1/3心肌組織中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，從各組取5張石蠟切片，二甲苯脫蠟，98℃用修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫涼至30℃，滴加過氧化物酶阻斷液，室溫孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加動物血清室溫封閉10min，一抗(1∶200稀釋)濕盒內(nèi)4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶50稀釋)濕盒內(nèi)室溫20min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，氨水返藍(lán)，乙醇梯度脫水，封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。Image-pro軟件分析計算各組陽性表達(dá)細(xì)胞的光密度值。結(jié)果見表18。

表18 IRI大鼠心肌組織中PKCε蛋白表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組僅見較少PKCε蛋白陽性表達(dá)；模型組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)中PKCε蛋白陽性染色顯著增多；與模型組比較，藥物組能夠減少PKCε的表達(dá)，且隨著劑量的增加而使抑制PKCε表達(dá)的程度增強(qiáng)；與陽性藥物組表現(xiàn)相當(dāng)。提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷可以抑制PKCε表達(dá)，達(dá)到心肌保護(hù)作用。

實(shí)施例1：

本發(fā)明的目的是刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的用途：

本發(fā)明的用途是：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷具有心肌保護(hù)作用活性，該化合物能作為心肌保護(hù)作用先導(dǎo)化合物。從動物整體及細(xì)胞因子水平闡明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷對抗心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。

實(shí)施例2

本發(fā)明的目的是刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的用途：

本發(fā)明的用途是：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷具有心肌保護(hù)作用活性，該化合物能作為心肌保護(hù)作用先導(dǎo)化合物。

A、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷可抑制大鼠心肌梗死程度以及血清心肌酶的釋放；

B、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷通過糾正急性心肌缺血再灌注損傷過程中能量代謝障礙、抑制氧化損傷、炎癥因子活化及中性粒細(xì)胞浸潤的抗炎作用、緩解急性心肌缺血再灌注損傷時內(nèi)皮功能障礙、調(diào)控凋亡活性基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制發(fā)揮抗急性心肌缺血再灌注損傷的作用。