本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及桔梗皂苷D在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨肉瘤是較常見的發(fā)生在20歲以下的青少年或兒童的一種惡性骨腫瘤，在小兒骨惡性腫瘤中最多見，約為小兒腫瘤的5％。目前對骨肉瘤的主要治療方法是手術(shù)加術(shù)后化療，但是化療藥物往往具有很強的副作用，同時還破壞人體的免疫系統(tǒng)。

所以一種副作用較小的藥品，不但能夠抗包括骨肉瘤在內(nèi)的腫瘤還能使患者減少痛苦是十分具有實用價值的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了桔梗皂苷的應(yīng)用，其特征在于為其在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用。

較佳地，所述的抑制腫瘤藥物為抑制骨肉瘤藥物。

本發(fā)明的優(yōu)點在于在其制備的抑制腫瘤的藥物可以更好的治療腫瘤患者，并能減少患者的不良反應(yīng)，為最終治愈腫瘤患者奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實施例中桔梗皂苷D對骨肉瘤細(xì)胞和對人成骨細(xì)胞hFOB的作用的對比圖；

圖2是本發(fā)明實施例中桔梗皂苷D作用后骨肉瘤細(xì)胞凋亡的情況圖。

圖3為本發(fā)明實施例中小鼠的活體成像圖及實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

桔梗皂苷D是從桔?？浦参锏母刻崛〉囊环N三萜類化合物，它本是一種廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的中藥制劑。下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，以更好地理解本發(fā)明。

實施例1：桔梗皂苷D對骨肉瘤細(xì)胞和人成骨細(xì)胞hFOB細(xì)胞活力的影響的實施步驟。

體外培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞系Saos2-lung，它是從荷瘤裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶分離的高轉(zhuǎn)移潛能骨肉瘤細(xì)胞亞群，并且具有熒光素酶標(biāo)記，母本細(xì)胞為最常見的Saos2骨肉瘤細(xì)胞。同時培養(yǎng)hFOB細(xì)胞。取對數(shù)期生長的Saos2-lung和hFOB細(xì)胞，用胰酶消化后，以300g離心5min。離心后去除上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并各自計數(shù)。將兩種細(xì)胞以5000個/孔的數(shù)量種到96孔板中。細(xì)胞種板后次日加入相應(yīng)濃度的桔梗皂苷D，桔梗皂苷D的濃度分別為0,5,10和20μM。每個濃度三個復(fù)孔，檢測時間點為0h，24h，48h和72h。

細(xì)胞活力檢測用CCK-8檢測試劑盒。首先以1:10的比例用DMEM完全培養(yǎng)基配置適量的CCK-8溶液，將加藥后的Saos2-lung和hFOB細(xì)胞各取一板，把細(xì)胞中的培養(yǎng)液換上剛配置的CCK-8溶液，110μl/孔。放在培養(yǎng)箱中孵育2.5h。2.5h后將加入CCK-8的細(xì)胞取出，除掉孔中氣泡，放入酶標(biāo)儀中測量450nm的吸光度值。依次檢測0h，24h，48h和72h后骨肉瘤的細(xì)胞活力。細(xì)胞活力計算公式為：(24h/48h/72h處理組吸光度—0h處理組吸光度)/(24h/48h/72h非處理組吸光度—0h非處理組吸光度)。

結(jié)果如圖1所示，圖1A是桔梗皂苷D對Saos2-lung骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響，可以看到桔梗皂苷D能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的活性，并且呈濃度依賴性和時間依賴性。圖1B中是桔梗皂苷D對人成骨細(xì)胞hFOB的細(xì)胞活力的影響，如圖1B所示桔梗皂苷D對人成骨細(xì)胞hFOB無毒性作用。因此，桔梗皂苷D可以抑制骨肉瘤細(xì)胞同時對正常細(xì)胞并無毒性作用，說明其副作用小，對患者沒有不良反應(yīng)。

實施例2：桔梗皂苷D對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響的實施步驟。

1.凋亡誘導(dǎo)

取對數(shù)期生長的Saos2-lung細(xì)胞，消化后離心。離心后去除上清，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計數(shù)。將細(xì)胞以2×10⁵個/孔的數(shù)量種到6孔板中，細(xì)胞分三組，桔梗皂苷D的濃度分別為0，10和20μM，每組設(shè)三個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后加桔梗皂苷D誘導(dǎo)凋亡，凋亡誘導(dǎo)在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。

2.凋亡檢測

按照細(xì)胞傳代方法收集細(xì)胞，胰酶需用不含EDTA的胰酶。將細(xì)胞懸液收集到流式管中。1500rpm離心5min后小心去掉流式管中培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，并再次以1500rpm離心5min。小心倒掉流式管中上清，按AlexaAnnexinⅤ/PI試劑盒說明加入100μl 1×結(jié)合緩沖液(binding buffer)和5μl AlexaannexinⅤ染色液混勻，室溫孵育15min；最后加入1μl 100μg/ml的PI工作染色液，再加入400μl 1×結(jié)合緩沖液(binding buffer)，并將流式管置于冰上。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞結(jié)合AnnexinⅤ和PI的情況。

圖2為最終的結(jié)果，圖2A是不同濃度桔梗皂苷D對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞檢測結(jié)果。針對圖2A，在圖2B中對凋亡細(xì)胞比例進(jìn)行了統(tǒng)計，如圖所示，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例隨桔梗皂苷D濃度的增加而增多，并且具有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，桔梗皂苷D能夠誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡，并且呈濃度依賴性。

實施例3：桔梗皂苷D在體內(nèi)對骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響的實施步驟。

1.骨肉瘤模型建立

取對數(shù)期生長的Saos2-lung骨肉瘤細(xì)胞，隨后將此種細(xì)胞消化離心，用PBS溶液重懸骨肉瘤細(xì)胞并用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，用臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞的活力，然后再次離心沉淀細(xì)胞。采用PBS溶液再次重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度至少為2×10⁸/ml。

隨后采用SPF級4周齡裸鼠(BALB/c-nu/nu)建立骨肉瘤脛骨原位模型，共20只，每組5只，共4組。動物的飼養(yǎng)和操作均按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會的要求執(zhí)行。應(yīng)用3.5％戊巴比妥鈉麻醉，每只裸鼠腹腔注射100μl。將骨肉瘤細(xì)胞混合均勻，然后用1ml注射器抽取細(xì)胞懸液。待動物麻醉之后，將裸鼠仰臥位，左手拇示指捏住裸鼠的右膝關(guān)節(jié)并將其屈曲呈90°，用75％酒精棉球擦拭消毒之后，右手持1ml注射器從右膝關(guān)節(jié)脛骨平臺處垂直進(jìn)針，用來回旋轉(zhuǎn)的方式輕輕地將針頭鉆入骨皮質(zhì)，當(dāng)獲得突破感后即可認(rèn)為到達(dá)骨髓腔，隨后將50μl細(xì)胞懸液注射入裸鼠脛骨近端骨髓腔中，邊退針頭邊注射，注射后用75％酒精棉球擦拭。用此方法，每只裸鼠的骨髓腔內(nèi)注射了大約1×10⁷個骨肉瘤細(xì)胞。

2.動物分組及藥物治療

待模型建立完成后，20只裸鼠被隨機(jī)分為4組，分別為非治療組，桔梗皂苷D低劑量組，桔梗皂苷D高劑量組以及順鉑陽性對照組。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100mm³時，桔梗皂苷D低劑量組和高劑量組分別給予5mg/kg和10mg/kg桔梗皂苷D治療，每天腹腔注射一次。順鉑治療組劑量為15mg/kg，每周腹腔注射兩次。非治療組用生理鹽水腹腔注射，每周注射兩次。按照此種治療方案連續(xù)治療四周。再測試小鼠體內(nèi)的骨肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)結(jié)果如圖2所示，桔梗皂苷D能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。

3.動物活體成像檢測

Saos2-lung細(xì)胞帶有熒光素酶標(biāo)記，因此可對動物模型進(jìn)行在體熒光信號檢測，。檢測前需要給予裸鼠螢火蟲熒光素酶底物注射。螢火蟲熒光素酶底物濃度為15mg/ml。每只裸鼠按照150mg/kg體重的劑量給藥。發(fā)光檢測前按上述劑量腹腔注射底物，7至8min后將裸鼠用異氟烷氣體麻醉，然后轉(zhuǎn)入Xenogen公司的IVIS200小動物活體成像儀中，采用維持麻醉濃度，bin值為4，曝光時間為5s，記錄熒光圖像，并計算感興趣區(qū)域(ROI)每cm²、每秒的光子數(shù)(photons/sec/cm²)，后續(xù)各組之間的熒光強度比較即為此指標(biāo)。動物成像每周一次，連續(xù)監(jiān)測四周。

最終結(jié)果如圖3所示，圖3A是經(jīng)過桔梗皂苷D和順鉑治療后的骨肉瘤的大體標(biāo)本，圖3B是對圖3A的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果，可以看到，高濃度的桔梗皂苷D能夠產(chǎn)生與順鉑相當(dāng)?shù)囊种颇[瘤生長的效果，并且與對照組具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖3C是對腫瘤進(jìn)行的四周的動物活體成像，圖3D對其進(jìn)行了統(tǒng)計，可見桔梗皂苷D確實能夠與順鉑一樣抑制骨肉瘤生長，并同時抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。綜上所述，桔梗皂苷D能夠在小鼠體內(nèi)抑制骨肉瘤的生長，同時通過活體成像和檢驗結(jié)果可以看到桔梗皂苷D可以抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明實施例對桔梗皂苷D在制備包括抗骨肉瘤的腫瘤的藥物的應(yīng)用進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D可以有效地抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，但對正常的成骨細(xì)胞卻沒有毒性。同時桔梗皂苷D還能夠抑制骨肉瘤在小鼠體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移。因此本發(fā)明為桔梗皂苷D在制備抑制腫瘤藥物(包括骨肉瘤)提供了科學(xué)依據(jù)，增加了桔梗皂苷D在臨床應(yīng)用中的適應(yīng)癥。且本發(fā)明的優(yōu)點在于其制備的抑制腫瘤的藥物可以更好的治療腫瘤患者，并能減少患者的不良反應(yīng)，為最終治愈骨肉瘤患者奠定了基礎(chǔ)。

以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。