本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及crenatoside的用途。
背景技術(shù)：
：腦血管疾病是世界最常見的疾病之一，因其發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類生命與健康。缺血性腦血管病(ischemiccerebrovasculardisease,ICVD)指供應(yīng)大腦血流的主要?jiǎng)用}發(fā)生狹窄或閉塞，結(jié)果導(dǎo)致腦組織(特別是大腦中動(dòng)脈區(qū)域)急劇缺血缺氧，最終引起局部腦組織發(fā)生缺血或壞死,出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀。缺血性腦卒中后可通過溶解血栓或機(jī)械再通的方式恢復(fù)缺血區(qū)的血液灌注，但一些病人在缺血后再灌注后不僅沒有使組織功能恢復(fù),反而使缺血所致的功能障礙和結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重，即我們所說的腦缺血再灌注損傷(cerebralischemia-reperfusion(IR)injury)。腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，近來研究發(fā)現(xiàn),腦血流中斷和再灌注使腦的細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié)，如能量障礙、細(xì)胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。目前雖然對(duì)腦缺血的病理生理機(jī)制研究取得重大進(jìn)展，但治療選擇仍然有限。目前，常見的治療腦缺血疾病藥物有尼莫地平、消苯地平緩釋片、西比靈等，但是這些藥副作用較強(qiáng)。近年來，中藥治療腦缺血疾病的研究逐漸引起人們的關(guān)注，而且由于很多中藥組分屬于天然提取藥物，具有副作用小等優(yōu)點(diǎn)。Crenatoside是從中藥植物中提取苯乙醇苷類成分，其結(jié)構(gòu)如式I所示：藥理研究表明，該化合物具有壯陽、抗氧化、增強(qiáng)記憶力等多種作用。但是目前未見Crenatoside在制備治療腦缺血疾病藥物中應(yīng)用的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供crenatoside的用途，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)表明，crenatoside對(duì)缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧損傷后神經(jīng)細(xì)胞存活率及鈣離子含量均有明顯的改善作用；同時(shí)在體內(nèi)對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬及皮層中總?cè)姿嵯佘彰?ATP酶)、鈉-鉀-三磷酸腺苷酶(Na+-K+-ATP酶)、鈣-鎂-三磷酸腺苷酶(Ca2+-Mg2+-ATP酶)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的活性均有不同程度的調(diào)節(jié)作用，并具有一定的劑量依賴，表明該化合物具有治療腦缺血疾病的作用和應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供了Crenatoside在制備改善缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧損傷后細(xì)胞鈣離子濃度異常升高的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例中進(jìn)行試驗(yàn)的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞；具體為人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤；優(yōu)選的，細(xì)胞株為SH-SY5Y。Crenatoside用于改善缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧損傷后細(xì)胞鈣離子濃度異常升高的濃度為25μg/mL～100μg/mL；優(yōu)選的，濃度為50μg/mL。鈣離子是機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)不可缺少的離子，能夠用于維持正常的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。缺血缺氧條件下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)出現(xiàn)的鈣離子濃度異常升高的現(xiàn)象，這是造成腦缺血后神經(jīng)元不可逆損傷、凋亡的重要原因。本發(fā)明測(cè)定Crenatoside對(duì)缺氧缺糖所致SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)異常升高的鈣離子濃度的影響，復(fù)氧給藥1h后，模型組的細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高，與DMEM對(duì)照組(DMEM組)比較有顯著差異(P＜0.01)，Crenatoside各劑量組與復(fù)氧復(fù)糖共同作用1h后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，Crenatoside高、中、低劑量組對(duì)細(xì)胞損傷后鈣離子變化具有較好的調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明提供了Crenatoside在制備保護(hù)缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧對(duì)細(xì)胞損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例中進(jìn)行試驗(yàn)的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞；具體為人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤；優(yōu)選的，細(xì)胞株為SH-SY5Y。Crenatoside用于保護(hù)缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧對(duì)細(xì)胞損傷的濃度為25μg/mL～100μg/mL；優(yōu)選的，濃度為50μg/mL。缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧的過程中，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一系列的反應(yīng)，包括如能量障礙、細(xì)胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或壞死。本發(fā)明采用MTS法測(cè)定Crenatoside對(duì)缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧所致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧損傷4h、復(fù)氧給藥3h后，模型組的細(xì)胞存活率為51.02％，與溶劑對(duì)照組(DMSO組)比較有顯著差異(P＜0.01)；陽性藥及藥物組作用3h后，細(xì)胞保護(hù)率明顯增加，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。其中以Crenatoside化合物中劑量組對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用最好，可以明顯改善缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧損傷所致細(xì)胞損傷，對(duì)其具有較好的保護(hù)作用。本發(fā)明提供了Crenatoside在制備提高腦缺血再灌注后腦組織抗氧化能力的藥物中的應(yīng)用。一些實(shí)施例中，提高腦缺血再灌注后腦組織抗氧化能力包括：提高ATP酶活性、提高抗氧化酶活性、降低MDA和/或NO的含量。一些具體實(shí)施例中，ATP酶為總?cè)姿嵯佘彰?、鈉-鉀-三磷酸腺苷酶、鈣-鎂-三磷酸腺苷酶；所述抗氧化酶為超氧化物歧化酶或過氧化氫酶。一些實(shí)施例中，腦組織為海馬和/或皮層。一些具體實(shí)施例中，腦組織為大鼠腦組織。Crenatoside用于提高腦缺血再灌注后腦組織抗氧化能力的劑量為6.5mg/kg·d-1～26mg/kg·大鼠體重d-1。優(yōu)選的，劑量為26mg/kg·大鼠體重d-1。優(yōu)選的，給藥方式為靜脈注射。ATP酶又稱為三磷酸腺苷酶，是一類能將三磷酸腺苷(ATP)催化水解為二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根離子的酶，實(shí)驗(yàn)表明，缺血再灌注大鼠海馬和皮層中ATP酶活性發(fā)生降低，具體的，總?cè)姿嵯佘彰?ATP酶)、鈉-鉀-三磷酸腺苷酶(Na+-K+-ATP酶)、鈣-鎂-三磷酸腺苷酶(Ca2+-Mg2+-ATP酶)的活性降低?？寡趸甘侵阁w內(nèi)存在的清除活性氧自由基,防止氧化應(yīng)激狀態(tài)有害作用的酶，實(shí)驗(yàn)表明，缺血再灌注大鼠海馬和皮層中抗氧化酶活性發(fā)生降低。具體的，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性發(fā)生降低。丙二醛(MDA)主要導(dǎo)致膜脂過氧化，損傷生物膜結(jié)構(gòu)，改變膜的通透性，進(jìn)而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行。一氧化氮(NO)通過氧化應(yīng)激、干擾能量代謝、直接損害DNA、激活多聚ADP核糖聚合酶、或使胞液Ca2+調(diào)節(jié)紊亂等多個(gè)方面誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)表明，缺血再灌注大鼠海馬和皮層中丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的濃度異常升高。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)表明，Crenatoside可以改善缺血再灌注大鼠海馬和皮層中總ATP酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SOD、CAT的活性及MDA、NO含量，可通過抗自由基過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而，保護(hù)細(xì)胞膜上多種ATP酶的活性，發(fā)揮對(duì)缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用。本發(fā)明以靜脈注射給藥方式測(cè)定Crenatoside對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明，Crenatoside對(duì)缺糖缺氧復(fù)糖復(fù)氧所致的細(xì)胞活力級(jí)鈣離子異常具有不同程度的改善，并可以改善缺血再灌注大鼠海馬和皮層中總ATP酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SOD、CAT、MDA及NO的活性，可通過抗自由基過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而，保護(hù)細(xì)胞膜上多種ATP酶的活性，發(fā)揮對(duì)缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明還提供了Crenatoside在制備治療和/或預(yù)防腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用；所述腦血管疾病包括缺血性腦血管病和/或腦缺血再灌注損傷。一些實(shí)施例中，Crenatoside治療治療腦血管疾病的劑量為6.5mg/kg·d-1～26mg/kg·d-1。本發(fā)明還提供了一種治療和/或預(yù)防腦血管疾病的藥物，其中包括Crenatoside。本發(fā)明提供的治療和/或預(yù)防腦血管疾病的藥物中還包括藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明提供的治療和/或預(yù)防腦血管疾病的藥物具體用于防治缺血性腦血管病和/或腦缺血再灌注損傷。本發(fā)明提供的治療和/或預(yù)防腦血管疾病的藥物的劑型為口服給藥劑型、注射給藥劑型、外用給藥制劑。所述口服給藥劑型為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液劑、煎膏劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑。所述注射給藥劑型為注射液劑或注射用粉針劑。所述外用給藥制劑為栓劑、貼劑或凝膠劑。一些實(shí)施例中，治療和/或預(yù)防腦血管疾病的片劑中包括：Crenatoside、淀粉、羧甲基淀粉鈉、滑石粉、糊精、硬脂酸鎂和淀粉漿。具體的，Crenatoside、淀粉、羧甲基淀粉鈉、滑石粉、糊精與硬脂酸鎂的質(zhì)量比為350∶5:7.5:0.8:50:0.8。一些實(shí)施例中，治療和/或預(yù)防腦血管疾病的膠囊劑的內(nèi)容物中包括：Crenatoside、淀粉、低取代羥丙基纖維素、微粉硅膠、硬脂酸鎂和淀粉漿。具體的，Crenatoside、淀粉、低取代羥丙基纖維素、微粉硅膠與硬脂酸鎂的質(zhì)量比為350:32:6:4.5:1.5。一些實(shí)施例中，治療和/或預(yù)防腦血管疾病的顆粒劑中包括：Crenatoside、蔗糖和糊精。具體的，Crenatoside、蔗糖和糊精的質(zhì)量比為350:1000:500。一些實(shí)施例中，治療和/或預(yù)防腦血管疾病的丸劑中包括：Crenatoside、聚乙二醇-6000和聚山梨酯-80。具體的，Crenatoside、聚乙二醇-6000和聚山梨酯-80的質(zhì)量比為350:12:80.5。一些實(shí)施例中，治療和/或預(yù)防腦血管疾病的注射液劑中包括：Crenatoside、大豆磷脂、甘油和水。具體的，Crenatoside的濃度為200g/L；大豆磷脂的濃度為15g/L；甘油的濃度為25g/L。注射時(shí)，將治療和/或預(yù)防腦血管疾病的注射液劑稀釋后，靜脈滴注；所述稀釋采用5％葡萄糖注射液；所述稀釋的比例為1:250。本發(fā)明同時(shí)還提供了一種治療和/或預(yù)防腦血管疾病的方法，其為給予本發(fā)明提供的治療和/或預(yù)防腦血管疾病的藥物。所述給予為口服或注射。本發(fā)明提供的治療和/或預(yù)防腦血管疾病的藥物每天的注射劑量以Crenatoside的質(zhì)量計(jì)為6.5mg/kg大鼠體重～26mg/kg大鼠體重。優(yōu)選為26mg/kg大鼠體重。本發(fā)明提供了crenatoside的用途，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)表明，crenatoside對(duì)缺糖缺氧-復(fù)糖復(fù)氧損傷后神經(jīng)細(xì)胞存活率及鈣離子含量均有明顯的改善作用；同時(shí)在體內(nèi)對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬及皮層中總?cè)姿嵯佘彰?ATP酶)、鈉-鉀-三磷酸腺苷酶(Na+-K+-ATP酶)、鈣-鎂-三磷酸腺苷酶(Ca2+-Mg2+-ATP酶)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的活性均有不同程度的調(diào)節(jié)作用，并具有一定的劑量依賴，表明該化合物具有治療腦缺血疾病的作用和應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了crenatoside的用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明采用的藥品、生物材料或儀器皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1：Crenatoside對(duì)缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷所致細(xì)胞損傷的保護(hù)作用1、實(shí)驗(yàn)材料SH-SY5Y細(xì)胞系，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。2、實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)與給藥細(xì)胞傳代接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞基本長滿后(細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長期)，棄去培養(yǎng)液，加入適量PBS溶液輕輕蕩洗，棄去，然后加入0.25％胰蛋白酶溶液0.5ml消化2-3分鐘，加入完全培養(yǎng)基2ml終止胰酶的作用，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，1000r，離心4min，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基，小心吹打成單細(xì)胞。細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按照1.5×105個(gè)/mL，每孔100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，邊緣孔加100μL無菌水，繼續(xù)于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20小時(shí)后進(jìn)行造模、給藥試驗(yàn)。2.2分組及給藥實(shí)驗(yàn)設(shè)DMSO組、模型組、陽性對(duì)照組和樣品組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。DMSO組每孔加入100μL含1/1000DMSO的空白培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，模型組、陽性對(duì)照組和樣品組每孔加入100μLBSS緩沖液(NaCl122mmol/L、KCl5.4mmol/L、MgSO4·7H2O0.8mmol/L、NaH2PO42.6mmol/L、NaHCO326.2mmol/L、CaCl21.8mmol/L、HEPES20.1mmol/L)作為缺氧液，放入37℃、5％CO2、95％N2的缺氧小室內(nèi)進(jìn)行缺氧，缺氧開始前通氣20min使缺氧小室飽和，缺氧4小時(shí)后即刻將接入95％N2的接口斷開。造模后，模型組每孔加入100μL含1/1000DMSO的空白培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組每孔加入100μL含20μM小檗堿的空白培養(yǎng)基，DMSO含量在1/1000，樣品組每孔加入100μL不同劑量Crenatoside的空白培養(yǎng)基，DMSO含量在1/1000，復(fù)氧給藥3h。2.3細(xì)胞活力測(cè)定缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷4h、復(fù)氧給藥3h后，棄掉板中所有液體，PBS洗板一次，各孔加入100μL的細(xì)胞增殖檢測(cè)溶液(終濃度190μg/ml)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)吸光值，按公式：存活率＝(不同給藥組OD490/DMSO組OD490)*100％計(jì)算各組細(xì)胞存活率。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1Crenatoside對(duì)缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(n＝9)組別濃度(μg/ml)OD±SD存活率(％)DMSO組——0.49±0.11100模型組10μM0.25±0.03△△51.02陽性對(duì)照組20μM0.38±0.02**77.55Crenatoside低劑量250.40±0.04**81.63Crenatoside中劑量500.56±0.03**114.29Crenatoside高劑量1000.48±0.03**97.96注：△△P＜0.01，與DMSO組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較結(jié)果如表1所示，缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷4h、復(fù)氧給藥3h后，模型組的細(xì)胞存活率為51.02％，與溶劑對(duì)照組(DMSO組)比較有顯著差異(P＜0.01)；陽性藥及藥物組作用3h后，細(xì)胞保護(hù)率明顯增加，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。其中以Crenatoside化合物中劑量組對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用最好，可以明顯改善缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷所致細(xì)胞損傷，對(duì)其具有較好的保護(hù)作用。實(shí)施例2Crenatoside對(duì)缺氧缺糖所致細(xì)胞內(nèi)異常升高鈣離子濃度的降低作用1、實(shí)驗(yàn)材料SH-SY5Y細(xì)胞系，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Fluo-3AM(Sigma，73881-1MG)；BSA(BIORAD,E588)。2、實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。2.2分組及給藥取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，0.25％胰酶消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并用DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105cells/mL，每孔200μl接種于黑色96孔板中培養(yǎng)。分為正常組、模型組、Crenatoside低劑量組、Crenatoside中劑量組、Crenatoside高劑量組，模型組和DMEM正常對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)24h，用無糖DMEM清洗一次，各孔加入100μl無糖DMEM，置含5％CO2和95％N2的三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)，缺氧1h后取出96孔板，各孔加入0.5μl不同劑量Crenatoside藥物，至正常培養(yǎng)箱復(fù)氧1h后使用Fluo-3AM探針檢測(cè)各孔鈣離子濃度2.3鈣離子濃度測(cè)定各孔加入25μl含20uM的Fluo-3am探針和0.25％的F-127的HBSS，37℃放置30min，吸棄105μl上清，加入80μlHBSS，輕輕混勻，吸棄80μl上清，共重復(fù)3次，加入80μlHBSS-BSA，37℃×20min，檢測(cè)各孔F＝485/525nm熒光強(qiáng)度；各孔加入25μl含1％TritonX-100的BSS，避光室溫震蕩5min，同上檢測(cè)Fmax；各孔加入25μl500mM的EGTA，同上檢測(cè)Fmin，通過公式鈣離子＝Kd*(F-Fmin)/(Fmax-F)的各孔鈣離子濃度。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2Crenatoside對(duì)缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷致SH-SY5Y細(xì)胞鈣離子異常升高的調(diào)節(jié)作用(n＝5)注：△△P＜0.01，模型與DMEM組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較結(jié)果如表2所示，復(fù)氧給藥1h后，模型組的細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高，與DMEM對(duì)照組(DMEM組)比較有顯著差異(P＜0.01)；Crenatoside各劑量組與復(fù)氧復(fù)糖共同作用1h后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，Crenatoside高、中、低劑量組對(duì)細(xì)胞損傷后鈣離子變化具有較好的調(diào)節(jié)作用。實(shí)施例3Crenatoside對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。1、實(shí)驗(yàn)材料雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，體重240～280g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供；尼莫地平注射液；過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、總ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase檢測(cè)試劑盒；注射用硝普鈉。2、實(shí)驗(yàn)方法2.1大鼠急性腦缺血模型的制備取健康雄性Wistar大鼠，術(shù)前12h禁食，正常飲水。采用夾閉雙側(cè)頸動(dòng)脈合并降壓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。3.5％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，背位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部去毛，常規(guī)消毒。頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并輕輕剝離迷走神經(jīng)，穿線備用。在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈之前，腹腔注射硝普鈉(2.5mg/kg)，隨即夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10min后，再灌注10min，然后再夾閉10min，松開動(dòng)脈夾，再通后傷口局部噴灑青霉素40萬u，以預(yù)防感染?？p合傷口，5％碘伏消毒傷口，待其蘇醒后，正常飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠不注射硝普鈉，不進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉再灌注，其余操作步驟同上。2.2動(dòng)物分組與給藥雄性Wistar大鼠蘇醒后，按體重隨機(jī)分為模型組，尼莫地平組(0.36mg·kg-1)，RC-10低劑量組，RC-10中劑量組，RC-10高劑量組，另設(shè)假手術(shù)組，每組10只動(dòng)物。再灌注后3h首次靜脈給藥，24h后第二次給藥，以后每天給藥一次，共給藥7次。2.3指標(biāo)檢測(cè)末次給藥24h后取材，快速斷頭取腦，放在下置冰塊的表面皿上，用濾紙將表面血吸干，剝離雙側(cè)海馬及大腦皮質(zhì)組織，置于液氮中快速冷凍，稱重，凍存于-80℃?zhèn)溆?。進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)時(shí)，以重量/體積比1:9加入4℃生理鹽水，制成10％的腦組織勻漿，3000r/min低溫離心15min，取上清液，按試劑盒說明，用722分光光度計(jì)測(cè)定大鼠海馬及大腦皮質(zhì)中總ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、SOD、CAT活性以及MDA和NO含量。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3Crenatoside對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬中總ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、SOD及CAT活性的影響與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01結(jié)果如表3所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬中總?cè)姿嵯佘彰?ATP酶)、鈉-鉀-三磷酸腺苷酶(Na+-K+-ATP酶)、鈣-鎂-三磷酸腺苷酶(Ca2+-Mg2+-ATP酶)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)活性均顯著降低，與假手術(shù)組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05；p<0.01),與模型組比較，各濃度化合物組劑量依賴性升高總?cè)姿嵯佘彰?、鈣-鎂-三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶及過氧化氫酶含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05；p<0.01)。表4Crenatoside對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層中總ATP酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SOD及CAT活性的影響與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01結(jié)果如表4所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠大腦皮質(zhì)中總ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、SOD及CAT活性顯著降低，與模型組相比，Crenatoside可劑量依賴性地升高上述5種酶的活性，明顯改善缺血再灌注導(dǎo)致的酶活性降低。表5Crenatoside對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬、大腦皮層組織MDA、NO含量的影響與假手術(shù)組比較##P<0.01，###P<0.001；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001結(jié)果如表5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬及大腦皮層MDA和NO的含量顯著升高，與模型組相比，Crenatoside各劑量組MDA、NO含量顯著降低。大鼠急性腦缺血再灌注結(jié)果表明，急性腦缺血再灌注后大鼠海馬及皮層中中總?cè)姿嵯佘彰?ATP酶)、鈉-鉀-三磷酸腺苷酶(Na+-K+-ATP酶)、鈣-鎂-三磷酸腺苷酶(Ca2+-Mg2+-ATP酶)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性明顯降低，而丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)則顯著升高，與正常對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各濃度Crenatoside可以改善缺血再灌注大鼠海馬及皮層中中總ATP酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SOD、CAT、MDA、NO的活性，并具有一定的劑量依賴，表明其對(duì)缺血大鼠具有腦保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，Crenatoside對(duì)缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧所致的細(xì)胞活力級(jí)鈣離子異常具有不同程度的改善，并可以改善缺血再灌注大鼠海馬和皮層中總ATP酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SOD、CAT、MDA及NO的活性，可通過抗自由基過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而，保護(hù)細(xì)胞膜上多種ATP酶的活性，發(fā)揮對(duì)缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用。實(shí)施例4膠囊劑將350gCrenatoside和32g淀粉、6g低取代羥丙基纖維素、4.5g微粉硅膠、1.5g硬脂酸鎂、及適量10％淀粉漿混合，裝入膠囊，得到膠囊制劑1000粒。每日3次，每次1粒。實(shí)施例5顆粒劑將350gCrenatoside和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常規(guī)方法制成1000包顆粒劑。每日3次，每次1粒。實(shí)施例6片劑將350gCrenatoside和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉鈉、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸鎂及適量10％淀粉漿適混合，按照常規(guī)方法制成片劑1000片。每日3次，每次1片。實(shí)施例7丸劑將350gCrenatoside和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、適量液狀石蠟混合，按照常規(guī)方法制成丸劑1000粒。每日3次，每次1粒。實(shí)施例8注射劑將200gCrenatoside和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常規(guī)方法制成注射劑1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL5％葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3