本發(fā)明涉及趨化因子CXCL16的新用途，特別涉及趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α在制備抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤，嚴(yán)重危害人民健康，尚缺乏有效的治療方式。近30年來CHOP方案一直是該類型淋巴瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，F(xiàn)isher等的多中心前瞻性隨機(jī)對(duì)照結(jié)果表明，增大劑量的第二代和第三代常規(guī)化療方案與CHOP相比生存率相似，確定了CHOP為治療DLBCL的金標(biāo)準(zhǔn)，但其5年生存率僅在40％左右。

本發(fā)明旨在尋求一種有效的抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖的方法，通過采用人重組CXCL16蛋白和腫瘤壞死因子(TNF-α)聯(lián)合作用，來抑制DLBCL細(xì)胞株的增殖。然而，趨化因子CXCL16對(duì)于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的生物學(xué)作用國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α在制備抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于，提供一種趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α在制備治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供了一種趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α在制備抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，將趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α聯(lián)合用于制備彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖藥物中。

優(yōu)選地，所述趨化因子CXCL16的終末濃度為30-60ng/ml。

優(yōu)選地，所述趨化因子CXCL16的終末濃度為50ng/ml。

優(yōu)選地，所述腫瘤壞死因子-α的終末濃度為20-40ng/ml。

優(yōu)選地，所述腫瘤壞死因子-α的終末濃度為30ng/ml。

優(yōu)選地，所述彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞包括OCI-Ly1細(xì)胞、OCI-Ly3細(xì)胞、OCI-Ly8細(xì)胞、OCI-Ly10細(xì)胞。

相應(yīng)的，本發(fā)明還提供一種趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α在制備治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。

實(shí)施本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明采用人重組CXCL16蛋白和腫瘤壞死因子(TNF-α)的聯(lián)合作用，抑制DLBCL細(xì)胞株的增殖，效果顯著。本發(fā)明對(duì)治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤具有重大價(jià)值。

附圖說明

圖1是sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly-1細(xì)胞增殖的影響的示意圖；

圖2是sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly3細(xì)胞增殖的影響的示意圖；

圖3是sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly8細(xì)胞增殖的影響的示意圖；

圖4是sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly10細(xì)胞增殖的影響的示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

本發(fā)明提供了一種趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α在制備抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，具體將趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α聯(lián)合用于制備彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖藥物中。

其中，趨化因子(chemokines，CK)是具有多種生物學(xué)功能的小分子生物活性肽。CXCL16是作為磷脂酰絲氨酸和ox-LDL的清道夫受體的多功能趨化因子。

腫瘤壞死因子-α(TNFα)是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并參與正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。

所述彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞包括OCI-Ly1細(xì)胞、OCI-Ly3細(xì)胞、OCI-Ly8細(xì)胞、OCI-Ly10細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述趨化因子CXCL16的終末濃度為30-60ng/m；所述腫瘤壞死因子-α的終末濃度為20-40ng/ml。更佳地，所述趨化因子CXCL16的終末濃度為50ng/ml；所述腫瘤壞死因子-α的終末濃度為30ng/ml。

相應(yīng)的，本發(fā)明還提供一種趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α在制備治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤藥物含有活性成分趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α。

需要說明的是，在制備抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖藥物和治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤藥物時(shí)，只需要保證其活性成分同時(shí)含有趨化因子CXCL16與腫瘤壞死因子-α，其他藥物的原料可以參照現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明通過采用人重組CXCL16蛋白和腫瘤壞死因子(TNF-α)聯(lián)合作用，來抑制DLBCL細(xì)胞株的增殖。本發(fā)明驗(yàn)證了該作用較單獨(dú)作用效果顯著，使用CXCR6抗體抑制劑可以抑制該作用，因此該作用與DLBCL細(xì)胞表面存在能與CXCL16特異性結(jié)合的受體CXCR6有關(guān)，具體如下：

一、實(shí)驗(yàn)過程：

(一)、體外培養(yǎng)4株彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(OCI-Ly1、OCI-Ly3、OCI-Ly8、OCI-Ly10)：

96孔板鋪板：收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞重懸后調(diào)整細(xì)胞密度2×10⁴個(gè)/ml，取無菌96孔板，加入混勻后細(xì)胞懸液100ul，每孔細(xì)胞數(shù)2000個(gè)，注意細(xì)胞的重懸混勻，這對(duì)抑制DLBCL細(xì)胞株的增殖很重要。另外，為了防止揮發(fā)培基，影響OD值測(cè)定，96孔板周圍一圈的孔不加樣品，并添加適量滅菌PBS緩沖液或蒸餾水，以保持孔板內(nèi)的濕度，避免誤差。

(二)、加入下述試劑至上述細(xì)胞

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組如下：對(duì)照組(裸細(xì)胞)、sCXCL16組(50ng/ml)、TNF-α組(30ng/ml)，TNF-α+sCXCL16組，TNF-α+sCXCL16組+Anti-CXCR6(先加入anti-CXCR6作用10min后加入其它試劑)。sCXCL16的終末濃度50ng/ml，TNF-α終末濃度30ng/ml，Anti-CXCR6終末濃度為500ng/ml。

(三)、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

檢測(cè)步驟：避光條件下，每24h加入10ul/孔的CCK-8試劑，使用十字法小心搖勻，放置培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育2-4h，在避光下條件下，分光光度計(jì)下檢測(cè)OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇450nm。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，剔除最高值和最低值，留3個(gè)中間值進(jìn)行OD值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

檢測(cè)結(jié)果如下：

(1)sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly1細(xì)胞增殖的影響

從表1及圖1可見，經(jīng)過成對(duì)比較，day1各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；day2-4sCXCL16組與con之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sCXCL16對(duì)Ly-8的影響不大；day2-4TNF-α與con對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF-α抑制其增殖；day2-3TNF-α+sCXCL16組與TNF-α差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，day4兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sCXCL16能聯(lián)合TNF-α抑制其增殖；day2-3TNF-α+sCXCL16+Anti-CXCR6組與TNF-α+sCXCL16組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，day4兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Anti-CXCR6能部分拮抗sCXCL16與TNF-α的協(xié)同抑制作用。

表1 sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly-1細(xì)胞增殖的影響

Day與Group存在交互作用(F＝43.054，P＝0.000)，因此做simple effect檢驗(yàn)。調(diào)整的R²＝0.990。

(2)sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly3細(xì)胞增殖的影響

從表2及圖2可見，經(jīng)過成對(duì)比較，day1各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；day2-4sCXCL16組與con之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sCXCL16對(duì)Ly-8的影響不大；day2-3TNF-α與con對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，day4兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；day2-4TNF-α+sCXCL16組與TNF-α差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sCXCL16能聯(lián)合TNF-α協(xié)同抑制其增殖；day2-4TNF-α+sCXCL16+Anti-CXCR6組與TNF-α+sCXCL16組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Anti-CXCR6能拮抗sCXCL16與TNF-α的協(xié)同抑制作用。

表2 sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly3細(xì)胞增殖的影響

Day與Group存在交互作用(F＝3.419，P＝0.002)，因此做simple effect檢驗(yàn)。調(diào)整的

R²＝0.978。

(3)sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly8細(xì)胞增殖的影響

從表3及圖3可見，經(jīng)過成對(duì)比較，day1各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；day2-4sCXCL16組與con之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sCXCL16對(duì)Ly-8的影響不明顯；day2-4TNF-α與con對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF-α抑制其增殖；day2-4TNF-α+sCXCL16組與TNF-α差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sCXCL16聯(lián)合TNF-α抑制其增殖；day2-4TNF-α+sCXCL16+Anti-CXCR6組與TNF-α+sCXCL16組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Anti-CXCR6能拮抗sCXCL16與TNF-α的協(xié)同的抑制作用。

表3 sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly8細(xì)胞增殖的影響

Day與Group存在交互作用(F＝25.129，P＝0.000)，因此做simple effect檢驗(yàn)。調(diào)整的

R²＝0.984。

(4)sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly10細(xì)胞增殖的影響

從表4及圖4可見，經(jīng)過成對(duì)比較，在day1中，TNF-α+sCXCL16及TNF-α+sCXCL16+Anti-CXCR6組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；day2-4中，除了day3(P＝0.018)外，其余day中sCXCL16組與con之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sCXCL16對(duì)Ly-8的影響不大；day2-4TNF-α與con對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF-α抑制其增殖；day2-4TNF-α+sCXCL16組與TNF-α差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sCXCL16能聯(lián)合TNF-α產(chǎn)生協(xié)同抑制增殖的效應(yīng)；day2-3TNF-α+sCXCL16+Anti-CXCR6組與TNF-α+sCXCL16組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Anti-CXCR6能拮抗sCXCL16與TNF-α的協(xié)同抑制作用，day1及day4兩組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表4 sCXCL16聯(lián)合TNF-α對(duì)OCI-Ly10細(xì)胞增殖的影響

Day與Group存在交互作用(F＝31.229，P＝0.000)，因此做simple effect檢驗(yàn)。調(diào)整的R²＝0.990。

由上可知，人重組CXCL16蛋白和腫瘤壞死因子(TNF-α)聯(lián)合作用，抑制四種DLBCL細(xì)胞株的增殖，效果顯著。本發(fā)明對(duì)治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤具有重大價(jià)值。以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。