本發(fā)明涉及重組人成纖維細胞生長因子-21的新用途，特別涉及重組人成纖維細胞生長因子-21在預防和治療缺血性心律失常中的應用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域。

背景技術：

全球每年有1700萬人死于心血管疾病，其中一半以上死于心肌梗死。我國每年死于心肌梗死及其并發(fā)癥的人數已超過100萬。隨著溶栓和冠脈介入治療技術的發(fā)展，顯著提高了急性心肌梗死(AMI)患者的生存率，但心肌梗死急性發(fā)作后仍然存在較高的室性心律失常發(fā)生率，并已成為心肌梗死后患者死亡的主要原因。心肌電重構是心肌梗死后發(fā)生惡性室性心律失常的關鍵。心梗后心肌細胞膜表面離子(鈉、鈣、鉀等)通道表達和功能失衡引起了心肌電重構。此外，心肌纖維化是心肌梗死的嚴重并發(fā)癥之一，隨著心肌纖維化程度加深，進一步誘發(fā)周圍心肌細胞發(fā)生電重構。因此，如何預防或逆轉心肌梗死后發(fā)生心臟電生理重構已成為當前臨床心律失常治療中亟待解決的難點問題。傳統抗心律失常藥物在臨床治療中仍存在許多不足之處：(1)一種抗心律失常藥物只選擇性激動或阻斷某一特定類型離子通道，影響心肌動作電位時程及有效不應期，從而發(fā)揮其抗心律失常作用，但其作用機制并不能有效改善心臟電重構所引起的離子通道功能失衡這一病理生理學基礎，因此仍處于對癥治療階段；(2)傳統的四類抗心律失常藥長期或過量應用均可發(fā)生致心律失常副作用，因此長期應用的安全性均較差。

重組人成纖維細胞生長因子(Recombinant Human fibroblast growth factor，rhbFGF)參與機體多種系統和器官的病理生理過程。近年來，越來越多的成纖維細胞生長因子(FGFs)作為人類疾病的生物標志物、最佳藥靶及治療藥物被發(fā)現，但在心臟疾病的預防和治療領域中卻仍存在空白。目前已有研究證實，FGF家族成員FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF9、FGF16、FGF21及FGF23分別在心臟疾病中，如心肌缺血、心肌梗死、心衰、心肌肥厚、心肌纖維化、房顫及心肌氧化應激性損傷等，通過調控不同的信號通路參與其病理生理過程。其中，FGF21在心衰、心肌肥厚、心肌氧化應激損傷、心肌缺血及糖尿病心臟病動物模型中，具有抑制心肌細胞凋亡、抗缺血損傷等方面的心臟保護作用，但目前尚未有研究發(fā)現FGF21在心律失常發(fā)生過程中的作用。因此，本發(fā)明通過在體動物模型及離體細胞水平研究，發(fā)現重組人成纖維細胞生長因子21(Recombinant Human fibroblast growth factor21，rhbFGF21)能夠有效地抑制心梗后心律失常的發(fā)生。通過形態(tài)學及分子生物學等技術證實其作用機制為：rhbFGF21能夠靶向性調節(jié)心肌細胞鈉(Nav1.5)，鉀(Kir2.1、Kv4.3)及鈣(CaV1.2)離子通道m(xù)RNA及蛋白表達水平。rhbFGF21能夠顯著抑制心肌梗死缺血區(qū)心肌膠原生成，抑制心肌梗死后心肌纖維化發(fā)生。

由于rhbFGF21可調控多個參與心梗后心律失常發(fā)生的離子通道基因的表達并抑制缺血區(qū)心肌膠原生成，使得開發(fā)針對rhbFGF21為靶點的藥物成為可能，并可以成為一種新的缺血性心律失常的預防及治療藥物。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于確定rhbFGF21在重大心臟疾病(慢性缺血性心臟病，心肌梗死)中抗心律失常的作用，并將其作為一種新型藥物以及生物標志物，應用于預防和治療缺血性心律失常等相關心臟疾病中。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：

本發(fā)明通過建立大鼠心肌梗死模型，對重組人成纖維細胞生長因子-21(rhbFGF21)的抗心律失常作用、對心肌梗死大鼠模型心臟的保護作用以及對心肌細胞離子通道的影響進行了研究，本發(fā)明經實驗證實在急性心肌梗死動物模型室性心律失常的發(fā)生率明顯增高，同時伴有離子通道蛋白CaV1.2、Nav1.5、Kir2.1、Kv4.3表達異常下調。分別于術前和術后給予心肌梗死模型大鼠注射rhbFGF21，可顯著逆轉上述的病理過程，降低大鼠心臟急性心肌梗死后心律失常的發(fā)生率，同時降低了室顫發(fā)生的可能性，恢復大鼠缺血邊緣區(qū)心室肌離子通道相關蛋白CaV1.2、Nav1.5、Kir2.1、Kv4.3的表達異常。該結果表明：1)rhbFGF21在心肌梗死動物模型心梗前預防給藥，能夠顯著降低心肌梗死后急性期心律失常的發(fā)生率。2)rhbFGF21在心肌梗死動物模型心梗前預防給藥及心梗后1周持續(xù)腹腔注射給藥，能夠顯著降低心肌梗死后慢性期(1周及4周)心律失常的發(fā)生率。3)rhbFGF21在心肌梗死動物模型心梗前預防給藥及心梗后1周持續(xù)腹腔注射給藥，能夠顯著預防心肌梗死后心肌纖維化及心衰的并發(fā)癥。

在上述研究的基礎上，本發(fā)明提出了重組人成纖維細胞生長因子-21在制備預防和治療缺血性心律失常藥物中的應用。

在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的藥物能夠顯著降低心肌梗死后急性期或慢性期心律失常的發(fā)生率。

在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的藥物能夠顯著預防心肌梗死后心肌纖維化及心衰的并發(fā)癥。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的rhbFGF21可與適當載體，例如膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質體等，連接形成藥物。通過靜脈或肌肉注射方式，用于急、慢性心肌缺血后心律失常的預防和治療，并預防心梗后心肌纖維化及心臟功能衰竭。

相交于現有技術，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明經研究證明了rhbFGF21能夠預防和治療急性心肌梗死后室性心律失常的發(fā)生，從而提供了一種安全、有效的保護心臟并具有良好的抗心律失常作用的治療方法和藥物，同時也為rhbFGF21能夠成為預防和治療缺血性心律失常藥物提供了有力的理論依據。

附圖說明

圖1為rhbFGF21對心肌梗死大鼠心律失常發(fā)生率的影響；

A.肢體導聯心電圖檢測心肌梗死大鼠急性期(15mins)及慢性期(1week，4week)心律失常的發(fā)生；B.心肌梗死后大鼠急性期(15mins)及慢性期(1week，4week)心律失常發(fā)生頻率；

圖2為rhbFGF21對哇巴因誘導的心律失常潛伏期的影響；

圖3為rhbFGF21對心肌梗死大鼠心臟結構和功能的影響；

A.心肌梗死后1周及4周大鼠左心室超聲心動檢測。B-E.心肌梗死后1周及4周大鼠心臟射血分數(EF)及左心室縮短分數(FS)檢測；

圖4為心肌梗死模型大鼠心肌梗死區(qū)心肌缺血損傷面積TTC染色結果；

圖5為形態(tài)學觀察rhbFGF21對心肌梗死大鼠左心室缺血邊緣區(qū)心肌細胞形態(tài)及纖維化的影響；

A.心肌梗死模型大鼠心肌梗死邊緣區(qū)心肌組織H&E和Masson染色；B.心肌梗死模型大鼠心肌梗死邊緣區(qū)心肌組織H&E和Masson染色統計圖；

圖6為心肌梗死模型大鼠心肌梗死邊緣區(qū)心肌細胞電鏡觀察結果；

圖7為rhbFGF21對大鼠H9C2心室肌細胞系及原代培養(yǎng)成纖維細胞活力的影響；

A.MTT法檢測大鼠H9C2心肌細胞系細胞活力；B.MTT法檢測原代培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細胞活力；C.細胞計數法檢測原代培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細胞活力；

圖8為rhbFGF21對心肌梗死大鼠缺血區(qū)心室肌細胞離子通道m(xù)RNA表達水平的影響；

A-D.rhbFGF21對心肌梗死1周后大鼠缺血區(qū)心室肌細胞離子通道CaV1.2，Nav1.5，Kv4.3，Kir2.1 mRNA表達水平的影響；E-H.rhbFGF21對心肌梗死4周后大鼠缺血區(qū)心室肌細胞離子通道CaV1.2，Nav1.5，Kv4.3，Kir2.1 mRNA表達水平的影響；

圖9為rhbFGF21對心肌梗死大鼠缺血邊緣區(qū)心室肌細胞離子通道蛋白表達水平的影響；

A-E.rhbFGF21對心肌梗死1周大鼠缺血邊緣區(qū)心室肌細胞離子通道CaV1.2，Nav1.5，Kv4.3，Kir2.1蛋白表達水平的影響；F-J.rhbFGF21對心肌梗死4周大鼠缺血邊緣區(qū)心室肌細胞離子通道CaV1.2，Nav1.5，Kv4.3，Kir2.1蛋白表達水平的影響；

圖10為rhbFGF21對心室肌H9C2細胞系離子通道m(xù)RNA表達水平的影響。

A-D.rhbFGF21對H₂O₂處理的大鼠心室肌細胞系(H9C2)離子通道Nav1.5，CaV1.2，Kir2.1，Kv4.3 mRNA表達水平的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的抗心肌梗死后心律失常作用的優(yōu)點和特點。但實施例僅用于說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的保護范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。

本發(fā)明實施例所涉及的材料及其來源：

1、實驗動物：雄性SD大鼠，體重180±10g；豚鼠，雌雄各半，體重200g-250g，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

2、主要藥品與儀器：0.9％生理鹽水；rhbFGF21(為現有商品化的產品，可通過市場購買得到，本實施例中所使用的rhbFGF21由溫州醫(yī)科大學提供)；哇巴因(Sigma)。

3、主要儀器：自動灌流系統、細胞培養(yǎng)相關儀器、分子生物學檢測設備(Western blot odssay掃膜分析儀、Real-Time PCR system)

實施例一、rhbFGF21抗心律失常作用

1.rhbFGF21降低心肌梗死大鼠的急性期(15mins)及慢性期(1周，4周)心律失常的發(fā)生率

1)建立心肌梗死大鼠模型：本實驗選取SD大鼠180±10g，經3％異戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，連接小動物呼吸機，通過開胸后結扎冠狀動脈左前降支，成功建立大鼠心肌梗死模型。實驗動物分為假手術組(Sham組)，只開胸不結扎冠狀動脈；心梗組(MI組)，開胸并結扎冠狀動脈；心梗給藥組(MI+rhbFGF21組)，開胸結扎冠狀動脈前1小時心室內注射rhbFGF21(7μg/kg)和術后每天腹腔給藥(7μg/kg)。

2)觀察結果：分別記錄大鼠心臟結扎后15mins、1周、4周以及給藥后心電圖中QT間期及R-R間期變化，以及心律失常的發(fā)生頻率。在大鼠左心室結扎15mins后，心律失常頻繁發(fā)生，同時出現了二聯律和三聯律。結扎前給予心室注射rhbFGF21(7ug/kg)組中，心律失常的發(fā)生頻率明顯降低。在模型組大鼠左心室結扎1周后，ST段抬高，表現出明顯的心肌缺血的現象，rhbFGF21腹腔注射給藥組大鼠左心室冠狀動脈結扎1周后，心電圖檢測顯示未出現明顯的ST段抬高，表明無明顯的心肌缺血現象(見圖1A)。MI組大鼠左心室結扎4周后，心電圖顯示仍有室性早搏的產生，而MI+rhbFGF21組心電圖檢測未發(fā)現心律失常的現象。此結果說明，rhbFGF21參與大鼠心梗后心律失常發(fā)生的病理過程。心肌梗死大鼠急性期(15mins)及慢性期(1周及4周)的心律失常發(fā)生率經統計發(fā)現，rhbFGF21預處理組心肌梗死大鼠心律失常的發(fā)生頻率明顯低于未處理組(見圖1B)。

2.rhbFGF21延長哇巴因誘導大鼠心律失常發(fā)生的潛伏期

1)建立哇巴因誘導大鼠心律失常模型：選取260-300g豚鼠，雌雄各半，隨機分為生理鹽水組(Control)和rhbFGF21組(10μg/kg，20μg/kg)。建立頸外靜脈插管，給藥1h后，采用恒流泵勻速(1000μl/h)注射哇巴因(0.2mg/ml)誘導豚鼠的心律失常模型，心電示波器連續(xù)監(jiān)測心電圖的變化，直至出現室顫后死亡。記錄注射哇巴因0時到心律失常第一次出現的時間(心律失常出現潛伏期)。

2)心電監(jiān)測結果顯示，在rhbFGF21濃度為20μg/kg時，顯著延長心律失常的出現的潛伏期，并具有統計學意義(P<0.01)(見圖2)。

實施例二、rhbFGF21對心肌梗死大鼠模型心臟的保護作用

1.建立心肌梗死大鼠模型：方法同實施例一所述。

2.觀察結果：

1)rhbFGF21對心肌梗死后心臟功能的保護作用

心動超聲技術檢測各組動物手術前及術后1周和4周心臟功能及左心室結構變化(見圖3)。Sham組大鼠左心室容積及心室壁厚度于術后1周及4周較術前相比均無顯著變化；MI組大鼠心梗術后1周左心室容積較心梗前明顯擴張，心室壁變??；心梗術后4周左心室容積較心梗術后1周顯著擴張，左室前壁變薄，說明心梗模型大鼠術后1周及4周已出現顯著的心室重構，心腔擴張。MI+rhbFGF21組大鼠，術后1周及4周后大鼠心室容積及心室壁厚度均無顯著變化，說明rhbFGF21對心肌梗死大鼠心臟具有保護作用(見圖3A)。血流動力學參數顯示(見圖3B-E)，心肌梗死后1周及4周，MI組大鼠心臟射血分數(EF)值及左心室縮短分數(FS)與Sham組相比均顯著性降低(P<0.01)。MI+rhbFGF21組大鼠心肌梗死術后1周及4周心臟射血分數及左心室縮短分數較MI組相比顯著增加(P<0.05)。結果表明心肌梗死后心肌細胞因缺血缺氧，逐漸發(fā)生左心室重構表現為心室容積擴大，同時伴有心功能下降，最終發(fā)展為心力衰竭。rhbFGF21能有效的保護心梗后心臟結構重構及心功能損傷。

2)rhbFGF21對心肌梗死后心肌組織缺血性損傷的保護作用

TTC染色檢測心梗模型大鼠心肌梗死區(qū)面積，取各組大鼠心臟，沿左室長軸將心室水平切為3-4mm的心肌切片并進行TTC染色。結果顯示，MI+rhbFGF21組大鼠心肌梗死術后1周和4周后左心室梗死區(qū)的面積較MI組顯著降低(見圖4)。結果表明rhbFGF21能夠保護心肌梗死邊緣區(qū)心肌細胞，減少心肌缺血損傷面積。

形態(tài)學方法(H&E和Masson染色)觀察心肌梗死區(qū)及缺血邊緣區(qū)心肌結構和膠原纖維增生。結果顯示，H&E染色中，MI組大鼠心梗后1周和4周左心室缺血區(qū)心肌與Sham組相比，細胞排列紊亂，細胞體積變大，同時梗死區(qū)可見大量的炎性細胞浸潤。Masson染色結果顯示，MI組大鼠心梗后1周和4周左心室缺血區(qū)心肌均呈現出不同程度的纖維化，并且伴有大量膠原的生成。rhbFGF21給藥組心梗大鼠與MI組相比心梗1周和4周后，心肌細胞排列整齊，炎性細胞浸潤少，心肌纖維化和膠原生成減少(見圖5A、5B)。

透射電鏡觀察心肌梗死后缺血區(qū)心肌細胞內結構。結果顯示，MI組大鼠心梗1周后，缺血區(qū)心肌細胞出現明顯的細胞核腫脹，肌絲斷裂，肌節(jié)紊亂，橋粒消失，閏盤斷裂，線粒體腫脹。心梗術后4周，呈現肌絲完全斷裂或溶解，Z線消失，線粒體脊腫脹破裂。rhbFGF21給藥組心梗大鼠心梗邊緣區(qū)心肌組織與MI組相比較，肌絲排列整齊，線粒體形態(tài)完好，未發(fā)現線粒體腫脹及結構改變，橋粒及縫隙連接未見明顯損傷。說明rhbFGF21對缺血心肌組織具有較好的保護作用(見圖6)。

實施例三、rhbFGF21對于心肌細胞及成纖維細胞活力的影響

1.細胞培養(yǎng)及實驗分組：

培養(yǎng)成年大鼠的心室肌細胞系(H9C2)及原代培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細胞,經rhbFGF21(25、50、75、100、200、400ng/ml)預處理2h，37℃，5％CO₂孵箱培養(yǎng)24小時后收集細胞，進行MTT檢測。

2.觀察結果：

MTT法檢測心肌細胞活力。顯示rhbFGF21(25，50，75及100ng/ml)顯著增加心肌細胞的活力，促進心肌細胞增殖(見圖7A)。同時，原代培養(yǎng)大鼠成纖維細胞，不同濃度rhbFGF21孵育48h后分別通過細胞計數和MTT法檢測成纖維細胞活力。結果顯示，75ng/ml rhbFGF21對成纖維細胞增殖呈現抑制作用趨勢，但與對照組相比無顯著差異。說明rhbFGF21能夠增加心肌細胞的活力，但不影響或輕度抑制成纖維細胞的活力(見圖7B、7C)。

實施例四、rhbFGF21對心肌細胞離子通道的影響

1.動物模型建立、細胞培養(yǎng)及實驗分組：

建立心肌梗死大鼠模型：方法同實施例一。

體外心肌細胞氧化應激模型建立：培養(yǎng)成年大鼠的心室肌細胞系(H9C2),經rhbFGF21(25、50、75ng/ml)預處理2h后，給予H₂O₂(100μM)，建立心肌細胞氧化應激模型，經37℃，5％CO₂孵箱培養(yǎng)24小時后收集細胞，提取總mRNA，檢測心肌細胞經H₂O₂及rhbFGF21處理后離子通道CaV1.2，Nav1.5，Kir2.1，Kv4.3mRNA表達變化。提取總蛋白，采用Western blot技術檢測離子通道Scn5a、Kcnj2、Kcnd3及Cacna1c蛋白表達變化。

2.觀察結果：

1)rhbFGF21對離子通道m(xù)RNA表達水平的影響

qRT-PCR技術檢測大鼠心肌梗死缺血邊緣區(qū)心肌細胞離子通道Nav1.5、Kir2.1、Kv4.3及CaV1.2mRNA表達變化。在1周和4周大鼠心梗模型中，心肌梗死組大鼠心室肌缺血區(qū)心肌細胞CaV1.2，Nav1.5，Kir2.1，Kv4.3 mRNA表達較假手術組明顯降低(p<0.05)，MI+rhbFGF21組與MI組相比，CaV1.2，Nav1.5，Kir2.1，Kv4.3 mRNA表達顯著升高(p<0.05,p<0.01)(圖8A-8H)。結果表明rhbFGF21能夠恢復心梗后心肌細胞中鈉、鈣、鉀等離子通道表達的下降和功能失衡，從而降低心臟電重構和心律失常的發(fā)生率。

Western blot技術檢測心肌梗死1周及4周大鼠缺血邊緣區(qū)心室肌細胞離子通道Scn5a、Kcnj2、Kcnd3及Cacna1c蛋白表達水平。結果顯示，MI組大鼠心肌梗死術后1周缺血邊緣區(qū)心室肌細胞離子通道Scn5a、Kcnj2、Kcnd3及Cacna1c蛋白表達水平較Sham組相比顯著下降。表明心肌梗死模型制備成功，心肌梗死術后1周大鼠心室肌出現心肌電生理重構。經rhbFGF21預處理的大鼠心肌梗死術后1周缺血邊緣區(qū)心室肌細胞離子通道Scn5a、Kcnj2、Kcnd3及Cacna1c蛋白表達水平較MI組相比顯著回升(見圖9A-E)大鼠心肌梗死術后4周，MI組大鼠心室肌缺血邊緣區(qū)心肌細胞離子通道Scn5a、Kcnj2、Kcnd3及Cacna1c蛋白表達水平較Sham組顯著降低；經rhbFGF21預處理的大鼠心肌梗死術后1周缺血邊緣區(qū)心室肌細胞離子通道Scn5a、Kcnj2、Kcnd3及Cacna1c蛋白表達水平較MI組相比顯著回升(見圖9F-J)。結果表明心肌梗死后大鼠缺血邊緣區(qū)心室肌細胞離子通道表達下降，導致心肌電重構，從而誘發(fā)心肌梗死后心律失常。rhbFGF21預處理組中，心肌缺血缺氧對心肌細胞離子通道Scn5a、Kcnj2、Kcnd3及Cacna1c蛋白的損傷作用明顯減輕，因此，對大鼠心室肌電生理重構具有保護作用。

2)rhbFGF21對心肌細胞離子通道蛋白氧化應激損傷的影響

qRT-PCR技術檢測大鼠的心室肌細胞系(H9C2)在氧化應激(由H₂O₂誘導)過程中離子通道蛋白Cav1.2，Nav1.5，Kir2.1，Kv4.3 mRNA表達。結果顯示H₂O₂組中CaV1.2，Nav1.5，Kir2.1，Kv4.3 mRNA表達明顯降低(p<0.05)。rhbFGF21處理組與H₂O₂組相比，各組Cav1.2,Nav1.5,Kir2.1,Kv4.3 mRNA表達顯著升高(p<0.05)(見圖10)。結果表明在心肌氧化應激過程中，rhbFGF21對心肌細胞Na⁺，K⁺，Ca²⁺離子通道的損傷具有保護作用。