本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ICAM-1或αMβ2整合蛋白在篩選用于診斷或治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

卵巢癌(Ovarian cancer，OC)是全美婦科排名第二的常見腫瘤及主要死亡原因之一。高死亡率主要是由于卵巢癌在早期(I/II)診斷困難，直至其擴(kuò)散進(jìn)展至晚期(III/IV)后方能確診。我們已報(bào)道過OC患者從I期到IV的確診率分別為7.19％、8.63％、72％和72.18％。OC患者的預(yù)后不良，各期OC患者五年平均生存率為42％。對(duì)III期和IV期患者的長(zhǎng)期隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)其五年生存率低于10％；但對(duì)于早期(I-II)確診的患者，特別是那些腫瘤局限于原發(fā)部分的患者，其五年生存率達(dá)92.7％。研究顯示OC患者5年生存率與10年前相比上升不到2％。廣泛腹腔和盆腔內(nèi)種植轉(zhuǎn)移是OC預(yù)后不良的主要原因，手術(shù)治療通常不能完全將這些病灶清除干凈。在這種情況下，對(duì)大多數(shù)OC患者來說腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)成為最后的選擇。到目前為止，尚沒有發(fā)現(xiàn)有效的特定靶向藥物對(duì)種植轉(zhuǎn)移有所療效，而現(xiàn)在用于OC的化療藥物極易誘發(fā)癌細(xì)胞耐藥性，同時(shí)治療后患者的長(zhǎng)期預(yù)后并不理想。因此，弄清OC種植轉(zhuǎn)移的機(jī)制很有必要，其對(duì)于OC種植轉(zhuǎn)移靶向新藥物的研發(fā)以及提高OC患者生存率都至關(guān)重要。

增大的腫物破入腹膜表面后，腫瘤細(xì)胞從原位癌上脫落下來，并隨著腹水在腹腔中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)直至定植在腹腔中，這是目前對(duì)腹膜種植轉(zhuǎn)移現(xiàn)象最為普遍認(rèn)同的解釋。許多研究認(rèn)為種植轉(zhuǎn)移的過程分為如下幾個(gè)步驟：1)細(xì)胞脫落、存活及抵抗失巢凋亡；2)躲避免疫監(jiān)視：3)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化；4)球體形成；5)腹水形成6)腹膜種植。但是，自由脫落的腫瘤細(xì)胞在種植轉(zhuǎn)移環(huán)境中如何生存以及種植轉(zhuǎn)移初期球體形成的機(jī)制仍不清楚。目前的研究表明，種植轉(zhuǎn)移情況下從原位癌上自由脫落腫瘤細(xì)胞的生存和增殖以及種植轉(zhuǎn)移早期球體形成中，巨噬細(xì)胞均扮演了重要角色。因此，希望通過小鼠原位卵巢癌模型來揭示出OC種植轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，為卵巢癌和其他腹膜轉(zhuǎn)移癌的早期診斷提供相關(guān)基理。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了ICAM-1或αMβ2整合蛋白在篩選用于診斷或治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物中的用途，本發(fā)明為種植轉(zhuǎn)移癌新藥的設(shè)計(jì)提供了新的靶點(diǎn)，為植轉(zhuǎn)移癌的治療提供了新的方法和思路。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：ICAM-1或αMβ2整合蛋白在篩選用于診斷或治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物中的用途。其中，ICAM-1(Intracellular Adhesion Moleculae-1)為細(xì)胞粘附分子1。

作為對(duì)于上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述種植轉(zhuǎn)移癌的種植轉(zhuǎn)移與巨噬細(xì)胞相關(guān)。

作為對(duì)于上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述種植轉(zhuǎn)移癌為卵巢癌、胰腺癌或大腸癌。

作為對(duì)于上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述種植轉(zhuǎn)移癌為卵巢癌。

作為對(duì)于上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述藥物通過降低ICAM-1水平或降低αMβ2整合蛋白水平來治療種植轉(zhuǎn)移癌。

作為對(duì)于上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述藥物通過降低ICAM-1水平或降低αMβ2整合蛋白水平而抑制EGFR陽性腫瘤細(xì)胞與TAMs的相互黏附來治療種植轉(zhuǎn)移癌。

另一方面，本發(fā)明還提供了ICAM-1抑制劑或αMβ2整合蛋白抑制劑在制備用于治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物中的用途。

作為對(duì)于上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述ICAM-1抑制劑為ICAM-1中和抗體。

作為對(duì)于上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述ICAM-1中和抗體為抗-ICAM-1抗體。

作為對(duì)于上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述αMβ2整合蛋白抑制劑為αMβ2整合蛋白中和抗體。

需要說明的是，本發(fā)明中出現(xiàn)的中和抗體也即普通抗體，之所以稱為中和抗體主要從抗體的治療角度命名。

本發(fā)明建立了小鼠原位卵巢癌模型，通過熒光標(biāo)記、免疫染色和免疫印跡法觀察和發(fā)現(xiàn)TAMs(Tumor-associated Macrophages，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移早期中起促進(jìn)球體形成；M2型TAMs位于球體中央且分泌EGF(Epithelial Growth Factor，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，EGF能上調(diào)M2型TAMs表達(dá)αMβ2整合蛋白以及上調(diào)腫瘤細(xì)胞表達(dá)ICAM-1。進(jìn)一步，小鼠中去除TAMs、藥物阻滯EGFR或者以抗體中和ICAM1后將阻礙球體形成及卵巢癌進(jìn)展。

因此，可以利用ICAM-1和αMβ2整合蛋白，篩選出用于診斷或治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明首次在小鼠原位卵巢癌模型證實(shí)了ICAM-1和αMβ2整合蛋白在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中起著重要調(diào)控作用且揭示了卵巢癌球體形成的基理，可以為篩選用于診斷或治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物提供理論依據(jù)。

附圖說明

圖1顯示巨噬細(xì)胞(TAMs)在原位卵巢癌模型中參與球體的形成；將穩(wěn)定表達(dá)mCherry熒光蛋白標(biāo)記的ID8OCs植入8周大的tomato^lyz-cre受體小鼠體內(nèi)，在瘤細(xì)胞分別植入2，4，6及8周時(shí)檢測(cè)滲入腹腔的Cherry⁺腫瘤細(xì)胞和GFP⁺細(xì)胞；其中，A為顯示將腹腔細(xì)胞涂于切片上后置于熒光顯微鏡下觀察的熒光圖，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取n＝5只小鼠；B為對(duì)GFP⁺細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行量化，插圖為對(duì)從0到20天對(duì)GFP⁺細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)圖，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取n＝5只小鼠；C為對(duì)Cherry⁺腫瘤細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行量化，插圖為0到20天對(duì)Cherry⁺腫瘤細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)圖，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取n＝5只小鼠；D-G顯示巨噬細(xì)胞和球體形成，3至6周時(shí)的典型熒光圖像如D所示，圖E為對(duì)球體總數(shù)[球體/100μl腹水]的量化統(tǒng)計(jì)圖，圖F為對(duì)球體體積[細(xì)胞數(shù)/球體]的量化統(tǒng)計(jì)圖，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取n＝5只小鼠，已證實(shí)在3周時(shí)開始啟動(dòng)球體形成；G為用APC(647nm)-結(jié)合型抗-CD68和DAPI對(duì)8周時(shí)采集的球體進(jìn)行免疫染色后以共焦成像技術(shù)所得的圖像，對(duì)GFP⁺和CD68⁺巨噬細(xì)胞、Cherry⁺腫瘤細(xì)胞和DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色后可見，右圖所示為融合后圖像，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，n＝5，星號(hào)*為P<0.05，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001。

圖2顯示M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)聚合與卵巢癌的進(jìn)展相關(guān)；原位卵巢癌模型中F4/80⁺CD11b⁺巨噬細(xì)胞來自于指定時(shí)間(1，4和8周)點(diǎn)的單個(gè)細(xì)胞群或球體；A為用qRT-PCR技術(shù)對(duì)M1型特異性和M2型特異性的標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)圖，以外周血單核細(xì)胞作為對(duì)照，與1周內(nèi)單個(gè)細(xì)胞體內(nèi)的基因表達(dá)相比，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，n＝5，星號(hào)*為P<0.05，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001(雙側(cè)t分布檢驗(yàn))；B-C為用FACS法對(duì)第1和8周個(gè)體細(xì)胞群內(nèi)CD163和CD206在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，n＝5，星號(hào)*為P<0.05，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001。

圖3顯示了腹腔球體形成及卵巢癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所必需；將小鼠ID8細(xì)胞注入C57BL/6雌性受體小鼠腹腔內(nèi)建立原位小鼠OC模型，然后小鼠分別予脂質(zhì)體(ID8組)或氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(ID8+LC組)治療，一半供體小鼠接受了ID8細(xì)胞加上從患癌供體小鼠球體中分離出來的TAMs及脂質(zhì)體(ID8+TAM)或者氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(ID8+TAM+LC)；A-D顯示氯膦酸二鈉脂質(zhì)體和TAM對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)，A為在指定時(shí)間(0-60天)小鼠體重的增加曲線圖；B-C顯示在第60天時(shí)測(cè)量腹水體積和腫瘤凈重的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n＝10，星號(hào)***為P<0.001；D為監(jiān)測(cè)小鼠狀態(tài)對(duì)其生存率的量化統(tǒng)計(jì)圖，每組n＝24只小鼠，用對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行Kaplan-Meier分析，星號(hào)***為P<0.001；E-G顯示氯膦酸二鈉脂質(zhì)體和TAM對(duì)球體形成的影響作用，圖E為8周時(shí)從腹水中收集球體進(jìn)行H&E染色圖，圖F為球體總數(shù)統(tǒng)計(jì)圖，圖G為球體大小統(tǒng)計(jì)圖；H-J顯示氯膦酸二鈉脂質(zhì)體和TAM對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，H為采集8周時(shí)單個(gè)細(xì)胞群和球體，用抗-Ki67、抗-CD68和DAPI對(duì)其進(jìn)行免疫染色后以共焦成像技術(shù)觀察的染色結(jié)果圖，H顯示在ID8組內(nèi)CD68⁺巨噬細(xì)胞被Ki67⁺腫瘤細(xì)胞包圍，而在ID8+LC組未見，比例尺為25μm；圖I為對(duì)單個(gè)細(xì)胞群總體和總的球體中Ki67⁺進(jìn)量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；圖J為對(duì)單個(gè)細(xì)胞群總體和總的球體中CD68⁺細(xì)胞進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，n＝5只小鼠，每只小鼠提供10個(gè)球體，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，星號(hào)***為P<0.001(雙側(cè)t分布檢驗(yàn))。

圖4顯示TAMs中EGF與腫瘤細(xì)胞中EGFR表達(dá)相互上調(diào)對(duì)卵巢癌生長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用；A-C顯示TAMs促進(jìn)體外ID8細(xì)胞增殖，當(dāng)腫瘤細(xì)胞植入8周后從OC-模型小鼠體內(nèi)腹水中采集球體。將TAMs與ID8腫瘤細(xì)胞(PE-ID8)分離開，單獨(dú)培養(yǎng)PE-ID8細(xì)胞或者與TAMs在transwell中一起培養(yǎng)但不與其直接接觸，原始ID8細(xì)胞作為對(duì)照；A為在指定時(shí)間細(xì)胞總數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；B為細(xì)胞生長(zhǎng)用Ki67染色后的染色結(jié)果圖，比例尺25μm；C為對(duì)Ki67⁺腫瘤細(xì)胞進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，n＝9；D為qRT-PCR檢測(cè)PE-ID8以及球體中EGF、FGF、PDGFs、HGF及VEGFs的基因表達(dá)量；E為TAMs中的EGF與PE-ID8細(xì)胞中的EGFR的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)圖，用qRT-PCR對(duì)TAMs及PE-ID8組中的EGF和EGFR基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，外周血單核細(xì)胞和原始ID8腫瘤細(xì)胞分別作為對(duì)照組，相關(guān)基因表達(dá)呈現(xiàn)倍數(shù)增長(zhǎng)，將單核細(xì)胞數(shù)作為1.0，n＝3；F為用EGF或EGFR對(duì)分離自O(shè)C小鼠腹水中的球體CD68細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的染色圖，n＝5只小鼠，其球體的典型圖像如圖所示；G為ELISA檢測(cè)4周和8周腹水上清的EGF蛋白表達(dá)量，血漿作為陰性對(duì)照；H為ELISA檢測(cè)腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞加巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上清中EGF蛋白表達(dá)水平；I-J通過siRNAs使EGF沉默表達(dá)，TAMs被EGF siRNAs或參照siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)，I為經(jīng)qRT-PCR法檢測(cè)TAMs中EGF mRNA水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；J為用ELISA法檢測(cè)TAMs與ID8細(xì)胞共培養(yǎng)體系上清液中的EGF蛋白水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；K-L顯示分別在無EGFR拮抗劑及存在拮抗劑(10或20μM)的情況下用EGF處理ID8細(xì)胞12小時(shí)，以相應(yīng)抗體通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)磷酸化的和總的EGFR以及ERK1/2進(jìn)行檢測(cè)，總EGFR、ERK1/2和GAPDH均進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)相對(duì)磷酸化水平進(jìn)行了量化，K為蛋白質(zhì)印跡結(jié)果圖，L為統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；M-N顯示TAMs用參照siRNA或EGFsiRNA進(jìn)行了預(yù)轉(zhuǎn)染，將PE-ID8細(xì)胞單獨(dú)或與TAMs在缺乏或存在EGF(20ng/ml)或EGFR拮抗劑(20μM)的情況下進(jìn)行共培養(yǎng)12小時(shí)，圖M為用Ki67對(duì)增生的PE-ID8細(xì)胞進(jìn)行染色的染色結(jié)果圖，比例尺100μm；圖N為對(duì)Ki67細(xì)胞進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，所有試驗(yàn)均進(jìn)行了三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM來表示,星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001。

圖5顯示OC患者EGF⁺TAMs及EGFR⁺腫瘤細(xì)胞與球體形成間的臨床相關(guān)性；A為對(duì)從OC患者中分離出來的原位腫瘤和球體進(jìn)行H&E及CD68IHC染色的染色結(jié)果圖，比例尺分別為50μm(H&E)和25μm(CD68)；B為對(duì)OC患者原位腫瘤和球體中CD68陽性細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖，n＝128，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，星號(hào)***為P<0.001(雙側(cè)t分布檢驗(yàn))；C-D顯示巨噬細(xì)胞和癌細(xì)胞在球體中生長(zhǎng)的相關(guān)性；C為分別對(duì)人的小、中和大體積OC球體中CD68和Ki67進(jìn)行免疫染色的染色結(jié)果圖，其中DAPI用于細(xì)胞核染色，比例尺5μm；D為對(duì)球體內(nèi)CD68和Ki67陽性細(xì)胞進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，n＝30，小球體(0-50個(gè)細(xì)胞/球體)，中等細(xì)胞集群(50-500個(gè)細(xì)胞/球體)，大球體(≥500個(gè)細(xì)胞/球體)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001，小體積球體與中、大體積球體相比較P<0.001(雙側(cè)t分布檢驗(yàn))；E為對(duì)OC患者腹水中的球體進(jìn)行免疫熒光染色的熒光染色圖，采用EGF或EGFR與CD68聯(lián)合染色，來自n＝128例OC患者球體的典型圖像如圖所示，箭頭所指位置為球體中央的CD68⁺EGF⁺TAMs，比例尺10μm；F為在不同分化程度的OC球體中其CD68⁺細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；G為128例OC患者球體中低(<14.5％)或高(≥14.5％)CD68⁺細(xì)胞百分比與總體存活率Kaplan-Meier曲線間關(guān)系圖(以對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析)。

圖6顯示在小鼠模型中阻斷EGFR減少球體形成、細(xì)胞增殖及卵巢癌生長(zhǎng)；通過向雌性受體裸鼠腹腔內(nèi)注射人SKOV3OCs建立起原位小鼠模型，接著對(duì)小鼠不做處理(CON)或給予厄洛替尼治療，LC作為治療對(duì)照組；A-E顯示厄洛替尼對(duì)SKOV3腫瘤生長(zhǎng)的影響；A為在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)小鼠體重的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，箭頭所指為使用LC治療的不同起始治療時(shí)間(在腫瘤細(xì)胞植入2，4或8周時(shí))；B為在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)小鼠體重的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，箭頭所指為使用厄洛替尼治療的不同起始治療時(shí)間(在腫瘤細(xì)胞植入2，4或8周時(shí))；C為CON、LC及厄洛替尼治療組小鼠的全身典型照片；D為14周時(shí)稱量小鼠腹水體積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；E為14周時(shí)稱量小鼠腫瘤凈重的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；其中A-E中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組中n＝10，星號(hào)***為P<0.001；ns：無顯著性差異；F為厄洛替尼組合對(duì)照組的總體存活率Kaplan-Meier曲線間關(guān)系圖；G-I顯示厄洛替尼對(duì)SKOV3球體形成的作用，G為14周時(shí)收集腹水中的球體并置于涂片上，對(duì)球體進(jìn)行H&E染色的染色結(jié)果圖，比例尺100μm；H為對(duì)球體總數(shù)進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；I為對(duì)球體體積進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；J-K顯示厄洛替尼對(duì)SKOV3腫瘤細(xì)胞增殖的作用，對(duì)14周時(shí)采集的球體用抗-Ki67、抗-CD68和DAPI進(jìn)行免疫染色，接著以共焦成像技術(shù)進(jìn)行觀察；J為含有Ki67⁺腫瘤細(xì)胞和CD68⁺巨噬細(xì)胞球體的免疫熒光染色圖；K為對(duì)球體內(nèi)Ki67⁺和CD68⁺細(xì)胞進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，n＝5只小鼠，每只小鼠中采集10個(gè)球體，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，星號(hào)***為P<0.001。

圖7顯示TAMs通過分泌EGF促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移；A-B為PE-ID8細(xì)胞在transwell小室單獨(dú)培養(yǎng)，或與小鼠單核細(xì)胞或TAMs共培養(yǎng)，用劃痕實(shí)驗(yàn)定量分析PE-ID8細(xì)胞的遷移能力；其中，腫瘤細(xì)胞遷移如圖A所示，D為統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；n＝3，標(biāo)尺為100μm；C-D為PE-ID8細(xì)胞在transwell小室單獨(dú)培養(yǎng)，或與小鼠單核細(xì)胞或TAMs共培養(yǎng)，計(jì)數(shù)穿過transwell小室的細(xì)胞數(shù)來定量分析PE-ID8細(xì)胞的遷移能力；其中，C顯示穿過transwell小室的腫瘤細(xì)胞的蘇木素染色結(jié)果，D為統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；n＝3，標(biāo)尺為50μm；E-F為TAMs與參照siRNA或EGF siRNAs預(yù)轉(zhuǎn)染48小時(shí)，進(jìn)而PE-ID8細(xì)胞與轉(zhuǎn)染的TAMs細(xì)胞在transwell小室共培養(yǎng)，在PE-ID8培養(yǎng)液體系中加或不加EGF(20ng/ml)或EGFR抑制劑厄洛替尼(20μM)；其中，E顯示穿過transwell小室的腫瘤細(xì)胞的蘇木素染色結(jié)果，F(xiàn)為統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；標(biāo)尺為100μm，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n＝3，星號(hào)***為P<0.001(雙尾t檢驗(yàn))。

圖8顯示EGF上調(diào)OC腫瘤細(xì)胞中VEGF-C-VEGFR3信號(hào)；A-B顯示用qRT-PCR檢測(cè)從小鼠體內(nèi)分離的TAMs和PE-ID8腫瘤細(xì)胞中VEGF-C和VEGFR3的mRNA表達(dá)量；相關(guān)基因表達(dá)呈現(xiàn)倍數(shù)增長(zhǎng)，將單核細(xì)胞數(shù)的mRNA表達(dá)水平作為1.0，n＝3；C顯示通過ID8和PE-ID8腫瘤細(xì)胞中特異性抗體用蛋白印跡法來檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中VEGF-C、磷酸化VEGFR和總VEGFR3的的蛋白表達(dá)量，以用加和不用VEGF-C(20ng/ml)處理的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(LECs)為陽性對(duì)照；D為定量測(cè)定VEGF-C和磷酸化VEGFR3的蛋白相對(duì)表達(dá)量；E-F為小鼠ID8細(xì)胞和人SKOV3卵巢癌細(xì)胞通過EGF(20ng/ml)處理不同時(shí)間(0-12h)，用qRT-PCR檢測(cè)兩組VEGF-C的mRNA表達(dá)量，以未處理組的VEGF-C的mRNA表達(dá)量為1，其他時(shí)間點(diǎn)VEGF-C表達(dá)量以倍數(shù)變化顯示；G-H為不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)用EGF處理ID8細(xì)胞；其中，G為對(duì)VEGF-C、磷酸化VEGFR3和總VEGFR3蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，H為對(duì)VEGF-C和磷酸化VEGFR3相對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行量化；I顯示分別在EGFR拮抗劑(20μM)或ERK拮抗劑(PD98059，20μM)加入及缺失的情況下，EGF對(duì)SKOV3細(xì)胞進(jìn)行12小時(shí)的處理，用qRT-PCR檢測(cè)VEGF-C mRNA表達(dá)量，將未處理組結(jié)果作為1.0，以GADPH作為內(nèi)參EGFR拮抗劑或ERK拮抗劑組的VEGF-C相對(duì)mRNA表達(dá)量呈倍數(shù)變化；J顯示分別在EGF、VEGF-C、EGFR拮抗劑厄洛替尼(20μM)或VEGFR3結(jié)抗劑(MAZ51，10nM)存在及缺失的情況下，對(duì)ID8細(xì)胞處理12小時(shí)，用蛋白印跡法檢測(cè)對(duì)磷酸化VEGFR3和總VEGFR3蛋白表達(dá)量化看，以GAPDH作為對(duì)照；所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n＝3，星號(hào)***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗(yàn))。

圖9顯示EGF通過自分泌VEGF-C/VEGFR3信號(hào)途徑促進(jìn)EGFR⁺腫瘤細(xì)胞遷移；A為對(duì)OC小鼠腹水球體中的VEGF-C或VEGFR3與CD68進(jìn)行免疫熒光染色的染色結(jié)果圖，來自n＝5只小鼠的球體典型圖像；B-C顯示PE-ID8細(xì)胞與EGF或VEGF-C(20ng/ml)分別在不加入或加入EGFR拮抗劑厄洛替尼或VEGFR3拮抗劑MAZ51(10nM)的情況下進(jìn)行12小時(shí)的transwell遷移實(shí)驗(yàn)；B為采用蘇木素染色的染色結(jié)果圖，比例尺150μm；C為細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；D-F顯示從荷瘤tomato^lyz-cre小鼠球體中分離出的小鼠GFP⁺F4/80⁺CD206⁺TAMs與參照siRNA或EGF-siRNA進(jìn)行48小時(shí)的預(yù)轉(zhuǎn)染，接著將TAMs與ID8細(xì)胞在厄洛替尼或MAZ51(20nM)存在的情況下于3D共培養(yǎng)體系中進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，D為熒光結(jié)果圖，比例尺50μm，可見局部GFP⁺細(xì)胞(TAMs)位于對(duì)照組球體中央但未見于siEGF組，E為48小時(shí)后對(duì)球體數(shù)量(每孔)進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，F(xiàn)為48小時(shí)后對(duì)球體大小(面積)進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；G-I顯示從人卵巢癌患者球體分離出的CD14⁺TAMs與參照siRNA或EGF-siRNA進(jìn)行了48小時(shí)的預(yù)轉(zhuǎn)染，用于與人OC SKOV3細(xì)胞進(jìn)行3D共培養(yǎng)，G為熒光結(jié)果圖，比例尺為25um；H為對(duì)48小時(shí)的球體數(shù)量進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；I為對(duì)48小時(shí)的球體體積進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，所有試驗(yàn)均進(jìn)行了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式記錄，星號(hào)***為P<0.001。

圖10顯示CD11a、CD11b、CD11c及ITGβ2在TAMs的mRNA表達(dá)量；在第8周從球體中分離出原位卵巢癌模型的TAMs和PE-ID8細(xì)胞；A為用qRT-PCR檢測(cè)TAMs以及PE-ID8細(xì)胞中的CD11a、CD11b、CD11c和ITGβ2整合蛋白的mRNA表達(dá)量，以原始ID8細(xì)胞作為對(duì)照；所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，n＝5，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗(yàn))；B為用FACS技術(shù)對(duì)腹腔內(nèi)CD11b⁺和CD11c⁺巨噬細(xì)胞進(jìn)行分析；C為分別對(duì)CD11b⁺和CD11c⁺細(xì)胞以百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；n＝5，星號(hào)***為P<0.001，ns：無顯著性差異(雙側(cè)t檢驗(yàn))；所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)****為P<0.001。

圖11顯示EGF/EGFR-VEGF-C/VEGFR3信號(hào)通路誘導(dǎo)球體ICAM-1表達(dá)；在指定時(shí)間(8周時(shí))從球體中分離出原位卵巢癌模型的TAMs和PE-ID8細(xì)胞；A為用qRT-PCR檢測(cè)ICAM-1和ICAM-2的mRNA表達(dá)量，以外周血單核細(xì)胞作為對(duì)照。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n＝5，星號(hào)**為P<0.01(雙側(cè)t檢驗(yàn))；B為EGF處理ID8細(xì)胞不同時(shí)間，用qRT-PCR技術(shù)分析ICAM-1的mRNA表達(dá)量并統(tǒng)計(jì)ICAM-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量；三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗(yàn))；C-E為EGF(C)或VEGF-C(E)對(duì)ID8細(xì)胞進(jìn)行處理不同時(shí)間，用免疫印跡方法檢測(cè)ICAM-1的蛋白表達(dá)；(D，F(xiàn))定量統(tǒng)計(jì)分析ICAM-1的蛋白表達(dá)水平；所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝3，星號(hào)***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗(yàn))；G為分別在加入VEGFR3拮抗劑(MAZ51)及其缺失的情況下，EGF或VEGF-C對(duì)ID8細(xì)胞進(jìn)行24小時(shí)的處理，用qRT-PCR檢測(cè)ICAM-1的mRNA表達(dá)量；所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗(yàn))。

圖12顯示TAMs通過整合蛋白αMβ2與ICAM-1相互作用促進(jìn)與EGFR⁺腫瘤細(xì)胞相黏附；A為對(duì)CD68以O(shè)C小鼠腹水球體中提取的ICAM-1進(jìn)行免疫熒光染色的染色結(jié)果圖，來自n＝5只；B-C顯示PE-ID8細(xì)胞與EGF分別在缺乏或存在EGFR拮抗劑厄洛替尼或ERK拮抗劑PD98059(10nM)的情況下處理24小時(shí)，B為用免疫印跡法檢測(cè)ICAM-1蛋白表達(dá)的免疫印跡圖，C為對(duì)ICAM-1相對(duì)含量進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；D-E顯示ID8細(xì)胞與EGF或VEGF-C分別在缺乏或存在MAZ51(VEGFR3拮抗劑)的情況下處理24小時(shí)，D為用免疫印跡法檢測(cè)ICAM-1蛋白表達(dá)的免疫印跡圖，E為對(duì)ICAM-1相對(duì)含量進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；F-K顯示ICAM-1中和抗體對(duì)球體形成的影響，F(xiàn)-H為加入抗小鼠ICAM-1情況下對(duì)小鼠TAM–ID8進(jìn)行3D共培養(yǎng)，F(xiàn)為免疫熒光結(jié)果圖，比例尺50μm；G為48小時(shí)后檢測(cè)球體數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；H為48小時(shí)后檢測(cè)球體大小的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；I-K為加入抗人ICAM-1情況下對(duì)人TAM-SKOV3進(jìn)行3D共培養(yǎng)，I為免疫熒光結(jié)果圖，比例尺25μm；J為48小時(shí)后檢測(cè)球體的數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；K為48小時(shí)后檢測(cè)球體的大小的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均進(jìn)行3項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示，星號(hào)**為P<0.01，星號(hào)***為P<0.001；L-Q顯示通過給C57BL/6雌性受體小鼠腹腔內(nèi)注入小鼠ID8OCs細(xì)胞而建立原位小鼠模型，接著將小鼠予腹腔注入IgG或抗小鼠ICAM-1抗體治療，L為在指定時(shí)間(0-50天)測(cè)量小鼠體重增加情況的曲線圖；M為在指定時(shí)間(0-50天)測(cè)量小鼠腹水體積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；N為在指定時(shí)間(0-50天)測(cè)量小鼠腫瘤重量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；O為對(duì)球體進(jìn)行H&E染色的染色結(jié)果圖；P為對(duì)球體的總數(shù)進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；Q為對(duì)球體的大小進(jìn)行量化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，數(shù)據(jù)以平均值±SEM形式表示，n＝10，星號(hào)***為P<0.001。

圖13顯示球體形成中TAM-腫瘤細(xì)胞相互作用模型，A為EGF、VEGF-C、ICAM-1、αMβ2相互作用調(diào)節(jié)的示意圖，顯示在OC種植轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)的早期，脫落的OC細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到腹腔中，在腹腔環(huán)境下巨噬細(xì)胞與OC細(xì)胞相互作用形成球體同時(shí)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞為M2亞型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)，TAMs位于球體中央或許為OC逃避失巢凋亡提供了最初的基質(zhì)支持，重要的是，TAMs能分泌大量EGF從而激活EGFR，這會(huì)上調(diào)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，激活的EGF/EGFR信號(hào)通路能誘導(dǎo)VEGF-C表達(dá)，其反過來激活VEGFR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)整合蛋白/ICAM-1表達(dá)從而形成一個(gè)正向自分泌反饋環(huán)路，因而促進(jìn)了腫瘤遷移、粘附和球體形成；B為TAMs和OC細(xì)胞分子間相互作用的示意圖。

具體實(shí)施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例

1.材料與方法

1.1研究批準(zhǔn)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由耶魯大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)后進(jìn)行。從知情同意患者提供的腹水中采集晚期(即III-IV期)卵巢癌患者的人腫瘤球體，以上完成于耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院，紐黑文,康涅狄格州(HIC協(xié)議#1111003959)。臨床石蠟標(biāo)本由中國(guó)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)后使用。

1.2動(dòng)物模型

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由耶魯大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)后施行。所有的小鼠均為C57BL/6系列。溶菌酶Cre小鼠與tomato(mT/mG)小鼠進(jìn)行雜交以便用譜系標(biāo)記溶菌酶提取細(xì)胞。裸鼠購于Jackson實(shí)驗(yàn)室。將細(xì)胞培養(yǎng)基上100μl小鼠卵巢癌ID8或人卵巢癌SKOV3細(xì)胞(1×10⁶/ml)注入到C57BL/6系小鼠或裸鼠的腹腔內(nèi)。小鼠體重增加、腹水體積和腫瘤重量變化情況均由電子天平稱量。9周后將小鼠處死，腫瘤球體和腫瘤移植物進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.3臨床樣本

經(jīng)資格審查委員會(huì)批準(zhǔn)，2005年1月至2009年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的共128例晚期上皮性卵巢癌(EOC)患者其中符合我們納入標(biāo)準(zhǔn)的入組我們的研究對(duì)象。納入合格標(biāo)準(zhǔn)包括如下幾方面:(1)病理檢查證實(shí)為III期EOC；(2)有完整的基本臨床資料；(3)癌癥尚未經(jīng)過任何治療；(4)未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥或其他惡性疾?。?5)告知病人及其家屬病情且在治療前簽署知情同意書。所有患者均進(jìn)行了完整的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)治療。晚期(即III-IV期)卵巢癌患者的腫瘤球體通過自愿的形式從患者腹水中采集得到(HIC協(xié)議#1111003959)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)

ID8(小鼠卵巢癌上皮細(xì)胞株)來自Drs.Jack Lawler和哈佛醫(yī)學(xué)院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心的Carmelo Nucera的贈(zèng)送，SKOV3(人卵巢腺癌細(xì)胞株)從ATCC取得。SK-OV-3對(duì)腫瘤壞死因子及幾種細(xì)胞毒藥物包括白喉毒素，順鉑和阿霉素等具有抵抗力。ID8和SKOV3細(xì)胞在達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)(美國(guó)加利福利亞，生命科技公司)中培養(yǎng)，其中再加入10％小牛血清(FBS)、100U/ml青霉素以及100μg/ml的鏈霉素，保持溫度37℃并置于5％CO₂與95％空氣混合的濕潤(rùn)環(huán)境中。每隔2天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)80-90％的細(xì)胞發(fā)生融合時(shí)將其分離。所有試驗(yàn)中，細(xì)胞以合理密度種植且在實(shí)驗(yàn)開始進(jìn)行前達(dá)到80-90％的細(xì)胞融合。C57BL/6系小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)上予腹腔注入ID8細(xì)胞，此后從其腹腔中分離得到原代小鼠的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)和PE-ID8細(xì)胞。

1.5統(tǒng)計(jì)方法

Western-blot、qRT-PCR、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、免疫染色、FACS以及腫瘤生長(zhǎng)均采用T檢驗(yàn)分析。OC患者人口因素差異由卡方檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Kaplan-Meier法用于評(píng)估OS，同時(shí)，用單因素分析法的對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)校正預(yù)后因素間可能存在的差異。多變量Cox回歸(比例分析模型)用于確定預(yù)后和獨(dú)立因子CD68水平對(duì)OS。此項(xiàng)研究使用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(9.1.4版本，SAS軟件研究所，北卡羅萊納州，新喀里多尼亞)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)同時(shí)以P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6重組蛋白及拮抗劑

重組人和小鼠EGF、VEGF-C采購自R&D Systems。MAZ51(VEGFR3拮抗劑)購買于EMD Millipore公司。厄諾替尼(EGFR拮抗劑)從Roche公司購買。用于清除巨噬細(xì)胞的中性氯氟松氯膦酸二鈉脂質(zhì)體購自FormuMax Scientific公司(產(chǎn)品代碼#:F70101-N)。

1.7免疫染色

用于免疫組化和免疫熒光染色的抗體列于表一中。共聚焦顯微鏡圖像由Zeiss-LSM700顯微鏡拍攝并由ZEN2010軟件進(jìn)行處理。對(duì)于平均熒光強(qiáng)度的測(cè)量、共聚焦顯微鏡圖像分析由ImageJ軟件負(fù)責(zé)。細(xì)胞切片用蔡司Axiovert200熒光顯微鏡觀察(卡爾蔡司縮微成像；索恩伍德，紐約)，圖像由Openlab3軟件捕捉(Improvision,列克星敦,馬薩諸塞州)。在冰凍、OCT包埋的組織上進(jìn)行5μm連續(xù)切片后將其置于-20℃條件下用丙酮固定10分鐘、干燥15分鐘。

1.8蛋白提取及蛋白質(zhì)印跡分析

將新鮮切割未固定的組織在裂解緩沖液中均質(zhì)化，裂解產(chǎn)物在4℃、13,000g條件下，離心10分鐘，收集的上清液用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Bio-Rad公司,赫拉克勒斯,加利福利亞州)進(jìn)行滴定。將細(xì)胞裂解物用SDS-PAGE分析，然后與特異性抗體一起以免疫印跡法處理(Immobilon P；Millipore公司,米爾福德,馬薩諸塞州)，最后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham生命科學(xué)公司,阿靈頓高地,伊利諾伊州)進(jìn)行檢測(cè)。所有用于蛋白免疫印跡法的抗體均在表一中列出。

表一為抗體信息表

1.9熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)(FACS)

通過FACS分析小鼠細(xì)胞表面CD11b、F4/80、CD3e、CD206和CD163以及人細(xì)胞表面CD14和CD326的表達(dá)，此前已有文獻(xiàn)報(bào)道。將小鼠的TAMs混懸劑與小鼠CD11b-FITC，F(xiàn)4/80-PE，CD3e-APC，PE-CD206，APC-CD163和人CD14，CD326抗體在冰上短暫地混合15分鐘。同種抗體作為陰性對(duì)照。流式細(xì)胞用FACSCalibur(BD生命科學(xué))完成。數(shù)據(jù)用BD CellQuestPro軟件進(jìn)行分析。所有用于FACS的抗體息列于表一中。

1.10遷移實(shí)驗(yàn)

使用transwell離體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Corning公司，孔徑尺寸，0.3或8μm)對(duì)巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行檢測(cè)，為了完成ID8細(xì)胞的驅(qū)化遷移實(shí)驗(yàn)，將1x10⁴ID8細(xì)胞接種于transwell小室表面上。不同的化學(xué)趨化物(VEGFC或EGF)或巨噬細(xì)胞(TAM)置于小室下方位置。在12小時(shí)孵化期后，用棉簽拭去transwell膜上層的ID8細(xì)胞，在transwell膜底面的細(xì)胞用4％PFA進(jìn)行固定后用蘇木素-伊紅染色，然后在顯微鏡(200X)下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行遷移細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

1.11定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

所有從人體中提取的RNA使用RNeasy Plus Mini Kit(74134，Qiagen公司)，然后在生產(chǎn)商說明書指導(dǎo)下用High Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(4368814，Applied Biosystems公司)將其轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNAs。定量PCR使用RT2SYBR Green(330500，SA Biosciences)試劑盒及CFX-96(Bio-Rad)儀器完成。qRT-PCR中用到的所有引物均在表二中列出。所有的值均以GAPDH的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)以三組平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

1.12TAM和ID8細(xì)胞3D共培養(yǎng)系統(tǒng)

小鼠F4/80⁺CD206⁺TAMs通過FACS從患癌供體tomato^lyzM-cre小鼠的球體中分揀而來，采集到晚期(即III-IV期)卵巢癌患者的人腫瘤球體后(IH協(xié)議#1111003959)，接著用FACS鑒定和分揀出CD14⁺TAMs。如上所述在24孔板上鋪基質(zhì)膠，TAMs和ID8cells(比例為1:10，細(xì)胞總數(shù)固定為40,000細(xì)胞/孔)的混合物直接接種在鋪滿基質(zhì)膠的24孔板上。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)保證聚合物/球體的形成。在共培養(yǎng)6小時(shí)后加入EGFR拮抗劑厄洛替尼、VEGFR3拮抗劑MAZ51(每次20nM)或抗-ICAM-1抗體(20ug/ml)。從6-48小時(shí)拍攝熒光顯微圖像進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。沒有細(xì)胞的小孔含有培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)至少做3次且每次要做三份。使用蔡司Axiovert 200熒光顯微鏡(卡爾蔡司微縮成像；索恩伍德，紐約)觀察所有顯微鏡圖像，圖像由Openlab3軟件捕捉(Improvision，列克星敦，馬薩諸塞州)。

表二為引物信息表

2.結(jié)論

2.1巨噬細(xì)胞在卵巢癌生長(zhǎng)過程中參與球體形成

為了確定巨噬細(xì)胞是否在種植轉(zhuǎn)移過程中參與OC腫瘤細(xì)胞的存活、增殖以及定植等環(huán)節(jié)，本申請(qǐng)人將小鼠ID8細(xì)胞注入C57BL/6雌性受體小鼠腹腔內(nèi)從而建立原位小鼠OC模型；為了追蹤觀察這段時(shí)期內(nèi)癌細(xì)胞及受體小鼠的單核/巨噬細(xì)胞情況，將ID8OC細(xì)胞以穩(wěn)定表達(dá)的mCherry熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記，與此同時(shí)，將作為受體小鼠的tomato^lyzM-cre小鼠體內(nèi)包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的髓細(xì)胞以綠色熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記(GFP)。

結(jié)果如圖1的A-B所示，處于基礎(chǔ)狀態(tài)下(在腫瘤細(xì)胞注入前)或在腫瘤細(xì)胞注入早期時(shí)間段內(nèi)(<1周)的受體tomato^lyzM-cre小鼠腹腔內(nèi)幾乎不能檢測(cè)出GFP⁺細(xì)胞，但是，在注入瘤細(xì)胞后的第2、4、6及8周時(shí)滲入腹腔內(nèi)的GFP⁺細(xì)胞有了大幅增加，在2、4、6及8周時(shí)GFP⁺細(xì)胞總數(shù)分別為3×10⁶、16×10⁶、18×10⁶及20×10⁶。

如圖1中C-D所示，我們亦在晚期(6周)腹水中檢測(cè)到CD11b⁺Gr1⁺髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的數(shù)量有所增加，這組原位卵巢癌模型中，注入的癌細(xì)胞首先進(jìn)入休眠期(0-2周)隨后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期(在癌細(xì)胞注入2-8周時(shí))(如圖1C)，酷似人卵巢癌的II-III期。有趣的是，我們觀察到在注入瘤細(xì)胞的最初2小時(shí)至2周時(shí)間內(nèi)腹膜內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)量有所減少，可能為失巢凋亡所致。

如圖1中D-F所示，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)球體包含GFP⁺巨噬細(xì)胞與mCherry腫瘤細(xì)胞，二者比例為1:10；球體數(shù)量與體積隨腫瘤生長(zhǎng)而增加。有趣的是，如圖1G所示，球體切面免疫染色顯示大球體內(nèi)的mCherry腫瘤細(xì)胞圍繞在位于球體中心位置的GFP⁺CD68⁺巨噬細(xì)胞周圍，在CD11b⁺Gr1⁺MDSCs中得到同樣的結(jié)果。

以上結(jié)果均提示髓系細(xì)胞和ID8細(xì)胞的相互作用促進(jìn)卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中球體的形成。

2.2M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)聚合與卵巢癌的進(jìn)展相關(guān)

在將瘤細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)2小時(shí)后我們?cè)谄涓骨粌?nèi)發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞，但巨噬細(xì)胞似乎在瘤細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體3周形成巨噬細(xì)胞-腫瘤球體后才能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，此前有報(bào)道在體內(nèi)外環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞都將巨噬細(xì)胞極化為M2型，我們推測(cè)巨噬細(xì)胞在球體形成期與初始期相比有不同的基因表達(dá)譜和表現(xiàn)型。為了證明這點(diǎn)，我們采集卵巢癌不同生長(zhǎng)階段(腫瘤細(xì)胞注入1，4和8周時(shí))的F4/80⁺CD11b⁺巨噬細(xì)胞，通過qRT-PCR檢測(cè)一組M1型-特異標(biāo)志物和M2型-特異標(biāo)志物，將外周血單核細(xì)胞作為對(duì)照組。

結(jié)果顯示最初由腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞(1周時(shí))大量表達(dá)M1樣標(biāo)記基因(Ly6G/C，CR2，F(xiàn)NαR，NOS)，但這些標(biāo)志物在4周后逐漸消失。但是，浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展過程中(4-8周時(shí))逐漸獲得表達(dá)M2型標(biāo)記基因[CD206(甘露糖受體)，3CR1，精氨酸酶1和CD163(清道夫受體，富含半胱氨酸1型蛋白質(zhì)M130)]的能力。顯然，如圖2A所示，無論是單個(gè)還是球體相關(guān)性巨噬細(xì)胞在末期(8周時(shí))均有相似的基因表達(dá)譜；如圖2A、2B和2C所示，F(xiàn)ACS分析確定了早期CCR2⁺和晚期CD163⁺，D206⁺及CX3CR1⁺腫瘤誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞不同的表達(dá)方式。

以上結(jié)果表明在卵巢癌進(jìn)展過程中TAMs在腹腔微環(huán)境下極化為M2亞型。

2.3TAMs為腹腔球體形成及卵巢癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所必需

為了探討TAMs在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中所起作用，我們用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行處理。如圖3A-C所示，表型分析顯示氯膦酸二鈉脂質(zhì)體明顯減少小鼠體重、腹水體積以及從腹水中分離出來的腫瘤細(xì)胞濕重，因此，經(jīng)過氯膦酸鹽治療的小鼠生存率大大提高(圖3D)，尤其是氯膦酸鹽組的球體數(shù)量及平均大小與脂質(zhì)體組相比都明顯減少(圖3，E-G)，進(jìn)一步研究表明球體中Ki67⁺是圍繞在CD68⁺TAMs周圍的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過氯膦酸鹽治療后CD68⁺TAMs和Ki67⁺細(xì)胞數(shù)量均有減少(圖3，H-J)。

進(jìn)而我們對(duì)TAMs能否促進(jìn)球體形成及卵巢癌進(jìn)展進(jìn)行了直接檢測(cè)。為達(dá)到目的，將從供體患癌小鼠球體中分離出的F4/80⁺CD206⁺M2TAMs(1×10⁶)與ID8細(xì)胞(1×10⁶)一起注入新的受體小鼠腹腔中，受體小鼠以脂質(zhì)體或氯磷酸二鈉脂質(zhì)體治療，注入TAMs或ID8細(xì)胞作為對(duì)照組。單獨(dú)注入TAMs不引起腫瘤，說明分離的為純粹未受ID8污染的TAMs細(xì)胞。TAMs⁺ID8組與ID8組相比，前者明顯增大腫瘤體積、增加腹水以及腫瘤濕重。但是，氯膦酸二鈉脂質(zhì)體治療組與TAM⁺ID8相比而言，前者體重、腹水以及腫瘤質(zhì)量的增加不及后者，甚至低于ID8組(圖3，A-C)。以上數(shù)據(jù)說明磷酸二鈉脂質(zhì)體能削弱內(nèi)外源性TAMs對(duì)卵巢癌生長(zhǎng)的影響。TAMs同時(shí)也縮短了荷瘤小鼠的存活時(shí)間，但氯膦酸二鈉脂質(zhì)體卻能將時(shí)間延長(zhǎng)(圖3D)。此外，TAMs明顯增加球體的數(shù)量和體積、球體內(nèi)CD68⁺巨噬細(xì)胞和Ki67⁺腫瘤細(xì)胞但氯膦酸鈉鹽能削弱上述作用(圖3，E-G)。TAMs同樣增加粘附或圍繞在球體內(nèi)CD68⁺巨噬細(xì)胞周圍的Ki67⁺腫瘤細(xì)胞數(shù)量。但是，氯膦酸鈉鹽治療能減少Ki67⁺細(xì)胞以及CD68⁺巨噬細(xì)胞的數(shù)量(圖3，H-J)。

以上結(jié)果說明，巨噬細(xì)胞為卵巢癌腹腔內(nèi)球體形成和細(xì)胞增殖所必需。

2.4TAMs中EGF與腫瘤細(xì)胞中EGFR表達(dá)相互上調(diào)對(duì)卵巢癌生長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用

為了研究TAMs促進(jìn)OC增殖的分子機(jī)制，我們通過transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定F4/80⁺CD206⁺M2TAMs對(duì)分離自腹腔中球體ID8細(xì)胞(PE-ID8)的作用效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)過程中巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞沒有直接接觸。體外已培育好的ID8OC細(xì)胞(原始ID8)作為對(duì)照組。如圖4A所示，雖然F4/80⁺CD206⁺TAMs對(duì)原始ID8細(xì)胞僅有微弱作用，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)后發(fā)現(xiàn)F4/80⁺CD206⁺TAMs明顯增加PE-ID8細(xì)胞生長(zhǎng)。使用Ki67免疫染色發(fā)現(xiàn)F4/80⁺CD206⁺TAMs促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖(圖4，B-C)。

我們推斷球體內(nèi)TAMs提供生長(zhǎng)因子EGF促進(jìn)球體形成和腫瘤細(xì)胞增殖。因而我們采用定量RT-PCR法對(duì)從腹腔中提取的TAMs和ID8(PE-ID8)癌細(xì)胞內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子表達(dá)方式進(jìn)行篩選。發(fā)現(xiàn)僅僅EGF能在TAMs中被檢測(cè)到，而其他生長(zhǎng)因子如FGFs，HGF，IGF，TNF-α，TGF-β或VEGFs卻不能(圖4D)。通過定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EGF在球體源性的F4/80⁺CD206⁺TAMs而非球體源性的PE-ID8中大量表達(dá)。相反，EGFR在球體源性PE-ID8細(xì)胞中高表達(dá)，而非TAMs內(nèi)(圖4E)。對(duì)球體免疫染色發(fā)現(xiàn)在TAMs中能特異性檢測(cè)到被EGFR⁺腫瘤細(xì)胞包圍的EGF(圖4F)。的確，ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腹水中分泌型EGF與血漿中EGF相比保持在較高濃度(圖4G)。與qRT-PCR得出的結(jié)果一致，在培養(yǎng)球體源性PE-ID8的上清液中未檢測(cè)到EGF。EGF在F4/80⁺CD206⁺TAMs的上清液中檢測(cè)到，并且通過與ID8腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后數(shù)量明顯增加(圖4H)。

接下來我們對(duì)F4/80⁺CD206⁺TAMs是否通過EGF–EGFR信號(hào)促進(jìn)PE-ID8腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)定。為此，用siRNAs降解EGF在TAMs中的表達(dá)，相反PE-ID8中的EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路用EGFR拮抗劑厄洛替尼阻斷。通過兩套siRNAs使TAMs中的EGF基因表達(dá)沉默并用qRT-PCR和ELASA法檢驗(yàn)核實(shí)(圖4，I-J)。通過EGFR和ERK1/2的磷酸化作用驗(yàn)證厄洛替尼對(duì)ID8細(xì)胞內(nèi)EGF–EGFR信號(hào)通路的作用(圖4,K-L)。重要的是,無論是使TAMs中的EGF沉默表達(dá)還是用厄洛替尼對(duì)ID8進(jìn)行治療都能完全鈍化TAMs刺激的PE-ID8腫瘤細(xì)胞增殖(圖4，M-N)。

2.5OC患者EGF⁺TAMs及EGFR⁺腫瘤細(xì)胞與球體形成間的臨床相關(guān)性

為了探討我們所觀察到的球體形成與EGF⁺TAMs和OC患者體內(nèi)存在的EGFR⁺腫瘤細(xì)胞有關(guān)，我們對(duì)128例從OC患者腹水中提取的球體進(jìn)行了檢測(cè)。對(duì)CD68進(jìn)行IHC染色顯示巨噬細(xì)胞幾乎出現(xiàn)在我們采集的所有球體中。此外，球體中巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯多于原位癌中巨噬細(xì)胞的數(shù)量(圖5,A-B)。與小鼠模型相似，大部分CD68⁺巨噬細(xì)胞采集自球體中心(圖5C)，說明巨噬細(xì)胞在OC種植轉(zhuǎn)移中球體初始形成過程中起重要作用。對(duì)從腹水不同大小(小，中和大)球體中分離得到的CD68和Ki67進(jìn)行染色，它們?yōu)榫奘杉?xì)胞和增殖細(xì)胞的標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)TAMs和增生腫瘤細(xì)胞間呈明顯正相關(guān)性(圖5，C-D)。

為了解卵巢癌中TAM相關(guān)球體和臨床病理間可能存在的聯(lián)系，我們對(duì)128例高、中、低組織分化的OC患者球體中TAMs所占百分比進(jìn)行了分析。OC患者球體中CD68⁺細(xì)胞數(shù)量與淋巴血管侵犯(LVI；p＝0.013)、腹水體積(p＝0.009)以及血清癌胚抗原125(CA-125：一種女性卵巢癌早期標(biāo)志物與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有較高相關(guān)性)(p＝0.0043)呈正相關(guān)性。對(duì)高、中、低分化OC患者球體中的CD68陽性細(xì)胞進(jìn)行量化可看出：從高到低分化球體中其CD68陽性細(xì)胞百分比明顯增加，說明與高分化OC相比低分化OC在球體形成中能吸引更多的巨噬細(xì)胞(圖5，E-F)。生存分析顯示球體中CD68陽性細(xì)胞占較高百分比(>14.5％)的患者其5年總體生存率(OS)明顯低于CD68陽性細(xì)胞占較低百分比(<14.5％)的患者(圖5G)。

2.6在小鼠模型中阻斷EGFR減少球體形成及卵巢癌生長(zhǎng)

考慮到球體形成與EGF⁺TAMs和EGFR⁺腫瘤細(xì)胞的相互作用有關(guān)，這在小鼠模型和人OC患者中皆如此，我們對(duì)EGFR阻滯劑能否阻斷球體形成和腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。厄洛替尼(EGFR阻滯劑)抑制大多數(shù)卵巢癌細(xì)胞系生長(zhǎng)，與其相反，吉非替尼和西妥昔單抗則抑制部分卵巢癌細(xì)胞系。我們選擇厄洛替尼來說明EGFR在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中所起的作用。為此，我們首先在上述ID8模型和異種移植小鼠模型中驗(yàn)證了厄洛替尼對(duì)OC進(jìn)展的作用情況，異種移植即SKOV3人OCs經(jīng)腹腔注入雌性受體小鼠模型中所得，厄洛替尼與腫瘤細(xì)胞一起注入受體小鼠腹腔內(nèi)。類似同系小鼠模型，用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(LC)清除TAMs后人OC的生長(zhǎng)速度明顯減慢。此外，與晚期(4-8周)注射LC相比而言早期予LC治療(腫瘤細(xì)胞植入2周后)時(shí)其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更為顯著(圖6A)。與LC類似，早期注射EGFR阻滯劑厄洛替尼對(duì)徹底鈍化卵巢癌生長(zhǎng)有更好效果(圖6B)。兩組小鼠模型中厄洛替尼治療組與未治療組相比，前者腹水體積和腫瘤重量明顯減少同時(shí)伴隨著生存率的提高(圖6，C-F)。

我們進(jìn)一步分析厄洛替尼治療組的球體形成、癌細(xì)胞增殖以及卵巢癌進(jìn)展情況。接受厄洛替尼治療的小鼠組其球體數(shù)量和體積均明顯減少(圖6，G-I)。厄洛替尼能大幅減少游離或在球體中TAMs與Ki67⁺增殖型癌細(xì)胞的總數(shù)(圖6，J-K)。這些結(jié)果說明TAM分泌的EGF在卵巢癌早期種植轉(zhuǎn)移球體的形成、癌細(xì)胞增殖以及腫瘤生長(zhǎng)等方面起到重要作用。

2.7EGF通過VEGF-C/VEGFR3信號(hào)途徑促進(jìn)EGFR+腫瘤細(xì)胞遷移和腫瘤-TAM球體形成

接下來我們對(duì)TAMs產(chǎn)生的EGF如何介導(dǎo)球體形成進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，EGF對(duì)最初OC的生長(zhǎng)是必不可少的。數(shù)據(jù)顯示TAMs位于細(xì)胞群中央，OC模型中EGFR抑制劑厄洛替尼能明顯減少球體的數(shù)量和體積。基于上述發(fā)現(xiàn)，我們作出TAMs分泌型EGF介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向TAMs遷移和黏附的假設(shè)，這是球體形成的先決條件之一。為了搞清楚TAMs促進(jìn)OC遷移的分子機(jī)制，我們分別用劃痕法和transwell法檢測(cè)F4/80⁺CD206⁺TAMs對(duì)腹腔中球體分離的ID8細(xì)胞(PE-ID8)作用。F4/80⁺CD206⁺TAMs,而非單核細(xì)胞，在兩組實(shí)驗(yàn)中均明顯促進(jìn)PE-ID8細(xì)胞遷移(圖7，A-D)。但是，當(dāng)TAMs中EGF基因沉默表達(dá)或ID8接受厄洛替尼治療后，TAMs刺激下的腫瘤遷移效應(yīng)將變遲鈍(圖7,E-F)。這些結(jié)果表明TAMs中EGF與腫瘤細(xì)胞中EGFR表達(dá)相互上調(diào)在TAMs促使的卵巢腫瘤細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用。

有報(bào)道稱VEGF-C/VEGFR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肺癌模型中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。我們發(fā)現(xiàn)在ID8細(xì)胞中VEGFR3處于較高水平。有趣的是，我們?cè)诟骨辉葱缘腎D8(PE-ID8)中檢測(cè)到VEGF-C，而在原始ID8細(xì)胞或TAMs中卻沒有此發(fā)現(xiàn)(圖8，A-B)。進(jìn)一步免疫染色結(jié)果顯示VEGF-C和VEGFR3在PE-ID8腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)而在球體TAMs中卻沒有(圖9A)。免疫印跡分析法顯示PE-ID8與未活化的ID8細(xì)胞相比，前者細(xì)胞內(nèi)VEGF-C和磷酸化VEGFR3水平增加(圖8，C-D)。我們推測(cè)EGF誘導(dǎo)VEGF-C表達(dá)，其反過來又激活瘤細(xì)胞中的VEGFR3。的確，經(jīng)過EGF治療8周或更長(zhǎng)時(shí)間后，經(jīng)qRT-PCR(圖8,E-F)和蛋白印跡法(圖8,G-H)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)小鼠ID8和人SKOV3OC細(xì)胞中的VEGF-C水平明顯增加；這種誘導(dǎo)能被EGFR阻滯劑或ERK/2阻滯劑所阻斷(圖8，I)。一如既往的，經(jīng)過EGF或VEGF-C治療能使VEGFR3磷酸化，這種活化作用被EGFR拮抗劑厄洛替尼或VEGFR3拮抗劑MAZ51所阻斷。但是，由VEGF-C誘發(fā)的VEGFR3激活卻不能被EGFR阻滯劑阻斷(圖8，J)，說明EGF/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路于VEGF-C/VEGFR3信號(hào)通路上游發(fā)揮作用。在功能上，EGF和VEGF-C均能促進(jìn)ID8細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果一致，VEGFR3拮抗劑阻斷EGF和VEGF-C-誘導(dǎo)的ID8細(xì)胞遷移(圖9,B-C)。這些結(jié)果說明EGF–EGFR–VEGF-C–VEGFR3信號(hào)旁路在調(diào)劑OC細(xì)胞遷移中起到關(guān)鍵作用。

最后，我們確定了TAMs怎樣促進(jìn)球體形成。為此，我們通過標(biāo)準(zhǔn)3D共培養(yǎng)系統(tǒng)建立起一個(gè)體外球體試驗(yàn)，人CD14⁺TAMs和從患癌供體tomato^lyzM-cre小鼠球體中分離出的GFP⁺F4/80⁺CD206⁺TAMs與ID8細(xì)胞在含有2％基質(zhì)膠的培養(yǎng)基中混合(TAM：ID8比例為1：10)接著接種到鋪有基質(zhì)膠的24孔培養(yǎng)板上。在這個(gè)模型中，48小時(shí)共培養(yǎng)后我們檢測(cè)到球體形成。為確定腫瘤細(xì)胞遷移是否需要球體形成，我們?cè)?D共培養(yǎng)體系中對(duì)TAMs內(nèi)EGF siRNA以及球體EGFR或VEGFR3特異型拮抗劑效應(yīng)進(jìn)行了檢驗(yàn)。在小鼠細(xì)胞3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中，EGF基因在TAMs中沉默表達(dá)以及阻斷EGFR或VEGF-C/VEGFR3信號(hào)通路都能大幅度減少球體體積和數(shù)量(圖9D-F)。更重要的是，人OC患者中分離出的TAMs與SKOV3細(xì)胞在3D共培養(yǎng)體系下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖9,G-I)，得出了類似結(jié)果。我們?cè)谌撕托∈蠹?xì)胞進(jìn)行EGF siRNA，檢測(cè)到散在分布有活性的TAMs和小型腫瘤細(xì)胞群(圖9,D和G),說明TAMs與腫瘤細(xì)胞間的聯(lián)系通過抑制EGF/EGFR和VEGF-C/VEGFR3信號(hào)通路而被阻斷。

2.8EGF通過ICAM-1-αMβ1整合蛋白的相互作用促進(jìn)EGFR⁺腫瘤細(xì)胞與TAMs相互黏附

我們推測(cè)腫瘤細(xì)胞與TAM相互黏附是球狀體形成的必須前提。有報(bào)道指出球狀體中的TAMs提供整合蛋白促進(jìn)其與腫瘤細(xì)胞間的黏附。因此我們通過熒光定量PCR技術(shù)對(duì)從腹腔中分離出的ID8卵巢癌細(xì)胞(PE-ID8)和TAMs中的多種整合蛋白表達(dá)方式進(jìn)行了篩選。不出所料，我們發(fā)現(xiàn)整合蛋白αM(也稱為CD11b)及β2在球狀體相關(guān)的F4/80⁺CD206⁺TAMs中高表達(dá)，而非在腫瘤細(xì)胞內(nèi)(圖10A)。FACS分析顯示CD11b以及CD11c同樣在TAM高表達(dá)(圖10B-C)。眾所周知巨噬細(xì)胞在靠近炎性組織的過程中通過Mac-1(由整合蛋白αMβ2形成)結(jié)合到血管內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)或ICAM-2上。我們檢測(cè)ICAM-1及ICAM-2在球狀體內(nèi)的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)了ICAM-1，但不是ICAM-2，通過qRT-PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)ICAM-1在球狀體內(nèi)高表達(dá)(圖11A)。接下來我們通過免疫染色技術(shù)確定究竟是哪種類型的細(xì)胞在球狀體內(nèi)表達(dá)ICAM-1。令我們驚訝的是，ICAM-1并非在TAMs里而是在ID8腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)(圖12A)。ICAM-1在原始ID8細(xì)胞中的基線表達(dá)水平是非常低的，但在EGF作用下無論是mRNA還是蛋白質(zhì)水平均大幅度上調(diào)(圖11B-D)。EGFR-或ERK1/2阻滯劑能阻止EGF誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)(圖12，B-C)。有趣的是，EGF誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)也能通過VEGFR3阻滯劑而被阻斷。VEGF-C誘導(dǎo)的ICAM-1在ID8細(xì)胞中的表達(dá)是相一致的(圖12，D-E)。

此后我們對(duì)TAMs上的整合蛋白αMβ2和腫瘤細(xì)胞上的ICAM-1間相互作用是否對(duì)初始球體形成起關(guān)鍵作用進(jìn)行了檢測(cè)。為此，我們測(cè)定了ICAM-1中和抗體在3D球體形成實(shí)驗(yàn)中的作用，ICAM-1中和抗體顯著減少小鼠(圖12,F-H)和人細(xì)胞(圖12，I-K)在3D共培養(yǎng)體系中球體的數(shù)量和體積，但作為參照的IgGs卻沒有此現(xiàn)象。值得注意的是，抗-ICAM-1抗體對(duì)球體的作用影響比起使EGF基因沉默表達(dá)或阻斷EGFR/VEGFR3傳導(dǎo)通路更為深刻，說明TAM–腫瘤細(xì)胞聯(lián)合是球體形成中早期的一步。為了探求ICAM-1中和抗體在卵巢癌治療中的效果，在已建立的原位小鼠模型中，ID8荷瘤小鼠予抗-ICAM-1抗體或作為對(duì)照的IgGs進(jìn)行治療。表型分析顯示抗-ICAM-1抗體組明顯減少小鼠體重、腹水體積和從腹水中分離得到的腫瘤細(xì)胞濕重(圖12,L-N)。與EGFR阻滯劑效果類似，抗-ICAM-1抗體明顯減少球體的數(shù)量和體積(圖12，O-Q)。這些結(jié)果說明整合蛋白-ICAM-1介導(dǎo)的TAM-腫瘤聯(lián)合在球體形成和卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。

3.結(jié)論分析

種植(腹腔)轉(zhuǎn)移幾乎發(fā)生在所有OC患者身上(超過90％)，尤其常見于晚期癌癥患者并由此導(dǎo)致死亡。種植轉(zhuǎn)移亦發(fā)生于其他許多癌癥如胰腺癌(50％)及大腸癌(32％)。因此，研究種植轉(zhuǎn)移的共同機(jī)制對(duì)提高OC以及其他種植轉(zhuǎn)移癌患者的預(yù)后至關(guān)重要?？紤]到腹膜有其獨(dú)特的特點(diǎn)譬如空間較大、無血管或淋巴管道。脫落OC細(xì)胞怎樣得到必需的基質(zhì)供養(yǎng)而避免失巢凋亡現(xiàn)象的發(fā)生、其避免免疫細(xì)胞攻擊的適度保護(hù)機(jī)制以及哪些特異性生長(zhǎng)因子能維持他們迅速生長(zhǎng)及著床目前仍未研究清楚。曾有報(bào)道OC細(xì)胞能激活細(xì)胞存活通路如活化RAB25從而獲得貼壁依賴性生存能力同時(shí)上調(diào)表面免疫抑制分子(如B7-H4及補(bǔ)體C1抑制物)來躲避免疫系統(tǒng)的攻擊(如T細(xì)胞或補(bǔ)體)。球狀體形成是OC腹膜種植轉(zhuǎn)移得以啟動(dòng)的另一基本步驟。但是，關(guān)于球狀體形成的詳細(xì)機(jī)制尚不明確。通過對(duì)128例III期OC患者腹水中分離的組成球狀體的細(xì)胞成分進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞存在于所有球狀體中。我們還觀察到從腹水中分離的球狀體中所含巨噬細(xì)胞數(shù)目顯著多于原發(fā)腫瘤中的巨噬細(xì)胞數(shù)量。另外，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞數(shù)量與其在球狀體內(nèi)的增生呈正相關(guān)，但與OC患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。我們的結(jié)果顯示球狀體相關(guān)TAMs也許在人類OC進(jìn)展中起到重要作用。

TAMs在實(shí)體瘤中能通過分泌促血管新生因子和化學(xué)誘導(dǎo)物來促進(jìn)腫瘤血管形成以及癌癥轉(zhuǎn)移，TAMs亦能分泌細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。巨噬細(xì)胞在OC中所起作用在此前建立的小鼠模型中已進(jìn)行過研究。Toni等報(bào)道腹腔內(nèi)炎癥擴(kuò)散時(shí)卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性將增加；消耗掉腹膜巨噬細(xì)胞，但不包括中性粒及自然殺傷細(xì)胞，能減少腹膜種植轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)率。這些結(jié)果與我們從人體樣本上觀察到的結(jié)果均提示我們做出一種假設(shè)：巨噬細(xì)胞在腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生前球狀體形成過程中起到至關(guān)重要的作用。人及小鼠的OC樣本中TAMs均位于球狀體中央(圖13A：TAM-癌細(xì)胞在球狀體內(nèi)相互作用模型一例)，這一有趣發(fā)現(xiàn)大力支持了我們的假設(shè)。我們進(jìn)一步提供有力證據(jù)表明TAMs在球狀體形成起始步驟中必不可少。在使用GFP轉(zhuǎn)基因受體小鼠建立的OC原位癌模型中，我們觀察到滲入腹腔的巨噬細(xì)胞約有80％出現(xiàn)在球體中。當(dāng)TAMs使用氯膦酸鹽療法后球體細(xì)胞的大小和數(shù)目顯著減少，反過來，腹腔定植被抑制存活時(shí)間延長(zhǎng)。相反，當(dāng)孤立的TAMs注入小鼠腹腔內(nèi)后球體的體積與數(shù)量有明顯增加。有趣的是，滲入腹腔中的巨噬細(xì)胞逐漸獲得M2樣表現(xiàn)型。

在OC小鼠模型中，我們觀察到在種植轉(zhuǎn)移發(fā)生后3周內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)與腫瘤球狀體形成有關(guān)。的確，在小鼠及人OC樣本中觀察到TAM相關(guān)球狀體能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生。另外，體外transwell試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TAMs能直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，表明TAMs 通過釋放某些調(diào)節(jié)因子來調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)。通過篩選TAMs和球體相關(guān)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一組生長(zhǎng)因子及它們的同源受體，我們已確認(rèn)EGF/EGFR調(diào)控通路對(duì)TAM刺激下的OC增生和腫瘤進(jìn)展有至關(guān)重要的作用。前期研究已報(bào)道EGFR在腹腔內(nèi)游離腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定腫瘤細(xì)胞內(nèi)相比明顯增加，說明EGFR通路在腹腔游離腫瘤細(xì)胞內(nèi)起到重要作用。眾所知周，卵巢癌患者腹腔內(nèi)腹水中有大量巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。此外，有報(bào)道稱來自巨噬細(xì)胞的EGF能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲性。我們的研究清楚的說明TAM是EGF的主要來源，其誘導(dǎo)EGFR陽性的OC增殖，這已在體外及小鼠模型中通過EGF基因沉默和EGFR阻滯劑得以證實(shí)。腹腔微環(huán)境下EGF在TAM中是如何被調(diào)控的尚待進(jìn)一步研究。TAM-OC細(xì)胞在球體內(nèi)的相互作用很有可能增加了EGF的表達(dá)。同樣地，從腹水中分離出來的球體相關(guān)OC細(xì)胞內(nèi)的EGFR水平顯著上調(diào)。

有趣的是，在球體中EGFR-陽性O(shè)C細(xì)胞環(huán)繞在EGF-陽性TAMs周圍。這種緊密接觸說明球體中心的TAMs不僅為OC細(xì)胞避免失巢凋亡提供了最初的基質(zhì)支持，還通過EGF-EGFR旁分泌環(huán)路促進(jìn)了OC細(xì)胞的增殖。此外，我們證實(shí)EGF/EGFR信號(hào)不僅對(duì)OC增殖起重要作用，還誘導(dǎo)VEGF-C在OC細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，其反過來激活VEGFR3自分泌旁路進(jìn)而提高整合蛋白/ICAM-1的表達(dá)、OC細(xì)胞的遷移和球體形成(圖13B)。這個(gè)結(jié)論通過以下研究得出：1)在transwell中與TAMs細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)通過降低EGF值或使用EGFR阻滯劑厄洛替尼能顯著抑制OC細(xì)胞的增殖。此外，在兩只OC小鼠模型中觀察到EGFR阻滯劑能徹底鈍化球狀體形成、OC細(xì)胞增殖及腫瘤生長(zhǎng)；2)TAM產(chǎn)生的EGF誘導(dǎo)OC細(xì)胞內(nèi)VEGF-C的表達(dá)，其反過來激活VEGFR3旁路；通過阻滯EGFR-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能消除OC細(xì)胞內(nèi)由EGF誘導(dǎo)產(chǎn)生VEGF-C。重要的是，EGF與VEGF-C均能刺激ICAM-1在OC細(xì)胞中的表達(dá)以及OC細(xì)胞的分化；上述所有效應(yīng)在使用VEGFR3阻滯劑后均能被削弱。因此，在OC細(xì)胞內(nèi)VEGF-C/VEGFR3作用于EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游部位(見圖9B)。

我們的數(shù)據(jù)表明在早期消耗掉TAMs或用厄洛替尼阻滯OC細(xì)胞中的EGFR能有效預(yù)防卵巢癌的種植性轉(zhuǎn)移，但在晚期上述措施無效。這項(xiàng)研究結(jié)果也許能解釋為何晚期OC患者使用EGF抗體單藥治療未能取得成果。因此，OC的治療應(yīng)包括早期診斷、去除TAMs及EGF抗體療法的使用。此外，我們建立的EGF/EGFR、VEGF-C/VEGFR3和ICAM-1–αMβ2整合蛋白模型要求OC細(xì)胞增殖、遷移、粘附和球體形成具有臨床意義。因此，ICAM-1中和抗體，類似于阻斷EGF和VEGFR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，強(qiáng)烈抑制體外球體的形成。而且，ICAM-1中和抗體明顯減少小鼠模型中球體的大小、數(shù)量以及腫瘤的進(jìn)展。本研究表明中和ICAM-1 可能為治療OC提供新的療法。

總的說來，我們的研究表明TAMs在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移球狀體形成過程中起到必不可少的作用。TAM能分泌大量EGF從而激活周圍腫瘤細(xì)胞中的EGFR。激活的EGF/EGFR信號(hào)通路能上調(diào)VEGF-C其反過來又上調(diào)整合蛋白和ICAM-1從而形成自分泌正反饋環(huán)路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生、分化、粘附、形成球狀體及腹膜轉(zhuǎn)移(見圖13B)。我們目前的研究揭示出球狀體形成的關(guān)鍵機(jī)制、為抑制種植轉(zhuǎn)移提供了一種新策略以及改善OC患者的預(yù)后情況。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)。