專利名稱：α1β1整合蛋白受體抑制劑和TGF－β1抑制劑在治療腎病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及以腎小球性腎炎和/或腎纖維化為特征的腎病(即腎臟病變)領(lǐng)域。具體地講，本發(fā)明涉及α1β1整合蛋白受體抑制劑在腎病中的用途。另外，本發(fā)明涉及將α1β1整合蛋白抑制劑與TGF-β1抑制劑組合用于腎病。
本發(fā)明背景在美國，現(xiàn)有大約12,000人患有Alport綜合癥。這種遺傳學(xué)疾病會(huì)導(dǎo)致漸進(jìn)性腎病，這種病只能通過透析和腎臟移植進(jìn)行治療。移植的腎臟通常會(huì)受到排斥。因此，需要其他治療方法。不過，目前尚沒有闡明這種病的發(fā)病或發(fā)展的機(jī)制的治療方法。因此，所需要的是一種針對這種病發(fā)作和/或發(fā)展的機(jī)制的治療方法，這種方法能夠明顯延緩疾病狀態(tài)，如腎小球性腎炎和腎纖維化。
多種腎病都與基質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的改變相關(guān)，其中，結(jié)構(gòu)分子的合成和轉(zhuǎn)化的微妙的平衡受到破壞。例如，Alport綜合癥是一種會(huì)導(dǎo)致漸進(jìn)性腎衰竭的疾病，并且與感覺神經(jīng)性聽力喪失相關(guān)。男性攜帶者最容易受這種病的影響，并且，超級結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)了受感染患者的腎小球基底膜(GBM)的異常。在20,000個(gè)人中大約有1人患有Alport綜合癥，使得這種病成為較流行的已知遺傳學(xué)疾病之一。例如，參見Atkin等，“Alport綜合癥”，參見R.W.Schrier&C.W.Gottschalk(著)，腎病，第4版，第19章，Little Brown,Boston,617-641頁，1988。X一連鎖Alport綜合癥是由在膠原蛋白4A5基因上的一系列突變中的任意一種引起的(Barker等，科學(xué)，348:1224-1227,1990)。在該基因上業(yè)已鑒定了至少60種不同的突變。Alport綜合癥的常染色體形式所表現(xiàn)出的表型范圍與X-連鎖形式的相同，并且是由于在基底膜膠原蛋白基因4A3(COL4A3)或4A4(COL4A4)上的突變引起的。例如，參見Lemmink等，人類分子遺傳學(xué)3:1269-1273,1994和Mochizuki等，自然遺傳學(xué)，8:77-81,1994?；啄さ钠渌膊“℅oodpasture綜合癥-它是由于針對膠原蛋白4A3的NC1結(jié)構(gòu)域上的表位的極性自身免疫反應(yīng)引起的(Hudson等，Kidney Int.,43:135-139,1993)和擴(kuò)散性平滑肌瘤——與膠原蛋白4A5和4A6的缺乏相關(guān)的良性平滑肌瘤(Zhou等，科學(xué)261:1167-1169,1993)。
基底膜是特化的胞外結(jié)構(gòu)，它幾乎與體內(nèi)的每一種器官和組織相關(guān)。它通常存在于細(xì)胞和結(jié)締組織的結(jié)合部位，但也可以存在于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間，在腎小球(即，毛細(xì)管簇)中就是這種情況?；啄さ闹饕Y(jié)構(gòu)元件包括Ⅳ型膠原蛋白、層連蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白和有時(shí)是纖連蛋白和Ⅴ型膠原蛋白。在所有基底膜中，最具有代表性的成分是Ⅳ型膠原蛋白，它是僅存在于基底膜中的一種特殊類型的膠原蛋白。天然形式的Ⅳ型膠原蛋白與所有膠原蛋白一樣，包括以三螺旋形式組裝的三種膠原蛋白分子，它包括6個(gè)α鏈的不同組合(4A1-4A6)。4A1和4A2鏈(又被稱作α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈)是最常見的(Timpl,生物化學(xué)雜志180:487-502,1989)。Ⅳ型膠原蛋白與間隙膠原蛋白在很多方面都不相同。α鏈結(jié)合的螺旋結(jié)構(gòu)不像在其他膠原蛋白中所看到的那樣嚴(yán)格地連接于甘氨酸X-Y基序上；它含有3-羥基脯氨酸而不是4-羥基脯氨酸，并且，在碳水化合物中的含量豐富。所產(chǎn)生的膠原的超級結(jié)構(gòu)是由基底膜膠原蛋白組成的雞籠樣網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)是基礎(chǔ)，輔助分子(層連蛋白，硫酸肝素等)結(jié)合在它上面。
基底膜是高度異源的結(jié)構(gòu)，這就是它具有多種功能特性的原因。對所述結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的了解還很少。幾種新型基底膜膠原蛋白鏈(α3、4、5、和6鏈)是最近才發(fā)現(xiàn)的。例如，參見Gunwar等，生物學(xué)化學(xué)雜志，266:15318-15324,1990,Hostikka等，美國科學(xué)院院報(bào)，87:1606-1610,1990；Butkowski等，生物學(xué)化學(xué)雜志，262:7874-7877,1987；和Zhou等，科學(xué)，261:1167-1169,1993。有趣的是，所述新型鏈僅存在于某些組織中(例如，腎小球、眼睛的Decimet’s膜、晶狀體、皮膚、肺、睪丸、和耳蝸)。例如，參見Kleppel等，美國病理學(xué)雜志134:813-825,1989,和Tryggvason等，Kidney Int.,43:38-44,1993。所述新型鏈在基底膜結(jié)合中的作用和功能目前尚不清楚。據(jù)信，所述新型基底膜膠原蛋白構(gòu)成不同于4A1(α1(Ⅳ))和4A2(α2(Ⅳ))膠原蛋白的網(wǎng)絡(luò)的獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)。
腎小球基底膜(GBMs)是超濾過程所必需的(即，在這里對血液進(jìn)行過濾，除去代謝物，以便以諸如尿液的形式排泄)。Alport綜合癥會(huì)導(dǎo)致胞外基質(zhì)的被動(dòng)積累，而受到損壞的基底膜會(huì)導(dǎo)致局部和部分腎小球性腎炎(即腎小球中毛細(xì)管回路的發(fā)炎)，它最終會(huì)導(dǎo)致致命的尿毒癥(即由于腎衰竭而在血液中存在過量的尿素)。在IDDM(胰島素依賴型糖尿病)腎炎患者的GBM中也會(huì)逐漸積累很多相同的胞外基質(zhì)分子(例如，Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白、層連蛋白、和Ⅳ型膠原蛋白)。不過，在這種疾病中，GBM增厚，但缺乏GBM的局部變薄和開裂(分裂)，這是Alport綜合癥的特征。
整合蛋白是結(jié)合于基底層和胞外基質(zhì)的成分上的異源二聚體跨膜糖蛋白受體的家族。它們起著粘接分子的作用，與細(xì)胞聚合和細(xì)胞錨定在基底層上相關(guān)。它還向細(xì)胞核傳導(dǎo)信號，并且與調(diào)節(jié)基因表達(dá)相關(guān)，特別是決定細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化的基因表達(dá)(Hynes，細(xì)胞，69:11-25,1992)。有20種以上不同的整合蛋白受體是已知的，其中包括大約14種不同的α亞基和大約8種不同的β亞基(DiSimone，現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)觀點(diǎn)，6:182-194,1994)。
在腎小球中，存在不同類型的整合蛋白受體。它們與腎小球膜基質(zhì)(即有助于支撐腎小球中的毛細(xì)血管回路的膜)或內(nèi)臟上皮細(xì)胞相關(guān)(Patey等，細(xì)胞粘通，2:159-167,1994)。在成年腎小球內(nèi)臟上皮細(xì)胞上最常見的整合蛋白受體是α3β1異源二聚體(Adler，美國病理學(xué)雜志，141:571-578,1992；和Patey等，細(xì)胞粘通，2:159-167,1994)。業(yè)已證實(shí)β5亞基在成年內(nèi)臟上皮細(xì)胞中表達(dá)(Yamada等，細(xì)胞粘通，3:311-325,1995)，而α1、α3、α5、αⅤ、β1和β3整合蛋白受體是在腎形態(tài)發(fā)生期間隨著發(fā)育而表達(dá)的(Korhonen等，實(shí)驗(yàn)室研究，62:616-625,1990；Wada等，細(xì)胞生物學(xué)雜志132:1161-1176,1996；和Yamada等，細(xì)胞粘通，3:311-325,1995)。α1β1異源二聚體整合蛋白受體是在腎小球中腎小球膜細(xì)胞表面上鑒定的唯一的整合蛋白受體。
業(yè)已生產(chǎn)出了在α3整合蛋白受體亞基上的基因敲除小鼠。其后代在出生后不久就因?yàn)槟I衰竭而死亡(Kreidberg等，發(fā)育，122:3537-3547,1996)。該模型的新生兒的GBM的超級結(jié)構(gòu)病理學(xué)與在晚期Alport綜合癥上所觀察到的現(xiàn)象十分相似?；啄に坪醢l(fā)生畸變(即不規(guī)則地增厚、變薄和開裂)，而內(nèi)臟上皮細(xì)胞的足突似乎融合。由于α3β1受體的一種配體是Ⅳ型膠原蛋白(Krishnamurti等，實(shí)驗(yàn)室研究，74:650-665,1996；和Rupprecht等，Kidney Int.,49:1575-1582,1996)，并且，由于該受體存在于內(nèi)臟上皮細(xì)胞和GBM之間的平面上(Baraldi等，Nephron,66:295-301,1994)，上面所說的有關(guān)α3整合蛋白敲除的發(fā)現(xiàn)支持了這樣一種模型，其中，所述整合蛋白/配體相互作用在基底膜發(fā)育中起著重要作用。
在正常動(dòng)物體內(nèi)，在胚胎腎小球基底膜(GBM)中的Ⅳ型膠原到出生時(shí)完全由α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈組成(被稱為典型的膠原鏈)。在出生后不久，就發(fā)生了發(fā)育上的轉(zhuǎn)變，在GBM中即可明確檢測到α3(Ⅳ),α4(Ⅳ)，和α5(Ⅳ)鏈(被稱為新型膠原蛋白鏈)，而α1(Ⅳ),α2(Ⅳ)鏈則主要存在于腎小球膜基質(zhì)中(Minor&Sanes,細(xì)胞生物學(xué)雜志，127:879-891,1994)。
在成年人腎臟中，由α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈組成的一薄層GBM位于靠近內(nèi)皮細(xì)胞層處，而GBM的整個(gè)厚度的主要部分是由α3(Ⅳ),α4(Ⅳ)，和α5(Ⅳ)鏈組成(Desjardins&Bendayan，細(xì)胞生物學(xué)雜志，113:689-700,1991；和Kashtan等，臨床研究雜志，78:1035-1044,1996)。有生物化學(xué)證據(jù)表明，由以上兩種不同類型的膠原鏈構(gòu)成分離的網(wǎng)絡(luò)(Kleppel等，生物學(xué)化學(xué)雜志，267:4137-4142,1992)。在家族性腎炎中，α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、和α5(Ⅳ)基因上所發(fā)生的無效突變(即破壞基因表達(dá)的突變)，會(huì)導(dǎo)致所有三種鏈在GBM中的缺乏，推測這是由于在GBM超級結(jié)構(gòu)的大分子組裝中的專性結(jié)合。這會(huì)導(dǎo)致α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈在整個(gè)GBM厚度上的存在。因此，在Alport腎(即患有Alport綜合癥的人體的腎臟)中的內(nèi)臟上皮細(xì)胞的表面上的Ⅳ型膠原蛋白受體與具有非典型Ⅳ型膠原鏈組成的GBM直接接觸。至少有一個(gè)研究業(yè)已證實(shí)了內(nèi)臟上皮細(xì)胞粘著于具有所述不同組成的Ⅳ型膠原蛋白上的相對能力，并發(fā)現(xiàn)與直接連接于典型的鏈α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)上相比，它與包括所述新型鏈的基底膜的粘接明顯更好。這種粘接可以用抗α3整合蛋白受體的抗體抑制。
通過COL4A3膠原蛋白原基因的定向誘變，產(chǎn)生了常染色體形式的Alport綜合癥的小鼠模型(Cosgrove等，基因發(fā)育，10:2981-2992,1996)，該動(dòng)物模型形成了一種漸進(jìn)性腎小球性腎炎，在近交129Sv/J背景中，在大約4周大小的時(shí)候蛋白尿發(fā)作，因?yàn)槟I衰竭導(dǎo)致的平均死亡年齡為大約8.5周。在1周大小的早期階段就在GBM中觀察到了超級結(jié)構(gòu)的改變，而在GBM中大多數(shù)腎小球是在3周大小時(shí)觀察到，離蛋白尿發(fā)作還有很長一段時(shí)間。胞外基質(zhì)成分包括在GBM中積累的層連蛋白-1、硫酸肝素蛋白聚糖、纖連蛋白、和巢蛋白。該小鼠在本文中被稱作“Alport”小鼠。
由于腎病發(fā)展而導(dǎo)致的胞外基質(zhì)在GBM和腎小球膜中的積累，是在患者和試驗(yàn)動(dòng)物系統(tǒng)中觀察到的多種腎小球疾病所具有的特征。例如，參見Goyal&Wiggins,Am.Soc.Nephrol.1:1334-1342,1991；Wilson等，Contrib.Nephrol.Basel,Karger,118:126-134,1996；Razzaque等，Clin.Nephrol.,46:213-214,1996；Yoshioka等，Kidney Int.,35:1203-1211,1989；和Klahr等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，318:1657-1666,1988。在糖尿病中，這種影響的主要介體被認(rèn)為是長時(shí)間接觸由于慢性高葡萄糖含量所導(dǎo)致非酶促葡萄糖化血清蛋白(Doe等，美國科學(xué)院院報(bào)，89:2873-2877,1992；和Roy等，臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，93:483-442,1994)。
對于大多數(shù)漸進(jìn)性腎小球疾病來說，轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1的過量產(chǎn)生似乎與導(dǎo)致纖維化(即形成纖維組織)的胞外基質(zhì)的積累密切相關(guān)。例如，參見Border&Ruoslahti，自然(倫敦)346:371-374，1992；Yang等，J.Am.Soc.Nephrol.,5:1610-1617,1995；和Yamamoto等，Kidney Int.,45:916-927,1994。在自身免疫腎炎的動(dòng)物模型中，注射TGF-β1的抗體或相應(yīng)的mRNA的反義寡核苷酸能夠抑制漸進(jìn)性腎小球性腎炎，并抑制胞外基質(zhì)的積累(Border等，自然(倫敦)346:371-374,1990；和Akaji等，Kidney Int.,50:148-155,1996)。
通過用3H-脯氨酸進(jìn)行的脈沖追蹤研究，估計(jì)大鼠的GBM中的基底膜膠原蛋白的半衰期為16-40天(Daha等，Nephron.22:522-528,1978)。與硫酸肝素蛋白聚糖(t1/2=20小時(shí))或GBM中的其他硫酸化大分子(t1/2=20-60小時(shí))的轉(zhuǎn)化相比，上述轉(zhuǎn)化是非常緩慢的?；啄さ鞍自贏lport小鼠模型的GBM中的積累(Cosgrove等，基因發(fā)育，10:2981-2992,1996)很可能是所述蛋白合成和降解的變化的凈效應(yīng)。在與GBM和基底膜基質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白酶中，鑒定得最清楚的是金屬蛋白酶MMP-2(72kD膠原酶)和MMP-9(92kD膠原酶)，以及MMP-3(溶基質(zhì)素-1)。除了多種其他胞外基質(zhì)成分之外，這些酶能夠降解Ⅳ型膠原。
腎小球膜細(xì)胞(并且可能還有其他類型的腎小球細(xì)胞)也能產(chǎn)生金屬蛋白酶的天然抑制劑，這些抑制劑被稱為TIMP’s(是金屬蛋白酶的組織抑制劑的縮寫)。它們是具有較低分子量的糖蛋白。其中，TIMP-1對溶基質(zhì)素-1和MMP-9具有特異性，而TIMP-2和TIMP-3能抑制MMP-2(Goldberg等，美國科學(xué)院院報(bào)，86:8207-8211,1989；Staskus等，生物學(xué)化學(xué)雜志266:449-454,1991；和Stetler-Stevenson等，生物學(xué)化學(xué)雜志264:17374-17378,1989)。
金屬蛋白酶及其相應(yīng)的抑制劑的調(diào)節(jié)有可能在維持GBM轉(zhuǎn)化的合適水平方面起作用。盡管對編碼腎小球中所述蛋白的基因的調(diào)控所知甚少，但通過整合蛋白受體/ECM(胞外基質(zhì))相互作用而進(jìn)行的信號傳導(dǎo)可能是該過程的一個(gè)重要方面。
仍然需要Alport綜合癥的動(dòng)物模型，特別是其中的疾病發(fā)展得到明顯延緩的模型。還需要治療與腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張和在腎小球基底膜中漸進(jìn)性的基質(zhì)積累和管間質(zhì)相關(guān)的腎病的新的療法，例如，所述腎病包括Alport綜合癥和胰島素依賴型糖尿病。
概述本發(fā)明提供了用于治療或限制(即推遲發(fā)作、延緩發(fā)展、和/或恢復(fù))患者(優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人)體內(nèi)的腎病的各種治療方法。腎臟疾病優(yōu)選包括腎小球性腎炎、腎纖維化，或這兩者。例如，以上疾病有可能與Alport綜合癥、IDDM腎炎、腎小球膜增殖腎小球性腎炎、膜增殖腎小球性腎炎、新月型腎小球性腎炎、糖尿病型腎病、和腎間質(zhì)纖維化相關(guān)。
在一種實(shí)施方案中，所述方法包括給所述患者給藥有效量的α1β1整合蛋白受體抑制劑。所述α1β1整合蛋白受體抑制劑可能是能結(jié)合在α1β1整合蛋白受體在腎細(xì)胞表面的結(jié)合位點(diǎn)上的抑制劑。所述抑制劑可能是選自下列一組的蛋白的至少九聚體的肽片段，這組蛋白包括層連蛋白、纖連蛋白、巢蛋白、和4型膠原。另外，所述抑制劑可能是一種抗體。也可能使用通過其他機(jī)制抑制(即使其失活)α1β1整合蛋白受體的其他抑制劑。
在另一種實(shí)施方案中，所述方法包括除了α1β1整合蛋白受體抑制劑之外，給所述患者給藥有效量的TGF-β1抑制劑。所述抑制劑可以同時(shí)給藥(例如，以混合物形式給藥)或依次給藥。TGF-β1抑制劑可以是能不可逆地結(jié)合于TGF-β1上并抑制其與它的受體結(jié)合的能力的抑制劑。另外，TGF-β1抑制劑可以是能抑制TGF-β1向腎細(xì)胞的細(xì)胞核傳導(dǎo)信號的能力的抑制劑。后一種類型的抑制劑優(yōu)選是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，如tacrolimus(以FK06為商標(biāo)出售)。還可以使用以其他機(jī)制抑制(即使其失活)TGF-β1的其他試劑。
優(yōu)選地是，本發(fā)明提供了用于推遲患者體內(nèi)的Alport綜合癥發(fā)作和/或延緩其進(jìn)展的方法。在一種實(shí)施方案中，該方法包括給藥有效量的能抑制通過腎細(xì)胞的α1β1整合蛋白受體進(jìn)行的信號傳導(dǎo)的試劑。在另一種實(shí)施方案中，該方法包括抑制患者腎細(xì)胞表面上的α1β1整合蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)。所述方法還可以通過給所述患者給藥有效量的TGF-β1抑制劑得到加強(qiáng)。
優(yōu)選地是，本發(fā)明還提供了用于推遲患者體內(nèi)由于胰島素依賴型糖尿病所導(dǎo)致的腎病的發(fā)作和/或延緩其發(fā)展的方法。在一種實(shí)施方案中，該方法包括給藥有效量的能抑制通過腎細(xì)胞的α1β1整合蛋白受體進(jìn)行的信號傳導(dǎo)的試劑。在另一種實(shí)施方案中，該方法包括抑制患者腎細(xì)胞表面上的α1β1整合蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)。所述方法還可以通過給所述患者給藥有效量的TGF-β1抑制劑得到加強(qiáng)。
另外，提供了用于限制患者體內(nèi)腎纖維化的方法。在一種實(shí)施方案中，該方法包括降低患者體內(nèi)的TGF-β1活性，同時(shí)，抑制患者腎細(xì)胞的α1β1整合蛋白受體。該活性可以通過給所述患者給藥一種能不可逆地結(jié)合于TGF-β1上的試劑，并抑制其與其受體結(jié)合的能力而得到降低。另外，該活性還可以通過給所述患者給藥一種能夠抑制TGF-β1向腎細(xì)胞的細(xì)胞核傳導(dǎo)信號的能力的試劑而得到減弱。
在另一種實(shí)施方案中，提供了限制Alport綜合癥患者的GBM中基質(zhì)積累的方法。在一種實(shí)施方案中，該方法包括降低患者體內(nèi)的TGF-β1活性。這一目的可以通過按本文所述方法給藥TGF-β1抑制劑而實(shí)現(xiàn)。
在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了一種通過給患者給藥鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，優(yōu)選tacrolimus限制腎纖維化的方法。
另外，本發(fā)明提供了腎病的小鼠模型，其中，所述小鼠由于敲除了膠原蛋白α3(Ⅳ)基因而不能在GBM中表達(dá)正常的4型膠原蛋白成份。就是說，該小鼠不能將膠原α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、或α5(Ⅳ)鏈結(jié)合到腎小球基底膜上(因此，GBM的Ⅳ型膠原鏈的組成完全是由膠原蛋白α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈組成)。另外，由于敲除了膠原α1亞基基因，它不能表達(dá)α1β1整合蛋白受體。
與現(xiàn)有的Alport小鼠模型相比，在所述雙敲除小鼠中，推遲了蛋白尿的發(fā)作。另外，所述動(dòng)物的生活時(shí)間幾乎為Alport同窩崽的兩倍。在大約8周齡時(shí)(這是Alport小鼠的平均死亡年齡)，所述雙敲除小鼠表現(xiàn)出明顯減輕了的腎小球病變。就是說，與同齡的Alport小鼠相比，所述雙敲除小鼠具有明顯減輕了的超級結(jié)構(gòu)損害，GBM變少的程度減輕，并且足細(xì)胞足突很少消失。另外，相對Alport小鼠而言，在GBM中出現(xiàn)了纖連蛋白、層連蛋白-1和硫酸肝素蛋白聚糖積累的減少，而巢蛋白和Ⅳ型膠原的積累沒有改變。以上結(jié)果表明，α1β1整合蛋白受體在Alport腎病的病理學(xué)中起著特殊作用?？紤]到敲除單一的α1整合蛋白對腎的生理學(xué)或功能沒有明顯影響，這一結(jié)果是值得注意的。
該小鼠可用于研究Alport綜合癥，胰島素依賴型糖尿病，和以腎小球炎癥和/或纖維化為特征的其他疾病。該小鼠還可用于篩選能用于治療Alport綜合癥和胰島素依賴型糖尿病以及以胞外基質(zhì)沉積和/或纖維化為特征的其他疾病的治療劑。
附圖的簡要說明

圖1表示在Alport和雙突變型小鼠體內(nèi)蛋白尿的發(fā)作，是通過每周一次收集所述小鼠的尿液進(jìn)行研究的。數(shù)字表示在采集尿液時(shí)小鼠的年齡(周數(shù))。A=Alport小鼠；B=雙突變型小鼠；Mr=分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
圖2表示對對照小鼠和雙突變型小鼠的腎小球毛細(xì)血管回路的超級結(jié)構(gòu)的破壞。在7周大時(shí)收獲正常(A)、Alport(B)、和雙突變型(C)小鼠的腎皮質(zhì)，包埋在環(huán)氧樹脂里。對超薄切片進(jìn)行染色，并用透射電子顯微鏡進(jìn)行分析。箭頭表示足突。C=毛細(xì)管腔；U=尿間隙。放大線條表示1.5微米。
圖3提供了正常、Alport、和雙突變型小鼠的胞外基質(zhì)蛋白的免疫熒光分析。讓腎皮質(zhì)的冷凍切片與對在Y-軸標(biāo)記上所表示的胞外基質(zhì)蛋白專一的抗體起反應(yīng)。用合適的熒光素偶連的二級抗體顯現(xiàn)信號，并通過數(shù)碼方法采集圖象，并用Cytovision超級軟件(應(yīng)用圖象公司)進(jìn)行加工。箭頭表示腎小球毛細(xì)管回路。4A1,2=膠原α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈；Lam-1=層連蛋白-1；Fib=纖連蛋白；HSP=硫酸肝素蛋白聚糖；ent=巢蛋白。α1+/+=在α1整合蛋白基因上純合的正常個(gè)體；α1-/-=在α1整合蛋白基因上純合的突變型；α3(Ⅳ)+/+=在α3(Ⅳ)膠原蛋白基因上純合的正常個(gè)體；α 3(Ⅳ)-/-=在α3(Ⅳ)膠原蛋白基因上純合的突變型。
圖4表示在Alport腎病發(fā)展過程中從全腎中獲得的mRNA的Northern分析。在變性瓊脂糖凝膠上分離從在所標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)(周數(shù))采集的腎臟中提取的總RNA，吸印到尼龍膜上，并用編碼TGF-β1或腎小球基底膜和/或胞外基質(zhì)的各種成分的鼠cDNA進(jìn)行檢測。用于獲得圖中所表示的數(shù)據(jù)的探針如下A,TGF-β1；B，膠原蛋白α1(Ⅳ)；C，膠原蛋白α2(Ⅳ)；D，纖連蛋白；E，巢蛋白；F，層連蛋白β1鏈；G，層連蛋白β2鏈。
圖5表示在Alport腎病發(fā)展期間mRNA誘導(dǎo)的定量分析。在對X光膠片進(jìn)行曝光之后，用BioRad GS-525磷成像儀對用來產(chǎn)生圖4的膜進(jìn)行分析。作圖的數(shù)值表示Alport樣品中的具體mRNA與在正常同窩崽中所觀察到的數(shù)據(jù)相比的誘導(dǎo)倍數(shù)。所有的帶都扣除了背景。分析的具體mRNA的類型在內(nèi)側(cè)表示。
圖6表示在發(fā)生蛋白尿以后的Alport小鼠體內(nèi)的特定轉(zhuǎn)錄物的原位雜交分析。同時(shí)，對來自正常同窩崽(A、D、G、和J)的腎和來自Alport小鼠(B、E、H、和K)的腎進(jìn)行分析。反義探針對膠原蛋白α1(Ⅳ)(A和B)、TGF-β1(D和E)、纖連蛋白(G和H)、巢蛋白(J和K)、層連蛋白β1鏈(M和N)的NC1域?qū)Ｒ?。將對?xì)菌β-半乳糖苷酶專一的探針用作非特異性結(jié)合的對照(C、F、I、L、和O)。
圖7表示在源于正常和Alport小鼠的組織切片中對TGF-β1的免疫過氧化物酶染色。用免疫過氧化物酶檢測可以將石蠟包埋的切片的活性形式的TGF-β1染色，P=足細(xì)胞；M=腎小球膜細(xì)胞。
圖8表示正常和Alport人腎皮質(zhì)的TGF-β1 mRNA的RNase檢測分析。從正常和Alport人腎皮質(zhì)中分離總RNA，并用人TGF-β1反義信使的放射性標(biāo)記的部分作為探針對10微克每一種RNA進(jìn)行RNase保護(hù)分析。該分析得到了一個(gè)264bp的保護(hù)片段。分子大小標(biāo)記物是放射性標(biāo)記過的MSP1裂解過的PBR322，并標(biāo)出了合適的片段以便比較。N=正常；A=Alport。
圖9表示源于正常、Alport、α1整合蛋白缺陷型、和同時(shí)缺乏α1整合蛋白和膠原蛋白α3(Ⅳ)的小鼠的腎皮質(zhì)的RNA的Northern印跡。從具有所標(biāo)明的基因型的7周齡小鼠(同窩崽)的腎皮質(zhì)中分離總RNA:+/+=在兩個(gè)等位基因上都正常；-/-=在兩個(gè)等位基因上都是突變型。
圖10是注射了對α1整合蛋白專一的中和抗體的7周齡Alport動(dòng)物的GBM的透射電子顯微照片。注意到了GBM的規(guī)則的3層外觀，并且缺乏局部增厚區(qū)。放大倍數(shù)為10,500倍。
圖11表示TGF-β1抑制劑對129Sv/J Alport小鼠的GBM超級結(jié)構(gòu)的影響。用FK506或TGF-β1可溶性受體處理動(dòng)物。將腎皮質(zhì)包埋在環(huán)氧樹脂中，切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用透射電子顯微鏡分析。A=對照；B=未處理過的Alport；C=用FK506處理過的Alport；D=用可溶性TGF-β1受體處理過的Alport。放大倍數(shù)為11,000倍。
圖12是源于處理過的和未處理過的129Sv/J Alport小鼠的腎小球的掃描電子顯微照片。對用于圖11的小鼠的腎皮質(zhì)進(jìn)行冷凍干燥，切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用掃描電子顯微鏡對確定的腎小球進(jìn)行曝光并照相。A=對照；B=未處理過的Alport；C=用可溶性TGF-β1受體處理過的Alport小鼠。放大倍數(shù)為2500倍。
圖13表示在129Sv/J Alport小鼠上藥物治療對尿白蛋白的影響。在藥物治療期間，采集尿液，冷凍干燥，并在聚丙烯酰胺凝膠上對相等的0.5微升樣品進(jìn)行分析。用考馬斯蘭對所述凝膠進(jìn)行染色，觀察。頭兩個(gè)泳道是未注射過的對照，緊接著的兩個(gè)泳道(Ⅰ組)是注射了FK506的，第3組(Ⅱ組)是注射了可溶性TGF-β1受體的。底部的數(shù)字表示在采集尿液時(shí)小鼠的年齡(周數(shù))。
C=對照；A=Alport。
圖14表示在雙敲除小鼠中，TGF-β1抑制劑對GBM超級結(jié)構(gòu)的影響。對動(dòng)物不作處理，或者用FK506或TGF-β1可溶性受體處理。將腎皮質(zhì)包埋在環(huán)氧樹脂中，切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用透射電子顯微鏡分析。A=未注射過的對照；B=未注射過的雙敲除；C=用FK506處理過的雙敲除；D=用可溶性TGF-β1受體處理過的雙敲除。放大倍數(shù)為8,000倍。
圖15表示用TGF-β1抑制劑處理過的10周齡雙敲除小鼠的正常腎小球結(jié)構(gòu)的例子。在用TGF-β1抑制劑處理過的小鼠體內(nèi)大約有25％的腎小球在形態(tài)學(xué)上與對照動(dòng)物沒有區(qū)別。動(dòng)物是未處理過的或者用FK506處理過的。將腎皮質(zhì)包埋在環(huán)氧樹脂中，切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用透射電子顯微鏡分析。A=未注射過的對照；B=用FK506處理過的雙敲除。
圖16表示藥物治療對雙敲除小鼠的尿白蛋白的影響。在藥物治療期間，采集尿液，冷凍干燥，并在聚丙烯酰胺凝膠上對相等的0.5微升樣品進(jìn)行分析。用考馬斯蘭對所述凝膠進(jìn)行染色，觀察。采集尿液時(shí)小鼠的年齡表示在圖的底部(周數(shù))。A=未注射過的雙敲除小鼠；B=注射了可溶性受體的雙敲除小鼠；C=注射了FK506的對照小鼠；D=注射了FK506的雙敲除小鼠。
圖17是源于Alport和雙敲除小鼠的腎小球的掃描電子顯微照片。將來自7周齡動(dòng)物的腎皮質(zhì)冷凍干燥，切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用掃描電子顯微鏡對確定的腎小球曝光并照相。A=對照；B=Alport；C=雙敲除小鼠。
圖18表示對正常和突變型小鼠的層連蛋白α2鏈的雙重免疫熒光染色。用巢蛋白專一性一級抗體和FITC-綴合的二級抗體可將腎小球基底膜染成綠色。用Texas紅偶聯(lián)的二級抗體可將層連蛋白α2鏈染成紅色。在毛細(xì)管回路中的同時(shí)沉積會(huì)導(dǎo)致黃色染色。Ⅰ組是源于7周齡小鼠的腎小球；A=未注射過的對照；B=未注射過的Alport；C=注射了可溶性受體的Alport；D=未注射過的雙敲除小鼠。Ⅱ組是源于2周齡小鼠的腎小球；A=對照；B=Alport。箭頭表示在腎小球的毛細(xì)管回路中的免疫染色。
圖19是2周齡正常小鼠和Alport小鼠的GBM的透射電子顯微照片。將腎皮質(zhì)包埋在環(huán)氧樹脂中，切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用透射電子顯微鏡分析。A=對照；B=Alport。
圖20表示在正常和Alport小鼠中TGF-β1抑制劑對編碼細(xì)胞基質(zhì)分子或金屬蛋白酶抑制劑的RNA在腎臟中表達(dá)的影響?？俁NA是從用FK506(Ⅰ)處理過的或未處理過的(Ni)7周齡正常(C)或Alport(A)的小鼠的腎中分離的。在變性瓊脂糖凝膠上分離RNA，并通過與編碼胞外基質(zhì)分子或金屬蛋白酶抑制劑的放射性探針雜交進(jìn)行分析。在雜交之后，洗滌雜交膜，并對X光膠片進(jìn)行曝光。所使用的探針在圖的左側(cè)表示。α1(Ⅳ)=膠原蛋白α1(Ⅳ)；fn=纖連蛋白；ent=巢蛋白；Timp2=金屬蛋白酶抑制劑Timp-2；Timp3=金屬蛋白酶抑制劑Timp-3。
圖21表示在正常和雙敲除小鼠中TGF-β1抑制劑對編碼細(xì)胞基質(zhì)分子或金屬蛋白酶抑制劑的RNA在腎臟中表達(dá)的影響。總RNA是從用FK506(Ⅰ)、TGF-β1可溶性受體(Ⅱ)處理過的或未處理過的(NI)10周齡正常(C)或雙敲除(Dko)小鼠的腎中分離的。在變性瓊脂糖凝膠上分離RNA，并通過與編碼胞外基質(zhì)分子或金屬蛋白酶抑制劑的放射性探針雜交進(jìn)行分析。在雜交之后，洗滌雜交膜，并對X光膠片進(jìn)行曝光。所使用的探針在圖的左側(cè)表示。α1(Ⅳ)=膠原蛋白α1(Ⅳ)；fn=纖連蛋白；ent=巢蛋白；Timp2=金屬蛋白酶抑制劑Timp-2；Timp3=金屬蛋白酶抑制劑Timp-3。
圖22表示用TGF-β1抑制劑抑制雙敲除小鼠的管間隙中基質(zhì)的積累。將來自10周齡正?；螂p敲除小鼠的腎包埋在塑料中，并用Jonessilver烏洛脫品方法對1μM的切片進(jìn)行染色。A=正常腎；B=雙敲除腎，未注射過的；C=用FK506處理過的雙敲除腎；D=用TGF-β1可溶性受體處理過的雙敲除腎。
圖23表示用TGF-β1抑制劑抑制Ⅰ型膠原在雙敲除小鼠的管間隙中基質(zhì)的積累。將來自10周齡正?；螂p敲除小鼠的腎包埋在塑料中，并用對Ⅰ型膠原蛋白專一的抗體對1μM的切片進(jìn)行免疫染色。用從Vector實(shí)驗(yàn)室購買的鏈霉親合素AEC染色試劑盒對染色進(jìn)行顯影。A=正常腎；B=雙敲除腎，未注射過的；C=用FK506處理過的雙敲除腎；D=用TGF-β1可溶性受體處理過的雙敲除腎。
圖24用TGF-β1抑制劑抑制纖連蛋白在雙敲除小鼠的管間隙中基質(zhì)的積累。將來自10周齡正?；螂p敲除小鼠的腎包埋在塑料中，并用對纖連蛋白專一的抗體對1μM的切片進(jìn)行染色。用從Vector實(shí)驗(yàn)室購買的鏈霉親合素AEC染色試劑盒對染色進(jìn)行顯影。A=正常腎；B=雙敲除腎，未注射過的；C=用FK506處理過的雙敲除腎；D=用TGF-β1可溶性受體處理過的雙敲除腎。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明本發(fā)明提供了針對腎病(腎疾病)的機(jī)制的治療方法，該方法能明顯延緩疾病狀態(tài)的發(fā)作和/或發(fā)展，所述腎病如腎小球性腎炎和腎纖維化。據(jù)信，本發(fā)明的方法甚至能夠恢復(fù)所述疾病。具體地講，本發(fā)明提供了用于治療與在腎小球中出現(xiàn)或增加出現(xiàn)產(chǎn)生腎小球性腎炎和腎纖維化的危險(xiǎn)的相關(guān)的腎病的方法，如在腎小球膜增殖性腎小球腎炎、膜增殖性腎小球腎炎、新月型腎小球性腎炎、糖尿病型腎病、和腎間質(zhì)纖維化中所出現(xiàn)的情況。腎小球性腎炎涉及腎小球的損壞，通常與GBM的增厚、變薄、和/或開裂的不規(guī)則性相關(guān)。這可能最終導(dǎo)致管間隙纖維化的共同途徑。所述癥狀的典型特征是肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)和基質(zhì)(包括Ⅰ型膠原、纖連蛋白、層連蛋白和Ⅳ膠原)在管間隙中的積累。通過評估上述特征中的一項(xiàng)或幾項(xiàng)可以確定用于本發(fā)明方法中的治療劑的效果。
本發(fā)明還提供了用于研究治療腎病患者的方法和篩選治療腎病患者的治療劑的小鼠模型，所述腎病與胞外基質(zhì)的積累，特別是在腎小球和管間隙中的積累的出現(xiàn)或具有較大的出現(xiàn)這種情況的危險(xiǎn)性相關(guān)的。因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了Alport綜合癥的小鼠模型。該小鼠模型包括一個(gè)與失活的膠原蛋白(Ⅳ型)分子結(jié)合的失活的α1β1整合蛋白受體。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，膠原蛋白(Ⅳ型)分子是通過破壞膠原蛋白(Ⅳ型)的α3亞基的表達(dá)而失活的。結(jié)果，所述小鼠不能將膠原蛋白α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、或α5(Ⅳ)鏈結(jié)合到GBM中。
所述小鼠模型可用于試驗(yàn)治療腎功能異常的制劑的方法中，如Alport綜合癥、胰島素依賴型糖尿病、以及其早期疾病以腎小球膜基質(zhì)膨大和腎小球膜細(xì)胞增殖為特征的其他腎病，所述腎病與腎小球基底膜損傷有關(guān)，其特征是基底膜增厚、變薄、開裂、以及足細(xì)胞足突的消失，或其組合。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制或以其他方式破壞α1β1整合蛋白受體功能的抑制劑，以此作為在腎小球疾病發(fā)展過程中推遲腎小球性腎炎和/或纖維化(表現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)和胞外基質(zhì)在管間隙中的積累，包括層連蛋白、纖連蛋白、Ⅰ型膠原和Ⅳ膠原)的發(fā)作(通過白蛋白在尿液中的出現(xiàn)衡量)或延緩疾病的發(fā)展(通過尿液中血清白蛋白含量升高的速度衡量)或者甚至恢復(fù)(通過尿液中血清白蛋白含量增加的速度衡量)?？梢允褂煤铣傻幕蛱烊坏母鞣N試劑，將在下面做更詳細(xì)的描述。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及TGF-β1在Alport腎病發(fā)病積累和其他所述腎病中的作用。在用于本發(fā)明的小鼠模型上在蛋白尿發(fā)作之后觀察到TGB-β1的mRNA含量的顯著增加。原位雜交證實(shí)，足細(xì)胞在蛋白尿發(fā)作之前能產(chǎn)生很少以至不產(chǎn)生TGB-β1的mRNA，而在蛋白尿發(fā)作之后一直到腎衰竭的晚期能表達(dá)TGB-β1的大量的mRNA。大體上在相同時(shí)間觀察到了編碼纖連蛋白、COL4A1和COL4A2的mRNA的激活。因此，降低TGB-β1含量的方法是治療諸如腎小球性腎炎和/或纖維化的腎病的另一種途徑。抑制TGB-β1活性的效果可以通過測定白蛋白在尿液中出現(xiàn)的時(shí)間(發(fā)作)和含量增加的速度而測定，和/或肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)(出現(xiàn)于管間隙中)和/或胞外基質(zhì)分子在GBM和管間隙中的積累。
在另一種實(shí)施方案中，通過將TGB-β1抑制劑用于α1整合蛋白缺陷型Alport小鼠，本發(fā)明通過α1β1整合蛋白抑制劑和TGB-β1抑制劑組合治療對延緩腎小球性腎炎的發(fā)作和發(fā)展和/或預(yù)防纖維化產(chǎn)生協(xié)同作用。小鼠模型控制患有Alport綜合癥和其他疾病患者的一個(gè)重要方面是確定這種病發(fā)展的原因和/或機(jī)制，所述其他疾病與漸進(jìn)性腎小球損傷相關(guān)，所述損傷與GBM上的增厚、變薄、或開裂的不規(guī)則性以及最終到達(dá)管間隙纖維化的共同途徑相關(guān)，其特征是肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)和基質(zhì)(包括Ⅰ型膠原、纖連蛋白、層連蛋白、和Ⅳ型膠原)在管間隙中的積累為特征。例如，盡管在膠原α3(Ⅳ)和α4(Ⅳ)基因上的突變會(huì)導(dǎo)致Alport綜合癥的常染色體隱性形式，而在α5(Ⅳ)基因上的突變會(huì)導(dǎo)致這種病的X-連鎖形式，但這些突變本身不會(huì)“導(dǎo)致”漸進(jìn)性腎衰竭。相反，膠原蛋白α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、或α5(Ⅳ)的缺乏似乎會(huì)導(dǎo)致由α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)膠原蛋白鏈組成的胚胎樣GBM的保留。這種胚胎樣GBM是人類生命中大約頭10年(或小鼠模型的大約頭3周)的合適的腎小球過濾器。不過，在此之后，胚胎樣GBM似乎不再能有效地起作用。例如，在一個(gè)Alport綜合癥患者上，對9歲大的Alport綜合癥患者的GBM的超級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)了比較正常的超級結(jié)構(gòu)(Cangiotti等，Nephrol.Dial.Transplant.,11:1829-1834,1996)。不過，在18歲時(shí)，同一個(gè)患者的GBM超級結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出發(fā)展了的Alport腎小球性腎炎。
在Alport綜合癥上，人的基底膜在5歲到10歲之間都比較正常，此時(shí)，基底膜完整性的喪失可以通過尿液中白蛋白的逐漸增加監(jiān)測?；顧z研究業(yè)已證實(shí)了在蛋白尿之前的Alport患者體內(nèi)基底膜的超級結(jié)構(gòu)是正常的。從超級結(jié)構(gòu)上看，GBM病表現(xiàn)為GBM的不規(guī)則增厚和變薄。基底膜的開裂被認(rèn)為是由于與蛋白尿同時(shí)出現(xiàn)的微量血尿病(即在尿液中有少量的可檢測紅細(xì)胞)所導(dǎo)致的。
對Alport腎病發(fā)作和發(fā)展的機(jī)制所知甚少。不過，據(jù)推測，GBM成分的積累和GBM的稀少化可能是由于這種膜遭受蛋白水解的可能性增強(qiáng)，和/或由于正常調(diào)節(jié)途徑的改變增加了基質(zhì)分子的合成。
因此，需要一種Alport綜合癥的模型，因?yàn)檠芯咳说臉悠肪哂芯窒扌浴＿@種病的發(fā)展在人體上會(huì)表現(xiàn)出不同程度的嚴(yán)重性，這可能是由于遺傳背景的差別所致。了解疾病發(fā)作和發(fā)展的分子特征的有意義的研究從道理上講在人體上是不可能的，這妨礙了Alport腎病研究的發(fā)展。
通過編碼4型膠原α3(Ⅳ)鏈的基因的定向誘變生產(chǎn)出了常染色體Alport綜合癥的小鼠模型(Cosgrove等，基因發(fā)育10:2981-2992,1996)。這種動(dòng)物模型會(huì)發(fā)生一種漸進(jìn)性的腎小球性腎炎。最早在1周大時(shí)就觀察到了GBM超級結(jié)構(gòu)的改變。在本文中這種小鼠被稱為“Alport小鼠”。
另外，通過編碼α1整合蛋白受體亞基的基因的定向誘變生產(chǎn)出了一種小鼠(Gardner等，發(fā)育生物學(xué)，175:301-313,1996)。該整合蛋白亞基與整合蛋白β1亞基一起形成一種異源二聚體，產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的α1β1整合蛋白異源二聚體，這種二聚體存在于腎小球中的腎小球膜細(xì)胞的表面上。整合蛋白α1β1受體是僅存在于腎小球基質(zhì)中的整合蛋白受體，它不存在于其他部位。除了纖維細(xì)胞與膠原基質(zhì)的粘接改變之外，所述敲除小鼠沒有明顯的表型。它能正常發(fā)育，可育，并且有正常的壽命。不存在腎衰竭，并且在這些小鼠的腎小球的分子組成或超級結(jié)構(gòu)方面沒有明顯差別。由于α1β1異源二聚體整合蛋白受體是在腎小球中的腎小球膜細(xì)胞表面上所鑒定到的唯一的整合蛋白受體，令人吃驚的是，這種受體的缺乏居然對正常腎發(fā)育和/或功能沒有影響。這表明，要么它是不必要的，要么豐余的途徑能夠彌補(bǔ)它的缺乏。
本發(fā)明提供了一種新型雙敲除(即雙突變型)小鼠模型。該模型是通過讓α1敲除小鼠品質(zhì)與膠原蛋白α3(Ⅳ)敲除小鼠品質(zhì)(Alport小鼠)雜交以便產(chǎn)生在整合蛋白α1受體亞基基因和膠原蛋白α3(Ⅳ)基因上都具有缺陷的突變型。盡管α1β1整合蛋白受體的缺乏表面上看在正常的腎發(fā)育和功能方面沒有作用，因?yàn)槟I小球膜基質(zhì)是合成金屬蛋白酶和諸如TGF-β1的細(xì)胞因子的場所，并且Alport腎小球性腎炎早期與腎小球膜細(xì)胞的增殖和腎小球膜基質(zhì)的擴(kuò)張相關(guān)，但相信α1β1整合蛋白受體可能在腎病發(fā)病中具有特殊作用。事實(shí)上，對整合蛋白α1膠原蛋白α3(Ⅳ)雙敲除小鼠的研究是十分特殊和重要的。下面的討論披露了本發(fā)明的雙敲除小鼠的很多特征。
對腎過濾器的完整性的最好整體評價(jià)方法是蛋白尿(即，在尿液中存在過量的血清蛋白)。如圖1所示，與Alport同窩崽(即缺乏膠原蛋白α3(Ⅳ)基因，但含有α1整合蛋白亞基基因)相比，所述雙敲除小鼠的蛋白尿至少推遲1周，并且在大約9周-大約9.5周達(dá)到高峰，而前者是在大約6周-大約6.5周達(dá)到高峰。蛋白尿(即在尿液中存在血清白蛋白)的發(fā)作和增加速度是評估本發(fā)明方法有效性的一個(gè)良好指標(biāo)?？梢酝ㄟ^凝膠電泳和考馬斯蘭染色(用等量的1微升的尿液進(jìn)行電泳)或市售檢驗(yàn)條測定血清白蛋白含量。Alport小鼠由于腎衰竭而導(dǎo)致的平均死亡年齡大約為8-9周，而無論這些小鼠的背景是129Sv/J或129Sv(為了確定這一點(diǎn)讓每一種遺傳背景的至少10只小鼠發(fā)展到晚期階段)。雙敲除小鼠的平均壽命為大約15-16.5周。
因此，清除α1β1整合蛋白受體對Alport腎病的發(fā)作和發(fā)展具有明顯影響。另外，與其他試驗(yàn)小鼠相比，沒有α1β1受體的小鼠具有改善了的腎小球功能。在不能表達(dá)α3(Ⅳ)基因，并且在α1敲除突變上是雜合的動(dòng)物上，在腎小球功能和疾病發(fā)展方面具有中等程度的改善，這表明α1整合蛋白對Alport腎病的發(fā)展具有劑量依賴型影響(即α1整合蛋白的表達(dá)降低1/2，所產(chǎn)生的保護(hù)作用介于Alport小鼠和所述雙敲除小鼠之間)。在α1整合蛋白突變上雜合的Alport動(dòng)物上的中等程度的保護(hù)作用表明，部分抑制α1β1整合蛋白受體，能產(chǎn)生有用的優(yōu)點(diǎn)。這是一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樗茉谟糜谌祟悤r(shí)，應(yīng)用于包括抑制α1β1整合蛋白受體的治療方法上。
對獲自在兩個(gè)等位基因上正常的(對照)、在膠原蛋白α3(Ⅳ)上無效并且在α1整合蛋白上正常的(Alport)、或在膠原蛋白α3(Ⅳ)和α1整合蛋白都無效(雙敲除)的7周齡小鼠的腎進(jìn)行透射電子顯微鏡分析。選擇這一時(shí)間點(diǎn)，是因?yàn)锳lport小鼠在此年齡已經(jīng)接近晚期階段。圖2中所選擇的照片是至少5個(gè)不同腎小球區(qū)的代表。如圖2所示，正常小鼠的腎小球毛細(xì)管回路(圖2A)具有三層基底膜，它具有均勻的厚度和規(guī)則的足突(在所有圖片中的足突用箭頭表示)。Alport小鼠的毛細(xì)管回路(圖2B)表現(xiàn)出稀少化的基底膜，具有局部增厚和變薄(發(fā)病晚期的特征)。足突膨大，變得模糊，據(jù)信其作用是影響過濾效率。在雙敲除小鼠上(圖2C)，基底膜所受的影響明顯低于Alport小鼠(圖2B)。盡管它的基底膜比對照的薄，但它稀少化的程度較低，并且，足細(xì)胞的足突似乎比較正常。在Alport小鼠上，大約有40％的腎小球纖維化，而在雙敲除突變型上僅有50％纖維化。
用取自圖2所示的相同動(dòng)物的冷凍的腎皮質(zhì)進(jìn)行免疫熒光分析。讓所述組織與對已知的由于Alport腎病發(fā)展而在GBM中積累的蛋白專一的抗體反應(yīng)。圖3中的結(jié)果表示對于Alport腎小球和雙突變型腎小球來說，膠原蛋白COL4A1(α1(Ⅳ))和COL4A2(α2(Ⅳ))鏈的分布。在兩種情況下，毛細(xì)管回路(在圖3的圖片中用箭頭表示)和腎小球膜基質(zhì)是陽性的(圖3B、C)。與對照相比，Alport小鼠的GBM中明顯積累了層連蛋白-1(比較圖3D和圖3E)。不過，在雙突變型(圖3F)中，相對Alport腎小球而言(圖3E)，層連蛋白-1的積累顯著減少。正常情況下，纖連蛋白僅存在于腎小球膜基質(zhì)中，但在Alport小鼠上發(fā)現(xiàn)它存在于GBM上，并且存在于腎小球膜基質(zhì)中。另人吃驚的是，在所述雙突變型中，未發(fā)現(xiàn)纖連蛋白在毛細(xì)管回路中的積累(圖3I)。這一結(jié)果是高度可再現(xiàn)的。相反，與對照(圖3J)或Alport小鼠(圖3K)相比，對硫酸肝素蛋白聚糖進(jìn)行染色，在雙突變型腎小球膜基質(zhì)中表現(xiàn)出減弱了的染色(圖3L)。在Alport和雙突變型樣品都觀察到巢蛋白在GBM中的積累，在兩者之間沒有可分辨的差別(圖3N和圖30)。
綜上所述，以上資料說明雙突變型中的α1無效突變會(huì)導(dǎo)致Alport腎病發(fā)展的延緩。這種延緩在生理學(xué)(如圖1所示，推遲了蛋白尿的發(fā)作)和超級結(jié)構(gòu)(如圖2所示，減弱了GBM損傷和足突的消失)水平上都很明顯。在圖3中所提供的免疫影響研究說明，α1β1整合蛋白受體的消失會(huì)導(dǎo)致胞外基質(zhì)成分在GBM和腎小球膜基質(zhì)中積累的特殊變化。因此，本發(fā)明涉及治療方法，其中，腎細(xì)胞表面的α1β1整合蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)受到抑制。下面將更詳細(xì)地披露所述治療方法。另外，圖9表明，盡管在Alport小鼠中誘導(dǎo)了細(xì)胞因子TGF-β1，但同時(shí)也具有α1整合蛋白突變的Alport小鼠中不能誘導(dǎo)。因此，在缺乏α1β1整合蛋白的情況下，未觀察到TGF-β1誘導(dǎo)，這導(dǎo)致了基質(zhì)在腎小球基底膜中積累的減少，并因此顯著降低了腎病發(fā)展的速度。GBF-β1在腎病中的這種作用，將在以下部分作更詳細(xì)的討論。TGF-β1的作用本文的資料清楚地表明，TGF-β1是在本發(fā)明所使用的小鼠模型中的特殊腎小球細(xì)胞類型(足細(xì)胞)中誘導(dǎo)的。TGF-β1mRNA的誘導(dǎo)，是編碼已知的腎小球基底膜中積累的基質(zhì)分子誘導(dǎo)的反應(yīng)，所述分子的積累是所述模型中漸進(jìn)性腎小球性腎炎的結(jié)果(例如，層連蛋白、纖連蛋白、巢蛋白和4型膠原蛋白)。另外，本文的資料還表明，在人Alport腎皮質(zhì)中也誘導(dǎo)了TGF-β1。這一結(jié)果支持了所述動(dòng)物模型在模擬人類Alport腎中所發(fā)生的情況的能力方面的實(shí)用性。
為了證實(shí)TGF-β1的作用，從Alport動(dòng)物的腎中分離總RNA，并用放射性標(biāo)記過的，對α1(Ⅳ)或α2(Ⅳ)膠原蛋白鏈、巢蛋白、層連蛋白β1或β2鏈、纖連蛋白、或TGF-β1專一的探針檢測。圖4的結(jié)果表示上述所有蛋白的mRNA，所不同的是層連蛋白β1是在Alport小鼠中在蛋白尿發(fā)作之后誘導(dǎo)的。與此同時(shí)，還要對層連蛋白α1、層連蛋白β2、層連蛋白γ1、硫酸肝素蛋白聚糖核心蛋白、膠原α4(Ⅳ)、和膠原α5(Ⅳ)鏈進(jìn)行Northern吸印。在比較所述對照和突變型時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)上述其他基底膜蛋白在mRNA水平上有明顯差別。
對上述Northern分析的結(jié)果進(jìn)行分析，以便直接對在上述時(shí)間內(nèi)特定mRNA表達(dá)的相對變化進(jìn)行定量。圖5表示在6周齡時(shí)，所述特定mRNA含量的誘導(dǎo)第一次顯著。到第8周，mRNA的含量達(dá)到最高，編碼TGF-β1和纖連蛋白的mRNA被誘導(dǎo)分別超過對照小鼠6.6倍和9.4倍。到第8周，膠原蛋白α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、和巢蛋白的mRNA含量被誘導(dǎo)了大約3倍。相反，在腎病發(fā)展的任何時(shí)間，都沒有發(fā)現(xiàn)編碼層連蛋白β1β2鏈的mRNA有明顯變化，這一結(jié)果是通過上述相同的總RNA的Northern印跡測定的。
腎小球僅占腎臟總質(zhì)量的很小的百分比。腎小球中單個(gè)細(xì)胞類型所占的百分比更低。因此，總的腎RNA的Northern印跡不可能檢測出對腎小球?qū)Ｒ坏模蛘邔μ囟ǖ哪I小球細(xì)胞類型專一的信息的誘導(dǎo)。為了確定編碼TGF-β1或不同基底膜成分的mRM在特定腎小球細(xì)胞類型中是否被誘導(dǎo)，用洋地黃毒苷標(biāo)記過的、對所述mRNA專一的反義探針進(jìn)行原位雜交。結(jié)果如圖6所示。在正常小鼠中，TGF-β1的轉(zhuǎn)錄物(圖6D)、纖連蛋白的轉(zhuǎn)錄物(圖6G)和層連蛋白β1的轉(zhuǎn)錄物(圖6M)僅存在于腎小球膜細(xì)胞中，而在Alport小鼠中，相同的轉(zhuǎn)錄物(圖6E、H、和N)明確存在于足細(xì)胞中(位于腎小球外面的細(xì)胞環(huán))，表明了在該腎小球細(xì)胞類型中的基因激活。還證實(shí)了膠原蛋白α1(Ⅳ)足細(xì)胞的激活(比較圖6B和6A)。腎小球足細(xì)胞中的編碼基質(zhì)蛋白的基因的激活，能導(dǎo)致GBM組成的改變。
基于用對所述細(xì)胞因子的活性異構(gòu)形式專一的抗體進(jìn)行免疫過氧化物酶檢測的TGF-β1蛋白的資料，證實(shí)了通過原位雜交分析所獲得的TGF-β1 mRNA的資料。圖7所示資料表明，TGF-β1 mRNA在足細(xì)胞中的較高水平的表達(dá)，可轉(zhuǎn)譯成較高的蛋白。
由于有關(guān)TGF-β1的資料是用小鼠模型獲得的，要進(jìn)行RNase保護(hù)分析，以便確定在獲自Alport和對照患者的人腎皮質(zhì)中，所述細(xì)胞因子的mRNA含量是否也提高了。圖8中的資料表明，相對對照而言，人Alport腎皮質(zhì)中的TGF-β1 mRNA的含量提高了3-4倍。這證實(shí)了所述細(xì)胞因子在人Alport腎中也是超量表達(dá)的。因此，抑制TGF-β1的活性可以作為治療Alport綜合癥的合理的治療方法，特別是用于限制、優(yōu)選預(yù)防基質(zhì)在GBM中的積累。如上文所述，圖9表示，盡管TGF-β1在Alport小鼠中被誘導(dǎo)，但它在同時(shí)具有α1整合蛋白突變的雙敲除小鼠中不能被誘導(dǎo)。因此，在缺乏α1β1整合蛋白的情況下，不會(huì)出現(xiàn)TGF-β1的誘導(dǎo)，這就是在腎小球基底膜中基質(zhì)積累減少的原因，因此，明顯降低了腎病發(fā)展的速度。
重要的是，抑制(或以其他方式失活)整合蛋白α1β1受體和抑制TGF-β1，在減緩腎病(特別是Alport腎病)發(fā)作、發(fā)展和/或恢復(fù)方面具有協(xié)同作用。例如，這種協(xié)同作用是用兩種不同的試劑證實(shí)的，這兩種試劑以三種不同方式抑制TGF-β1的活性。對兩種試劑進(jìn)行研究，以便確定這一結(jié)果是由于抑制了TGF-β1的活性，而不是由于藥物治療的副作用。
第一個(gè)例子是由Fujisawa藥物有限公司(大阪，日本)生產(chǎn)的藥物，被稱為tacrolimus或FK506。這種藥物通常被用作免疫抑制劑，用于在器官移植之后預(yù)防排異作用。它通過抑制被稱為鈣調(diào)磷酸酶的T-細(xì)胞受體的關(guān)鍵亞基而起作用。所述酶是一種絲氨酸蘇氨酸磷酸酶，并且是T-細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)的一個(gè)關(guān)鍵部分。正如在最近的綜述中所指明的(Crabtree等，細(xì)胞，96:611-614,1999)，鈣調(diào)磷酸酶是各種受體的亞基。最近報(bào)導(dǎo)的所述受體之一是TGF-β1的受體(Wang等，細(xì)胞，86:435-444,1996)。藥物FK506是作為TGF-β1的抑制劑試驗(yàn)的。因此，用適當(dāng)劑量的FK506處理小鼠能抑制TGF-β1Ⅰ/Ⅱ型受體信號傳導(dǎo)。
由于FK506除了抑制TGF-β1之外還具有其他生物學(xué)作用(通過T-細(xì)胞受體抑制實(shí)現(xiàn)的有效的免疫抑制最為突出)，對第二種TGF-β1抑制劑進(jìn)行了評估。第二種抑制劑是由Biogen Inc.(劍橋，MA)開發(fā)的實(shí)驗(yàn)藥物。這種藥物是所述細(xì)胞因子的競爭性抑制劑，能吸收所述活性細(xì)胞因子，形成失活的可溶性受體復(fù)合體。它是一種可溶性嵌合TGF-βRII/IgG1鼠融合蛋白(參見國際公開號WO98/48024)。在所述實(shí)驗(yàn)中，每周2次通過尾靜脈將25微克抑制劑注射到小鼠體內(nèi)。
由于FK506和Biogen的可溶性TGF-β1抑制劑的活性模式和潛在的副作用是如此不同，用所述動(dòng)物模型系統(tǒng)進(jìn)行的觀察與這兩種藥物吻合，這可以歸結(jié)為是由于抑制了TGF-β1的活性。
進(jìn)行了兩種類型的試驗(yàn)。用129Sv/J小鼠模型(Alport小鼠)對兩種制劑進(jìn)行試驗(yàn)，以便檢驗(yàn)其對TGF-β1抑制的生物學(xué)效應(yīng)。其次，在雙敲除小鼠模型中對兩種制劑進(jìn)行試驗(yàn)，以便檢驗(yàn)α1β1整合蛋白抑制和TGF-β1抑制的生物學(xué)效應(yīng)。在所有情況下，本文所給出的數(shù)據(jù)都至少重復(fù)了3次，具有高度的一致性。
當(dāng)Alport小鼠模型中TGF-β1受到抑制時(shí)，具有某些有益的效果?；啄さ男螒B(tài)學(xué)具有總體的改善，不過，仍然觀察到了明顯的足突消失。因此，TGF-β1可以通過降低基質(zhì)積累的速度改善GBM形態(tài)學(xué)，但它對足突消失的機(jī)制沒有明顯影響。這意味著TGF-β1抑制劑盡管能提供某些改善，但不大可能成功地改善Alport綜合癥或其他諸如此類的疾病的所有特征。在雙敲除小鼠中，到10周齡時(shí)，大多數(shù)足突看上去正常，不過，在GBM中有大量的基質(zhì)積累。如果從4周齡時(shí)開始用任一種TGF-β1抑制劑處理相同的動(dòng)物，并在10周齡時(shí)收獲組織，大約有30％的腎小球在超級結(jié)構(gòu)方面與正常小鼠沒有差別。因此，可以通過組合使用TGF-β1抑制劑和α1β1整合蛋白受體抑制劑，實(shí)現(xiàn)本文所述治療方法的顯著改進(jìn)。
獲自用任一種TGF-β1抑制劑處理過的Alport小鼠或雙敲除小鼠的腎臟的特定mRNA的Northern印跡資料，證實(shí)了TGF-β1或α1β1整合蛋白敲除突變在影響編碼GBM中積累的任一種基質(zhì)分子的信息的表達(dá)方式方面存在明顯差別。編碼金屬蛋白酶(包括基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2))的mRNA及其相應(yīng)的抑制劑(包括TIMP-2和TIMP-3)(該抑制劑被認(rèn)為能調(diào)節(jié)構(gòu)成GBM的分子的轉(zhuǎn)化速度)同樣以不同方式影響用任一種TGF-β1抑制劑處理過的Alport小鼠或雙敲除小鼠。具體地講，在正常小鼠中能以很高水平表達(dá)的Timp-3在Alport小鼠和雙敲除小鼠中受到了抑制。用TGF-β1抑制劑處理雙敲除小鼠，可預(yù)防TIMP-3的抑制，將其mRNA恢復(fù)到與對照小鼠相當(dāng)?shù)乃?圖21)。
與此同時(shí)，層連蛋白α2正常情況下嚴(yán)格局限于在腎小球膜基質(zhì)中表達(dá)。層連蛋白α2的沉積是所鑒定到的與Alport GBM疾病發(fā)作相關(guān)的最早的分子變化，與此同時(shí)，首先檢測到基底膜的增厚。即使是在7周齡時(shí)，在GBM的雙敲除小鼠中也未觀察到層連蛋白α2的沉積(圖18，1D組)。給SV/J Alport小鼠給藥TGF-β1抑制劑不能抑制層連蛋白α2的沉積(圖18,1C組)。這證實(shí)了α1β1整合蛋白和TGF-β1抑制劑在延緩疾病發(fā)展的作用方式方面存在其他不同，用有力的證據(jù)證實(shí)了組合治療能產(chǎn)生協(xié)同效果的原因。據(jù)信，TGF-β1不能抑制足細(xì)胞足突的消失，直接與有關(guān)層連蛋白α2的發(fā)現(xiàn)相關(guān)。所述層連蛋白形成包括α、β、和γ鏈的異源三聚體。在基底膜中，它們相互交聯(lián)形成層狀超級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是基底膜的一個(gè)整體部分。已知層連蛋白能與整合蛋白受體起作用，并在分化和組織功能的保持方面起著重要作用。在正常小鼠中，GBM主要包括層連蛋白-11，由α5、β2和γ1組成的異源三聚體。已知該層連蛋白能以很高的親合力結(jié)合在足細(xì)胞表面上的整合蛋白α3β1受體上。很多人都認(rèn)為這種相互作用在保持構(gòu)成足突的復(fù)雜的細(xì)胞骨骼結(jié)構(gòu)方面起著關(guān)鍵作用。包括α2鏈的層連蛋白異源蛋白三聚體(層連蛋白-2和層連蛋白-4)不能結(jié)合α3β1整合蛋白。因此，層連蛋白-2鏈在GBM中的存在會(huì)導(dǎo)致通過抑制α3β1整合蛋白與其正常底物(層連蛋白-11)結(jié)合而出現(xiàn)足突消失。如上文所述，在所述雙敲除小鼠中，層連蛋白α2的沉積受到抑制，它與在該小鼠中足突的保持十分吻合。
其他觀察與間質(zhì)纖維化的組織相關(guān)，間質(zhì)纖維化發(fā)生在Alport綜合癥發(fā)生的晚期。在129Sv/J Alport小鼠模型中，在7周之前很少觀察到纖維化，平均死亡年齡為8周。不過，在雙敲除小鼠中纖維化發(fā)作于8-9周，并且一直發(fā)展到15周的平均死亡年齡。因此，雙敲除小鼠是研究纖維化的優(yōu)良模型。在雙敲除小鼠中存在明顯的纖維化進(jìn)程，這一進(jìn)程可以用TGF-β1抑制劑有效抑制。治療方法一方面，本發(fā)明涉及用抑制劑(例如，封閉劑)抑制或以其他方式破壞α1β1整合蛋白受體的功能，以此作為推遲腎小球疾病，特別是漸進(jìn)性腎小球性腎炎和/或纖維化發(fā)作(通過在尿液中出現(xiàn)可檢測水平的血清白蛋白衡量，使用市售檢驗(yàn)條或凝膠電泳和凝膠染色方法)、延緩其發(fā)展(通過測定尿液中的白蛋白含量隨時(shí)間而提高的速度確定，按上述方法測定)、或者甚至是恢復(fù)這種病的方法。例如，其中包括源于結(jié)合在α1β1整合蛋白受體上的蛋白的9聚體肽，如，(但不限于)層連蛋白、4型膠原蛋白、纖連蛋白和巢蛋白?？梢愿鶕?jù)蛋白/α1β1整合蛋白受體研究，生產(chǎn)出結(jié)合于α1β1受體的受體/配體位點(diǎn)內(nèi)的小分子?？蓪⒛軐Ｒ坏亟Y(jié)合于α1β1整合蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)上的抗體和抗體片段用于本發(fā)明中。所述抗體或抗體片段包括多克隆抗體、單克隆抗體、抗獨(dú)特型抗體、動(dòng)物產(chǎn)生的抗體、人源化抗體和嵌合抗體。
可將能抑制α1β1整合蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)的試劑(人工配體)用于本發(fā)明的方法中。所述試劑的例子包括，但不限于中和抗體、肽、或蛋白水解片段等。據(jù)信，所述試劑能夠抑制通過所述受體進(jìn)行的信號傳導(dǎo)?？梢酝ㄟ^評估諸如TGF-β1、纖連蛋白、層連蛋白鏈等的基因表達(dá)的下游效應(yīng)、通過腎小球基底膜的形態(tài)變化和/或通過表現(xiàn)為蛋白尿的發(fā)作和發(fā)展速度降低的腎小球篩改善，來確定所述治療的效果。
在實(shí)施例和圖10中提供了能中和α1β1整合蛋白功能的抗體。作為說明一種能夠抑制α1β1整合蛋白與其配體相互作用的可溶性試劑的例子，獲得了Fabbri等(組織抗原，48:47-51,1996)披露的抗體，所述相互作用能夠產(chǎn)生與α1基因敲除突變相同的對腎病發(fā)病的影響。注射該抗體(每周注射3次，每次腹膜內(nèi)注射400ng)，并證實(shí)能抑制Alport小鼠模型中的腎小球基底膜損傷，在很大程度上在雙突變型中觀察到的作用方式相同。
另一方面，本發(fā)明涉及使用能降低TGF-β1含量的制劑，以此作為在腎小球疾病，特別是漸進(jìn)性腎小球性腎炎發(fā)病中延緩基質(zhì)積累的方法。因此，所述試劑可用于治療Alport綜合癥患者和胰島素依賴型糖尿病患者，以及患有以下疾病的其他患者特別是漸進(jìn)性腎小球性腎炎或以腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張、腎小球膜細(xì)胞增殖、會(huì)導(dǎo)致增厚、變薄、開裂、或某些諸如此類的不規(guī)則性、足細(xì)胞突起的消失的腎小球基底膜中基質(zhì)的沉積，或上述表現(xiàn)的某種組合，以上所有疾病最終都會(huì)發(fā)展到腎纖維化的共同途徑上(用α1β1整合蛋白抑制劑和TGF-β1抑制劑進(jìn)行組合治療對于預(yù)防以上疾病是特別有效的)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中所披露的反義療法，可用于抑制TGF-β1或α1β1整合蛋白受體蛋白表達(dá)?？梢允褂煤铣傻幕蛱烊坏亩喾N試劑。
能中和TGF-β1細(xì)胞因子與其受體相互作用的能力的試劑可用于本發(fā)明的方法中。所述試劑的例子包括，但不限于中和抗體、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(即microlide)如在US5260301中所披露的(Nakanishi等)(例如，F(xiàn)K506或tacrolimus以及結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物)，一種可溶性受體，如披露于國際公開號WO98/48024(Biogen公司)中的可溶性重組TGF-β1受體(例如，可溶性嵌合TGF-βRII/IgG1融合蛋白)，所述受體的肽片段，或某些具有能不可逆地(或穩(wěn)定的)結(jié)合細(xì)胞因子并抑制其與其受體結(jié)合的能力的所述片段。另外，可以使用能抑制TGF-β1向細(xì)胞核傳導(dǎo)信號的能力的試劑?？梢酝ㄟ^評估諸如纖連蛋白、層連蛋白鏈等的基因表達(dá)的下游效應(yīng)、通過腎小球基底膜的形態(tài)變化，和/或通過表現(xiàn)為蛋白尿的發(fā)作和發(fā)展速度降低的腎小球篩改善進(jìn)行來確定所述治療的效果。
在一種例子中，可將FK506或環(huán)孢菌素A用于抑制TGF-β1受體的鈣調(diào)磷酸酶部分，抑制通過該受體復(fù)合體進(jìn)行的信號傳導(dǎo)，正如在某些其他腎病中業(yè)已披露過的(Wang等，細(xì)胞86:435-444,1996和Miller等，內(nèi)分泌學(xué)，3:1926-1934,1989)，并因此抑制(通過一種未知的機(jī)制)蛋白尿的發(fā)作，正如在相同的腎病上業(yè)已披露的(Callis等，Pediatt.Nephrol.,6:140-144,1992)。在本發(fā)明之前，還沒有對Alport綜合癥、糖尿病或與腎小球中胞外基質(zhì)的增加相關(guān)的疾病提出所述建議。
具體地講，本發(fā)明說明了抑制α1β1整合蛋白受體和TGF-β1的組合療法的作用，在預(yù)防腎小球疾病和與Alport綜合癥相關(guān)的纖維化方面具有協(xié)同作用。隨之而來的是，與腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張、腎小球膜細(xì)胞增殖、表現(xiàn)為GBM增厚、變薄、開裂、足細(xì)胞足突消失的一種或幾種的漸進(jìn)性基底膜損傷或上述現(xiàn)象的任意組合相關(guān)的其他疾病也可以得益于該治療方法。另外，我們說明了所述組合治療在預(yù)防Alport綜合癥的管間隙纖維化方面的效果。纖維化是一種常見途徑，據(jù)信其機(jī)制在所有與纖維化相關(guān)的腎病中是相同的。因此，這種在治療纖維化方面的組合治療的效果可適用于所有形式的腎纖維化，而無論啟動(dòng)通向纖維化的途徑內(nèi)在原因是什么。
用于本發(fā)明方法中的試劑可以與藥理學(xué)上可以接受的載體組合給藥。本發(fā)明的試劑被配制在藥用組合物中(即制劑)，然后以適應(yīng)所選擇的給藥途徑的各種形式給諸如人類患者的哺乳動(dòng)物給藥。所述制劑通常包括適用子腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、和靜脈內(nèi))給藥和其他能保持所述試劑穩(wěn)定性的方法的形式。
合適的藥理學(xué)上可以接受的載體可以為液體、半固體、細(xì)碎的固體或其組合形式。適用于腸胃外給藥的制劑通常包括所述試劑的無菌水制劑，或含有所述試劑的無菌粉末的分散劑，該制劑優(yōu)選是與受體的血液等滲的。可以包含在所述液體制劑中的等滲試劑包括糖、緩沖液、和氯化鈉。所述試劑的溶液可以用水制備，選擇性地與無毒表面活性劑混合。所述試劑的分散液可以用水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、植物油、甘油酯及其混合物制備。最終的劑型是無菌的，并且在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定的?？梢酝ㄟ^諸如使用脂質(zhì)體、通過在分散液中采用合適的粒度或使用表面活性劑獲得所需的流動(dòng)性。液體的消毒可以用任何能保留所述試劑生物活性的常規(guī)方法完成，優(yōu)選通過過濾器消毒。制備粉末的優(yōu)選方法包括無菌可注射溶液的真空干燥和冷凍干燥?？梢酝ㄟ^使用諸如抗細(xì)菌劑、抗病毒劑和抗真菌劑的各種抗微生物劑預(yù)防后續(xù)的微生物污染，所述抗微生物劑包括parabens，三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞?？梢酝ㄟ^將試劑包含在用于緩釋的諸如單硬脂酸鋁和明膠的材料中實(shí)現(xiàn)所述試劑的較長時(shí)間的吸收。
除了上述成分之外，本發(fā)明的制劑還可以包括一種或幾種輔助成分，其中包括稀釋劑、緩沖劑、粘接劑、分解劑、表面活性劑、增稠劑、潤滑劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等。所述制劑通常以單一劑量形式存在，并可以通過制藥領(lǐng)域所公知的任意方法制備。
本文所披露的試劑的有用的劑量(即能提供理想作用的有效劑量)可以通過比較其體外活性及在動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性來確定。根據(jù)在小鼠和其他動(dòng)物中的有效劑量推測在人體上有效劑量的方法在本領(lǐng)域中是公知的。例如，對于靜脈內(nèi)注射來說，劑量為每天2次，每公斤體重大約150-300毫克。一般，可以給藥的合適劑量為能充分產(chǎn)生理想的效果，如通過誘導(dǎo)Ⅱ期酶表達(dá)的明顯增加，或本文所述的其他特征。
實(shí)施例在實(shí)施例中對兩種不同的動(dòng)物模型進(jìn)行了說明。第一種模型是“Alport”小鼠模型，它不能表達(dá)膠原蛋白α3(Ⅳ)，而α1整合蛋白是正常的，并披露于Cosgrove等，基因發(fā)育，10:2981-2992,1996中，第二種模型被稱為“雙敲除”小鼠，這種小鼠是通過讓Alport小鼠與α1整合蛋白基因無效的小鼠雜交產(chǎn)生的。在用于說明抑制α1β1整合蛋白對延緩腎小球疾病的作用的效力方面Alport小鼠和雙敲除小鼠之間沒有差別。將對這些效果進(jìn)行詳細(xì)說明。
Alport小鼠是純合的129Sv/J遺傳背景，而雙敲除小鼠是97.5％純合的129Sv背景。所不同的是，將所述動(dòng)物用于產(chǎn)生圖4、5和6。所述實(shí)驗(yàn)是在Alport小鼠模型的生命的早期進(jìn)行的，因此，是通過讓嵌合型雄鼠與C57B1/6雌鼠雜交產(chǎn)生的，然后再讓得到的雜合型小鼠與所產(chǎn)生的純合型Alport小鼠雜交，得到F2代。這是與用于Alport小鼠模型原始說明中的同一世代的小鼠(Cosgrove等，基因發(fā)育，10:2981-2992,1996)。這是早期基因敲除研究的習(xí)慣做法，因?yàn)樗芗铀偾贸憩F(xiàn)型的鑒定。從所述F2代獲得的有關(guān)特定mRNA誘導(dǎo)的結(jié)果與由純的129Sv/J敲除小鼠獲得的結(jié)果一致。應(yīng)當(dāng)指出的是，對Alport小鼠和雙敲除小鼠進(jìn)行比較分析的所有實(shí)驗(yàn)都是用近交系進(jìn)行的。
檢驗(yàn)了TGF-β1在兩種動(dòng)物模型的腎病發(fā)展方面的作用，以及在纖維化發(fā)生方面的作用。這一目的是通過檢驗(yàn)兩種以很不相同的方式起作用的TGF-β1的不同抑制劑進(jìn)行的。使用兩種不同的抑制劑(FK506和可溶性TGF-β1受體)，提供了有關(guān)作用是由于TGF-β1抑制，而不是由于所使用的試劑的副作用的證據(jù)。FK506在治療與TGF-β1的超量表達(dá)相關(guān)的漸進(jìn)性纖維化方面具有治療作用。
在分析所披露的不同動(dòng)物模型和藥物治療的過程中，有一個(gè)一直保留使用的特殊評估過程。對三個(gè)不同的方面進(jìn)行評估。首先，檢查腎功能，它可以對腎小球過濾器的總體完整性進(jìn)行評價(jià)。這一目的是通過檢驗(yàn)?zāi)蛞褐械难灏椎鞍椎妮敵龆鴮?shí)現(xiàn)的。其次，在光學(xué)和電子顯微鏡水平上檢驗(yàn)組織的結(jié)構(gòu)完整性。采用透射和掃描電子顯微方法，設(shè)計(jì)所述方法，是為了確定在不同條件下腎病理組織學(xué)的程度。最后，進(jìn)行分子分析實(shí)驗(yàn)，以便檢驗(yàn)在特定的基因上發(fā)生了什么樣的變化，并由于這些不同的條件產(chǎn)生了什么樣的相應(yīng)的蛋白。這些檢驗(yàn)是通過用Northern印跡、原位雜交、RNase保護(hù)觀察特定的RNA，并通過用免疫組織化學(xué)檢測特定蛋白而進(jìn)行的。由于特定的方法被重復(fù)用于分析不同的動(dòng)物模型，和在不同的動(dòng)物模型上進(jìn)行不同的藥物治療，為了避免重復(fù)，現(xiàn)在要指出的是，所述方法在所有情況下都是以相同方式進(jìn)行的(幾乎可以視為日常的實(shí)踐)，因此，只說明一次，然后在后面的特定實(shí)施例中加以引用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用多種其他技術(shù)和方法，這些技術(shù)和方法同樣能夠成功地完成本發(fā)明。所有試劑都是從Sigma化學(xué)公司(St.Louis,MO)獲得的，除非另有說明。用于本發(fā)明所有研究中的PBS是以片劑形式購買的，每片被重溶于200毫升水中，形成pH7.4的PBS，所述片劑購自Sigma化學(xué)公司(St.Louis,MO)，產(chǎn)品代號P-4417。
方法Ⅰ．腎功能A．蛋白分析尿蛋白的最初測定是用Albustix(Miles實(shí)驗(yàn)室，Elkhart,IN)進(jìn)行的，并根據(jù)該試劑盒所提供的比色圖表讀出相對含量。
每隔1周采集1次尿樣，并在10％的變性丙烯酰胺凝膠上通過電泳分離0.5微升的樣品。用考馬斯蘭對凝膠上的蛋白進(jìn)行染色，并照相。用牛血清白蛋白作為分子量標(biāo)準(zhǔn)物。Ⅱ．結(jié)構(gòu)完整性A．透射電子顯微術(shù)在4％的低聚甲醛中切碎新鮮的外腎皮質(zhì)，將其固定2小時(shí)，并于5℃下保持在PBS(pH7.4)中。用0.1M Sorenson’s緩沖液(Sorenson’s緩沖液是通過混合100毫升的200mM磷酸二氫鈉和400毫升的200mM磷酸氫二鈉和500毫升的水，并調(diào)整到pH7.4而制成的)充分洗滌所述組織(在4℃下洗滌5次，每次10分鐘)，并在含有1％四氧化鋨的Sorenson’s緩沖液中進(jìn)行后固定1小時(shí)。然后在梯度乙醇中對該組織進(jìn)行脫水(70％、然后80％、然后90％、然后100％，每次10分鐘)，然后在氧化丙烷中脫水，并包埋在Poly/Bed812環(huán)氧樹脂中(Polysciences公司，Warrington,PA)，按照生產(chǎn)商所提供的方法進(jìn)行。簡單地講，將42毫升的polybed812與26毫升的十二烷基琥珀酸酐(DDSA,Polysciences公司)和24毫升的nadic甲基酸酐(Polysciences公司)混合。加入1.5毫升的2,4,6三(二甲基氨基甲基)苯酚作為催化劑，并將活化的樹脂冷凍在10毫升樣品中，在需要時(shí)用于包埋樣品。在用甲苯胺蘭染色的1微米的切片上鑒定腎小球，并用Reichert Jung Ultracut E ultramicrotome(劍橋儀器公司，維也納，奧地利)切成厚度為70nm的薄切片。將切片安裝在網(wǎng)格上，并用已知方法用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。用飛利浦CM10電子顯微鏡檢查安裝在網(wǎng)格上的切片，并照相。
B．掃描電子顯微術(shù)將腎皮質(zhì)的小片(大約2立方毫米)放在3％磷酸緩沖的戊二醛中固定，然后在1％磷酸緩沖的四氧化鋨中后固定。然后在梯度乙醇中對樣品進(jìn)行脫水，并在二氧化碳中進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。通過用剃須刀片的刀刃切割將所述樣品塊切碎成碎片，并用膠水將其安裝在支柱上，使開裂的表面向上。通過已知方法用金/鈀對所述表面進(jìn)行噴射包衣，然后用掃描電子顯微鏡觀察。
C．Jones Silver烏洛脫品染色Jones染色是用由Burna和Bretschneider披露的方法，用石蠟包埋的腎進(jìn)行的(參見用于光學(xué)顯微術(shù)的組織的塑料包埋，教育用品部，美國臨床病理學(xué)家協(xié)會(huì)，芝加哥，IL,24-25頁，1981)。Ⅲ．分子分析A．Northern印跡分析取出腎臟并在液氮中快速冷凍，并用研缽和研棒在液氮中研磨成粉末。將這種粉末溶解在TRIZOL試劑(GibCo/BRL，格蘭特島，NY)，每個(gè)腎使用5毫升試劑。按照說明提取總的細(xì)胞RNA。通過在0.1％瓊脂糖/甲醛/MOPS(3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸)凝膠上以80V的電壓電泳4小時(shí)分離20微克RNA。將凝膠在水中浸泡45分鐘，并通過毛細(xì)吸印過夜，轉(zhuǎn)移到Hybond N(不帶電荷的尼龍，新英格蘭核公司，玻士頓，MA)上，使用750mM乙酸銨(溶解在水中)作為轉(zhuǎn)移緩沖液。用Stratalinker(Stratagene,La Jolla,CA)將RNA通過UV交聯(lián)到所述印跡上。在含有50％甲酰胺、10×Denhardt’s溶液，1M氯化鈉，50mMTris-HCl,pH7.4,1％SDS，和200微克/毫升超聲處理并變性的鮭魚精DNA(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)的溶液中對印跡進(jìn)行預(yù)雜交。用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(BoeringerMannheim,Indianapolis,IN)通過隨機(jī)啟動(dòng)標(biāo)記探針(32P標(biāo)記的cDNA探針片段)，達(dá)到109cpm/μg的濃度。預(yù)雜交和雜交緩沖液含有5×鹽水-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)、10×Denhardt’s溶液、0.5％的十二烷基硫酸鈉(SDS)、200微克/毫升超聲處理并變性的鮭魚精DNA。讓濾膜預(yù)雜交至少5小時(shí)，然后以每毫升雜交溶液一百萬DPM(每分鐘的衰減量)的探針的用量雜交過夜。然后在高嚴(yán)格條件下洗滌濾膜(在65℃下，在含有300mM氯化鈉、30mM檸檬酸鈉、和溶解在水中的0.2％的十二烷基硫酸鈉的溶液中洗滌2次，每次30分鐘)，并對X光膠片進(jìn)行曝光。通過用溴化乙錠染色測定RNA制劑的質(zhì)量和加樣的一致性，并用凝膠成像2000數(shù)碼成像系統(tǒng)裝置和軟件包(應(yīng)用成像，SantaClara,CA)掃描18S和28S核糖體RNA帶。適當(dāng)?shù)暮颂求w帶的比例，證實(shí)了該RNA制劑具有高度一致的質(zhì)量。當(dāng)量光密度掃描證實(shí)樣品的加樣誤差不超過10％。采用以上措施，而不使用對照探針，是因?yàn)榭紤]到隨著漸進(jìn)性纖維化所發(fā)生的細(xì)胞生理學(xué)的改變使得這種對照探針不可靠。通過用BioRad GS-525磷成像儀(BioRad公司，Hercules,CA)進(jìn)行磷成像分析測定表達(dá)的定量差別，并扣除背景雜交。
通過PCR擴(kuò)增從鼠腎5’cDNA片段文庫(Clonetech)中分離探針，使用不同基底膜膠原蛋白cDNA的公開序列和相關(guān)蛋白的公開序列。對于基底膜膠原蛋白探針來說，擴(kuò)增編碼保守的NC1域的序列.所使用的引物和條件與Miner和Sanes(細(xì)胞生物學(xué)雜志，127:879-891,1994)所采用的相同。對于膠原蛋白COL4A1來說，引物是(Muthukumaran等，生物學(xué)化學(xué)雜志，264:6310-6317,1989)有義引物，5’TCTGTGGACCATGGCTTC3’(序列1)；反義引物，5’TTTCTCATGCACACTTGGC3’(序列2)。對于膠原蛋白COL4A2來說，引物是(Saus等，生物學(xué)化學(xué)雜志，264:6318-6324,1989)有義引物，5’GGCTACCTCCTGGTGAAG3’(序列3)；反義引物，5’TTCATGCACACTTGGCAG3’(序列4)。在相同條件下擴(kuò)增COL4A1和COL4A2。通過熱啟動(dòng)(95℃下10分鐘)對毒粒(a×106)進(jìn)行35輪PCR，然后在95℃下30秒，55℃下30秒，并在72℃下1分鐘。對探針進(jìn)行亞克隆，并通過DNA序列分析加以確定。
用于基底膜相關(guān)蛋白的探針是由與基底膜膠原蛋白相同的文庫擴(kuò)增的。引物獲自3’序列。對于HSPG核心蛋白來說，引物是(Noonan等，生物學(xué)化學(xué)雜志，263:16379-16387,1988)有義引物，5’CGGGCCACATTCTCC3’(序列5)；反義引物，5’GGAGTGGCCGTTGCATT3’(序列6)。對于層連蛋白B2來說，引物是(Sasaki和Yamada，生物學(xué)化學(xué)雜志，262:17111-17117,1987)有義引物，5’ACCAGTACCAAGGCGGA3’(序列7)；反義引物，5’TCATTGAGCTTGTTCAGG3’(序列8)。對于層連蛋白B1來說，引物是(Sasaki等，美國科學(xué)院院報(bào)，84:935-939,1987)有義引物，5’TAGAGGTTATTTTGCAGCAGA3’(序列9)；反義引物，5’TTGGATATCCTCATCAGCTTG3’(序列10)。對于巢蛋白來說，引物是(Mann等，EMBO雜志，8:65-72,1989)有義引物，5’GTGGTTTACTGGACAGACATC3’(序列11)；反義引物，5’CCAATCTGTCCAATAAAGG3’(序列12)。對于層連蛋白A鏈來說，引物是(Duetzmann等，歐洲生物化學(xué)雜志，177:35-45,1988)有義引物，5’ACACACTCCAAGCCCACAAAAGCAAG3’(序列13)；反義引物，5’GAGGGAAGACTCCTTGTAGGTCAA3’(序列14)。對于S-層連蛋白來說，引物是(Hunter等，自然，338:229-234,1989)有義引物，5’GCAGAGCGGGCACGGAGC3’(序列15)；反義引物，5’TGTACCTGCCATCCTCTCCTG3’(序列16)。PCR條件與用于上述Ⅳ型膠原蛋白鏈的條件相同。
用于MMP-2、Timp2和Timp3的探針是用獲自13天的小鼠胚胎的總RNA通過RT-PCR分離的。MMP-2的引物組擴(kuò)增來自mRNA的237bp的片段(Reponen等，生物學(xué)化學(xué)雜志，267:7856-7862,1992)，并包括上游引物5’CCCCTATCTACACCTACACCA3’(序列17)和下游引物5’TGTCACTGTCCGCCAAATAAA3’(序列18)。Timp-2的引物套擴(kuò)增mRNA的195bp的片段(Shimizu等，基因，114:291-292,1992)，并包括上游引物5’CAGAAGAAGAGCCTGAACCACA3’(序列19)和下游引物5’GTACCACGCGCAAGAACC3’(序列20)。Timp-3的引物套擴(kuò)增mRNA的337bp的片段(Apte等，發(fā)育動(dòng)力學(xué)，200:177-197,1994)，并包括上游引物5’GGTCTACACTATTAAGCAGATGAAG3’(序列21)和下游引物5’AAAATTGGAGAGCATGTCGGT3’(序列22)。對所有三種探針來說，按照生產(chǎn)商披露的方法用GibCo超級轉(zhuǎn)錄+逆轉(zhuǎn)錄酶和下游引物對1微克的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用PFU聚合酶(Strategene公司)對1/10的反應(yīng)物進(jìn)行40輪熱啟動(dòng)PCR。
TGF-β1探針是由H.L.Moses饋贈(zèng)的(Miller等，分子內(nèi)分泌學(xué)，3:1926-1934,1989)，所不同的是RNase保護(hù)需要人探針。對該探針來說，通過PCR擴(kuò)增來自人腎cDNA文庫(Clonetech,Palo Alto,CA)的24個(gè)堿基對的TGF-β1片段。所用的引物組是GCAGAAGTTGGCATGGTAG(序列23)(下游)和GGACATCAACGGGTTCACTA(序列24)(上游)。用PFU聚合酶(Stratagene)對該片段進(jìn)行再次擴(kuò)增，并平端連接到pBlueScript SK+質(zhì)粒上。
B．原位雜交首先通過心臟緩慢輸液對腎臟進(jìn)行固定(使用含有4％的低聚甲醛的PBS)。首先用Avertin(2,2,2-三溴乙醇，Aldrich化學(xué)公司，Milwalkee,WI)對動(dòng)物進(jìn)行深度麻醉。切開動(dòng)物的胸腔，并通過用結(jié)核菌素針穿孔，在右心室上形成一個(gè)小孔，以便讓灌注液流出。將連接在裝有輸注緩沖液的30毫升的注射器上的結(jié)核菌素針插入左心室的最高點(diǎn)。以每分鐘大約3毫升的速度，以每克體重1毫升固定液的用量輸入固定液。適當(dāng)固定的腎臟是堅(jiān)固的，并具有大理石般的外觀。在輸液之后，用虹膜鑷子取出腎囊，將腎臟縱向切成兩半(將腎盂、髓質(zhì)和皮質(zhì)一分為二)，并放入固定液中，在4℃下再固定1小時(shí)。將固定的兩半包埋在石蠟中，切成6微米的厚度，并轉(zhuǎn)移到SUPERFROST PLUS顯微鏡載玻片上(Fisher科學(xué)公司，Pittsburg,PA)，將所述載玻片放在載玻片加熱器上在60℃下烤20分鐘，并在4℃下保存待用(載玻片可以使用6周時(shí)間)。將取自對照和Alport同窩崽的腎并列包埋，以便控制在雜交過程中有可能出現(xiàn)的細(xì)微的差別。
將所述切片放入真空烘箱中在60℃下烤1小時(shí)，然后通過在二甲苯中連續(xù)3次進(jìn)行2分鐘的洗滌脫蠟。在乙醇中對所述組織進(jìn)行脫水，通過在0.2N氯化氫中培養(yǎng)15分鐘脫蛋白化，用PBS洗滌，并在37℃下用3微克/毫升的蛋白酶K(Boeringer Mannheim,Indianapolis,IN)消化10分鐘。通過用在PBS中配制的2毫克/毫升甘氨酸洗滌終止消化。然后在梯度乙醇溶液中對所述組織進(jìn)行脫水(分別在70％、80％、90％、100％的乙醇中，在室溫下脫水10分鐘)，按照披露于Genius原位雜交試劑盒(Boeringer Mannheim,Indianapolis,IN)中披露的方法對所述組織進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、和洗滌，對所述方法做了以下改進(jìn)。在預(yù)雜交和雜交溶液中添加了10毫克/毫升苯酚/氯仿提取的面包酵母tRNA。該步驟能顯著降低非專一信號。在雜交之后，在50℃下，在2×SSC中洗滌所述組織2次，然后在室溫下用RNaseA消化6分鐘。確定每一種探針的RNaseA的用量(在200ng/ml-5微克/毫升范圍內(nèi)波動(dòng))。陰性對照探針包括細(xì)菌β-半乳糖苷酶或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的編碼序列。所有探針的長度均大約為200個(gè)堿基，將其克隆到BlueScriptSK+(Stratagene公司，La Jolla,CA)的SacⅠ位點(diǎn)上，然后從T3一側(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄(在線性化之后)。唯一的區(qū)別是TGF-β1為974個(gè)堿基，并克隆到pmT載體上。
C．RNase保護(hù)試驗(yàn)按照試劑盒中所提供的方法用RPAⅡ試劑盒(Ambion公司，Austin,TX)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于一種探針來說，通過PCR由人腎cDNA文庫(Clonetech,Palo Alto,CA)擴(kuò)增264個(gè)堿基對的TGF-β1片段。引物組為GCA GAAGTTGGCATGGTAG(序列25)(下游)和GGACATCAACGGGTTCACTA(序列26)(上游)。用PFU聚合酶(Stratagene)對該片段進(jìn)行再次擴(kuò)增，并平端連接到BlueScript SK+質(zhì)粒(Stratagene)上。由T7啟動(dòng)子制備反義探針。
D．免疫熒光分析取出新鮮的腎臟，切成3毫米厚的截面，包埋在組織Tek OCT含水化合物(產(chǎn)品編號4583,Miles實(shí)驗(yàn)室，Elkhart,IN)中，并放入-150℃的冰箱中冷凍。用Microm型HM505N(Zeiss公司，Walldorf，德國)冷凍切片機(jī)將切片切成3微米的厚度，并在聚-L-賴氨酸-涂敷過的載玻片上解凍。將載玻片固定15分鐘，如果要用基底膜膠原專一性抗體染色的話，是通過浸泡在冷的(-20℃)95％的乙醇中進(jìn)行固定，如果是用對基底膜相關(guān)的蛋白專一的抗體染色的話，則在冷的(20℃)丙酮中固定。將載玻片風(fēng)干過夜，并在-80℃下保存待用。
讓樣品達(dá)到環(huán)境溫度，然后在室溫下用PBS(pH7.4)洗滌3次。為了用抗Ⅳ型膠原的抗體染色，要用0.1M甘氨酸和6M尿素(pH3.5)對該組織進(jìn)行預(yù)處理，以便使蛋白變性并暴露出抗原位點(diǎn)。將一級抗體的合適的稀釋液(根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定)加在所述樣品上，并讓其在潮濕的培養(yǎng)箱中在5℃下反應(yīng)3小時(shí)。用由PBS制備的5％的脫脂干奶(pH7.4)溶液稀釋抗體。脫脂干奶的使用能顯著降低背景熒光。在室溫下用PBS(pH7.4)洗滌樣品4次，每次10分鐘，以便除去所述一級抗體，然后與合適的FITC-綴合的二級試劑反應(yīng)。使用的所有二級試劑都是1∶100的稀釋液，用由PBS制備的7％的脫脂干奶作為稀釋劑。在4℃下讓二級試劑反應(yīng)2小時(shí)。用冷的PBS(pH7.4)洗滌載玻片4次，然后涂上抗退色安裝介質(zhì)(Vector實(shí)驗(yàn)室公司，Burlingame,CA)。用透明的指甲光亮劑將樣品密封在蓋玻片下面。以1000倍的放大倍數(shù)對載玻片進(jìn)行照相。對塑料包埋的樣品進(jìn)行Jones silver烏洛托品染色。
抗COL4A1和COL4A2鏈的山羊抗血清是從Southern生物技術(shù)公司(Birmingham,AL)購買的。生產(chǎn)商測試了這種抗體的交叉反應(yīng)性，并在腎小球上產(chǎn)生了一種染色模式，該染色模式與在抗所述鏈的其他抗體制劑上觀察到的模式吻合(Miner和Sanes，細(xì)胞生物學(xué)雜志，127:879-891,1994)?？沽蛩岣嗡氐鞍拙厶?HSPG)抗體是抗從EHS小鼠腫瘤中純化的HSPG核心蛋白的大鼠單克隆抗體。生產(chǎn)商通過Western印跡和斑點(diǎn)印跡免疫測定測定了所述抗體與層連蛋白、4型膠原蛋白、纖連蛋白、和巢蛋白的交叉反應(yīng)性(Chemicon International,Temecula,CA)，并披露于其他文獻(xiàn)中(Horiguchi，組織化學(xué)細(xì)胞化學(xué)雜志，37:961-970,1989)?？箤舆B蛋白-1抗體是兔抗血清。免疫原是從EHS基底膜中純化的，并且是從Sigma免疫化學(xué)公司(St.Louis,MO)購買的。由生產(chǎn)商(Sigma)進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡免疫試驗(yàn)證實(shí)了對4型膠原蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、和A、B、和C型硫酸軟骨素的交叉反應(yīng)性的缺乏?？估w連蛋白是抗從人血漿中純化的兔抗血清。生產(chǎn)商(Sigma免疫化學(xué)公司)通過斑點(diǎn)印跡免疫測定測定了對4型膠原蛋白、層連蛋白、玻連蛋白、和A、B、和C型硫酸軟骨素的交叉反應(yīng)性?？?巢蛋白是用EHS-衍生的巢蛋白作免疫原生產(chǎn)的大鼠單克隆抗體。該試劑是從Upstate生物技術(shù)公司(Lake Placid,NY)購買的，并通過Western印跡分析，測定合適的免疫反應(yīng)性以及對其他主要基底膜成分的交叉反應(yīng)性的缺乏(Ljubimov等，Exp.Cell Res.,165:530-540,1986)。
用連接了應(yīng)用成像Cytovision Ultra成像分析系統(tǒng)(應(yīng)用成像公司)的Olympus BH2RFLA熒光顯微鏡記錄并處理免疫熒光和Jones染色的圖象。用高分辨的黑白攝象機(jī)攝取圖象。用所述系統(tǒng)軟件修飾圖象。在處理這些圖象時(shí)，要加以小心，以便盡量接近在顯微鏡上直接觀察到的熒光。
E．免疫過氧化物酶檢測將免疫過氧化物酶檢測方法，用于腎小球中的TGF-β1的免疫染色以及用于管間隙中的纖連蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的免疫染色。Ⅰ型膠原蛋白的抗體是從Biogenesis公司(Sandown,AH)購買的兔抗小鼠抗體。以1∶100的稀釋比例將所述抗血清用于免疫過氧化物酶染色。用于所使用的纖連蛋白抗體與用于熒光染色的抗體相同(購自Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO的兔抗人纖連蛋白抗血清)，并且以1∶100的稀釋比例使用。二級試劑是購自Vector實(shí)驗(yàn)室(Burlingame,CA)的生物素化的抗兔抗體，并且以1∶100的稀釋比使用。將所述組織包埋在石蠟中(使用與原位雜交相同的方法)，并切成3微米的切片。用溶解在100mM Tris-HCl(pH7.4)中的5微克蛋白酶K(Boeringer Mannheim,Indianapolis,IN)對脫石蠟的切片進(jìn)行預(yù)處理，以便暴露出表位。通過在含有2毫克/毫升甘氨酸的PBS中培養(yǎng)30秒終止蛋白酶消化。用PBS洗滌脫蠟的、蛋白酶K處理過的組織3次，并在室溫下與所述一級抗體反應(yīng)1小時(shí)，用PBS洗滌3次，再在室溫下與生物素化的二級抗體反應(yīng)1小時(shí)。用PBS(pH7.4)洗滌3次，然后在室溫下用鏈霉親合素辣根過氧化物酶(3微克/毫升，Vector)培養(yǎng)載玻片30分鐘。用PBS洗滌3次，然后按照生產(chǎn)商披露的方法，用AEC底物系統(tǒng)(Vector AEC SK-4200,Vector實(shí)驗(yàn)室)顯現(xiàn)抗體結(jié)合。
對于TGF-β1來說，一級抗體是雞α-人TGF-β1(R&D系統(tǒng)，Minneapolis,MN)，使用時(shí)按1∶15稀釋，用含有7％脫脂干奶的PBS稀釋(將其用作所有抗體的稀釋劑)。在室溫下讓其至少反應(yīng)3小時(shí)，二級抗體是生物素標(biāo)記的山羊抗雞TGF-β1(Vector實(shí)驗(yàn)室，Burlingame,CA)，并以1∶100的稀釋比使用，并讓其反應(yīng)至少1小時(shí)。在經(jīng)過3次洗滌之后，用AEC試劑盒(Vector實(shí)驗(yàn)室，Burlingame,CA)進(jìn)行免疫過氧化物酶檢測。
實(shí)施例1Alport/α1整合蛋白雙突變型的生產(chǎn)常染色體形式的Alport綜合癥的小鼠模型，是通過早先披露的方法(Cosgrove等，基因發(fā)育，10:2981-2992,1996)對COL4A3前膠原基因進(jìn)行定向誘變產(chǎn)生的。該小鼠模型在本文中被稱為“Alport小鼠”，并且是從位于Bar Harbor,Maine的Jackson實(shí)驗(yàn)室購買的，保藏號為2908。這種α3(Ⅳ)敲除小鼠是129Sv/J背景的，讓它雜交(與純的129Sv進(jìn)行5次連續(xù)回交，然后與整合蛋白α1無效小鼠雜交，后者是純的129Sv)，以便產(chǎn)生“雙敲除”小鼠，它是純度超過97.5％的129Sv。這種α1敲除小鼠是由位于LaJ olla,CA的Scripps研究所的Humphrey Gardner提供的，并由Gardner等披露(發(fā)育生物學(xué)，175:301-313,1996)。
實(shí)施例2在小鼠模型中評估Alport腎病的發(fā)展在該實(shí)施例中研究的小鼠包括Alport小鼠，它不能表達(dá)膠原α3(Ⅳ)，而具有正常的α1整合蛋白(由位于Bar Harbor,Maine的Jackson實(shí)驗(yàn)室提供)；以及雙敲除小鼠(即雙突變型)，它不能表達(dá)膠原蛋白α3(Ⅳ)或整合蛋白α1。這種雙突變型的背景為97.5％的129Sv和2.5％的Sv/J。
每隔1周采集所述小鼠的尿液，并按方法部分所披露的方法進(jìn)行蛋白分析。如圖1所示，對于不能表達(dá)膠原蛋白α3(Ⅳ)，而具有正常的α1整合蛋白的動(dòng)物來說，Alport腎病發(fā)作的平均年齡(基于對6只動(dòng)物的研究)為3.5-4周，通過蛋白尿的發(fā)作測定。蛋白尿的發(fā)展很快，在6-6.5周齡達(dá)到最高含量。由于腎衰竭導(dǎo)致的平均死亡年齡為8-9周。這種基因型的動(dòng)物(試驗(yàn)了9只)無一能活過9周。在7-7.5周大時(shí)，血液尿氮含量(BUN)開始升高。在雙敲除突變型中(該測定中試驗(yàn)了4只動(dòng)物)，蛋白尿的發(fā)作是在5-5.5周齡時(shí)，并且發(fā)展的更緩慢一些，在9-9.5周達(dá)到最高值。由于腎衰竭導(dǎo)致的平均死亡年齡為15-16.5周。動(dòng)物在10-11周齡時(shí)產(chǎn)生較高的BUN。
實(shí)施例3雙敲除小鼠模型的鑒定用多種不同技術(shù)在4-7周齡時(shí)對3組不同的動(dòng)物(正常的對照，不能表達(dá)α3(Ⅳ)基因而具有正常的α1整合蛋白的動(dòng)物(Alport小鼠)和雙突變小鼠)進(jìn)行分析。
進(jìn)行透射電子顯微術(shù)，以便評估基底膜的完整性。在4周大時(shí)(資料未顯示)，Alport同窩崽在100％的腎小球毛細(xì)管回路中表現(xiàn)出稀少化的基底膜。雙突變型表現(xiàn)出某些腎小球基底膜(GBM)稀少化(即不規(guī)則的增厚、變薄、和開裂)，不過，這種現(xiàn)象不常見，而且程度不深。在雙突變型小鼠中大約有20％的腎小球根本就沒有明顯的基底膜稀少化。在該時(shí)間點(diǎn)，在Alport小鼠中大約有5％的腎小球發(fā)生了纖維化，而在雙突變型同窩崽中未發(fā)現(xiàn)纖維化的腎小球。圖2表示在7周齡時(shí)不同的小鼠所特有的腎小球基底膜損傷的程度。示出了一種典型的腎小球毛細(xì)管回路。在該發(fā)育時(shí)間點(diǎn)上，在Alport小鼠中，幾乎在所有的腎小球上的腎小球基底膜都受到嚴(yán)重?fù)p傷。圖2B中表示明顯的不規(guī)則地增厚和變薄，以及足細(xì)胞足突的嚴(yán)重消失。不過，在雙敲除小鼠中(圖2C)，大部分GBM的超級結(jié)構(gòu)正常，僅有少量的不規(guī)則性，并且足細(xì)胞足突保持正常的結(jié)構(gòu)(比較圖2A中所示的正常小鼠和圖2C所示雙敲除小鼠的用箭頭標(biāo)出的部分)。在該時(shí)間點(diǎn)上，Alport小鼠的30％-50％的腎小球纖維化，而在雙突變型小鼠中只有不到5％纖維化。
對7周齡小鼠進(jìn)行的掃描電子顯微術(shù)(資料未顯示)表明，Alport小鼠表現(xiàn)出足細(xì)胞足突的明顯膨大，破壞了所述細(xì)胞的正常的完美和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。在Alport腎小球性腎炎上披露過這種足突的消失。在雙突變型小鼠中，盡管其結(jié)構(gòu)并不完美，但它非常接近在對照小鼠上所觀察到的腎小球。所述足突膨大決定了腎小球過濾器的抑制，并導(dǎo)致尿毒癥。因此，考慮到雙突變型小鼠相對Alport同窩崽的改善了的腎小球功能，這一發(fā)現(xiàn)是重要的。
用Jones’方法對獲自7周齡小鼠的完整的腎臟進(jìn)行石蠟包埋，并統(tǒng)計(jì)纖維化的腎小球的總數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)。幾乎所有來自Alport小鼠的腎小球都在某種程度上受到影響。大多數(shù)表現(xiàn)出腎小球細(xì)胞過多和腎小球膜基質(zhì)的膨大，并有大約1/3纖維化。相反，來自雙突變小鼠的腎小球在腎小球基質(zhì)和細(xì)胞數(shù)量方面大多正常。大約有25％確實(shí)表現(xiàn)出腎小球膜細(xì)胞增殖的跡象，并有5％纖維化。用兩組不同的小鼠重復(fù)以上分析，得到了非常相似的結(jié)果。
用取自相同動(dòng)物的冷凍的腎皮質(zhì)進(jìn)行免疫熒光分析。讓該組織與對由于Alport腎病發(fā)展而在GBM中積累的已知蛋白專一的抗體反應(yīng)。其中包括層連蛋白-1(Lam-1)(使用1∶200的稀釋液)，膠原蛋白α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈(COL4A1,2)(使用1∶15的稀釋液)、纖連蛋白(Fib)(使用1∶200的稀釋液)、硫酸肝素蛋白聚糖(HSP)(使用1∶100的稀釋液)、以及巢蛋白(ent)(使用1∶200的稀釋液)。所有抗體都用含有7％脫脂干奶的PBS稀釋。結(jié)果如圖3所示。與對照相比，在7周齡時(shí)，在Alport小鼠的GBM中以上所有成分都明顯增加。在纖維化的腎小球中，以上所有成分都過量。在雙突變小鼠中，在非纖維化腎小球中對膠原α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈的免疫染色與Alport小鼠相當(dāng)。這是出乎預(yù)料的，因?yàn)樵陔p突變型小鼠的GBM中的Ⅳ型膠原的組成與Alport小鼠的相同(即完全由膠原蛋白α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈組成)。與Alport小鼠相比，在雙突變型小鼠的GBM中對層連蛋白-1和硫酸肝素蛋白聚糖的染色明顯減弱(分別比較圖3F和圖3E以及圖3L和圖3K)，而對雙突變型的GBM中的纖連蛋白沒有明顯染色(圖3I)，這種成分在Alport小鼠的GBM中含量豐富(圖3H)。在雙突變型小鼠和Alport小鼠之間所述蛋白在腎小球膜基質(zhì)中的免疫染色相當(dāng)，不過，對硫酸肝素蛋白聚糖來說，與正常對照(圖3J)或Alport小鼠(圖3K)相比，在雙突變型中的腎小球膜染色減弱(圖3L)。
用從7周大的正常、Alport、和雙突變小鼠身體上獲得的全腎皮質(zhì)中分離的RNA進(jìn)行Northern印跡分析。在瓊脂糖凝膠上對20微克的每一種RNA樣品進(jìn)行分離，通過毛細(xì)吸印轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并與相當(dāng)于小鼠TGF-β1 cDNA的部分的放射性標(biāo)記過的探針雜交。在經(jīng)過一系列高嚴(yán)格性的洗滌之后，用所述膜對X光膠片進(jìn)行曝光。圖9表示盡管TGF-β1在Alport小鼠中得到誘導(dǎo)(從左邊數(shù)第4泳道與作為對照的第2泳道比較)，但在具有α1整合蛋白突變的Alport小鼠(雙敲除小鼠)中不能誘導(dǎo)(從左邊數(shù)第3泳道與作為對照的從左邊數(shù)第2泳道比較)。正是由于這一資料使得研究者推測α1抑制劑的作用是否可以通過抑制TGF-β1調(diào)節(jié)。因此，為了澄清這一問題，進(jìn)行了下面的TGF-β1抑制劑試驗(yàn)。
實(shí)施例4TGF-β1在蛋白尿以后的Alport腎病發(fā)展中的作用收獲來自129Sv/J建立者動(dòng)物(founder animal)回交到C57B1/6背景上的F-2的組織(參見上文)。至少重復(fù)該試驗(yàn)2次(用獲自兩組不同動(dòng)物的樣品)。本文所提供的結(jié)果是明確的，并且是一致。
進(jìn)行以上試驗(yàn)是為了說明兩個(gè)問題。首先，在TGF-β1 mRNA和編碼由于Alport腎病發(fā)展而積累的基質(zhì)蛋白的mRNA的誘導(dǎo)之間是否存在時(shí)間上的關(guān)系，其次，在腎小球中所述mRNA是否確實(shí)被誘導(dǎo)？(由于腎小球僅占腎臟濕重的5％，在總的腎皮質(zhì)中特定mRNA的誘導(dǎo)與腎小球性腎炎的漸進(jìn)性纖維化的關(guān)系更密切)。
從第6周開始每隔2周從Alport動(dòng)物和對照同窩崽的腎臟中分離總的RNA，在第12周時(shí)結(jié)束。用于本研究的F2小鼠在大約5.5-6周齡時(shí)開始蛋白尿(資料未顯示)。在變性的瓊脂糖凝膠上分離RNA，轉(zhuǎn)移到尼龍支持物上，并用對α1(Ⅳ)或α2(Ⅳ)膠原鏈、巢蛋白、層連蛋白β1或β2鏈、纖連蛋白或TGF-β1專一的放射性標(biāo)記過的探針檢測。圖4中的結(jié)果說明，在Alport小鼠模型中在蛋白尿發(fā)作之后，除了層連蛋白β1之外，以上所有蛋白的mRNA都被誘導(dǎo)。
與此同時(shí)，還對層連蛋白α1、層連蛋白β2、層連蛋白γ1、硫酸肝素蛋白聚糖核心蛋白和膠原蛋白α4(Ⅳ)和α5(Ⅳ)鏈進(jìn)行Northern印跡(資料未顯示)。對照和所述突變型相比，以上所有其他基底膜蛋白的mRNA含量沒有明顯差別。
用磷成像儀對所述Northern分析的結(jié)果進(jìn)行分析，以便對在所述時(shí)間過程中特定mRNA表達(dá)的相對變化進(jìn)行直接定量。圖5表示特定mRNA水平的誘導(dǎo)在6周齡時(shí)第1次顯著，或者說這一時(shí)間大體上是在F2小鼠中尿液中的蛋白達(dá)到最高含量的時(shí)間(Cosgrove等，基因發(fā)育，10:2981-2992,1996)。到8周時(shí)，mRNA水平達(dá)到最高，編碼TGF-β1和纖連蛋白的mRNA的誘導(dǎo)倍數(shù)分別超過對照小鼠6.6倍和9.4倍。到第8周時(shí)，編碼膠原蛋白α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)和巢蛋白的mRNA水平被誘導(dǎo)了大約3倍。相反，通過用相同的總的RNA Northern印跡進(jìn)行的測定證實(shí)在腎病發(fā)展的任何時(shí)間編碼層連蛋白β1和β2鏈的mRNA都沒有明顯變化。
為了證實(shí)在特定腎小球細(xì)胞類型中編碼TGF-β1或不同基底膜成分的mRNA得到誘導(dǎo)，用對所述mRNA專一的洋地黃毒苷標(biāo)記過的反義探針進(jìn)行原位雜交。在向心臟中輸注含有4％低聚甲醛的PBS之后，從10周大的F2 Alport小鼠體內(nèi)收獲腎臟。并按照在方法部分所述進(jìn)行原位雜交分析。反義探針對膠原蛋白α1(Ⅳ)的NC1域、TGF-β1、纖連蛋白、巢蛋白、或?qū)舆B蛋白β1鏈專一。將對細(xì)菌β-半乳糖苷酶專一的探針用作非特異結(jié)合的對照(陰性對照)，因?yàn)樵撎结槻荒芘cNorthern印跡上的小鼠腎的總RNA雜交(資料未顯示)。所述對照探針與每一種特異性探針同時(shí)進(jìn)行雜交，并用相同濃度的RNaseA按照雜交方法進(jìn)行處理。以0.25微克/毫升的濃度用RNaseA對α1(Ⅳ)、TGF-β1和纖連蛋白進(jìn)行處理，而巢蛋白和層連蛋白β1的處理濃度為3微克/毫升。結(jié)果如圖6所示。
圖6的結(jié)果表明，對于所有檢驗(yàn)過的特定mRNA來說，在COL4A3敲除小鼠(Alport小鼠)的腎小球的內(nèi)臟上皮細(xì)胞足細(xì)胞中明確觀察到含量的提高。對于膠原α1(Ⅳ)鏈來說，在對照動(dòng)物的腎小球膜細(xì)胞和腎小球的內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到mRNA的表達(dá)(圖6A)，這一結(jié)果與該分析存在于成熟的動(dòng)物中吻合。在突變型中，在腎小球基質(zhì)中的表達(dá)有可能提高，表現(xiàn)為在與對照樣品的腎小球膜細(xì)胞染色相比時(shí)其染色更深，不過，對照和突變型的最明顯的差別是位于腎小球周圍的染色細(xì)胞環(huán)，相當(dāng)于足細(xì)胞(圖6B)。在對照腎小球中纖連蛋白的表達(dá)主要出現(xiàn)在腎小球膜細(xì)胞中(圖6D)。盡管在突變型中也出現(xiàn)了腎小球膜細(xì)胞的染色，所述足細(xì)胞明顯表現(xiàn)出較高含量的纖連蛋白mRNA(圖6E)。在對照動(dòng)物的腎小球中TGF-β1的表達(dá)很微弱，不過，在對照動(dòng)物的腎小球膜細(xì)胞中觀察到某些特異性染色(圖6G)。在突變型中，腎小球膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、以及足細(xì)胞中TGF-β1mRNA的水平明顯提高(圖6H)。對于巢蛋白來說，mRNA在于對照的足細(xì)胞中，這一點(diǎn)是出乎預(yù)料的，因?yàn)檫@種蛋白專一性地存在于GBM上。出人預(yù)料的是，在對照動(dòng)物中出現(xiàn)了某些腎小球膜細(xì)胞的特異性染色。盡管在突變型中內(nèi)臟上皮細(xì)胞的染色似乎表明表達(dá)的增強(qiáng)，但這并不是定量的測定，并且對照和突變型之間的差別太小以至于無法確認(rèn)(比較圖6J和6K)。
Northern印跡發(fā)現(xiàn)，在以上時(shí)間過程中，在對照和突變小鼠體內(nèi)層連蛋白β1鏈的mRNA水平未改變。對相同信息所做的原位雜交分析證實(shí)了在對照腎臟的腎小球中預(yù)期的腎小球膜細(xì)胞特異性定位(圖6M)。不過，在源于突變型小鼠的腎小球中，內(nèi)臟上皮細(xì)胞中的mRNA明顯受到誘導(dǎo)(圖6N)。
在3周和5周大時(shí)采集組織樣品，并用相同的探針通過原位雜交進(jìn)行分析。在所述腎小球中的染色形式與正常同窩崽的沒有差別(資料未顯示)。這表明所述基因在足細(xì)胞中的激活發(fā)生在蛋白尿發(fā)作之后。
基于用對所述細(xì)胞因子活性異構(gòu)形式專一的抗體進(jìn)行的免疫過氧化物酶檢測所獲得的TGF-β1蛋白資料證實(shí)了通過對TGF-β1 mRNA進(jìn)行原位雜交所獲得的資料(比較圖7B和圖7A的免疫染色)。這表明，在足細(xì)胞中TGF-β1 mRNA的較高的表達(dá)水平能翻譯成較高的蛋白。
進(jìn)行RNase保護(hù)分析，以便確定在源于Alport和對照患者的人腎皮質(zhì)中所述細(xì)胞因子的mRNA的水平是否也提高了。人Alport腎皮質(zhì)是在移植手術(shù)期間從15歲的男孩體內(nèi)取出的。該樣品受到了中等程度的損害，有大約50％的腎小球纖維化。馬上取出所述樣品，并在液氮中快速冷凍。正常的人腎RNA是從Clonetech(Palo Alto,CA)購買的，并且是從正常人體上獲得的庫存樣品。用與從小鼠腎中分離RNA相同的方法從所述Alport樣品中分離RNA。通過在瓊脂糖凝膠上分離10微克樣品，并用溴化乙錠對該凝膠進(jìn)行染色(每毫升水10微克)，檢查所述RNA的完整性。根據(jù)28S和18S核糖體RNA帶的相對量來看，正常的和Alport樣品都是完整的。按照所述方法進(jìn)行RNase保護(hù)試驗(yàn)。圖8中的資料表明與對照相比，人Alport腎皮質(zhì)中TGF-β1mRNA的水平提高了3-4倍。這證實(shí)了所述細(xì)胞因子在人Alport腎中也是超量表達(dá)的。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了這樣的預(yù)期，即該技術(shù)可用于人類。
實(shí)施例5用中和抗體抑制α1β1整合蛋白為了說明一種可溶性試劑能夠抑制α1β1整合蛋白與其配體的相互作用，并能對Alport腎病病理學(xué)產(chǎn)生與α1基因敲除突變相同的作用，作為一種例子，獲得了披露于Fabbri等，組織抗原，48:47-51,1996中的抗體。從2周齡開始注射這種抗體(注射量為400ng/注射，每周3次，腹膜內(nèi)注射)到Alport小鼠體內(nèi)。在6周齡時(shí)收集動(dòng)物，并通過透射電子顯微術(shù)分析基底膜。如圖10所示，在這些處理過的動(dòng)物體內(nèi)的基底膜大多是規(guī)則的，具有正常的三層外觀。由于對所述抗體的免疫反應(yīng)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞的膨大。這些結(jié)果表明，一種能夠抑制整合蛋白α1β1的受體的可溶性制劑，能延緩Alport GBM疾病的發(fā)展，在很大程度上與在雙敲除小鼠品系上觀察到的情況相同。
實(shí)施例6在Alport(129Sv/J)小鼠模型中單獨(dú)用TGF-β1抑制的效應(yīng)試驗(yàn)方法是，從3周齡開始每周2次注射FK506(2微克/克體重，腹膜內(nèi)注射，F(xiàn)ujisawa藥物有限公司，大阪，日本)，或可溶性TGF-β1受體(25微克/注射，通過尾靜脈進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，Biogen公司，劍橋，MA)。在7周齡時(shí)收獲腎臟，并進(jìn)行所述分析。
在圖11中示出了在各種條件下的基底膜超級結(jié)構(gòu)的透射電子顯微鏡分析。圖11A表示來自正常未處理動(dòng)物的腎小球毛細(xì)管回路。注意規(guī)則的足突和三層基底膜染色。圖11B表示來自典型的7周大的129Sv/JAlport小鼠的毛細(xì)管回路。注意膨大的足突和GBM的明顯的局部增厚。圖11C表示來自用FK506處理過的7周大的Alport動(dòng)物的典型的毛細(xì)管回路。明顯缺乏基底膜的增厚，這表明所述藥物能夠降低GBM中基質(zhì)的積累速度。不過，在足突中有明顯程度的膨大，明顯缺乏足突的結(jié)構(gòu)。在注射了TGF-β1可溶性受體的小鼠上進(jìn)行相同的觀察(圖11D)。以上資料表明，TGF-β1抑制劑能抑制不規(guī)則的GBM增厚，但不能抑制與發(fā)展的Alport GBM病相關(guān)的足突的結(jié)構(gòu)的改變。
對某些腎臟樣品進(jìn)行處理，以便進(jìn)行掃描電子顯微鏡分析。通過對腎皮質(zhì)進(jìn)行冷凍破裂，暴露出腎小球。這樣做可以去掉Bowman’s囊，暴露出足細(xì)胞的外層，因?yàn)樵撏鈱痈采w腎小球的毛細(xì)管回路。正常的腎小球示于圖12A中，其中，足細(xì)胞的復(fù)雜結(jié)構(gòu)是很明顯的，因?yàn)榉种У淖阃话鼑?xì)管回路.在典型的7周齡Alport小鼠上，在腎小球中的足細(xì)胞表面上明顯缺乏細(xì)小的纖維狀分支，這些分支由于膨大而消失了(圖12B)。在用FK506或TGF-β1的可溶性受體處理過的Alport動(dòng)物上，腎小球的表面看上去與未處理過的Alport小鼠十分相同(圖12C)。該圖明顯表明，僅抑制TGF-β1不能避免與發(fā)展的Alport腎小球疾病相關(guān)的足突結(jié)構(gòu)的改變。
通過對在藥物治療期間每周1次采集的冷凍尿液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白尿。如上文所述，尿液中白蛋白的存在和含量的超標(biāo)，可以對腎小球過濾器的完整性作出綜合評估。圖13表明，盡管給藥TGF-β1抑制劑延緩了蛋白尿的發(fā)作，但尿液中高水平白蛋白的發(fā)展，發(fā)生的非常迅速(1周)。以上結(jié)果表明，單獨(dú)使用TGF-β1抑制劑，雖然能夠延緩蛋白尿的發(fā)作，但不能改善腎小球過濾器。這一特性很可能與這種抑制劑不能抑制上文在圖11和12中所示的足細(xì)胞的足突消失直接相關(guān)。
應(yīng)當(dāng)指出的是，給正常的同窩崽給藥藥物，不會(huì)產(chǎn)生與未注射過的正常小鼠有明顯差別。
例7TGF-β1抑制劑對雙敲除(DKO)小鼠的作用從4周齡開始，給小鼠(在膠原蛋白α3(Ⅳ)和整合蛋白α1基因上都是無效的DKO小鼠)注射TGF-β1抑制劑FK506(2微克/克體重，每周2次，腹膜內(nèi)注射)或Biogen’s TGF-β1可溶性受體(25微克/注射，每周2次，靜脈內(nèi)注射)。在10周大時(shí)取得腎臟并進(jìn)行分析。選擇10周這一時(shí)間點(diǎn)，是因?yàn)樵陔p敲除小鼠上(疾病通常發(fā)展到可以觀察到GBM的明顯不規(guī)則增厚，并且該動(dòng)物開始向腎衰竭的晚期發(fā)展。因?yàn)椋绻鸗GF-β1抑制劑是要提供額外的保護(hù)作用，這種作用在GBM疾病發(fā)展的這一時(shí)期應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出來。透射電子顯微鏡分析證實(shí)了在注射了抑制劑的小鼠和未處理過的雙敲除小鼠之間非常明顯、并且一致的差別。這種差別的一個(gè)典型例子如圖14所示。圖14B表示10周大的雙敲除小鼠上的腎小球毛細(xì)管回路的典型特征。很突出的是由發(fā)展的Alport腎小球性腎炎的基底膜增厚特征所表現(xiàn)出的明顯的囊。即使是在病態(tài)的發(fā)展階段，足細(xì)胞的足突也具有高度規(guī)則的結(jié)構(gòu)，具有發(fā)育良好的開裂的隔膜。雙敲除小鼠的這一特征是Alport小鼠所不具備的(比較圖12B所示的足突)。
在用TGF-β1抑制劑處理雙敲除小鼠時(shí)，局部GBM增厚和足突消失都明顯減弱(圖14C是用FK506處理的，而圖14D是用可溶性TGF-β1受體處理的)。盡管大多數(shù)腎小球的GBM不具備完全正常的超級結(jié)構(gòu)(注意圖14D中出現(xiàn)的中等程度的GBM不規(guī)則性)，在該發(fā)育階段完全缺乏在未處理過的雙敲除動(dòng)物的大多數(shù)腎小球毛細(xì)管回路中出現(xiàn)的顯著的GBM增厚囊(如圖14B所示)。在用這種方法檢查的腎小球中大約有25％能用TGF-β1抑制劑將腎小球超級結(jié)構(gòu)恢復(fù)到與正常小鼠的DKO腎小球沒有區(qū)別的程度(圖15A表示10周齡正常小鼠的GBM；圖15B表示用FK506處理過的10周齡雙敲除小鼠的GBM)?？紤]到這是在未處理過的Alport動(dòng)物模型腎衰竭晚期平均年齡之后2周，這確實(shí)是一個(gè)獨(dú)特的、并且是重要的發(fā)現(xiàn)。
在處理過程中，檢查每周所采集的所述相同小鼠的蛋白尿。通過在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分析樣品(大體上相當(dāng)于1/2微升)。通過用考馬斯蘭染色顯示白蛋白。圖16的結(jié)果說明與未處理過的雙敲除小鼠相比(圖16A)，用FK506(圖160)或TGF-β1的可溶性受體(圖16B)處理能明顯改善腎小球過濾器的功能。圖16C表示用FK506處理過的正常小鼠的尿蛋白。注意在用FK506處理過的正常和DKO(圖16D)小鼠上，在任何時(shí)間點(diǎn)都出現(xiàn)的一組模糊的帶。這種現(xiàn)象在用所述藥物處理的小鼠中經(jīng)常觀察到，有可能與在移植之后用所述藥物治療的某些患者上所報(bào)導(dǎo)的腎中毒效應(yīng)相關(guān)(Solez等，移植，66:1736-1740,1998)。
例8α1整合蛋白抑制劑和TGF-β1抑制劑延緩Alport腎小球性腎炎發(fā)作和發(fā)展的協(xié)同作用的機(jī)制圖11、12和14的資料綜合表明，α1整合蛋白抑制劑能與TGF-β1抑制劑協(xié)同起作用的原因是，α1抑制能導(dǎo)致改善了的足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)，而TGF-β1抑制能導(dǎo)致GBM中基質(zhì)沉積的減少。圖17是為了進(jìn)一步證實(shí)α1整合蛋白抑制劑在改善足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)方面的作用。與圖12所示相同的方法制備腎皮質(zhì)。圖17A表示來自7周齡正常小鼠的腎小球的表面。圖17B表示來自7周齡Alport小鼠的腎小球。注意由于足突的消失而導(dǎo)致的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的消失。圖17C表示7周齡雙敲除小鼠的腎小球表面。注意幾乎完全恢復(fù)了正常的足突結(jié)構(gòu)。以上資料與圖14B所示由透射電子顯微術(shù)所提供的橫切面視圖吻合，其中，在雙敲除小鼠上的足突具有完美的形態(tài)。
實(shí)施例9α1整合蛋白抑制作用在檢驗(yàn)這種現(xiàn)象的一種似乎合理的機(jī)制時(shí)，對層連蛋白鏈進(jìn)行了評估。由于已知存在于腎小球基底膜中的主要的層連蛋白是層連蛋白11(Miner等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，137:65-701,1997)，據(jù)信，Alport GBM中新型層連蛋白的出現(xiàn)，有可能導(dǎo)致了結(jié)合在GBM上的足細(xì)胞的消失。實(shí)際上，在檢查Alport GBM的層連蛋白組成時(shí)，在Alport小鼠的GBM上發(fā)現(xiàn)了正常情況下僅存在于正常小鼠的腎小球膜基質(zhì)中的層連蛋白α2鏈。圖18表示用雙熒光標(biāo)記方法免疫染色的腎小球的一系列照片。
在雙熒光分析中，將新鮮的腎皮質(zhì)包埋在Tissue Tek含水包埋化合物中，快速冷凍，并在冷凍切片機(jī)上切成4微米的厚度。在冷的(-20℃)100％的丙酮中對載玻片進(jìn)行后固定10分鐘，然后空氣干燥過夜。通過在PBS中洗滌3次，每次10分鐘，對組織進(jìn)行重新水合。將一級抗體與7％的脫脂干奶(BioRad)一起稀釋。以1∶200的稀釋比例將抗一巢蛋白抗體(Chemicon公司)用作腎小球基底膜的已知標(biāo)記。層連蛋白α2鏈專一性抗體是由Peter Yurchenco博士(Robert Wood Johnson醫(yī)學(xué)院，Piscataway,NJ)贈(zèng)送的。這種抗體對層連蛋白α鏈的專一性披露于Cheng等，生物學(xué)化學(xué)雜志，272:31525-31532,1997中。所述抗體以1∶10的濃度使用。在4℃下，在潮濕的培養(yǎng)皿中讓一級抗體反應(yīng)過夜。用冷的PBS洗滌載玻片3次，每次10分鐘，然后與二級抗體反應(yīng)，二級抗體也是一起加入的。層連蛋白α2的二級抗體是Texas紅偶連的抗兔抗體，而巢蛋白的二級抗體是FITC-偶連的抗大鼠抗體，這兩種抗體都以1∶100的比例使用(Vector實(shí)驗(yàn)室，Burlingame,CA)。讓二級試劑在4℃下反應(yīng)4小時(shí)。用PBS洗滌載玻片3次，每次10分鐘，在用蓋玻片密封之前加一滴Vectashield抗退色安裝介質(zhì)(Vector實(shí)驗(yàn)室，Burlingame,CA)。用連接了Cytovision Ultra成像分析系統(tǒng)(應(yīng)用成像公司)的BH-2落射熒光顯微鏡對每一種抗體的圖象進(jìn)行數(shù)字化顯示。
腎小球基底膜專一性抗原(巢蛋白)是綠色的，而層連蛋白α2鏈?zhǔn)羌t色的。在同時(shí)存在巢蛋白和層連蛋白α2的地方的染色是黃色的。在圖18的Ⅰ組中，照片A表示來自7周齡正常小鼠的腎小球的免疫染色。在這里，層連蛋白α2僅存在于腎小球膜基質(zhì)中。照片B表示7周齡Alport同窩崽的染色。箭頭表示主要染成黃色的毛細(xì)管回路，說明在Alport小鼠中，層連蛋白α2同時(shí)存在于腎小球膜基質(zhì)和腎小球基底膜中。照片C表示來自用FK506處理過的129Sv/J Alport小鼠的腎小球的免疫染色(皮質(zhì)取自用于上述實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物，并且是用于上述實(shí)驗(yàn)并且示于圖11、12和13中的動(dòng)物)。在這里，大多數(shù)腎小球毛細(xì)管回路也是黃色的，表明抑制TGF-β1的活性不能阻止層連蛋白α2在Alport小鼠的GBM中積累。不過，在7周齡雙敲除小鼠中，在腎小球毛細(xì)管回路中沒有層連蛋白α2免疫染色(照片D，箭頭)。位于足細(xì)胞表面的主要的整合蛋白受體是整合蛋白α3β1(Patey等，細(xì)胞粘接和通信，2:159-167,1994)。這種整合蛋白被普遍認(rèn)為在足細(xì)胞與GBM的結(jié)合和維持正常的足突結(jié)構(gòu)方面起著重要作用(Smoyer和Mundel，分子醫(yī)學(xué)雜志，76:172-183,1998)。作為一種例子，最近證實(shí)了敲除整合蛋白α3基因會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)的完全消失(Kreidberg等，發(fā)育，122:3537-3547,1996)。最近，生產(chǎn)出了一種可溶性α3β1整合蛋白受體，并證實(shí)能以高的親合力結(jié)合含有層連蛋白α5鏈的層連蛋白(如層連蛋白11，它是由α5、β2和γ1鏈組成的異源三聚體)，但不能結(jié)合含有α2鏈的層連蛋白(Eble等，生物化學(xué)，37:10945-10955,1998)。綜合以上信息，本文所提供的資料支持一種模型，其中，在Alport小鼠上，含有層連蛋白α2鏈的層連蛋白在GBM中的逐漸沉積，會(huì)導(dǎo)致通過整合蛋白α3β1受體進(jìn)行的粘接的減弱，導(dǎo)致足突的消失。抑制整合蛋白α1鏈，會(huì)導(dǎo)致層連蛋白α2鏈在GBM中沉積的減少或缺乏，避免正常足突結(jié)構(gòu)的消失。
為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，以與正常同窩崽比較的形式對層連蛋白α2鏈在2周齡Sv/J Alport小鼠中的分布進(jìn)行了評估。在GBM疾病發(fā)展的如此早的階段，就有明顯的GBM增厚“囊”稀疏地分散在大約一半腎小球上。在圖19B中示出了一個(gè)這樣的GBM增厚的囊。在該發(fā)育階段，在腎小球的未受影響的部位的GBM和足細(xì)胞足突在形態(tài)上是正常的，不過，在局部增厚部位足突膨大并消失，更像是在GBM疾病發(fā)展的晚期所出現(xiàn)的更普遍的變化。據(jù)推測，如果層連蛋白α2的沉積導(dǎo)致了與足細(xì)胞的局部粘接接觸的喪失的話，就可以在2周齡Alport小鼠上觀察到層連蛋白α2在GBM中的局部沉積。這正是在圖18的Ⅱ組中所表示的情況。照片B上的箭頭表示層連蛋白α2在2周齡Alport小鼠的GBM中的沉積。這是能在Alport小鼠模型上檢測到的最早的分子變化(而不是4型膠原組成的變化，這種變化是由先天性遺傳突變產(chǎn)生的)，并與可檢測的GBM損傷的發(fā)作完全吻合。
實(shí)施例10TGF-β1抑制劑與α1整合蛋白抑制劑的協(xié)同效應(yīng)如圖3所示，由于Alport腎病的發(fā)病而導(dǎo)致的在GBM和間質(zhì)中積累的基質(zhì)包括膠原蛋白α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)鏈、纖連蛋白和巢蛋白。如圖20所示(每一塊凝膠的頭兩個(gè)泳道)，相對正常的對照而言，在Alport腎臟中，編碼所述每一種蛋白的mRNA都得到誘導(dǎo)。注射TGF-β1抑制劑能明顯減弱誘導(dǎo)的程度(圖20，凝膠的最后兩個(gè)泳道)，這可能是在用TGF-β1抑制劑處理過的Sv/J Alport小鼠上觀察到的基底膜增厚減弱的原因(如圖11所示)。
用獲自未處理過的或注射了TGF-β1抑制劑的雙敲除小鼠的腎臟的RNA進(jìn)行一組類似的Northern印跡。所述小鼠與用于獲得圖14所示資料的小鼠相同，因此藥物注射方案如例7所述。從圖21所示資料可以看出，在比較未注射過的對照和雙敲除小鼠時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)給藥TGF-β1抑制劑不會(huì)明顯改變編碼基質(zhì)蛋白的mRNA的水平。不過，對編碼加到探針上的金屬蛋白酶抑制劑Timp-3的mRNA的表達(dá)有明顯影響(圖21，下面一排)。如泳道1和2所示，與對照小鼠相比，在10周齡未處理過的雙敲除小鼠的腎臟中Timp-3的表達(dá)明顯減弱(根據(jù)磷成像分析，有9倍的差別)。在注射了FK506(泳道3和4)或TGF-β1可溶性受體(泳道5和6)的雙敲除小鼠上未發(fā)現(xiàn)這種Timp-3的表達(dá)的減弱。在Sv/J小鼠上觀察到了對Timp-3表達(dá)的相同影響(圖20，下面一排)，表明在Alport小鼠中抑制Timp-3 mRNA抑制的能力是由TGF-β1抑制抑制劑產(chǎn)生的，而不是由α1整合蛋白和TGF-β1的雙重抑制產(chǎn)生的。
這一觀察的在功能上的重要性是基于這樣的事實(shí)Timp-3是基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)劑，并且被認(rèn)為在腎基底膜體內(nèi)平衡和疾病中體內(nèi)平衡的喪失方面起著重要作用(Esposito等，Kidney Int.50:506-514,1996；和Elliot等，J.Am.Soc.Nephrol.,10:62-68,1999).Timp-3金屬蛋白酶抑制劑表達(dá)的減弱可以導(dǎo)致金屬蛋白酶活性的相應(yīng)增強(qiáng)。這種增強(qiáng)可能導(dǎo)致基底膜的損傷，導(dǎo)致TGF-β1的激活，并同時(shí)導(dǎo)致基質(zhì)的積累。因此，打破這種循環(huán)可以導(dǎo)致基底膜體內(nèi)平衡的恢復(fù)，這種恢復(fù)表現(xiàn)為6BM形態(tài)學(xué)的恢復(fù)，這正是所觀察到的情況(圖11、14和15)。
實(shí)施例11在用TGF-β1抑制劑處理的雙敲除小鼠中抑制間質(zhì)纖維化
TGF-β1在基質(zhì)蛋白的上調(diào)和腎纖維化中的作用業(yè)已研究的十分清楚(Yand等，J.Am.Soc.Nephrol.,5:1610-1617,1994；Border和Ruoslahti，臨床研究雜志，90:1-7,1992)。在雙敲除小鼠中，腎間質(zhì)纖維化被推遲，而在大約10周齡時(shí)未能廣泛擴(kuò)散，并且在大約15周齡時(shí)發(fā)展到腎衰竭的晚期。用三種標(biāo)記對注射了TGF-β1抑制劑的動(dòng)物的間質(zhì)纖維化進(jìn)行分析，并與未用抑制劑處理過的10周齡雙敲除動(dòng)物直接進(jìn)行比較。使用在例7中用于制備圖14的相同方法給動(dòng)物注射。對于圖22、23和24來說，照片A是對照，照片B是未處理過的雙敲除小鼠，照片C是用FK506處理過的雙敲除小鼠，而照片D是用TGF-β可溶性受體處理過的雙敲除小鼠。這些附圖都表示腎皮質(zhì)的50倍的低倍放大視圖。圖22是Jones silver烏洛托品染色，它是基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)組織化學(xué)染色?？梢钥闯?，在未處理小鼠的腎皮質(zhì)的間質(zhì)中積累了基質(zhì)(比較照片B和照片A)。不過，來自用任一種TGF-β1抑制劑處理過的動(dòng)物的腎皮質(zhì)與對照沒有差別，表現(xiàn)出少有至沒有纖維化。常用的腎間質(zhì)纖維化的分子標(biāo)記包括1型膠原蛋白和纖連蛋白(Yamamoto等，Kidney Int.,45:916-927,1994)。圖23表示1型膠原蛋白的免疫染色。很顯然，在未處理過的動(dòng)物的腎皮質(zhì)間質(zhì)中有1型膠原蛋白的積累(比較照片B和照片A中的對照)。圖23中的照片B和C表示來自分別用FK506或可溶性受體處理過的雙敲除小鼠的腎臟中的1型膠原積累的相對缺乏。對于纖連蛋白來說情況也是這樣，纖連蛋白在未處理過的雙敲除小鼠的皮質(zhì)中含量豐富(圖24B)，并且更像是在注射了TGF-β1抑制劑的小鼠的腎皮質(zhì)對照(圖24照片C和D)?？傊?，以上資料表明，TGF-β1抑制劑與整合蛋白α1抑制劑的組合能夠在Alport小鼠模型上抑制(或延緩)間質(zhì)纖維化。
本文所引用的所有文獻(xiàn)、專利、專利申請和出版物都被收作本說明書的參考文獻(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，盡管上面業(yè)已結(jié)合特定的實(shí)施方案和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了說明，但本發(fā)明并不一定局限于此，并且在不超出本申請發(fā)明范圍的前提下，可以對所述實(shí)施方案、實(shí)施例和用途進(jìn)行改進(jìn)，以便提出多種其他的實(shí)施方案、實(shí)施例和用途。
序列表<110>BOYS TOWN NATIONAL RESEARCH HOSPITAL<120>USE OF alBl INTEGRIN RECEPTOR INHIBITORS AND TGF-BlINHIBITORS IN THE TREATMENT OF KIDNEY DISEASE<130>249.00010230<140>PCT/US99/11073<141>1999-05-19<150>60/086,587<151>1998-05-22<150>09/088,766<151>1998-06-02<150>09/150,485<151>1998-09-09<160>26<170>PatentIn Ver. 2.0<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>1tctgtggacc atggcttc 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>2ttctcatgca cacttggc 18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>3ggctacctcc tggtgaag 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>4ttcatgcaca cttggcag 18<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>5cgggccacat tctcc 15<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>6ggagtggccg ttgcatt17<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>7accagtacca aggcgga17<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>8tcattgagct tgttcagg 18<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>9tagaggttat tttgcagcag a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>10ttggatatcc tcatcagctt g 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>11gtggtttact ggacagacat c21<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>12ccaatctgtc caataaagg 19<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>13acacactcca agcccacaaa agcaag 26<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>14gagggaagac tccttgtagg tcaa 24<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400> 15gcagagcggg cacggagc18<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>16tgtacctgcc atcctctcct g 21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>17cccctatcta cacctacacc a 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>18tgtcactgtc cgccaaataa a 21<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>19cagaagaaga gcctgaacca ca 22<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>20gtaccacgcg caagaacc 18<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>21ggtctacact attaagcaga tgaag 25<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>22aaaattggag agcatgtcgg t 21<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>23gcagaagttg gcatggtag 19<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>24ggacatcaac gggttcacta 20<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>25gcagaagttg gcatggtag 19<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>26ggacatcaac gggttcacta 20
權(quán)利要求
1．一種限制患者的腎疾病的方法，包括給患者給藥有效量的α1β1整合蛋白受體抑制劑。
2．如權(quán)利要求1的方法，還包括給所述患者給藥有效量的TGF-β1抑制劑。
3．如權(quán)利要求2的方法，其中，同時(shí)給藥所述α1β1整合蛋白受體抑制劑和TGF-β1抑制劑。
4．如權(quán)利要求2的方法，其中，所述TGF-β1抑制劑不可逆地結(jié)合在TGF-β1上，并抑制它與其受體結(jié)合的能力。
5．如權(quán)利要求2的方法，其中，所述TGF-β1抑制劑是一種抑制TGF-β1向腎細(xì)胞的細(xì)胞核傳導(dǎo)信號的能力的試劑。
6．如權(quán)利要求5的方法，其中，TGF-β1抑制劑是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑。
7．如權(quán)利要求6的方法，其中，所述鈣調(diào)磷酸酶抑制劑是tacrolimus。
8．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述α1β1整合蛋白受體抑制劑是能結(jié)合在腎細(xì)胞表面上的α1β1整合蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)上的抑制劑。
9．如權(quán)利要求8的方法，其中，所述α1β1整合蛋白受體抑制劑包括一種肽。
10．如權(quán)利要求9的方法，其中，所述肽是選自下列一組的蛋白的至少九聚體片段層連蛋白、纖連蛋白、巢蛋白、和4型膠原蛋白。
11．如權(quán)利要求8的方法，其中，所述肽是一種抗體。
12．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述腎疾病包括腎小球性腎炎、腎纖維化或這兩者。
13．如權(quán)利要求12的方法，其中，所述腎小球性腎炎或腎纖維化與Alport綜合癥、IDDM腎炎、腎小球膜增殖性腎小球性纖維化、膜增殖腎小球性腎炎、新月型腎小球性腎炎、糖尿病性腎病和腎間質(zhì)纖維化相關(guān)。
14．一種推遲患者Alport綜合癥發(fā)作和/或延緩這種病發(fā)展的方法，該方法包括給所述患者給藥有效量的能抑制通過腎細(xì)胞的α1β1整合蛋白受體進(jìn)行的信號傳導(dǎo)的試劑。
15．一種推遲患者Alport綜合癥發(fā)作和/或延緩這種病發(fā)展的方法，該方法包括抑制患者腎細(xì)胞表面上的α1β1整合蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)。
16．如權(quán)利要求15的方法，其中，抑制α1β1整合蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)包括讓腎細(xì)胞與有效量的α1β1整合蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)肽接觸。
17．如權(quán)利要求16的方法，其中，所述肽是選自下列一組的蛋白的至少九聚體片段層連蛋白、纖連蛋白、巢蛋白、和4型膠原蛋白。
18．如權(quán)利要求15的方法，還包括給所述患者給藥有效量的TGF-β1抑制劑。
19．如權(quán)利要求18的方法，其中，所述TGF-β1抑制劑能不可逆地結(jié)合TGF-β1，并抑制它與其受體結(jié)合的能力。
20．如權(quán)利要求18的方法，其中，所述TGF-β1抑制劑是一種能夠抑制TGF-β1向腎細(xì)胞的細(xì)胞核傳導(dǎo)信號的能力的試劑。
21．如權(quán)利要求20的方法，其中，TGF-β1抑制劑是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑。
22．如權(quán)利要求21的方法，其中，所述鈣調(diào)磷酸酶抑制劑是tacrolimus。
23．一種推遲患者由胰島素依賴型糖尿病導(dǎo)致的腎病發(fā)作和/或延緩這種病發(fā)展的方法，該方法包括給所述患者給藥有效量的能抑制通過腎細(xì)胞的α1β1整合蛋白受體進(jìn)行的信號傳導(dǎo)的試劑。
24．一種推遲患者由胰島素依賴型糖尿病導(dǎo)致的腎病發(fā)作和/或延緩這種病發(fā)展的方法，該方法包括抑制患者腎細(xì)胞表面上的α1β1整合蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)。
25．一種限制患者腎纖維化的方法，該方法包括降低患者體內(nèi)的TGF-β1活性，同時(shí)抑制患者腎細(xì)胞的α1β1整合蛋白受體。
26．如權(quán)利要求25的方法，其中，所述降低TGF-β1活性的步驟包括給所述患者給藥能不可逆地結(jié)合在TGF-β1上，并抑制它與其受體結(jié)合的能力的試劑。
27．如權(quán)利要求26的方法，其中，所述降低TGF-β1活性的步驟包括給所述患者給藥能夠抑制TGF-β1向腎細(xì)胞的細(xì)胞核傳導(dǎo)信號的能力的試劑。
28．一種限制患者腎纖維化的方法，包括給所述患者給藥鈣調(diào)磷酸酶抑制劑。
29．如權(quán)利要求28的方法，其中，所述鈣調(diào)磷酸酶抑制劑是tacrolimus。
30．一種用于腎病的小鼠模型，其中，所述小鼠不能在該小鼠的腎小球基底膜中表達(dá)正常的4型膠原蛋白組份，并且不能表達(dá)α1β1整合蛋白受體。
31．如權(quán)利要求30的小鼠模型，其中，所述小鼠不能將膠原蛋白α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、和α5(Ⅳ)鏈結(jié)合到其腎小球基底膜上。
32．一種篩選用于限制腎病的試劑的方法，包括給腎病的小鼠模型給藥所述試劑，其中，所述小鼠不能在該小鼠的腎小球基底膜中表達(dá)正常的4型膠原蛋白組份，并且不能表達(dá)α1β1整合蛋白受體。
33．一種限制患有Alport綜合癥的患者GBM中基質(zhì)積累的方法，包括降低患者體內(nèi)的TGF-β1活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療(即推遲發(fā)作、延緩發(fā)展、和/或恢復(fù))腎病(例如,腎小球性腎炎和/或腎纖維化)的方法。所述方法中的某一些,包括選擇性地與TGF－β1抑制劑組合給藥α1β1整合蛋白受體抑制劑。本發(fā)明還提供了腎病的小鼠模型,其中,所述小鼠不能在GBM中表達(dá)正常的4型膠原蛋白組合物(即它不能將膠原蛋白α3(Ⅳ)、α(Ⅳ)、和α5(Ⅳ)鏈結(jié)合到其腎小球基底膜上),而且,不能表達(dá)α1β1整合蛋白受體。
文檔編號C07K16/28GK1310625SQ99809024
公開日2001年8月29日 申請日期1999年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月22日
發(fā)明者D·科斯格羅維 申請人:博伊斯鎮(zhèn)國家研究醫(yī)院