本申請是申請?zhí)枮?01280036307.6、申請日為2012年6月8日、發(fā)明名稱為“可裂解脂質(zhì)”的中國發(fā)明專利申請的分案申請，原申請為國際申請?zhí)枮閜ct/us2012/041663的國家階段申請，該國際申請要求申請日為2011年6月8日，申請?zhí)枮?1/494,882以及申請日為2011年6月8日，申請?zhí)枮?1/494,745的美國臨時(shí)專利申請的優(yōu)先權(quán)。核酸的脂質(zhì)體遞送已被用于基于以下的療法的部位特異性遞送：包封的質(zhì)粒dna、反義寡核苷酸、短干擾rna和微小rna。然而，有效遞送核酸至靶細(xì)胞和組織以及隨后轉(zhuǎn)染此類靶細(xì)胞和組織仍然是一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)。盡管促進(jìn)治療劑遞送至靶細(xì)胞和組織的多重基于脂質(zhì)體的系統(tǒng)和媒介物是可用的，但在體內(nèi)和體外應(yīng)用中仍存在許多問題。例如，脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的明顯缺點(diǎn)涉及脂質(zhì)體的構(gòu)建，所述脂質(zhì)體具有足夠的細(xì)胞培養(yǎng)物或體內(nèi)穩(wěn)定性以到達(dá)所需靶細(xì)胞和/或胞內(nèi)區(qū)室，并且此類脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)能夠有效釋放其包封的物質(zhì)至此類靶細(xì)胞。此外，用于構(gòu)建此類基于脂質(zhì)體的媒介物所采用的許多陽離子脂質(zhì)通常對靶細(xì)胞是有毒的，并且相應(yīng)地可有限使用，特別必需大量以成功遞送包封的物質(zhì)至此類靶細(xì)胞。盡管有上述限制，并且由于基于脂質(zhì)體的媒介物具有保護(hù)和促進(jìn)遞送包封的物質(zhì)至一種或多種靶細(xì)胞的能力，它們?nèi)员徽J(rèn)為是有吸引力的載體和治療劑并且仍將得以繼續(xù)努力開發(fā)。雖然包含陽離子脂質(zhì)組分的基于脂質(zhì)體的媒介物已顯示出關(guān)于包封、穩(wěn)定性和部位定位的有前景的結(jié)果，但仍然需要改進(jìn)基于脂質(zhì)體的遞送系統(tǒng)。特別地，仍然需要能夠以增強(qiáng)的效率將大分子諸如核酸遞送至多種細(xì)胞類型和組織類型的改進(jìn)的陽離子和脂質(zhì)。也仍然特別需要結(jié)合有用于遞送包封的核酸和多核苷酸的多官能途徑的新型脂質(zhì)。因此，本發(fā)明提供新型化合物、包括此類化合物的藥物組合物及其用途的相關(guān)方法。在一些實(shí)施方案中，本文所述的化合物用作為促進(jìn)遞送至并隨后轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞的脂質(zhì)體組合物或脂質(zhì)體組合物的組分。在某些實(shí)施方案中，本文所公開的組合物是陽離子和/或可離子化的脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，已基于所需特征或性質(zhì)設(shè)計(jì)本文所述的化合物，例如以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率或促進(jìn)特定生物結(jié)果。此外，在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物采用多官能策略以促進(jìn)將包封的物質(zhì)(如，一種或多種多核苷酸)遞送至并隨后轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞。例如，在某些實(shí)施方案中，本文所述化合物的特征在于具有為此類化合物提供相對于其它相似類別的脂質(zhì)優(yōu)點(diǎn)的一種或多種融合性、內(nèi)體或溶酶體破壞和/或可剝離的性質(zhì)。本文所述的化合物通常包含其上鍵合(如，共價(jià)鍵合)有兩個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)或部分(如，疏水性的r1基團(tuán)和親水性的r2基團(tuán))的一個(gè)或多個(gè)可裂解的(如，可裂解的酶或通過還原、氧化或水解)官能團(tuán)。例如，本文所公開的是包含可裂解的二硫(s-s)官能團(tuán)的化合物。還涵蓋的是包含能夠例如在暴露于生物條件下裂解的任何官能團(tuán)的化合物，并且為了這一目的(可裂解)此類基團(tuán)可包括但不限于酯和醚。在某些實(shí)施方案中，包含化合物的兩個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)(如，頭部基團(tuán)和尾部基團(tuán))使得此類化合物具有兩親性。例如，在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)官能團(tuán)是非極性的、親脂性的或疏水性尾部基團(tuán)(如，自然出現(xiàn)的脂質(zhì)諸如膽固醇或c6-c20烷基)。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)官能團(tuán)是極性的或親水性的頭部基團(tuán)(如，咪唑)。在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物(如，hgt4001、hgt4002、hgt4003、hgt4004和/或hgt4005)是陽離子或可離子化的脂質(zhì)，所述陽離子或可離子化的脂質(zhì)可用作促進(jìn)或增強(qiáng)遞送和釋放包封的物質(zhì)(如，一種或多種治療劑)至一種或多種靶細(xì)胞(如，通過穿透此類靶細(xì)胞的脂質(zhì)膜或與此類靶細(xì)胞的脂質(zhì)膜融合)的脂質(zhì)體組合物的組分。在某些實(shí)施方案中，包含此類化合物的一個(gè)或多個(gè)可裂解的官能團(tuán)(如，二硫)允許，例如親水性的官能頭部基團(tuán)，從化合物的親脂性官能尾部基團(tuán)解離(如，在暴露于氧化、還原或酸性的條件下)，從而促進(jìn)一種或多種靶細(xì)胞的脂質(zhì)雙層中的相變。例如，當(dāng)脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)包括一種或多種本文所述的化合物，一種或多種靶細(xì)胞的脂質(zhì)雙層中的相變促進(jìn)遞送包封的物質(zhì)(如，包封于脂質(zhì)納米顆粒中的一個(gè)或多個(gè)治療的多核苷酸)至一種或多種靶細(xì)胞內(nèi)。類似地，用一種或多種本文所述的化合物富集脂質(zhì)體組合物可促進(jìn)脂質(zhì)體組合物融合性，從而增強(qiáng)此類化合物胞內(nèi)遞送包封其中的物質(zhì)(如，多核苷酸)的能力。在某些實(shí)施方案中，所述化合物具有式(i)結(jié)構(gòu)，其中r1選自由以下組成的組：咪唑、胍、氨基、亞胺、烯胺、任選取代的烷基氨基(如，烷基氨基諸如二甲基氨基)和吡啶基；其中r2選自選自由式ii和式iii組成的組；其中r3和r4各自獨(dú)立選自由以下組成的組：任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20烷基和任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20?；徊⑶移渲衝是零或任何正整數(shù)(如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更大)。在某些實(shí)施方案中，r3和r4各自是任選取代的、多不飽和的c18烷基，而在其它實(shí)施方案中，r3和r4各自是未取代的、多不飽和的c18烷基。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)r3和r4是(9z,12z)-十八-9,12-二烯。本文還公開的是包括式i化合物的藥物組合物，其中r1選自由以下組成的組：咪唑、胍、氨基、亞胺、烯胺、任選取代的烷基氨基(如，烷基氨基諸如二甲基氨基)和吡啶基；其中r2是式ii；并且其中n是零或任何正整數(shù)。本文進(jìn)一步公開的是包括式i化合物的藥物組合物，其中r1選自由以下組成的組：咪唑、胍、氨基、亞胺、烯胺、任選取代的烷基氨基(如，烷基氨基諸如二甲基氨基)和吡啶基；其中r2是式iii；其中r3和r4各自獨(dú)立選自由以下組成的組：任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20烷基和任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20?；徊⑶移渲衝是零或任何正整數(shù)；在某些實(shí)施方案中，r3和r4各自為任選取代的、多不飽和的c18烷基，而在其它實(shí)施方案中，r3和r4各自為未取代的、多不飽和的c18烷基(如，十八-9,12-二烯)。在某些實(shí)施方案中，r1基團(tuán)或頭部基團(tuán)是極性的或親水性的基團(tuán)(如，一個(gè)或多個(gè)咪唑、胍和氨基基團(tuán))并且例如如式i所述，所述基團(tuán)通過二硫(s-s)可裂解的連接基團(tuán)鍵合至r2脂質(zhì)基團(tuán)。其它涵蓋的可裂解的連接基團(tuán)包括包含鍵合(如，共價(jià)鍵合)至例如烷基基團(tuán)(如，c1至c10烷基)的一個(gè)或多個(gè)二硫(s-s)連接基團(tuán)的組合物。在某些實(shí)施方案中，r1基團(tuán)通過c1-c20烷基基團(tuán)(如，其中n是一至二十)共價(jià)鍵合至可裂解的連接基團(tuán)，或可選地可直接鍵合至可裂解的連接基團(tuán)(如，其中n是零)。在某些實(shí)施方案中，二硫連接基團(tuán)是體外和/或體內(nèi)可裂解的(如，酶可裂解的或暴露于酸性或還原性條件下可裂解的)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式iv結(jié)構(gòu)的化合物5-(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基)二硫烷基)甲基)-1h-咪唑(在本文中稱為“hgt4001”)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式v結(jié)構(gòu)的化合物-(2-(((3s,10r,13r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基)二硫烷基)乙基)胍(在本文中稱為“hgt4002”)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式vi結(jié)構(gòu)的化合物2-((2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)-n,n-二甲基乙胺(在本文中稱為“hgt4003")。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式vii結(jié)構(gòu)的化合物5-(((2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)甲基)-1h-咪唑(在本文中稱為“hgt4004”)。在另外其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及化合物具有式viii結(jié)構(gòu)的化合物1-(((2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)甲基)胍(在本文中稱為“hgt4005”)。在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物是陽離子和/或可離子化的脂質(zhì)，其可被用作為脂質(zhì)體組合物或替代地作為脂質(zhì)體組合物的組分(如，脂質(zhì)納米顆粒)。在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物用于富集脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)，從而賦予此類富集的脂質(zhì)體組合物改進(jìn)的性質(zhì)(如，改進(jìn)遞送包封的多核苷酸至一種或多種靶細(xì)胞和/或降低脂質(zhì)體組合物的體內(nèi)毒性)。相應(yīng)地，還涵蓋的是藥物組合物，并且特別是包括一種或多種本文所述化合物的脂質(zhì)體組合物。在某些實(shí)施方案中，此類藥物和脂質(zhì)體組合物包括一種或多種peg修飾的脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)(諸如膽固醇)。例如，涵蓋的是藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)，所述組合物包括一種或多種本文所述的化合物(如，hgt4001、hgt4002、hgt4003、hgt4004和/或hgt4005)和一種或多種陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)/膽固醇和peg修飾的脂質(zhì)組分。還涵蓋的是藥物和脂質(zhì)體組合物，所述組合物包括一種或多種本文所述的化合物并進(jìn)一步包括一種或多種額外的陽離子的脂質(zhì)。類似地，還涵蓋的是脂質(zhì)體組合物和藥物組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)，所述組合物包括一種或多種hgt4001、hgt4002、hgt4003、hgt4004和/或hgt4005化合物和一種或多種c12-200、dlindma、dlinkc2-dma、chol、dope、dmg-peg-2000、ice、dspc、dodap、dotap和c8-peg-2000。在某些實(shí)施方案中，此類藥物組合物和脂質(zhì)體組合物填充有或另外地包封有物質(zhì)，諸如一個(gè)或多個(gè)生物活性的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，本文所述的一種或多種藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)包括本文所公開的一種或多種化合物和一種或多種額外的脂質(zhì)。例如，包括或另外富含一種或多種本文所述的化合物的脂質(zhì)納米顆?？蛇M(jìn)一步包括一種或多種dotap(1,2-二油基-3-三甲基銨丙烷)、dodap(1,2-二油基-3-二甲基銨丙烷)、dotma(1,2-二-o-十八烯基-3-三甲基銨丙烷)、dlindma、dlin-kc2-dma、c12-200和ice。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括脂質(zhì)納米顆粒，所述脂質(zhì)納米顆粒包括hgt4001、dope和dmg-peg2000。在另一實(shí)施方案中，藥物組合物包括脂質(zhì)納米顆粒，所述脂質(zhì)納米顆粒包括hgt4003、dope、膽固醇和dmg-peg2000。在某些實(shí)施方案中，本文所述的一種或多種藥物組合物可包括一種或多種peg修飾的脂質(zhì)。例如，包括或另外富含一種或多種本文所述的化合物的脂質(zhì)納米顆?？蛇M(jìn)一步包括peg修飾的脂質(zhì)，所述peg修飾的脂質(zhì)包含共價(jià)連接至包含一個(gè)或多個(gè)c6-c20烷的脂質(zhì)的長達(dá)5kda的聚乙烯乙二醇鏈。類似地，本文所公開的藥物組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)可包括或可另外地富含一種或多種本文所述的化合物并且可進(jìn)一步包括選自由以下組成的組的一種或多種輔助脂質(zhì)：dspc(1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿、dppc(1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿)、dope(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dppe(1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dmpe(1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopg(,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油))、dope(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dspe(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dlpe(1,2-二月桂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dpps(1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸-l-絲氨酸)、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂和膽固醇。在某些實(shí)施方案中，化合物及包括此類化合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的藥物和脂質(zhì)體組合物包括一個(gè)或多個(gè)多核苷酸(如，包封的dna或rna)。在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)多核苷酸包括至少一個(gè)鎖核酸(如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十二、十五、十六、十八、二十或更多鎖核酸殘余物或單體)。其中一個(gè)或多個(gè)包封的多核苷酸包括rna，此類rna可包括例如，mrna、sirna、snorna、微小rna及其組合。在某些實(shí)施方案中，包封于藥物和其脂質(zhì)體組合物中的多核苷酸包括編碼例如功能多肽、蛋白或酶的mrna，并且當(dāng)通過一種或多種靶細(xì)胞表達(dá)時(shí)(即翻譯)，所述多核苷酸產(chǎn)生功能多肽產(chǎn)物(如，蛋白或酶)，并且在一些情況中，所述功能多肽產(chǎn)物被靶細(xì)胞分泌至受試者的外周循環(huán)內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，包含(或另外填充或包封有)本文所述的化合物和藥物及脂質(zhì)體組合物的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸編碼通過受試者異常表達(dá)的核酸(如，多肽)。在某些實(shí)施方案中，包含此類化合物和脂質(zhì)體或藥物組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的一個(gè)或多個(gè)包封的多核苷酸編碼功能酶諸如尿素循環(huán)酶(如，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(otc)、氨甲酰磷酸合成酶1(cps1)、精氨基琥珀酸合成酶(ass1)、精氨基琥珀酸裂解酶(asl)或精氨酸酶1(arg1))。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)包封的多核苷酸包括編碼與溶酶體貯積癥相關(guān)酶的mrna(如，包封的多核苷酸是編碼以下一種或多種酶的mrna，所述酶如：α半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、β-葡糖苷酶、半乳糖腦苷脂酶和酸性α-葡糖苷酶)。在其它實(shí)施方案中，其中核酸包括mrna，此類mrna可編碼一種或多種蛋白或酶，例如在受試者中可能缺乏的蛋白或酶(如，選自由以下酶組成的組的酶或蛋白：囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cftr)、α-l-艾杜糖醛酸酶、n-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸苷酶、葡糖腦苷脂酶、乙酰肝素磺酰胺酶(heparansulfamidase)和透明質(zhì)酸酶)。本文還涵蓋的是藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)，所述組合物包括一種或多種本文所述的化合物和一個(gè)或多個(gè)多核苷酸(如，反義寡核苷酸)，并且特別包括一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾的多核苷酸。例如，在某些實(shí)施方案中，其中多核苷酸是mrna，此類化學(xué)修飾使得mrna更加穩(wěn)定并且可能包括例如mrna的5’或3’非翻譯區(qū)的末端阻斷修飾。在某些實(shí)施方案中，化學(xué)修飾包括將cmv立即早期1(ie1)基因的部分序列包含至mrna的5’非翻譯區(qū)諸如，如seqidno：1：xcacaucgccuggagacgccauccacgcuguuuugaccuccauagaagacaccgggaccgauccagccuccgcggccgggaacggugcauuggaacgcggauuccccgugccaagagugacucaccguccuugacacg，其中如果x存在，則其是gga(seqidno：1)；或與seqidno：1至少90％或至少95％相同的序列。在其它實(shí)施方案中，化學(xué)修飾包括將聚a尾包含至mrna的3’非翻譯區(qū)。還涵蓋的是包括將帽1結(jié)構(gòu)包含至mrna的5’非翻譯區(qū)的化學(xué)修飾。在另外其它的實(shí)施方案中，化學(xué)修飾包括將來自人類生長激素(hgh)基因的序列包含至mrna的3’非翻譯區(qū)。hgh序列可能包含：seqidno：2cggguggcaucccugugaccccuccccagugccucuccuggcccuggaaguugccacuccagugcccaccagccuuguccuaauaaaauuaaguugcauc(seqidno：2)或與seqidno：2至少90％或至少95％相同的序列。可將本文所述的化合物和藥物組合物配制成以特定靶向和/或轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞、組織和器官。在某些實(shí)施方案中，此類化合物和藥物組合物通過一個(gè)或多個(gè)機(jī)制促進(jìn)此類靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(如，靶細(xì)胞脂質(zhì)雙層膜的基于融合性的釋放和/或質(zhì)子海綿介導(dǎo)的破壞)。涵蓋的靶細(xì)胞包括，例如，選自由以下組成的組的一種或多種細(xì)胞：肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，肺細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心臟細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、β細(xì)胞、腦垂體細(xì)胞、滑膜襯里細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、b細(xì)胞、t細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、白細(xì)胞、粒細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。進(jìn)一步的本發(fā)明提供藥物組合物，所述藥物組合物包括用于完成遞送包封內(nèi)容物(如，多核苷酸)至一種或多種靶細(xì)胞、組織或器官的脂質(zhì)體遞送媒介物和脂質(zhì)體制劑(如，脂質(zhì)納米顆粒)。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于制備此類藥物組合物的相關(guān)方法和工藝，以及通過給有此需要的受試者施用此類藥物組合物治療一種或多種疾病或疾患的方法。還期望本文所述的凍干組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)在制冷或環(huán)境溫度下(如，室溫)貯藏時(shí)具有改進(jìn)的長期穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方案中，包括凍干納米顆?；蛑|(zhì)體(lyposomal)遞送媒介物的藥物組合物的特征在于其是穩(wěn)定的(如，與包括當(dāng)量的未凍干媒介物的藥物組合物一樣穩(wěn)定)。例如參照包括此類組合物的脂質(zhì)納米顆粒的粒徑，可確定凍干遞送媒介物的穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒的凍干不明顯改變或變動(dòng)凍干和/或復(fù)溶之后的脂質(zhì)納米顆粒的粒徑。例如，本文所公開的是包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的藥物組合物，其中當(dāng)復(fù)溶(如，用純化水)時(shí)，脂質(zhì)納米顆粒不絮凝或聚集或可選地顯示有限的或可略的絮凝或聚集(如，通過復(fù)溶的脂質(zhì)納米顆粒的粒徑確定)。相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)凍干脂質(zhì)納米顆粒復(fù)溶時(shí)，脂質(zhì)納米顆粒具有小于約500nm的dv50(如，小于約300nm、200nm、150nm、125nm、120nm、100nm、75nm、50nm、25nm或更小)。類似地，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)凍干脂質(zhì)納米顆粒復(fù)溶時(shí)，脂質(zhì)納米顆粒具有小于約750nm的dv90(如，小于約700nm、500nm、300nm、200nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或更小)。在其它實(shí)施方案中，包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的藥物組合物的特征在于具有小于1的多分散性指數(shù)(如，小于0.95、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.1、0.05或更小)。另外，在其它實(shí)施方案中，包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的藥物組合物顯示降低的絮凝或另外聚集的趨勢(如，在凍干期間或復(fù)溶時(shí))。例如，當(dāng)復(fù)溶時(shí)，脂質(zhì)遞送媒介物可具有小于500nm的平均粒徑(zave)(如，在pbs溶液中小于約400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或更小)。本發(fā)明提供的穩(wěn)定的凍干脂質(zhì)遞送媒介物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的特征還在于其改進(jìn)的貯藏性質(zhì)。例如，在某些實(shí)施方案中，凍干脂質(zhì)遞送媒介物可制冷貯藏并保持穩(wěn)定(如，如通過其預(yù)期藥物或生物活性的最小或無損失所顯示)一段更長的時(shí)間(如，在貯藏于約4℃下穩(wěn)定至少約1、2、3、4、5、6、9、12、18、24、36個(gè)月或更久)。在其它實(shí)施方案中，凍干脂質(zhì)遞送媒介物可非致冷貯藏并保持穩(wěn)定一段更長的時(shí)間(如，在貯藏于約25℃下穩(wěn)定至少約1、2、3、4、5、6、9、12、18、24、36個(gè)月或更久)。在某些實(shí)施方案中，在用合適的再水合介質(zhì)(如，純化水、去離子水、5％右旋糖和/或生理鹽水)復(fù)溶時(shí)，復(fù)溶的組合物顯示與凍干前觀察到的藥理學(xué)或生物活性相當(dāng)?shù)乃幚韺W(xué)或生物活性。例如，在某些實(shí)施方案中，包封的多核苷酸的藥理學(xué)或生物活性等同于組合物凍干前觀察到的藥理學(xué)或生物活性，或可選地顯示可忽略不計(jì)的降低的藥理學(xué)或生物活性(如，包封的多核苷酸的生物或藥理學(xué)活性的降低，小于約1％、2％、2.5％、4％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、18.5％、20％、25％、30％、35％、40％或50％)。本文還公開的是包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的藥物組合物(如，凍干脂質(zhì)納米顆粒)，所述凍干脂質(zhì)遞送媒介物進(jìn)一步包括或可選地使用一種或多種凍干保護(hù)劑(如，糖和/或碳水化合物)來制備。在某些實(shí)施方案中，將一種或多種凍干保護(hù)劑包括在脂質(zhì)納米顆粒中，可改進(jìn)或另外地增強(qiáng)凍干脂質(zhì)遞送媒介物的穩(wěn)定性(如，在正常貯藏條件下)和/或使用再水合介質(zhì)促進(jìn)凍干脂質(zhì)遞送媒介物的復(fù)溶，從而制備水性制劑。例如，在某些實(shí)施方案中，制備脂質(zhì)納米顆粒并在凍干前可用凍干保護(hù)劑諸如蔗糖溶液或懸浮液(如，包含約1-50％或10-25％蔗糖的水溶液)代替(如，經(jīng)由離心)存在于脂質(zhì)體制劑中的緩沖液。可用于制備本文所述凍干組合物的其它適合的凍干保護(hù)劑包括，例如海藻糖、葡聚糖(如，1.5kda、5kda和/或40kda)和菊糖(如，1.8kda和/或4kda)。在一些實(shí)施方案中，本文所公開的凍干組合物還能夠促進(jìn)包封于包括此類組合物的一種或多種脂質(zhì)納米顆粒中的內(nèi)容物(如，多核苷酸)的緩釋。例如，涵蓋的是包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的藥物組合物，其中可將組合物不經(jīng)復(fù)溶植入至受試者內(nèi)(如，皮下植入，例如，作為膜或盤)。此類植入的凍干組合物例如在暴露于一種或多種生物流體(如，血清、血液、腦脊液、黏液、汗液、胃分泌物、尿和/或唾液)時(shí)，可以以預(yù)定的速率腐蝕或另外地分解。在某些實(shí)施方案中，包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的此類植入的藥物組合物經(jīng)過至少1、2、7、10、14、21、30、45、60、90、120天或更久釋放例如包封的多核苷酸。可選地，包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的此類植入的組合物經(jīng)過至少一、二、三、六、十二、十六、二十四、三十六或更久釋放例如包封的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，可將本文中本發(fā)明提供的包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的藥物組合物在施用于受試者(如，哺乳動(dòng)物)之前復(fù)溶。在復(fù)溶(如，使用純化水或5％右旋糖作為再水合介質(zhì))時(shí)，可將復(fù)溶的水性組合物通過一種或多種以下施用途徑施用于受試者：靜脈內(nèi)、經(jīng)口、直腸、經(jīng)經(jīng)、經(jīng)粘膜、舌下、硬膜下、經(jīng)鼻、肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)眼和/或眼內(nèi)。本發(fā)明還提供治療受試者中的疾病(如，與基因或核酸的異常表達(dá)相關(guān)的疾病)的方法，其中所述方法包括給受試者施用本發(fā)明的一種或多種化合物和/或藥物組合物。還涵蓋的是用一個(gè)或多個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞，其中所述方法包括用本文所述的化合物或藥物組合物接觸一種或多種靶細(xì)胞，使得用一個(gè)或多個(gè)包封的多核苷酸轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的處理方法采用包括本發(fā)明的凍干或復(fù)溶的脂質(zhì)遞送媒介物的組合物，所述組合物能夠調(diào)節(jié)異常表達(dá)的核酸和多核苷酸在一種或多種靶細(xì)胞和組織中的表達(dá)。相應(yīng)地，本文還提供治療受試者中疾病的方法，所述方法通過向受試者施用本發(fā)明提供的包括凍干脂質(zhì)遞送媒介物的有效量的藥物組合物(如，用再水合介質(zhì)諸如用于注射的無菌水復(fù)溶時(shí))。在某些實(shí)施方案中，此類方法可以增強(qiáng)(如，增加)多核苷酸的表達(dá)和/或增加功能多肽產(chǎn)物在一種或多種靶細(xì)胞和組織(如，肝細(xì)胞)中的產(chǎn)生和分泌。在一些實(shí)施方案中，靶向的細(xì)胞或組織異常表達(dá)由本發(fā)明的一種或多種凍干脂質(zhì)遞送媒介物(如，脂質(zhì)納米顆粒)包封的多核苷酸。本發(fā)明還提供增加一個(gè)或多個(gè)多核苷酸(如，mrna)在一種或多種靶細(xì)胞、組織和器官中的表達(dá)的方法。通常，此類方法包括用一種或多種化合物和/或包括一個(gè)或另外地包封一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的藥物或脂質(zhì)體組合物接觸靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及用多核苷酸轉(zhuǎn)染一種或多種細(xì)胞的方法(如，包括以下步驟：將凍干組合物再水合并用再水合的組合物接觸此類一種或多種細(xì)胞)。通過當(dāng)連同隨附實(shí)施例時(shí)參照本發(fā)明以下細(xì)節(jié)描述，本發(fā)明的以上所討論的和許多其他特征和附帶的優(yōu)點(diǎn)將變得更好理解。本文所述的各種實(shí)施方案是互補(bǔ)的并且可通過技術(shù)人員鑒于本文所包含的教義以所理解的方式將其結(jié)合或一起使用。附圖簡述圖1說明在靜脈內(nèi)施用基于hgt4003的填充有螢火蟲熒光素酶(ffl)mrna的脂質(zhì)納米顆粒之后，小鼠肝臟和脾中的螢火蟲熒光素酶蛋白的發(fā)光度輸出。施用的基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒提供包封的mrna在肝臟中超過脾的富集。將值描述為中間相對光單位(rlu)/施用后四小時(shí)的總蛋白mg。圖2說明腦血管內(nèi)(icv)和鞘內(nèi)(it)施用基于hgt4003的填充有螢火蟲熒光素酶(ffl)mrna的脂質(zhì)納米顆粒之后，螢火蟲熒光素酶蛋白在小鼠腦和脊髓組織中的發(fā)光度輸出。與it施用途徑相比，使用icv施用途徑施用的基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒提供包封的mrna在腦中的富集。將值描述為中間相對光單位(rlu)/施用后四小時(shí)的總蛋白mg。示例性實(shí)施方案的描述本發(fā)明的化合物可用作，例如，脂質(zhì)體遞送媒介物或用作脂質(zhì)體遞送媒介物的組分。在某些實(shí)施方案中，本文所公開的化合物可用作脂質(zhì)體組合物或可選地用作脂質(zhì)體組合物的組分(如，用作脂質(zhì)納米顆粒)。還可采用本發(fā)明的化合物用于藥物組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)中并且用于施用此類藥物組合物以治療或防止疾病、病癥或疾患或遞送治療用分子的方法中。在某些實(shí)施方案中，此類化合物和組合物促進(jìn)遞送例如，包封物質(zhì)(如，多核苷酸)至一種或多種靶細(xì)胞、組織和器官。本文公開的化合物通常包含一個(gè)或多個(gè)可裂解的基團(tuán)，諸如，例如如下式i所述的一個(gè)或多個(gè)二硫(s-s)官能團(tuán)。本文所用術(shù)語“裂解”和“可裂解的”通常意指主題官能團(tuán)中的或臨近的原子之間的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵(如，一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵、氫鍵、范德華力和/或離子相互作用)斷開(如，水解)或能夠在暴露于所選的條件(如，在暴露于酶條件下)時(shí)斷開。在某些實(shí)施方案中，可裂解的基團(tuán)是二硫官能團(tuán)，并且在具體的實(shí)施方案中是能夠在暴露于所選的生物條件(如，胞內(nèi)條件)時(shí)裂解的二硫基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，可裂解的基團(tuán)是能夠在暴露于所選的生物條件時(shí)裂解的酯官能團(tuán)。例如，二硫基團(tuán)可酶裂解或通過水解、氧化或還原反應(yīng)裂解。在此類二硫官能團(tuán)裂解時(shí)，可釋放鍵合其上的一個(gè)或多個(gè)官能部分或基團(tuán)(如，一個(gè)或多個(gè)頭部基團(tuán)和/或尾部基團(tuán))。示例性可裂解的基團(tuán)可包括但不限于：二硫基團(tuán)、酯基團(tuán)、醚基團(tuán)及其任何衍生物(如，烷基和芳基酯)。在某些實(shí)施方案中，可裂解的基團(tuán)不是酯基團(tuán)或醚基團(tuán)。本文所述的可裂解基團(tuán)通常鍵合(如，通過一個(gè)或多個(gè)氫鍵、范德華力、離子相互作用和共價(jià)鍵鍵合)至一個(gè)或多個(gè)官能部分或基團(tuán)(如，至少一個(gè)頭部基團(tuán)和至少一個(gè)尾部基團(tuán))。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)官能部分或基團(tuán)是親水性的(如，包含一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)的親水性頭部基團(tuán)：咪唑、胍、氨基、亞胺、烯胺、任選取代的烷基氨基和吡啶基)。如本文所用，術(shù)語“親水性的”用于在定性方面表明官能團(tuán)是親水的并且通常此類基團(tuán)是水溶性的。例如，本文公開的是包含鍵合至一個(gè)或多個(gè)親水性基團(tuán)(如，親水性頭部基團(tuán))的可裂解二硫(s-s)官能團(tuán)的化合物，其中此類親水性基團(tuán)包括或選自由以下組成的組：咪唑、胍、氨基、亞胺、烯胺、任選取代的烷基氨基(如，烷基氨基諸如二甲基氨基)和吡啶基。在某些實(shí)施方案中，所選的親水性官能團(tuán)或部分可變化或另外地為化合物或有此類化合物作為組分的脂質(zhì)體組合物賦予性質(zhì)(如，通過改進(jìn)有所述化合物作為組分的脂質(zhì)納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率)。例如，將胍作為親水性頭部基團(tuán)摻入至本文所述的化合物中可促進(jìn)此類化合物(或有此類化合物作為組分的脂質(zhì)體組合物)與一種或多種靶細(xì)胞的細(xì)胞膜的融合性(fusogenicity)，從而增強(qiáng)例如此類化合物的轉(zhuǎn)染效率。據(jù)推測，來自親水性胍部分的氮形成六元環(huán)過渡態(tài)，所述六元環(huán)過渡態(tài)賦予相互作用以穩(wěn)定性并因此允許細(xì)胞攝取包封物質(zhì)。(wender，等，adv.drugdel.rev.(2008)60:452-472.)類似地，摻入一個(gè)或多個(gè)氨基基團(tuán)或部分至公開的化合物中(如，作為頭部基團(tuán))可通過利用此類氨基基團(tuán)的融合性進(jìn)一步促進(jìn)靶細(xì)胞的內(nèi)體/溶酶體膜破壞。這不僅基于組合物氨基基團(tuán)的pka，而且還基于氨基基團(tuán)進(jìn)行六角相轉(zhuǎn)變和與靶細(xì)胞表面即囊泡膜融合的能力。(koltover，等science(1998)281:78-81.)據(jù)信這一結(jié)果促進(jìn)囊泡膜的破壞和釋放脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)容物至靶細(xì)胞內(nèi)。類似地，在某些實(shí)施方案中，例如將咪唑作為親水性頭部基團(tuán)摻入本文所述的化合物中可起到促進(jìn)內(nèi)體或溶酶體釋放，例如包封于本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)中的內(nèi)容物?？赏ㄟ^一個(gè)或兩個(gè)質(zhì)子海綿介導(dǎo)的破壞機(jī)制和/或增強(qiáng)的融合性機(jī)制獲得此類增強(qiáng)的釋放。質(zhì)子海綿機(jī)制基于化合物并特別基于化合物的官能部分或基團(tuán)緩沖內(nèi)體的酸化的能力。這可通過化合物的pka或包含此類化合物(如，咪唑)的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)來操控或另外地控制。相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，例如本文所公開的基于咪唑的化合物(如，hgt4001和hgt4004)的融合性與由此類咪唑基團(tuán)促進(jìn)的內(nèi)體破壞性質(zhì)相關(guān)，所述化合物具有相對于其它傳統(tǒng)陽離子脂質(zhì)較低的pka。此類內(nèi)體破壞性質(zhì)轉(zhuǎn)而促進(jìn)滲透性溶脹和脂質(zhì)體膜的破壞，隨后轉(zhuǎn)染或胞內(nèi)釋放填充或包封其中的多核苷酸物質(zhì)至靶細(xì)胞內(nèi)。這一現(xiàn)象可適用于除咪唑部分之外的具有所需pka特征的各種化合物。此類實(shí)施方案還包括基于多氮的官能度諸如聚胺、多肽(組氨酸)和基于氮的樹突機(jī)構(gòu)。本文所述的化合物，特別是基于咪唑的化合物(如，hgt4001和hgt4004)的特征還在于其特別相對于傳統(tǒng)脂質(zhì)和陽離子脂質(zhì)降低的毒性。在一些實(shí)施方案中，本文所述的藥物和脂質(zhì)體組合物包括一個(gè)或多個(gè)基于咪唑的陽離子脂質(zhì)化合物，使得可降低或另外地去除此類藥物或脂質(zhì)體組合物中的其它更毒的陽離子脂質(zhì)的相對濃度?；谶溥虻幕衔锘蛑|(zhì)(如，hgt4001和/或hgt4004)可用作本文所述的一種或多種藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)中僅有的陽離子脂質(zhì)，或可選地可與傳統(tǒng)陽離子脂質(zhì)(如，lipofectin或lipofectamine)、非陽離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)/膽固醇、和/或peg修飾的脂質(zhì)組合。在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物或可選地藥物和脂質(zhì)體組合物的總陽離子脂質(zhì)組分可包括以下的摩爾比的存在于此類藥物或脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)中的總脂質(zhì)：約1％至約90％、約2％至約70％、約5％至約50％、約10％至約40％，或優(yōu)選地存在于此類藥物或脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)中約20％至約70％的總脂質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，包含本文所述化合物的部分的至少一個(gè)官能團(tuán)是天然疏水性的(如，包含天然存在的脂質(zhì)諸如膽固醇的疏水性尾部基團(tuán))。如本文所用，術(shù)語“疏水性的”是用于在定性方面表明官能團(tuán)是防水的并且通常此類基團(tuán)不是水溶性。例如，本文所公開的是包含鍵合至一個(gè)或多個(gè)疏水性基團(tuán)的可裂解的官能團(tuán)(如，二硫(s-s)基團(tuán))的化合物，其中此類疏水性基團(tuán)包括一種或多種天然存在的脂質(zhì)諸如膽固醇和/或任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20烷基和/或任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20?；?。在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物包含，例如，至少一個(gè)親水性頭部基團(tuán)和至少一個(gè)疏水性尾部基團(tuán)，所述基團(tuán)各自鍵合至至少一個(gè)可裂解的基團(tuán)，從而賦予此類化合物兩親性。如本文所用描述化合物或組合物的術(shù)語“兩親性”意指在極性(如，水)和非極性(如，脂質(zhì))環(huán)境中均可溶解的能力。例如，在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物包含至少一個(gè)親脂性尾部基團(tuán)(如，膽固醇或c6-c20烷基)和至少一個(gè)親水性頭部基團(tuán)(如，咪唑)，所述基團(tuán)各自鍵合至可裂解的基團(tuán)(如，二硫)。應(yīng)當(dāng)指出，如用于描述本發(fā)明化合物，并特別是包含此類化合物的官能團(tuán)的術(shù)語“頭部基團(tuán)”和“尾部基團(tuán)”是為了便于參照以描述一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)相對于其它官能團(tuán)的定位。例如，在某些實(shí)施方案中，親水性頭部基團(tuán)(如，胍)鍵合(如，如通過一個(gè)或多個(gè)氫鍵、范德華力、離子相互作用和共價(jià)鍵)至可裂解的官能團(tuán)(如，二硫基團(tuán))，所述可裂解的官能團(tuán)轉(zhuǎn)而鍵合至疏水性尾部基團(tuán)(如，膽固醇)。本文還公開的是具有式i結(jié)構(gòu)的化合物，其中r1選自由以下組成的組：咪唑、胍、氨基、亞胺、烯胺、任選取代的烷基氨基(如，烷基氨基諸如二甲基氨基)和吡啶基；其中r2選自由式ii和式iii組成的組；其中r3和r4各自獨(dú)立選自由以下組成的組：任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20烷基烷基和任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20?；徊⑶移渲衝是零或任何正整數(shù)(如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更大)。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)r3和r4包含任選取代的、多不飽和的c18烷基，而在其它實(shí)施方案中，r3和r4各自是未取代的、多不飽和的c18烷基。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)r3和r4是(9z,12z)-十八-9,12-二烯。在某些實(shí)施方案中，n是1(使得烷基是乙基)、2(使得烷基是甲基)、3(使得烷基是例如丙基或異丙基、4(使得烷基是例如丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基)、5(使得烷基是例如戊烷)、6(使得烷基是例如己烷)、7(使得烷基是例如庚烷)、8(使得烷基是例如辛烷)、9(使得烷基是例如壬烷)或10(使得烷基是例如癸烷)。如本文所用，術(shù)語“烷基”是指直鏈和支鏈c1-c40烴(如，c6-c20烴)，并且包括飽和或不飽和烴。在某些實(shí)施方案中，烷基可包括一個(gè)或多個(gè)環(huán)烷基和/或一個(gè)或多個(gè)雜原子諸如氧、氮或硫，并且可被取代基(如，一個(gè)或多個(gè)烷基、鹵素、烷氧基、羥基、氨基、芳基、醚、酯或酰胺)任選地取代。在某些實(shí)施方案中，涵蓋的烷基包括(9z,12z)-十八-9,12-二烯。諸如“c6-c20”的名稱的使用意指具有引用范圍碳原子的烷基(如，直鏈或支鏈并且包括烯烴和烷基)。如本文所用，術(shù)語“芳基”是指在環(huán)部分含有六至十個(gè)碳的芳族基團(tuán)(如，單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)結(jié)構(gòu))。芳基基團(tuán)可通過可用的碳原子被任選取代，并且在某些實(shí)施方案中可包括一個(gè)或多個(gè)雜原子諸如氧、氮或硫。本文還公開的是包括式i化合物的藥物組合物，其中r1選自由以下組成的組，如：咪唑、胍、氨基、亞胺、烯胺、任選取代的烷基氨基(如，二甲基氨基)和吡啶基；其中r2是式ii；并且其中n是零或任何正整數(shù)(如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更大)。本文進(jìn)一步公開的是包括式i化合物的藥物組合物，其中r1選自由以下組成的組，如：咪唑、胍、亞胺、烯胺、氨基、任選取代的烷基氨基(如，二甲基氨基)和吡啶基；其中r2是式iii；其中r3和r4各自獨(dú)立選自由以下組成的組：任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20烷基和任選取代的、可變飽和的或不飽和的c6-c20?；?；并且其中n是零或任何正整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，r3和r4各自為任選取代的、多不飽和的c18烷基，而在其它實(shí)施方案中，r3和r4各自為未取代的、多不飽和的c18烷基。在某些實(shí)施方案中，涵蓋的烷基包括(9z,12z)-十八-9,12-二烯。在某些實(shí)施方案中，r1基團(tuán)或頭部基團(tuán)是極性或親水性基團(tuán)(如，一個(gè)或多個(gè)咪唑、胍和氨基基團(tuán))并且通過例如如式i所述的二硫(s-s)可裂解的連接基團(tuán)鍵合至r2脂質(zhì)基團(tuán)。r1基團(tuán)或頭部基團(tuán)可通過烷基基團(tuán)(如，c1-c20烷基，其中n是一至二十)共價(jià)鍵合至可裂解的連接基團(tuán)，或可選地可直接鍵合至可裂解的連接基團(tuán)(如，其中n是零)?？芍苽浔疚乃_的化合物和藥物組合物，使得在暴露于所選條件(如，合適的生物或酶條件)時(shí)，可裂解的連接基團(tuán)(如，二硫基團(tuán))裂解并從而引起鍵合至其上的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)或部分(如，頭部和/或尾部基團(tuán))的解離。官能團(tuán)或部分(如，r1親水性基團(tuán)諸如咪唑)的解離可引起有一種或多種本文所述的化合物為其組分的脂質(zhì)體組合物中的相變，這從而使得脂質(zhì)體不穩(wěn)定并促進(jìn)與一種或多種靶細(xì)胞膜融合。其它涵蓋的可裂解連接基團(tuán)可包括包含鍵合至(如，共價(jià)鍵合)例如烷基基團(tuán)(如，c1至c10烷基)的一個(gè)或多個(gè)二硫(s-s)連接基團(tuán)的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有式iv結(jié)構(gòu)的化合物5-(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基)二硫烷基)甲基)-1h-咪唑(在本文中稱為“hgt4001”)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有式v結(jié)構(gòu)的化合物1-(2-(((3s,10r,13r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基)二硫烷基)乙基)胍(在本文中稱為“hgt4002”)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有式vi結(jié)構(gòu)的化合物2-((2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)-n,n-二甲基乙胺(在本文中稱為“hgt4003”)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有式vii結(jié)構(gòu)的化合物5-(((2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)甲基)-1h-咪唑(在本文中稱為“hgt4004”)。在另外其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有式viii結(jié)構(gòu)的化合物1-(((2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)甲基)胍(在本文中稱為“hgt4005”)。本文所述的化合物可用于構(gòu)建脂質(zhì)體組合物，所述組合物促進(jìn)或增強(qiáng)遞送和釋放包封物質(zhì)(如，一個(gè)或多個(gè)治療性多核苷酸)至一種或多種靶細(xì)胞(如，通過穿透此類靶細(xì)胞的脂質(zhì)膜或與此類靶細(xì)胞的脂質(zhì)膜融合)。在某些實(shí)施方案中，包含此類化合物的一個(gè)或多個(gè)可裂解的官能團(tuán)允許，例如親水性官能頭部基團(tuán)從化合物的親脂性官能尾部基團(tuán)解離(如，暴露于酸性條件時(shí))，從而促進(jìn)一種或多種靶細(xì)胞的脂質(zhì)雙層中的相變。例如，當(dāng)脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)包括或另外地富含一種或多種本文所述的化合物時(shí)，一種或多種靶細(xì)胞脂質(zhì)雙層中的相變促進(jìn)將包封物質(zhì)(如，包封于脂質(zhì)納米顆粒中的一個(gè)或多個(gè)治療性多核苷酸)遞送至一種或多種靶細(xì)胞內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物的特征在于具有提供此類化合物相對于其它類似類別的脂質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)的一種或多種性質(zhì)。例如，在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物允許控制和定制有它們作為組分的脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的性質(zhì)。特別地，本文所述的化合物的特征可在于增強(qiáng)的轉(zhuǎn)染效率及其激發(fā)特定的生物結(jié)果的能力。此類結(jié)果可包括，例如增強(qiáng)的細(xì)胞攝取、內(nèi)體/溶酶體破壞能力和/或促進(jìn)包封物質(zhì)(如，多核苷酸)的胞內(nèi)釋放。在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物(及包括此類化合物的藥物和脂質(zhì)體組合物)采用多功能策略來促進(jìn)將包封的物質(zhì)(如，一個(gè)或多個(gè)多核苷酸)遞送至并隨后轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞。例如，在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物(及包括此類化合物的藥物和脂質(zhì)體組合物)的特征在于具有一種或多種受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的和細(xì)胞質(zhì)膜微囊介導(dǎo)的內(nèi)吞、吞噬和巨胞飲、融合性、內(nèi)體或溶酶體破壞和/或可剝離性質(zhì)，所述性質(zhì)提供此類化合物相對于其它類似類別的脂質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，化合物及有此類化合物作為組分的藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)展現(xiàn)增強(qiáng)的(如，增加的)轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞的能力。相應(yīng)地，本文還提供轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞的方法。此類方法通常包括用本文所公開的化合物和/或藥物組合物(如，包封有一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒)接觸一種或多種靶細(xì)胞的步驟，使得用包封其中的物質(zhì)(如，一個(gè)或多個(gè)多核苷酸)轉(zhuǎn)染一種或多種此類靶細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)染”是指胞內(nèi)引入一個(gè)或多個(gè)包封的物質(zhì)(如，核酸和/或多核苷酸)至細(xì)胞內(nèi)，或優(yōu)選地至靶細(xì)胞內(nèi)。引入的多核苷酸可穩(wěn)定或瞬時(shí)保持在靶細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染效率”是指由受到轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞攝入、引入和/或表達(dá)的此類包封的物質(zhì)(如，多核苷酸)的相對量。在實(shí)踐中，通過由轉(zhuǎn)染后的靶細(xì)胞產(chǎn)生的報(bào)告多核苷酸產(chǎn)物的量評估轉(zhuǎn)染效率。在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物和藥物組合物顯示高轉(zhuǎn)染效率，從而改進(jìn)即將遞送合適劑量的包封物質(zhì)(如，一個(gè)或多個(gè)多核苷酸)至病理學(xué)部位并隨后表達(dá)的可能性，而同時(shí)最小化潛在的全身不利影響?？墒褂帽景l(fā)明的化合物、組合物和方法，將可發(fā)揮藥物或治療性影響的廣泛范圍的物質(zhì)遞送至靶細(xì)胞。相應(yīng)地，本文所述的化合物和藥物及脂質(zhì)體組合物可用于包封適合于胞內(nèi)遞送的任何物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，此類包封的物質(zhì)能夠給此類物質(zhì)遞送其中的細(xì)胞賦予治療性或診斷益處，并且可包括任何藥物、生物制劑和/或診斷制劑。所述物質(zhì)可以是有機(jī)或無機(jī)的。有機(jī)分子可以是肽、蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)、甾醇、核酸(包括肽核酸)或其任何組合。在某些實(shí)施方案中，本文所述的藥物和脂質(zhì)體組合物可包括或另外地包封多余一種類型的物質(zhì)，例如，編碼蛋白、酶和/或類固醇的兩種或多種不同的多核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，包封的物質(zhì)是一個(gè)或多個(gè)多核苷酸和核酸。如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”可互換使用來指基因物質(zhì)(如，dna或rna)，并且當(dāng)就本文所述的化合物和組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)而言，此類術(shù)語通常用于指由此類化合物和組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)包封的基因物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸是rna。適合的rna包括mrna、sirna、mirna、snrna和snorna。涵蓋的多核苷酸還包括基因間長鏈非編碼rna(lincrna)，所述非編碼rna通常不編碼蛋白而是在例如免疫信號傳導(dǎo)、干細(xì)胞生物學(xué)和疾病進(jìn)展中起作用。(參見，如，guttman等，458:223-227(2009)；和ng，等，naturegenetics42:1035-1036(2010)，其內(nèi)容通過引用并入本文)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸是mrna。在某些實(shí)施方案中，由本發(fā)明的化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物包封的多核苷酸包括編碼蛋白或酶的rna或穩(wěn)定化的rna(如，編碼α半乳糖苷酶的mrna)。本發(fā)明涵蓋此類多核苷酸(并且特別是rna或穩(wěn)定化的rna)作為治療性的用途，例如如國際申請no.pct/us2010/058457和2011年6月8日提交的美國臨時(shí)申請no.61/494,881所公開的，所述多核苷酸能夠由靶細(xì)胞表達(dá)從而促進(jìn)由此類靶細(xì)胞產(chǎn)生(并且在某些情況下排泄)功能酶或蛋白，所述教義都以引用的方式完整地并入本文。例如，在某些實(shí)施方案中，在由靶細(xì)胞表達(dá)一個(gè)或多個(gè)多核苷酸時(shí)，可觀察到受試者缺乏的功能酶或蛋白(如，尿素循環(huán)酶或與溶酶體貯積癥相關(guān)的酶)的產(chǎn)生。如本文所用的限制蛋白或酶的術(shù)語“功能的”意指蛋白或酶具有生物活性或可選地能夠如天然或正常起作用的蛋白或酶一樣執(zhí)行相同或相似功能。以其最廣泛的意義使用的本發(fā)明上下文中的術(shù)語“表達(dá)”是指將特定基因或多核苷酸的轉(zhuǎn)錄為至少一個(gè)mrna轉(zhuǎn)錄物，或?qū)⒅辽僖粋€(gè)mrna或多核苷酸翻譯為蛋白或酶。例如，在某些實(shí)施方案中，本文所述的化合物和藥物或脂質(zhì)體組合物包括編碼功能蛋白或酶的多核苷酸(如，mrna)。在此類mrna多核苷酸上下文中，術(shù)語表達(dá)是指(如，通過靶細(xì)胞)翻譯此類mrna以產(chǎn)生由此編碼的多肽或蛋白。在某些實(shí)施方案中，本文提供的化合物和藥物組合物能夠調(diào)節(jié)異常表達(dá)的核酸和多核苷酸在一種或多種靶細(xì)胞和組織中的表達(dá)。相應(yīng)地，本文還提供通過向受試者施用有效量的本文所述的化合物和/或藥物或脂質(zhì)體組合物，治療受試者中疾病的方法。在某些實(shí)施方案中，此類方法可增強(qiáng)(如，增加)多核苷酸的表達(dá)和/或增加一種或多種靶細(xì)胞和組織(如，肝細(xì)胞)中的功能多肽產(chǎn)物的表達(dá)和分泌。在一些實(shí)施方案中，靶向的細(xì)胞或組織異常表達(dá)由本文所述的一種或多種化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)包封的多核苷酸。本文還提供的是增加一個(gè)或多個(gè)多核苷酸(如，mrna)在一種或多種靶細(xì)胞、組織和器官中表達(dá)的方法。通常，此類方法包括用包括或另外地包封有一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的一種或多種化合物和/或藥物或脂質(zhì)體組合物接觸靶細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本文公開的化合物可用作脂質(zhì)體或脂質(zhì)體的組分。特別地，在某些實(shí)施方案中本文所述的化合物可用作脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的脂質(zhì)(如，陽離子脂質(zhì))組分。此類脂質(zhì)體可用于包封物質(zhì)和促進(jìn)遞送此類物質(zhì)至一種或多種靶細(xì)胞、組織和器官。如本文所用，術(shù)語“脂質(zhì)體”通常指由以一個(gè)或多個(gè)球形雙層或雙層排列的脂質(zhì)(如，兩親性脂質(zhì))組成的囊泡。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)體是脂質(zhì)納米顆粒(如，包括一種或多種本文所公開的陽離子脂質(zhì)化合物的脂質(zhì)納米顆粒)。此類脂質(zhì)體可以是具有從親脂性物質(zhì)和水性內(nèi)部形成的膜的單層或多層囊泡，所述水性內(nèi)部含有即將遞送至一種或多種靶細(xì)胞、組織和器官的包封的物質(zhì)(如，多核苷酸)。在某些實(shí)施方案中，本文所述的藥物和脂質(zhì)體組合物包括一種或多種脂質(zhì)納米顆粒。涵蓋的脂質(zhì)體包括脂質(zhì)納米顆粒。用于形成脂質(zhì)體和由此涵蓋的脂質(zhì)納米顆粒的適合脂質(zhì)(如，陽離子脂質(zhì))的實(shí)例包括一種或多種本文所公開的化合物(如，hgt4001、hgt4002、hgt4003、hgt4004和/或hgt4005)。此類脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米顆粒還可包括額外的陽離子脂質(zhì)諸如c12-200、dlin-kc2-dma和/或hgt5001、非陽離子脂質(zhì)、輔助/基于膽固醇的脂質(zhì)、peg修飾的脂質(zhì)以及磷脂酰化合物(如，磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂)及上述化合物的組合或混合物。幾個(gè)陽離子脂質(zhì)已描述于文獻(xiàn)中，其中許多陽離子脂質(zhì)可商購獲得。在某些實(shí)施方案中，除了本文所公開的一種或多種化合物或脂質(zhì)(如，hgt4003)，本文所述的藥物或脂質(zhì)體組合物中包括此類陽離子脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，使用陽離子脂質(zhì)n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨或“dotma”。(felgner等(proc.nat'lacad.sci.84,7413(1987)；美國專利no.4,897,355)?？蓡为?dú)將dotma或與中性脂質(zhì)、二油?；字Ｒ掖及坊颉癲ope”或其它陽離子或非陽離子脂質(zhì)結(jié)合配制至脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)。其它適合的陽離子脂質(zhì)包括，例如，如在2012年3月29日提交的美國臨時(shí)專利申請61/617,468(其內(nèi)容通過引用并入本文)中所述的可離子化的陽離子脂質(zhì)，諸如：(15z,18z)-n,n-二甲基-6-(9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-15,18-二烯-1-胺(hgt5000)、(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三亞乙基四胺-1-胺(hgt5001)和(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三亞乙基四胺-1-胺(hgt5002)；c12-200(wo2010/053572),2-(2,2-二((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧雜戊環(huán)-4-基)-n,n-二甲基乙胺(dlinkc2-dma))(參見，wo2010/042877；semple等，naturebiotech.28:172-176(2010))、2-(2,2-二((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧雜戊環(huán)-4-基)-n,n-二甲基乙胺“dlin-kc2-dma”、(3s,10r,13r,17r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基3-(1h-咪唑-4-基)丙酸乙酯“ice”、(15z,18z)-n,n-二甲基-6-(9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-15,18-二烯-1-胺“hgt5000”、(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三亞乙基四胺-1-胺“hgt5001”和(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三亞乙基四胺-1-胺“hgt5002”、5-羧基精胺基甘氨酸-雙十八酰胺或“dogs”、2,3-二油基氧基-n-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙銨或“dospa”(behr等proc.nat.'lacad.sci.86,6982(1989)；美國專利no.5,171,678；美國專利no.5,334,761)、1,2-二油酰基-3-二甲基銨-丙烷或“dodap”、1,2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷或“dotap”。涵蓋的陽離子脂質(zhì)還包括1,2-二硬脂?；趸?n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dsdma”、1,2-二油基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dodma”、1,2-二亞油基氧基(dilinoleyloxy)-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dlindma”、1,2-二亞麻基氧基(dilinolenyloxy)-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dlendma”、n-二油基-n,n-二甲基氯化銨或“dodac”、n,n-二硬脂?；?n,n-二甲基溴化銨或“ddab”、n-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羥乙基溴化銨或“dmrie”、3-二甲基氨基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八烯氧基)丙烷或“clindma”、2-[5′-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9′,1-2′-十八烯氧基)丙烷或“cplindma”、n,n-二甲基-3,4-二油基氧基芐基胺或“dmoba”、1,2-n,n′-二油基氨甲?；?3-二甲基氨基丙烷或“docarbdap”、2,3-二亞油?；趸?dilinoleoyloxy)-n,n-二甲基丙基胺或“dlindap”、1,2-n,n′-二亞油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“dlincarbdap”、1,2-二亞油酰氨甲?；?dilinoleoylcarbamyl)-3-二甲基氨基丙烷或“dlincdap”、2,2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧雜戊環(huán)或“dlin-k-dma”、2,2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧雜戊環(huán)或“dlin-k-xtc2-dma”或其混合物。(heyes,j.，等，jcontrolledrelease107:276-287(2005)；morrissey,dv.，等，nat.biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；pct公布wo2005/121348a1)。本發(fā)明還涵蓋的是使用基于膽固醇的陽離子脂質(zhì)配制組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)。此類基于膽固醇的陽離子脂質(zhì)可單獨(dú)使用或與其它陽離子或非陽離子脂質(zhì)聯(lián)合使用。適合的基于膽固醇的陽離子脂質(zhì)包括，例如，dc-chol(n,n-二甲基-n-乙基酰胺基膽固醇,1,4-雙(3-n-油基氨基-丙基)哌嗪(gao，等biochem.biophys.res.comm.179,280(1991)；wolf等biotechniques23,139(1997)；美國專利no.5,744,335)。還涵蓋的是陽離子脂質(zhì)諸如基于二烷基氨基的、基于咪唑的和基于胍的脂質(zhì)。例如，還涵蓋的是如國際申請no.pct/us2010/058457所公開的(其內(nèi)容通過引用并入本文)陽離子脂質(zhì)(3s,10r,13r,17r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基3-(1h-咪唑-4-基)丙酸乙酯或“ice”的使用。還涵蓋的是聚乙二醇(peg)修飾的磷脂和衍生脂質(zhì)諸如衍生的神經(jīng)酰胺(cerarmides)(peg-cer)(包括本文所述的脂質(zhì)體和藥物組合物中的n-辛?；?鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000](c8peg-2000神經(jīng)酰胺))的使用和包括，所述化合物優(yōu)選地與本文所公開的一種或多種化合物和脂質(zhì)聯(lián)合使用。涵蓋的peg修飾的脂質(zhì)包括但不限于：長達(dá)5kda的聚乙二醇鏈，所述聚乙二醇鏈共價(jià)連接至具有c6-c20長的烷基鏈的脂質(zhì)上。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物和方法所采用的peg修飾的脂質(zhì)是1,2-二豆蔻?；?sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(2000mwpeg)“dmg-peg2000”。將peg修飾的脂質(zhì)加入至脂質(zhì)遞送媒介物可阻止復(fù)合物聚集并且還可提供用于增加循環(huán)壽命和增加遞送脂質(zhì)-多核苷酸組合物至靶組織的方法，(klibanov等(1990)febsletters,268(1):235–237)，或可選擇將它們體內(nèi)快速交換出制劑(參見美國專利no.5,885,613)。特別有用的可交換的脂質(zhì)是具有較短?；?如，c14或c18)的peg-神經(jīng)酰胺。本發(fā)明的peg修飾的磷酸脂質(zhì)和衍生(derivitized)脂質(zhì)可包括存在于脂質(zhì)體脂質(zhì)納米顆粒中的以下摩爾比的總脂質(zhì)：約0％至約20％、約0.5％至約20％、約1％至約15％、約4％至約10％或約2％。本發(fā)明還涵蓋在一種或多種藥物或脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)中使用非陽離子脂質(zhì)。優(yōu)選此類非陽離子脂質(zhì)與一種或多種本文所公開的化合物和脂質(zhì)聯(lián)合使用。如本文所用，短語“非陽離子脂質(zhì)”是指任何中性、兩性離子或陰離子脂質(zhì)。如本文所用，短語“陰離子脂質(zhì)”是指在所選的ph諸如生理ph下帶有凈負(fù)電荷的任何數(shù)量的脂質(zhì)物質(zhì)。非陽離子脂質(zhì)包括但不限于：二硬脂?；字Ｄ憠A(dspc)、二油?；字Ｄ憠A(dopc)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(dppc)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、二棕櫚?；字８视?dppg)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、棕櫚酰基油?；字Ｄ憠A(popc)、棕櫚酰基油?；?磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰基-磷脂?；掖及?-(n-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-甲酸甲酯(dope-mal)、二棕櫚酰基磷脂酰-乙醇胺(dppe)、二豆蔻?；姿嵋掖及?dmpe)、二硬脂?；?磷脂酰-乙醇胺(dspe)、dlpe(1,2-二月桂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dpps(1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸-l-絲氨酸)、16-o-單甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、1-硬脂酰基-2-油?；?磷脂酰乙醇胺(sope)、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、膽固醇或其混合物。此類非陽離子脂質(zhì)可單獨(dú)使用，但優(yōu)選與其它賦形劑，例如本文所公開的一種或多種陽離子脂質(zhì)化合物(如，hgt4001、hgt4002、hgt4003、hgt4004和/或hgt4005)聯(lián)合使用。當(dāng)與陽離子脂質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)，非陽離子脂質(zhì)可包括存在于脂質(zhì)納米顆粒中的以下摩爾比的總脂質(zhì)，如5％至約90％，或優(yōu)選地約10％至約70％。還涵蓋的是將聚合物包括至脂質(zhì)納米顆粒中，所述脂質(zhì)納米顆粒包括本文所述的藥物或脂質(zhì)體組合物。適合的聚合物可包括，例如，聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乳酸、聚乳酸-聚乙交酯共聚物、聚已內(nèi)酯、葡聚糖、白蛋白、明膠、藻酸鹽、膠原、殼聚糖、環(huán)糊精和聚乙稀亞胺。此類聚合物可單獨(dú)使用，但優(yōu)選與其它賦形劑，例如本文所公開的一種或多種陽離子脂質(zhì)化合物(如，hgt4001、hgt4002、hgt4003、hgt4004和/或hgt4005)聯(lián)合使用。在某些實(shí)施方案中，將藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)部分基于其促進(jìn)轉(zhuǎn)染(如，多核苷酸)靶細(xì)胞的能力配制。在另一實(shí)施方案中，可選擇和/或制備藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)以最大化遞送多核苷酸至靶細(xì)胞、組織和器官。例如，如果靶細(xì)胞是肝細(xì)胞，則可將藥物和/或脂質(zhì)體組合物的性質(zhì)(如，尺寸、電荷和/或ph)最大化以有效遞送此類組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)至靶細(xì)胞或器官、降低免疫清除和/或促進(jìn)在靶器官中的留滯?？蛇x地，如果靶組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，則藥物和脂質(zhì)體組合物的選擇和制備必需考慮血腦屏障內(nèi)的滲透及留滯和/或使用直接遞送此類組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)至此類靶組織(如，經(jīng)由腦血管內(nèi)施用)的可替代的方法。在某些實(shí)施方案中，藥物或脂質(zhì)體組合物或其組分脂質(zhì)納米顆?？膳c劑結(jié)合，所述劑促進(jìn)包封物質(zhì)的轉(zhuǎn)移(如，破壞或改進(jìn)血腦屏障的通透性并從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)移此類包封的多核苷酸至靶細(xì)胞)。雖然本文所述的藥物和脂質(zhì)體組合物(如脂質(zhì)納米顆粒)可促進(jìn)引入包封的物質(zhì)諸如一個(gè)或多個(gè)多核苷酸至靶細(xì)胞內(nèi)，但添加聚陽離子(如，聚l-賴氨酸和魚精蛋白)至例如包括作為共聚物的藥物組合物的一種或多種脂質(zhì)納米顆粒，還可促進(jìn)并且在某些情況下通過體外和體內(nèi)細(xì)胞系數(shù)目都增加2-28倍來顯著增強(qiáng)幾種類型陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。(參見，n.j.caplen，等，genether.1995；2:603；s.li，等，genether.1997；4,891.)在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)制備為包封有一種或多種物質(zhì)或治療劑(如，多核苷酸)。摻入所需的治療劑(如，mrna)至脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)的方法在本文是指“填充”或“包封”(lasic,等，febslett.,312:255-258,1992)。填充或包封脂質(zhì)納米顆粒的物質(zhì)(如，多核苷酸)可完全或部分位于脂質(zhì)納米顆粒的內(nèi)部空間中、脂質(zhì)納米顆粒的雙層膜內(nèi)或與脂質(zhì)納米顆粒的外部空間相聯(lián)系。填充或包封，例如多核苷酸至脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)可起到保護(hù)多核苷酸免受可含有降解此類多核苷酸的酶或化學(xué)物質(zhì)(如，血清)和/或引起此類多核苷酸的快速排泄的系統(tǒng)或受體的環(huán)境。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，特別是就此類多核苷酸將暴露于其中的環(huán)境而言，本文所述的組合物能夠增強(qiáng)由此包封的多核苷酸的穩(wěn)定性。將諸如多核苷酸的物質(zhì)包封至本文所述的一種或多種藥物和脂質(zhì)體組合物內(nèi)(如，脂質(zhì)納米顆粒)還促進(jìn)遞送此類多核苷酸至靶細(xì)胞和組織內(nèi)。例如，包括本文所述的一種或多種脂質(zhì)化合物的脂質(zhì)納米顆?？稍试S包封的多核苷酸到達(dá)靶細(xì)胞，或可基于存在的差別優(yōu)先允許包封的多核苷酸到達(dá)靶細(xì)胞或器官(如，脂質(zhì)納米顆?？蓾饪s于施用了此類脂質(zhì)納米顆粒的受試者的肝臟或脾中)。可選地，脂質(zhì)納米顆?？上拗七f送包封的多核苷酸至其它非靶向細(xì)胞或器官，在所述非靶細(xì)胞或器官中包封的多核苷酸的存在可以是非所需的或具有有限的效用。在某些實(shí)施方案中，通過將多個(gè)脂質(zhì)組分(如，一種或多種本文所述的化合物)與一種或多種聚合物組分結(jié)合制備本文所述的藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)。例如，可使用hgt4003、dope、chol和dmg-peg2000來制備脂質(zhì)納米顆粒。脂質(zhì)納米顆粒可由包括例如hgt4001、dope和dmg-peg2000的額外的脂質(zhì)組合以各種比例組成。包括脂質(zhì)納米顆粒的陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)和/或peg修飾的脂質(zhì)以及此類脂質(zhì)彼此之間的相對摩爾比的選擇基于所選的脂質(zhì)的特征、期望的靶細(xì)胞或組織的性質(zhì)和即將由脂質(zhì)納米顆粒遞送的物質(zhì)或多核苷酸的特征。額外的考慮包括例如所選的脂質(zhì)的烷基鏈飽和度以及尺寸、電荷、ph、pka、融合性和毒性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)已知的各種技術(shù)來制備本發(fā)明所用的藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)?？赏ㄟ^常規(guī)技術(shù)來制備多層囊泡(mlv)，例如通過經(jīng)由溶解脂質(zhì)于合適的溶劑中將所選的脂質(zhì)置于適合容器或器皿的內(nèi)壁上并然后蒸發(fā)溶劑以在器皿內(nèi)部上留下薄膜，或通過噴霧干燥。然后可將水相加入至器皿并渦旋，這將導(dǎo)致mlv的形成。然后可通過多層囊泡的均化、超聲處理或擠出形成單層囊泡(ulv)。此外，可通過洗滌劑去除技術(shù)形成單層囊泡。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物和脂質(zhì)體組合物包括脂質(zhì)納米顆粒，其中包封的多核苷酸(如，mrna)與脂質(zhì)納米顆粒的表面和相同脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)包封的表面相關(guān)。例如，在制備本發(fā)明的組合物期間，本文所述的并包含脂質(zhì)納米顆粒的一種或多種陽離子脂質(zhì)化合物可通過與此類多核苷酸靜電相互作用而與多核苷酸(如，mrna)締合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物和脂質(zhì)體組合物可填充有體外和體內(nèi)應(yīng)用中均可檢測的診斷的放射性核素、熒光物質(zhì)或其它物質(zhì)。例如，本發(fā)明所用的適合的診斷物質(zhì)可包括羅丹明-二油酰基磷脂酰乙醇胺(rh-pe)、綠色熒光蛋白mrna(gfpmrna)、海腎螢光素酶mrna和螢火蟲熒光素酶mrna(seqidno:1)。在本文所述的脂質(zhì)體組合物制備期間，還可通過在水合溶液中包括水溶性載體劑而將其包封于水性內(nèi)部并且可通過將親脂性分子包含在脂質(zhì)制劑中而將其摻入至脂質(zhì)雙層內(nèi)。就某些分子(如，陽離子或陰離子親脂性多核苷酸)而言，將多核苷酸填充至成型的脂質(zhì)納米顆?；蛑|(zhì)體內(nèi)可通過例如美國專利no.4,946,683中所述的方法來完成，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。包封多核苷酸之后，可通過諸如硅膠色譜、滲濾或超濾的方法處理脂質(zhì)納米顆粒以去除未包封的mrna。例如，如果期望從本文所述的脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的表面去除外部鍵合的多核苷酸，則可將此類脂質(zhì)納米顆粒通過二乙氨基乙基葡聚糖纖維素柱。除了包封的物質(zhì)之外可將(如，多核苷酸或一種或多種治療劑或診斷劑)包括或包封于脂質(zhì)納米顆粒中。例如，可將此類額外的治療劑與脂質(zhì)納米顆粒的表面締合，可通過將此類治療劑包括在脂質(zhì)制劑中或?qū)⒋祟愔委焺┨畛渲脸尚偷闹|(zhì)納米顆粒內(nèi)，而將其包含至脂質(zhì)納米顆粒的脂質(zhì)雙層中(參見，美國專利no.5,194,654和5,223,263，其內(nèi)容通過引用并入本文)。存在幾種減小本文所公開的脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)尺寸或“定型”的方法，并且當(dāng)定性用作為本發(fā)明的一部分時(shí)，通?？刹捎眠@些方法的任何一種。擠出方法是脂質(zhì)體定型的一種方法。(hope,mj等reductionofliposomesizeandpreparationofunilamellarvesiclesbyextrusiontechniques.in:liposometechnology(g.gregoriadis，編輯)第1卷.第123頁(1993))。方法由將脂質(zhì)體通過小孔聚碳酸酯膜或不對稱陶瓷膜擠出以減小脂質(zhì)體尺寸至相對定義明確的尺寸分布組成。通常，將懸浮液循環(huán)通過膜一次或多次直至實(shí)現(xiàn)所需的脂質(zhì)體尺寸分布?？蓪⒅|(zhì)體通過較小的孔膜連續(xù)擠出以實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體尺寸的逐漸減小。本領(lǐng)域內(nèi)多種可選地方法可用于定型一組脂質(zhì)納米顆粒。一種此類定型方法描述于美國專利no.4,737,323中，其內(nèi)容通過引用并入本文。通過浴或探針超聲處理對脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒懸浮液超聲處理，產(chǎn)生尺寸逐漸減小，低至直徑小于約0.05微米的小ulv。均化是另一種方法，所述方法依靠剪切能將大的脂質(zhì)體片段化為較小的脂質(zhì)體。在通常的均化程序中，將mlv再循環(huán)通過標(biāo)準(zhǔn)乳液勻漿器直至觀察到所選的脂質(zhì)體尺寸通常在約0.1和0.5微米之間。脂質(zhì)納米顆粒的尺寸可通過如以下文獻(xiàn)所述的準(zhǔn)電光散射(quasi-electriclightscattering)(qels)來確定：bloomfield,ann.rev.biophys.bioeng.,10:421–450(1981)，其內(nèi)容通過引用并入本文?？赏ㄟ^對形成的脂質(zhì)納米顆粒超聲處理來減小平均脂質(zhì)納米顆粒的直徑。間歇超聲處理循環(huán)可與qels評估交替來使用以指導(dǎo)有效的脂質(zhì)體合成。本文所述的脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的合適尺寸的選擇必需考慮靶細(xì)胞或組織的部位，并且在某種程度上考慮脂質(zhì)納米顆粒用于哪種應(yīng)用。如本文所用，短語“靶細(xì)胞”是指本文所述的一種或多種藥物和脂質(zhì)體組合物定位或靶向的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞包括特定的組織或器官。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞缺乏目標(biāo)蛋白或酶。例如，當(dāng)需要將多核苷酸遞送至肝細(xì)胞時(shí)，肝細(xì)胞代表靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物或脂質(zhì)體組合物(和例如其中包封的多核苷酸物質(zhì))基于存在的差別轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞(即，不轉(zhuǎn)染非靶細(xì)胞)?？蓪⒈景l(fā)明組合物和方法制備為優(yōu)先靶向多種靶細(xì)胞，所述靶細(xì)胞包括但不限于：肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肺細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞(如，腦膜星狀細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和前角神經(jīng)元)、感光細(xì)胞(如，視桿和視錐)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、分泌細(xì)胞、心臟細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、β細(xì)胞、腦垂體細(xì)胞、滑膜襯里細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、b細(xì)胞、t細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、白細(xì)胞、粒細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。在用例如包封于包括本文所公開的藥物或脂質(zhì)體組合物的一種或多種脂質(zhì)納米顆粒中的多核苷酸轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞后，可優(yōu)選促進(jìn)由此類多核苷酸編碼的產(chǎn)物(如，多肽或蛋白)的產(chǎn)生，并且增強(qiáng)此類靶細(xì)胞表達(dá)多核苷酸及產(chǎn)生目標(biāo)例如多肽或蛋白的能力。例如，用包封有mrna的一種或多種化合物或藥物組合物轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞將增強(qiáng)(即，增加)由此類mrna編碼的蛋白或酶的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，可能需要限制轉(zhuǎn)染多核苷酸至某些細(xì)胞或組織。例如，部分由于其在代謝和蛋白產(chǎn)生中的重要作用，肝代表對于本發(fā)明組合物重要的靶器官，并且相應(yīng)地由肝特定基因產(chǎn)物的缺陷所導(dǎo)致的疾病(如，尿素循環(huán)病癥)可從細(xì)胞(如，肝細(xì)胞)的特定靶向獲益。相應(yīng)地，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可利用靶組織的結(jié)構(gòu)特征來將本發(fā)明的藥物和脂質(zhì)體組合物(如，基于hgt4001的脂質(zhì)納米顆粒)的分布定位至此類靶組織。例如，為了靶向肝細(xì)胞，可將包括本文所述的藥物或脂質(zhì)體組合物的一種或多種脂質(zhì)納米顆粒定型，使得其尺寸小于肝中肝竇內(nèi)皮層襯里的穿孔；相應(yīng)地一種或多種此類脂質(zhì)納米顆粒可易于滲透此類內(nèi)皮穿孔以到達(dá)靶肝細(xì)胞?？蛇x地，可確定脂質(zhì)納米顆粒的大小使得脂質(zhì)體具有足夠的直徑以限制或特別避免其分布至某些細(xì)胞或組織內(nèi)。例如，可確定包括本文所述的藥物和脂質(zhì)體組合物的脂質(zhì)納米顆粒的大小，使得其尺寸大于肝竇內(nèi)皮層襯里的穿孔，從而限制脂質(zhì)體脂質(zhì)納米顆粒分布至肝細(xì)胞。在此實(shí)施方案中，大的脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)將不易滲透內(nèi)皮穿孔，并且反而被作為肝竇襯里的巨噬庫普費(fèi)爾細(xì)胞清除。例如確定包括藥物組合物的脂質(zhì)納米顆粒的大小，因而可以提供進(jìn)一步調(diào)控并精確控制可增強(qiáng)包封的多核苷酸在一種或多種靶細(xì)胞中的表達(dá)程度的機(jī)會(huì)。通常，包括本發(fā)明藥物和脂質(zhì)體組合物的至少一個(gè)脂質(zhì)納米顆粒的尺寸在約25至250nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選地小于約250nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或10nm。類似地，可將本發(fā)明的組合物制備為優(yōu)先地分布至其它靶組織、細(xì)胞或器官，諸如心、肺、腎、脾。例如，可將本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒制備為實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)遞送至靶細(xì)胞和組織。相應(yīng)地，本發(fā)明的組合物可富含額外的陽離子、非陽離子和peg修飾的脂質(zhì)以進(jìn)一步靶向組織或細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本文所述的化合物和藥物及脂質(zhì)體組合物(如，基于hgt4002的脂質(zhì)納米顆粒)分布至肝細(xì)胞和組織，以增強(qiáng)包封于其中的多核苷酸(如，mrna)的遞送、轉(zhuǎn)染和由肝臟細(xì)胞和組織(如，肝細(xì)胞)隨后的表達(dá)及由此類多核苷酸編碼的多肽或蛋白相應(yīng)的產(chǎn)生。雖然此類組合物可優(yōu)先分布至肝細(xì)胞和組織內(nèi)，表達(dá)的多核苷酸及隨后由其編碼產(chǎn)生的蛋白的治療效果不必限制于靶細(xì)胞和組織。例如，如在例如國際申請no.pct/us2010/058457和美國臨時(shí)申請no.61/494,881中所公開的一樣，靶向的肝細(xì)胞可作用為能夠表達(dá)或產(chǎn)生并系統(tǒng)地或向周圍排泄功能蛋白或酶的“貯存器”或“儲(chǔ)存器”，所述文獻(xiàn)的教義通過通過引用整體并入。相應(yīng)地，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，包括本文所述的藥物和脂質(zhì)體組合物的一種或多種脂質(zhì)納米顆粒(如，基于hgt4005的脂質(zhì)納米顆粒)可靶向肝細(xì)胞(hepatocyes)和/或通過遞送優(yōu)先分布至肝細(xì)胞和組織。在由包封于一種或多種此類脂質(zhì)納米顆粒中的多核苷酸轉(zhuǎn)染靶肝細(xì)胞之后，表達(dá)(如，翻譯)此類多核苷酸和排泄功能產(chǎn)物(如，多肽或蛋白)并且系統(tǒng)地分布至此類功能產(chǎn)物發(fā)揮所需治療效應(yīng)的地方。可將包封于本文所述的一種或多種化合物或藥物及脂質(zhì)體組合物中的多核苷酸遞送至和/或轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞或組織。在一些實(shí)施方案中，能夠表達(dá)包封的多核苷酸并且由靶細(xì)胞產(chǎn)生的(和在某些情況下排泄的)功能多肽產(chǎn)物，從而賦予例如靶細(xì)胞或組織有益的性質(zhì)。此類包封的多核苷酸可編碼例如激素、酶、受體、多肽、肽或其它目標(biāo)蛋白。在某些實(shí)施方案中，為了調(diào)節(jié)或另外降低或消除內(nèi)源核酸或基因表達(dá)的目的，此類包封的多核苷酸還可編碼小干擾rna(sirna)或反義rna。在某些實(shí)施方案中，此類包封的多核苷酸可以是自然界中天然的或重組體，并且使用正義或反義作用機(jī)制(如，通過調(diào)節(jié)靶基因或核酸的表達(dá))可發(fā)揮其治療活性。在一些實(shí)施方案中，包封的多核苷酸(如，編碼缺乏的蛋白的mrna)可任選包括化學(xué)或生物修飾，例如所述修飾改進(jìn)此類多核苷酸的穩(wěn)定性和/或半壽期或改進(jìn)或另外地促進(jìn)此類多核苷酸的翻譯。本發(fā)明還涵蓋的是通過本文所述的化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物，例如通過將兩個(gè)單一的治療劑或多核苷酸組合至單個(gè)脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)，遞送一個(gè)或多個(gè)單一的多核苷酸共至靶細(xì)胞。還涵蓋的是遞送一個(gè)或多個(gè)包封的多核苷酸至一種或多種靶細(xì)胞以治療單個(gè)病癥或缺陷，其中每個(gè)此類多核苷酸通過不同的作用機(jī)制起作用。例如，本發(fā)明的藥物或脂質(zhì)體組合物可包括例如包封在脂質(zhì)納米顆粒中并意在糾正內(nèi)源蛋白或酶缺陷的第一多核苷酸，和意在滅活或“敲低”功能失常的內(nèi)源多核苷酸及其蛋白或酶產(chǎn)物的第二多核苷酸。此類包封的多核苷酸可編碼，例如mrna和sirna。雖然可轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄的多核苷酸(如，mrna)至靶細(xì)胞內(nèi)，但此類多核苷酸可容易且有效地由細(xì)胞體內(nèi)降解，因此使得此類多核苷酸無效。此外，一些多核苷酸在體液(特別是人血清)中不穩(wěn)定，并且甚至在到達(dá)靶細(xì)胞之前可被降解或消化。此外，在細(xì)胞內(nèi)天然mrna可衰變，而半衰期是30分鐘至幾天之間。相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，本文提供的包封的多核苷酸，并且特別是本文提供的mrna多核苷酸，優(yōu)選保留至少一些被表達(dá)或被翻譯的能力，從而以在一種或多種靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生功能蛋白或酶。在某些實(shí)施方案中，藥物和脂質(zhì)體組合物包括本文所公開的一種或多種脂質(zhì)化合物和一種或多種脂質(zhì)納米顆粒，所述脂質(zhì)納米顆粒包括或包封有一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定化的多核苷酸(如，已針對體內(nèi)核酸酶消化或降解穩(wěn)定化的mrna)，所述多核苷酸調(diào)節(jié)基因的表達(dá)或可被表達(dá)或翻譯以在一種或多種靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生功能多肽或蛋白。在某些實(shí)施方案中，將此類包封的多核苷酸(如，編碼功能蛋白或酶的mrna)的活性延長超過加長的時(shí)間段。例如，可延長多核苷酸的活性，使得可將藥物組合物以半周或雙周計(jì)，或更優(yōu)選地以每月、雙月、每季度或每年計(jì)施用于受試者。本發(fā)明的藥物組合物并且特別是包封的mrna的加長或延長的活性，直接與從此類mrna翻譯的功能蛋白或酶的數(shù)量相關(guān)。類似地，可通過進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)或增強(qiáng)mrna多核苷酸的翻譯的化學(xué)修飾進(jìn)一步加長或延長本發(fā)明的組合物的活性。例如，kozac共有序列在蛋白翻譯的起始中起作用并且將此類kozac共有序列包含在包封的mrna多核苷酸中可進(jìn)一步加長或延長mrna多核苷酸的活性。此外，由靶細(xì)胞產(chǎn)生的功能蛋白或酶的數(shù)量是遞送至靶細(xì)胞的多核苷酸(如，mrna)的數(shù)量和此類多核苷酸穩(wěn)定性的函數(shù)。在可改進(jìn)或增強(qiáng)由本發(fā)明化合物或組合物包封的多核苷酸的穩(wěn)定性的情況下，可進(jìn)一步加長翻譯的蛋白或酶的半壽期、活性及組合物的給藥頻率。在某些實(shí)施方案中，可化學(xué)修飾多核苷酸，例如以賦予穩(wěn)定性(如，相對于野生型或天然存在型的mrna和/或?qū)τ诎屑?xì)胞是天然內(nèi)源mrna的穩(wěn)定性)。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，本文提供的包封的多核苷酸包括至少一種化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾賦予多核苷酸增加的或增強(qiáng)的穩(wěn)定性，包括例如改進(jìn)對體內(nèi)核酸酶消化的耐受。如本文所用的短語“化學(xué)修飾”和“化學(xué)修飾的”，當(dāng)此類術(shù)語涉及本文提供的多核苷酸時(shí)，此類術(shù)語包括至少一個(gè)優(yōu)選增強(qiáng)穩(wěn)定性并使得多核苷酸比野生型或天然存在型的那種多核苷酸更穩(wěn)定(如，對核酸酶消化耐受)的變化。當(dāng)此類術(shù)語“穩(wěn)定”和“穩(wěn)定性”涉及由本發(fā)明的化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物包封的多核苷酸并且特別地就mrna而言時(shí)，此類術(shù)語指增加或增強(qiáng)對例如通常能夠降解此類rna的核酸酶(即，內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶)降解的耐受。增加的穩(wěn)定性可包括，例如，對水解或由內(nèi)源酶(如，內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶)或靶細(xì)胞或組織內(nèi)的情況所導(dǎo)致的其它破壞有更低的敏感性，從而增加或增強(qiáng)靶細(xì)胞、組織、受試者和/或胞質(zhì)中此類多核苷酸的耐受。本文提供的穩(wěn)定化的多核苷酸分子顯示相對于其天然存在、未修飾的對應(yīng)物(如多核苷酸的野生型)更長的半壽期。短語“化學(xué)修飾”和“化學(xué)修飾的”還涵蓋當(dāng)此類術(shù)語涉及由本發(fā)明化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物包封的多核苷酸時(shí)，改進(jìn)或增強(qiáng)mrna多核苷酸的翻譯的變化，包括例如在蛋白翻譯起始中起作用的序列(如，kozac共有序列)的內(nèi)含物(inclusion)。(kozak,m.,nucleicacidsres15(20):8125-48(1987))。如本文所用的短語“化學(xué)修飾”還包括修飾引入與天然存在的多核苷酸中所見的那些化學(xué)物質(zhì)不同的化學(xué)物質(zhì)，例如共價(jià)修飾，諸如引入修飾的核苷酸(如，核苷酸類似物或此類多核苷酸分子中非天然發(fā)現(xiàn)的懸垂基團(tuán)的內(nèi)含物)。在一些實(shí)施方案中，在其包封于一種或多種脂質(zhì)納米顆粒之前，多核苷酸已進(jìn)行了使它們更穩(wěn)定的化學(xué)或生物修飾。對多核苷酸的示例性化學(xué)修飾包括堿基的缺失(如，通過缺失或取代一個(gè)核苷酸)或堿基的化學(xué)修飾。此外，適合的修飾包括密碼子的一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的變化，使得密碼子編碼相同的氨基酸但比多核苷酸野生型中發(fā)現(xiàn)的密碼子更穩(wěn)定。例如，已顯示rna的穩(wěn)定性和較高數(shù)目的胞苷(c)和/或尿苷(u)殘余物之間為倒數(shù)關(guān)系，并且已發(fā)現(xiàn)沒有c和u殘余物的rna對于多數(shù)rna酶是穩(wěn)定的(heidenreich，等jbiolchem269,2131-8(1994))。在一些實(shí)施方案中，將c和/或u殘余物在mrna序列中的數(shù)目減小。在另一實(shí)施方案中，通過取代一個(gè)編碼特定氨基酸的密碼子為另一編碼相同或相關(guān)氨基酸的密碼子來將c和/或u殘余物的數(shù)目減小。涵蓋的對由本發(fā)明化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物包封的mrna多核苷酸的修飾還包括假尿苷的摻入。將假尿苷摻入至由本發(fā)明化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物包封的mrna多核苷酸內(nèi)可增強(qiáng)穩(wěn)定性和翻譯能力以及減小體內(nèi)免疫原性(參見，如，karikó,k.，等，moleculartherapy16(11):1833–1840(2008))。對由本發(fā)明化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物包封的多核苷酸的取代和修飾可通過本領(lǐng)域一個(gè)或普通技術(shù)人員易知的方法來進(jìn)行。對減小序列中c和u殘余物數(shù)目的約束，與非翻譯區(qū)相比將可能在mrna編碼區(qū)內(nèi)更大(即，可以消除存在于信使(message)中的所有c和u殘余物而仍然保留信使編碼所需氨基酸序列的能力是不可能的)。然而，遺傳密碼子的簡并性代表允許減少存在于序列中的c和/或u殘余物數(shù)目而保持相同的編碼能力的機(jī)會(huì)(即，基于由密碼子編碼的氨基酸，可能有對rna序列修飾的幾種不同可能性)。例如，gly的密碼子可變化為gga或ggg，而不是ggu或ggc。術(shù)語化學(xué)修飾還包括，例如，將非核苷酸連接或修飾的核苷酸摻入至本發(fā)明的多核苷酸序列內(nèi)(如，對編碼功能蛋白或酶的mrna分子的3'和5'端的一個(gè)或兩個(gè)封端修飾)。此類修飾可包括將堿基加入多核苷酸序列(如，聚a尾巴或更長的聚a尾巴的內(nèi)含物)、3'utr或5'utr的改變、用劑(如，蛋白或互補(bǔ)多核苷酸分子)復(fù)合多核苷酸和改變多核苷酸分子結(jié)構(gòu)的元件的內(nèi)含物(如，形成二級結(jié)構(gòu))。聚a尾巴被認(rèn)為穩(wěn)定化天然信使和合成的反義rna。因而，在某些實(shí)施方案中，可將長聚a尾巴加入至mrna分子因此使得rna更穩(wěn)定。可使用本領(lǐng)域公認(rèn)的多種技術(shù)將加入聚a尾巴。例如，可使用聚a聚合酶將長聚a尾巴加入至合成的或體外轉(zhuǎn)錄的rna(yokoe，等naturebiotechnology.1996；14:1252-1256)。轉(zhuǎn)錄載體還編碼長聚a尾巴。此外，可通過直接來自pcr產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄將聚a尾巴加入。還可用rna連接酶將聚a連接至正義rna的3'端(參見，如，molecularcloningalaboratorymanual，第二版，sambrook、fritsch和maniatis編輯(coldspringharborlaboratorypress:1991版))。在某些實(shí)施方案中，聚a尾巴的長度為至少約90、200、300、400至少500核苷酸。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)聚a尾巴的長度以控制本發(fā)明修飾的正義mrma分子的穩(wěn)定性，并因此控制蛋白的轉(zhuǎn)錄。例如，既然聚a尾巴的長度可影響正義mrna分子的半壽期，就可調(diào)節(jié)聚a尾巴的長度以修改mrna對核酸酶耐受性水平，并從而控制多核苷酸表達(dá)的和蛋白在靶細(xì)胞中產(chǎn)生的時(shí)程。在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定化的多核苷酸分子對體內(nèi)降解(如，通過核酸酶)足夠耐受，使得將其在無脂質(zhì)納米顆粒存在時(shí)遞送至靶細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，化學(xué)修飾是包含本發(fā)明藥物組合物的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的封端修飾。例如，可通過摻入在野生型多核苷酸中非天然存在的3'和/或5'未翻譯(utr)序列來修飾此類多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，為了修飾mrna分子的核苷酸序列，可將位于mrna的側(cè)翼并編碼第二非相關(guān)蛋白的3'和/或5'側(cè)翼序列摻入至編碼功能蛋白的mrna分子核苷酸序列內(nèi)。例如，可將來自穩(wěn)定的mrna分子的3'或5'序列(如，珠蛋白、肌動(dòng)蛋白、gapdh、微管蛋白、組蛋白或檸檬酸循環(huán)酶)摻入至正義mrna多核苷酸分子的3'和/或5'區(qū)內(nèi)，以增加正義mrna分子的穩(wěn)定性。由本發(fā)明還涵蓋的是對多核苷酸3'和5'端之一或兩者進(jìn)行的多核苷酸序列修飾。例如，本發(fā)明涵蓋對多核苷酸(如，mrna)的3'和/或5'端進(jìn)行包含cmv立即早期1(ie1)基因部分序列或其片段的修飾，以改進(jìn)核酸酶耐受性和/或改進(jìn)多核苷酸(諸如，如seqidno:1)的半壽期。除了增加多核苷酸序列的穩(wěn)定性之外，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)包含cmv立即早期1(ie1)基因部分序列(如，至mrna的一個(gè)或多個(gè)5'非翻譯區(qū)和3'非翻譯區(qū))進(jìn)一步增強(qiáng)mrna的翻譯。還涵蓋的是將來自人類生長激素(hgh)基因序列或其片段包含至多核苷酸(如，mrna)的3'和5'端之一或兩者以進(jìn)一步穩(wěn)定化多核苷酸(諸如，如seqidno:2)。通常，相對于其未修飾的對應(yīng)物，涵蓋的化學(xué)修飾改進(jìn)多核苷酸的穩(wěn)定性和/或藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(如，半壽期)，并且包括進(jìn)行例如改進(jìn)此類多核苷酸對體內(nèi)核酸酶消化的耐受性的修飾。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物、其中包括的兩個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)納米顆?；蛴纱祟愔|(zhì)納米顆粒包封的多核苷酸可包括穩(wěn)定劑。組合物可包括直接或間接鍵合至多核苷酸并且穩(wěn)定化多核苷酸的一種或多種制劑試劑，從而增強(qiáng)靶細(xì)胞胞質(zhì)中的耐受時(shí)間。此類試劑優(yōu)選導(dǎo)致多核苷酸在靶細(xì)胞中改進(jìn)的半壽期?？赏ㄟ^摻入與細(xì)胞內(nèi)天然存在的多核苷酸(如，mrna)一起形成復(fù)合物的“穩(wěn)定劑”來增加mrna的穩(wěn)定性和翻譯效率(參見如，美國專利no.5,677,124)。例如，在將mrna填充或包封于包括藥物組合物的一種或多種脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)之前，可通過體外將聚a和蛋白與即將穩(wěn)定化的mrna結(jié)合來完成穩(wěn)定劑的摻入。示例性穩(wěn)定劑包括一種或多種蛋白、肽、適體、翻譯輔助蛋白、mrna結(jié)合蛋白和/或翻譯起始因子。還可以通過使用通常為大的親水性聚合物的調(diào)理作用抑制性部分，來改進(jìn)本文所述的藥物和脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的穩(wěn)定化，所述調(diào)理作用抑制性部分化學(xué)或物理被鍵合或另外摻入至脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)(如，通過將脂質(zhì)可溶性錨插層至本身膜內(nèi)，或通過直接鍵合至膜脂質(zhì)的活性基團(tuán))。這些調(diào)理作用抑制性親水性聚合物形成保護(hù)表面層，這顯著降低巨噬單核細(xì)胞系統(tǒng)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)對脂質(zhì)體的攝取(如，如在美國專利no.4,920,016中所述，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文)。例如，可通過加入親水性聚合物表面涂層至脂質(zhì)納米顆粒上或其內(nèi)，以掩蓋網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)對基于脂質(zhì)體的脂質(zhì)納米顆粒的識別和攝取，來促進(jìn)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)對脂質(zhì)納米顆粒的延遲攝取。例如，在某些實(shí)施方案中，包括本文所公開的藥物組合物的一種或多種脂質(zhì)納米顆粒包括聚乙二醇(peg)聚合物或peg修飾的脂質(zhì)以進(jìn)一步增強(qiáng)遞送此類脂質(zhì)納米顆粒至靶細(xì)胞和組織。當(dāng)rna與互補(bǔ)多核苷酸分子(如，dna或rna)雜交時(shí)，rna可避免酸酶(krieg，等melton.methodsinenzymology.1987；155,397-415)。雜交的mrna的穩(wěn)定性可能歸功于多數(shù)rna酶固有的單鏈特異性。在一些實(shí)施方案中，所選的復(fù)合多核苷酸的穩(wěn)定劑是真核蛋白(如，哺乳動(dòng)物蛋白)。在另一實(shí)施方案中，用于正義治療的多核苷酸(如，mrna)可通過雜交至第二多核苷酸分子來修飾。如果整個(gè)mrna分子與互補(bǔ)多核苷酸分子雜交，則翻譯起始可能減弱。在一些實(shí)施方案中，mrna分子的5'非翻譯區(qū)和aug起始區(qū)可任選地是未雜交的。翻譯起始后，核糖體復(fù)合物的解旋活性甚至可在高親和力雙鏈體上起作用，以致翻譯可進(jìn)行。(liebhaber.j.mol.biol.1992；226:2-13；monia，等jbiolchem.1993；268:14514-22.)應(yīng)理解上述用于增強(qiáng)多核苷酸穩(wěn)定性的任何方法可單獨(dú)使用或與一種或多種任何其它上述的方法和/或組合物結(jié)合使用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物增強(qiáng)遞送脂質(zhì)納米顆粒包封的多核苷酸至一種或多種靶細(xì)胞、組織或器官。在一些實(shí)施方案中，向一種或多種靶細(xì)胞增強(qiáng)的遞送包括增加與靶細(xì)胞接觸或另外遞送至靶細(xì)胞的多核苷酸的量。在一些實(shí)施方案中，向靶細(xì)胞增強(qiáng)的遞送包括減少與非靶細(xì)胞接觸的多核苷酸的量。在一些實(shí)施方案中，向靶細(xì)胞增強(qiáng)的遞送包括允許用包封的多核苷酸轉(zhuǎn)染至少一些靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，由包括主題藥物組合物的脂質(zhì)納米顆粒包封的多核苷酸的表達(dá)水平和由多核苷酸編碼的功能蛋白或酶的相應(yīng)產(chǎn)生在靶細(xì)胞中增加。由本發(fā)明化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物包封的多核苷酸可任選地與報(bào)告基因(如，多核苷酸編碼區(qū)的上游或下游)結(jié)合，例如這促進(jìn)遞送多核苷酸至靶細(xì)胞或組織的確定。適合的報(bào)告基因可包括，例如，綠色熒光蛋白mrna(gfpmrna)、海腎熒光素酶mrna(熒光素酶mrna)、螢火蟲熒光素酶mrna(seqidno:1)或其任何組合。例如，gfpmrna可與編碼otcmrna的多核苷酸融合以促進(jìn)mrna在靶細(xì)胞、組織或器官中定位的確認(rèn)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括一種或多種額外的分子(如，蛋白、肽、適體或寡核苷酸)，所述分子促進(jìn)多核苷酸(如，mrna、mirna、snrna和snorna)從脂質(zhì)納米顆粒轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的胞內(nèi)隔室內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，額外的分子促進(jìn)遞送多核苷酸至靶細(xì)胞的，例如胞質(zhì)溶膠、溶酶體、線粒體、細(xì)胞核、核仁或蛋白酶體內(nèi)。還包括的是促進(jìn)翻譯的目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至其正常胞內(nèi)位置(如，在線粒體中)以治療此細(xì)胞器中缺乏的劑。在一些實(shí)施方案中，所述劑選自由以下組成的組：蛋白、肽、適體和寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物促進(jìn)受試者內(nèi)源產(chǎn)生一種或多種功能蛋白和/或酶，并且特別促進(jìn)顯示相對于其重組制備的對應(yīng)物較小免疫原性的蛋白和/或酶的產(chǎn)生。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包括編碼缺乏的蛋白或酶的mrna的多核苷酸。當(dāng)此類組合物分布至靶組織并隨后轉(zhuǎn)染此類靶細(xì)胞時(shí)，可體內(nèi)翻譯填充或包封至包括組合物的脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)的外源mrna以產(chǎn)生由此類包封的mrna編碼的功能蛋白或酶(如，受試者缺乏的蛋白或酶)。相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物利用受試者以下的能力：翻譯外源或重組制備mrna的能力以產(chǎn)生內(nèi)源翻譯的蛋白或酶并且由此產(chǎn)生(并且適用于排泄)功能蛋白或酶的能力。翻譯的蛋白或酶的特征還在于天然轉(zhuǎn)錄后修飾的體內(nèi)包含，所述修飾可常在重組制備的蛋白或酶中缺乏，從而進(jìn)一步降低翻譯的蛋白或酶的免疫原性。將mrna包封于脂質(zhì)納米顆粒中并且施用包括此類脂質(zhì)納米顆粒的藥物組合物避免將mrna遞送至靶細(xì)胞內(nèi)特定的細(xì)胞器(如，線粒體)的需要。相反地，在轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞和遞送包封的mrna至靶細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)時(shí)，可翻譯脂質(zhì)納米顆粒的mrna內(nèi)容物并且產(chǎn)生功能蛋白或酶。本發(fā)明還涵蓋通過被動(dòng)和主動(dòng)靶向方法差別靶向一種或多種靶細(xì)胞和組織。被動(dòng)靶向的現(xiàn)象利用脂質(zhì)納米顆粒體內(nèi)天然分布形式，而不依賴于額外賦形劑的使用或一種或多種靶細(xì)胞對脂質(zhì)納米顆粒增強(qiáng)識別的方法。例如，受到由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)細(xì)胞的吞噬作用的脂質(zhì)納米顆粒可能累積于肝或脾中，并且相應(yīng)地可提供被動(dòng)定位遞送組合物至此類靶細(xì)胞的方法?？蛇x地，本發(fā)明涵蓋涉及使用額外賦形劑的主動(dòng)靶向，所述額外賦形劑在本文是指可鍵合(共價(jià)或非共價(jià))至脂質(zhì)納米顆粒以幫助此類脂質(zhì)納米顆粒在某些靶細(xì)胞或靶組織的定位的“靶向配體”。例如，可通過包含一種或多種內(nèi)源靶向配體(如，載脂蛋白e)在脂質(zhì)納米顆粒中或上來介導(dǎo)靶向，以幫助分布至靶細(xì)胞或組織。靶組織主動(dòng)對靶向配體的識別促進(jìn)組織分布至靶細(xì)胞和組織，及靶細(xì)胞和組織對脂質(zhì)納米顆粒和/或其內(nèi)容物的細(xì)胞攝取。例如，在某些實(shí)施方案中，包括藥物制劑的一種或多種脂質(zhì)納米顆?？砂ù祟愔|(zhì)納米顆粒中或上的載脂蛋白-e的靶向配體，以促進(jìn)或幫助此類脂質(zhì)納米顆粒識別和結(jié)合至例如由肝細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源低密度脂蛋白受體。如本文所提供，組合物可包括能夠增強(qiáng)組合物與一種或多種靶細(xì)胞的親和力的配體?？稍谂渲破陂g或配制后，將靶向配體連接至脂質(zhì)納米顆粒的外部雙層。這些方法是本領(lǐng)域熟知的。此外，一些脂質(zhì)納米顆?？砂ㄈ诤闲跃酆衔镏T如peaa、血球凝集素、其它脂肽(參見美國專利申請序列no.08/835,281和60/083,294，其內(nèi)容通過引用并入本文)和用于體內(nèi)和/或胞內(nèi)遞送的其它特征(feature)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物顯示改進(jìn)的轉(zhuǎn)染功效，和/或顯示對目標(biāo)靶細(xì)胞或組織增強(qiáng)的選擇性。因此涵蓋的是包括一種或多種配體(如，肽、適體、寡核苷酸、維生素或其它分子)的組合物或脂質(zhì)納米顆粒，所述配體能夠增強(qiáng)組合物或其組分脂質(zhì)納米顆粒及其多核苷酸內(nèi)容物與一種或多種靶細(xì)胞或組織的親和力。適合的配體可任選鍵合或連接至脂質(zhì)納米顆粒的表面。在一些實(shí)施方案中，靶向配體可跨越脂質(zhì)納米顆粒的表面或被包封在脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)。適合的配體的選擇基于其物理、化學(xué)或生物性質(zhì)(如，選擇性親和力和/或靶細(xì)胞表面標(biāo)記物或特征的識別)細(xì)胞特定的靶點(diǎn)及其對應(yīng)的靶向配體可以廣泛變化?？蛇x擇適合的靶向配體使得利用靶細(xì)胞的獨(dú)特特征，因此允許組合物辨別靶和非靶細(xì)胞。例如，本發(fā)明的組合物可具有表面標(biāo)記物(如，載脂蛋白-b或載脂蛋白-e)，所述表面標(biāo)記物(如，通過受體介導(dǎo)的對此類表面標(biāo)記物的識別和結(jié)合)選擇性地增強(qiáng)對肝細(xì)胞的識別或親和力。另外，期望使用半乳糖作為靶向配體將本發(fā)明的組合物定位至主質(zhì)肝細(xì)胞，或可選地將期望使用含有糖殘余物的甘露糖作為靶向配體將本發(fā)明的組合物定位至肝臟內(nèi)皮細(xì)胞(如，可優(yōu)先鍵合至脫唾液酸糖蛋白受體的含有糖殘余物的甘露糖存在于肝細(xì)胞)。(參見hilleryam，等“drugdeliveryandtargeting:forpharmacistsandpharmaceuticalscientists”(2002)taylor&francis,inc.)已綴合至存在于脂質(zhì)納米顆粒中部分的此類靶向配體的存在因而促進(jìn)一種或多種靶細(xì)胞和組織對本發(fā)明脂質(zhì)體組合物的識別和攝取。適合的靶向配體的實(shí)例包括一種或多種肽、蛋白、適體、維生素和寡核苷酸。如本文所用，術(shù)語“受試者”是指包括但不限于人類、非人類靈長類、嚙齒類等的任何動(dòng)物(如，哺乳動(dòng)物)，可向所述動(dòng)物施用本發(fā)明化合物、藥物或脂質(zhì)體組合物和方法。通常，術(shù)語“受試者”和“患者”在本文中當(dāng)指人類受試者時(shí)可互換使用。本文所述的化合物和藥物或脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的調(diào)節(jié)或增強(qiáng)包封的多核苷酸表達(dá)和多肽或蛋白產(chǎn)生的能力，提供新型和更有效的完成體內(nèi)產(chǎn)生用于宿主疾病或病理學(xué)疾患治療的多肽和蛋白的方法。此類脂質(zhì)納米顆粒組合物特別適用于與編碼蛋白或酶的核酸的異常表達(dá)相關(guān)的疾病或病理學(xué)疾患的治療。例如，成功遞送多核苷酸(諸如mrna)至靶器官(諸如肝)并且特別至肝細(xì)胞，可用于定位于肝臟的代謝的先天錯(cuò)誤的治療和改正。相應(yīng)地，可采用本文所述的化合物、藥物組合物及相關(guān)的方法來治療廣泛范圍的疾病和病理學(xué)疾患，特別是那些由于蛋白或酶缺乏的疾病。由本文所述的化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物(如，基于hgt4004的脂質(zhì)納米顆粒)包封的多核苷酸可編碼功能產(chǎn)物(如，蛋白、酶、多肽、肽、功能rna和/或反義分子)，并且優(yōu)選編碼需要體內(nèi)產(chǎn)生的產(chǎn)物。本發(fā)明的化合物、藥物組合物和相關(guān)方法廣泛適用于治療劑諸如多核苷酸(并且特別是mrna)的遞送以治療多種病癥。特別地，本發(fā)明此類化合物、組合物和相關(guān)方法適用于與蛋白和/或酶缺乏相關(guān)的疾病或病癥的治療。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包封的多核苷酸編碼功能蛋白或酶，所述功能蛋白或酶由一種或多種靶細(xì)胞排泄或分泌至周圍胞外液內(nèi)(如，編碼激素和神經(jīng)遞質(zhì)的mrna)?？蛇x地，在另一實(shí)施方案中，由本發(fā)明的化合物或藥物和脂質(zhì)體組合物包封的多核苷酸編碼功能蛋白或酶，所述功能蛋白或酶保留在一種或多種靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中(如，編碼與尿素循環(huán)或溶酶體貯積代謝病癥相關(guān)酶的mrna)。本發(fā)明化合物、藥物組合物及相關(guān)方法用于的其它病癥，包括但不限于以下病癥，諸如：smn1相關(guān)的脊髓性肌萎縮(sma)；肌萎縮側(cè)索硬化(als)；galt相關(guān)的半乳糖血癥；囊性纖維化病(cf)；slc3a1相關(guān)的病癥，包括胱氨酸尿癥；col4a5相關(guān)的病癥，包括奧爾波特綜合征(alportsyndrome)；半乳糖腦苷脂酶缺乏；x-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和腎上腺脊髓神經(jīng)病；亨廷頓舞蹈癥；帕金森??；肌營養(yǎng)不良(諸如，如迪謝納和貝克肌營養(yǎng)不良(duchenncandbecker))；血友病，諸如，如血友病b(fix)和血友病a(fviii)；弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥(friedreich'sataxia)；佩-梅二氏病(pelizaeus-merzbacherdisease)；tsc1和tsc2相關(guān)的結(jié)節(jié)性硬化癥；圣菲利波綜合征b型(sanfilippobsyndrome)(mpsiiib)；ctns相關(guān)的胱氨酸貯積癥；fmr1相關(guān)的病癥，包括脆性x染色體綜合征、脆性x-染色體相關(guān)震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征和脆性x染色體卵巢功能早衰綜合征；帕-魏二氏綜合征(prader-willisyndrome)；法布里病(fabrydisease)；遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(at)；尼曼-皮克二氏病c1型(niemann-pickdiseasetypec1)；神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥相關(guān)的疾病，包括幼年神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積癥(jncl)、幼年巴登氏病(juvenilebattendisease)、桑-哈病(santavuori-haltiadisease)、詹-比二氏病(jansky-bielschowskydisease)及ptt-1和tpp1缺乏；eif2b1、eif2b2、eif2b3、eif2b4和eif2b5相關(guān)的兒童共濟(jì)失調(diào)伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化不良/白質(zhì)消融；cacna1a和cacnb4相關(guān)的周期性共濟(jì)失調(diào)2型；mecp2相關(guān)的病癥，包括典型雷特綜合癥、mecp2相關(guān)的重度新生兒腦病和ppm-x綜合征；cdkl5相關(guān)的非典型雷特綜合癥(atypicalrettsyndrome)；肯尼迪病(kennedy'sdisease)(sbma)；notch-3相關(guān)的伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(cadasil)；scn1a和scn1b相關(guān)的癲癇癥；聚合酶g相關(guān)的病癥，包括阿爾珀斯-胡騰洛歇爾綜合征(alpers-huttenlochersyndrome)、polg相關(guān)的感覺共濟(jì)失調(diào)性神經(jīng)病、構(gòu)音困難和眼肌麻痹及常染色體顯性和隱性遺傳的進(jìn)行性外眼肌麻痹伴線粒體dna缺失；x-連鎖腎上腺發(fā)育不全；x-連鎖血中丙球蛋白貧乏癥；威爾森病(wilson'sdisease)和法布里病。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸，并且特別地mrna，可編碼功能蛋白或酶。例如，本發(fā)明的組合物可包括mrna編碼的阿加糖酶α、促紅細(xì)胞生成素、α1-抗胰蛋白酶、羧肽酶n、α-l-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸苷酶、葡糖腦苷脂酶、乙酰肝素磺酰胺酶、透明質(zhì)酸酶、半乳糖腦苷脂酶或人類生長激素?？蓪⒈疚乃龅幕衔锖退幬锝M合物施用于受試者。在一些實(shí)施方案中，將組合物與一種或多種額外的多核苷酸、載體、靶向配體或穩(wěn)定劑或其它適合的賦形劑聯(lián)合配制。用于配制和施用藥物的技術(shù)可在“remington’spharmaceuticalsciences”mackpublishingco.,easton,pa.，最新版本中找到。可根據(jù)當(dāng)前醫(yī)療實(shí)踐并考慮到受試者的臨床疾患、包封物質(zhì)的性質(zhì)、施用的部位和方法、施用時(shí)程、受試者年齡、性別、體重及與本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的臨床醫(yī)師相關(guān)的其它因素，施用本發(fā)明的化合物和藥物及脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)及給其定劑量。為了本文的目的，可通過實(shí)驗(yàn)臨床研究、藥理學(xué)、臨床和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的此類相關(guān)考慮來確定“有效量”。在一些實(shí)施方案中，施用量能夠有效地實(shí)現(xiàn)癥狀的至少一些穩(wěn)定、改善或消除，并且獲得由本領(lǐng)域的技術(shù)人員選為疾病進(jìn)展、消退或改善的合適測量的其它指標(biāo)。例如，適合的量和給藥方案為至少引起一個(gè)或多個(gè)多核苷酸在靶細(xì)胞中的短暫表達(dá)的量。本文所公開的化合物和藥物組合物的適合施用途徑包括，例如經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、經(jīng)粘膜或經(jīng)腸施用；胃腸外遞送，包括肌肉內(nèi)注射、皮下、髓內(nèi)注射及鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射或輸注。在某些實(shí)施方案中，向受試者施用本文所述的化合物或組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)促進(jìn)此類化合物或組合物與一種或多種靶細(xì)胞、組織或器官接觸?？蛇x地，可將本發(fā)明的化合物和組合物以局部而不是全身方式施用，例如，經(jīng)由直接注射或輸注藥物組合物至靶組織內(nèi)，優(yōu)選地以儲(chǔ)庫制劑或緩釋制劑的方式，使得可進(jìn)一步促進(jìn)靶向細(xì)胞與組分脂質(zhì)納米顆粒接觸。根據(jù)靶向的組織，可以以各種方式影響局部遞送。例如，可吸入(用于鼻、氣管或支氣管遞送)含有本發(fā)明組合物的氣霧劑；例如，可將本發(fā)明的組合物注射至受傷、疾病表現(xiàn)或疼痛的部位內(nèi)；可以以用于經(jīng)口、經(jīng)氣管或經(jīng)食道應(yīng)用的錠劑形式來提供組合物；可以以用于施用至胃或腸的液體、片劑或膠囊的形式來提供，可以用于經(jīng)直腸或經(jīng)陰道應(yīng)用的栓劑形式來提供；或甚至可通過使用霜?jiǎng)?、滴劑或注射來遞送至眼。與治療分子或配體復(fù)合的含有本發(fā)明化合物的制劑甚至可經(jīng)手術(shù)來施用，例如聯(lián)合聚合物或可允許組合物從植入部位彌散至周圍細(xì)胞的其它結(jié)構(gòu)或物質(zhì)?？蛇x地，可將此類組合物經(jīng)手術(shù)應(yīng)用，而不使用聚合物或支撐物。在某些實(shí)施方案中，配制本發(fā)明的組合物，使得其適用于緩釋，例如包封其中的多核苷酸或核酸。可將此類緩釋的組合物以延緩的給藥間隔方便地施用于受試者。例如，在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的組合物以每天兩次、每天或每隔一天施用于受試者。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的組合物以以下間隔施用于受試者：每周兩次、每周一次、每十天、每兩周、每三周或更優(yōu)選地每四周、每月一次、每六周、每八周、每隔一月、每三個(gè)月、每四個(gè)月、每六個(gè)月、每八個(gè)月、每九個(gè)月或每年。還涵蓋的是組合物和脂質(zhì)納米顆粒，將其配制為用于儲(chǔ)庫施用(如，肌內(nèi)、皮下、玻璃體內(nèi))以在更長時(shí)間段遞送或釋放多核苷酸(如，mrna)。優(yōu)選地，采用的緩釋方式與引入至多核苷酸的修飾(如，化學(xué)修飾)結(jié)合以增強(qiáng)穩(wěn)定性。雖然根據(jù)某些實(shí)施方案已特異地描述了本發(fā)明的某些化合物、組合物及方法，但以下的實(shí)施例僅起到說明本發(fā)明化合物的作用而不意在限制本發(fā)明化合物。以描述本發(fā)明背景并提供關(guān)于實(shí)施的額外細(xì)節(jié)的本文的每個(gè)公開、參考物質(zhì)等，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。凍干液體遞送媒介物本發(fā)明提供包括凍干脂質(zhì)體遞送媒介物和脂質(zhì)體制劑的藥物組合物，其能夠完成將包封內(nèi)容物(如，多核苷酸)遞送至一種或多種靶細(xì)胞、組織或器官。例如，在遞送包封的多核苷酸至一種或多種靶細(xì)胞時(shí)，此類多核苷酸能夠調(diào)節(jié)(如，增加表達(dá))多核苷酸或核酸在靶細(xì)胞中的表達(dá)。本文還公開的是用于制備此類藥物組合物的相關(guān)方法和工藝，以及通過施用此類藥物組合物給需要其的受試者來治療一種或多種疾病或疾患的方法。還期望本文所述的凍干組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)在制冷或環(huán)境溫度(如，室溫)下貯藏時(shí)具有改進(jìn)的長期穩(wěn)定性(如，至少一、二、三、六、九、十二、十八、二十四、三十個(gè)月或更久)。如本文所用的指脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的術(shù)語，“凍干”和“凍干的”是指通過快速冷凍以干燥形式制備此類脂質(zhì)體組合物的工藝，并且在某些情況下指一個(gè)或多個(gè)干燥步驟(如，暴露于真空條件時(shí))，由此降低此類脂質(zhì)體組合物中的水濃度以阻止或可選地限制進(jìn)一步的生物或化學(xué)反應(yīng)。脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的凍干可通過任何合適的方法來進(jìn)行，例如如根據(jù)實(shí)施例提供的凍干循環(huán)。在快速冷凍脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)之后，可通過一種或多種適合的方法來干燥脂質(zhì)體組合物，所述方法諸如暴露于第一和第二真空干燥條件。在一些實(shí)施方案中，可將脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)在室溫和本實(shí)施例提供的真空條件下干燥。在暴露于本文所述的凍干條件之后，可使用例如，適合的水性再水合介質(zhì)(如，無菌水、生理鹽水和/或5％右旋糖)對凍干脂質(zhì)納米顆粒組合物再水合并將其施用于受試者。在某些實(shí)施方案中，本文所述的凍干藥物組合物的特征在于其是穩(wěn)定的(如，相對于為未凍干藥物組合物)。如用于描述本文所述的凍干脂質(zhì)體組合物，術(shù)語“穩(wěn)定的”是指阻止此類脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)聚集或絮凝(如，在復(fù)溶之后)。此類凍干藥物組合物的穩(wěn)定性可參照多個(gè)物理特性來確定。例如，穩(wěn)定性可參照包括此類組合物的脂質(zhì)納米顆粒的粒徑來確定。優(yōu)選地，在本文所公開凍干組合物的再水合之后，復(fù)溶的組合物的尺寸分布和物理特征是相同于或可選地相當(dāng)于凍干前的組合物。相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒的凍干不明顯改變或變化凍干和/或復(fù)溶之后的脂質(zhì)納米顆粒的粒徑。例如，當(dāng)(如，用純化水)復(fù)溶時(shí)包括凍干藥物組合物的脂質(zhì)納米顆粒不絮凝或聚集，或可選地顯示有限或可忽略不計(jì)的絮凝或聚集(如，由復(fù)溶的脂質(zhì)納米顆粒的粒徑確定)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明復(fù)溶的脂質(zhì)體組合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)展現(xiàn)轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞增強(qiáng)(如，增加)的能力。相應(yīng)地，本文還提供轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞的方法。此類方法通常包括用例如復(fù)溶的本發(fā)明凍干藥物組合物(如，包封有一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的凍干基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒)與一種或多種靶細(xì)胞接觸的步驟，使得用包封其中的物質(zhì)(如，一個(gè)或多個(gè)多核苷酸)轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，一種或多種脂質(zhì)(如，陽離子脂質(zhì))可用作脂質(zhì)體或可選地用作本發(fā)明組合物中所用的脂質(zhì)遞送媒介物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的組分。如上所述，適合的脂質(zhì)遞送媒介物是包括核酸、陽離子脂質(zhì)(諸如可裂解的陽離子脂質(zhì))的脂質(zhì)納米顆粒，可裂解的陽離子脂質(zhì)諸如：上述的hgt4001、hgt4002、hgt4003、hgt4004和hgt4005或選自由以下組成的組：c12-200、ice、dotma、dogs、dospa、dodap、dotap、dsdma、dodmadlindmadlendmaddabdmrieclindmacplindmadmobadocarbdapdlindapdlincarbdapdlincdapdlin-k-dmadlin-k-xtc2-dma、dlinkc2-dma、hgt5000、hgt5001、hgt5002或其混合物。脂質(zhì)遞送媒介物的其它適合的組分包括非陽離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)，諸如，如上所述的膽固醇和peg修飾的脂質(zhì)。例如，可使用hgt4003、dope、cho和dmg-peg2000來制備脂質(zhì)納米顆粒。脂質(zhì)納米顆?？捎深~外的脂質(zhì)組合以各種比例來組成，包括例如hgt4001、dope和dmg-peg2000。包括脂質(zhì)納米顆粒的陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)和/或peg修飾的脂質(zhì)以及此類脂質(zhì)彼此的相對摩爾比的選擇基于所選的脂質(zhì)的特征、預(yù)期的靶細(xì)胞或組織的性質(zhì)及級將由脂質(zhì)納米顆粒遞送的物質(zhì)或多核苷酸的特征。額外的考慮包括，例如烷基鏈的飽和度以及所選的脂質(zhì)的尺寸、電荷、ph、pka、融合性和毒性。在一個(gè)實(shí)施方案中，凍干脂質(zhì)遞送媒介物進(jìn)一步包括至少一種凍干保護(hù)劑。本文所用的術(shù)語“凍干保護(hù)劑”是指一種或多種化合物，當(dāng)其與一種或多種本文所述的脂質(zhì)體化合物的制備結(jié)合或包括于所述制備中時(shí)，其在此類脂質(zhì)體化合物的凍干、貯藏或復(fù)溶期間增強(qiáng)(如，增加)脂質(zhì)體化合物(如，脂質(zhì)納米顆粒)的化學(xué)和/或物理穩(wěn)定性。例如，在某些實(shí)施方案中，將一種或多種凍干保護(hù)劑包括在脂質(zhì)納米顆粒中可改進(jìn)或另外地增強(qiáng)凍干組合物的穩(wěn)定性(如，在正常貯藏條件下)和/或使用再水合介質(zhì)促進(jìn)凍干組合物的復(fù)溶，從而制備水性制劑。在一些實(shí)施方案中，制備脂質(zhì)納米顆粒并在凍干前，存在于脂質(zhì)體制劑中的緩沖液可被適合的凍干保護(hù)劑(如，包含約1-50％或10-25％蔗糖的蔗糖水溶液)取代(如，經(jīng)由離心)。在一些實(shí)施方案中，將凍干保護(hù)劑(如，在水合、透濾和/或稀釋期間)作為緩沖液或在其中制備或凍干脂質(zhì)制劑的介質(zhì)的一部分包括其中?？捎糜谥苽浔疚乃鰞龈山M合物的適合凍干保護(hù)劑的實(shí)例包括，例如海藻糖、葡聚糖(如，1.5kda、5kda和/或40kda)、菊糖(如，1.8kda和/或4kda)及其任何組合。據(jù)信，在凍干期間糖凍干保護(hù)劑的包括可起到穩(wěn)定化凍干組合物的作用。(參見，anchordoquy，等，j.pharm.sci.(2000)89:289-296.)對于觀察到的穩(wěn)定化一個(gè)可能的解釋可包括顆粒分離假說，所述顆粒分離假說是指作為脂質(zhì)體顆粒間物理屏障的糖基質(zhì)的形成?？赏ㄟ^本領(lǐng)域目前已知的各種技術(shù)來制備本發(fā)明所用的凍干藥物和組分脂質(zhì)體(如，脂質(zhì)納米顆粒)?？赏ㄟ^常規(guī)技術(shù)來制備多層囊泡(mlv)，例如通過經(jīng)由漿脂質(zhì)溶解在合適的溶劑中而將所選的脂質(zhì)沉積于適合的容器或器皿的內(nèi)壁上，并然后蒸發(fā)溶劑以在器皿的內(nèi)部留下薄膜，或通過噴霧干燥。然后可將水相加入至器皿并渦旋，這將導(dǎo)致mlv的形成。然后可通過多層囊泡的均化、超聲處理或擠出形成單層囊泡(ulv)。此外，可通過洗滌劑去除技術(shù)形成單層囊泡。除非明確指出有相反情況，否則如本文所用的冠詞“一種”和“一個(gè)”在說明書和權(quán)利要求中應(yīng)理解為包括復(fù)數(shù)指示物。除非指出或另外地在上下文明顯存在有相反情況，否則在組的一個(gè)或多個(gè)成員之間包括“或”的權(quán)利要求或描述被認(rèn)為滿足一個(gè)或多于一個(gè)或所有組成員在給定的產(chǎn)物或方法中存在、采用或另外地與給定的產(chǎn)物或方法相關(guān)。本發(fā)明包括實(shí)施方案，其中一個(gè)組成員確切在給定的產(chǎn)物或方法中存在、采用或另外地與給定的產(chǎn)物或方法相關(guān)。本發(fā)明還包括實(shí)施方案，其中多于一個(gè)或整個(gè)組成員在給定的產(chǎn)物或方法中存在、采用或另外地與給定的產(chǎn)物或方法相關(guān)。此外，應(yīng)理解本發(fā)明涵蓋所有變型、組合和變換，除非指出有相反情況或除非本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員之一明知矛盾或不一致將出現(xiàn)，否則將所有變型、組合和變換中的來自一個(gè)或多個(gè)列出的權(quán)利要求的一個(gè)或多個(gè)限制、要素、從句、描述性術(shù)語等引入至取決于相同基礎(chǔ)權(quán)利要求(或，作為相關(guān)的任何其它權(quán)利要求)的另一權(quán)利要求內(nèi)。當(dāng)要素作為列表(如，以馬庫什(markush)組或以類似格式)呈現(xiàn)時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解還公開了要素的每個(gè)亞組，并且任何要素可從該組去除。應(yīng)當(dāng)理解，通常當(dāng)本發(fā)明或本發(fā)明的方面是指包括特別的要素、特征等時(shí)，本發(fā)明的某些實(shí)施方案或方面由此類要素、特征等組成或基本組成。為了簡便，那些實(shí)施方案還未在每種情況下以如此多的文字示于本文。還應(yīng)當(dāng)理解，將本發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面明確地從權(quán)利要求中排除，而不考慮是否在說明書中引用特定排除。本文引用的描述本發(fā)明背景并提供關(guān)于實(shí)施的額外細(xì)節(jié)的公開和其它參考物質(zhì)通過引用并入本文。實(shí)施例實(shí)施例1–hgt4001的制備根據(jù)在反應(yīng)1中顯示的下示通用合成方案來制備化合物5-(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基)二硫烷基)甲基)-1h-咪唑(咪唑-膽固醇二硫化物)(在本文中稱為“hgt4001”)。反應(yīng)1如下制備鑒定為化合物(3)的中間體化合物2-(((3s,10r,13r,17r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基)二硫烷基)吡啶(吡啶基膽固醇二硫化物)。制備在氯仿(35ml)中包含3.0g(7.45mmol)化合物(1)和1.8g(8.17mmol)化合物(2)的溶液并室溫?cái)嚢杷奶臁Ｕ舭l(fā)溶劑，將甲醇(50ml)加入至殘余物中并蒸發(fā)。將所得固體懸浮在甲醇(50ml)中并室溫?cái)嚢柽^夜。將吡啶基膽固醇二硫化物產(chǎn)物(3)通過過濾收集、用甲醇洗滌并且在高真空下干燥。產(chǎn)率：3.6g(95％)。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.43(m,1h),7.76(m,1h),7.62(m,1h),7.05(m,1h),5.32(bd,j＝4hz,1h),2.75(m,1h),2.35(d,j＝8hz,2h),2.05-1.7(m,5h),1.7-1.2(m,8h),1.2-0.8(m,25h),0.65(s,3h)。ms(apci,pos):512(m+1)。如下制備在反應(yīng)1中鑒定為化合物(6)的中間體化合物4-((芐基硫基)甲基)-1h-咪唑。制備在冰乙酸(200ml)中包含12.15g(123.9mmol)化合物(4)和15.5ml(132mmol)(5)的溶液，并將其加熱至回流溫度24小時(shí)。允許反應(yīng)混合物冷卻過夜。蒸發(fā)溶劑并且將殘余物溶解于氯仿(800ml)中。用稀釋的氨(4：1水：濃氨，200ml)和鹽水(200ml)洗滌所得溶液。將有機(jī)相干燥(na2so4)、過濾并蒸發(fā)溶劑?？焖偕V(硅膠，500g；在氯仿中的5-7％甲醇)提供23g所需產(chǎn)物4-((芐基硫代)甲基)-1h-咪唑(化合物(6))，這代表91％的產(chǎn)率。nmr顯示存在鑒定為乙酸鹽并鑒定為以下化合物(8)的小雜質(zhì)(4重量％)?；衔?物質(zhì)用于產(chǎn)生hgt4001，而不經(jīng)過進(jìn)一步純化。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.60(d,j＝1hz,1h),7.35-7.2(m,5h),6.90(d,j＝1hz,1h),3.67(s,2h),3.62(s,2h)。ms(apci,pos):205(m+1)。如下制備鑒定為方案1中的化合物(7)的中間體化合物(1h-咪唑-4-基)甲硫醇。經(jīng)過在醚(30ml)中包含15g化合物(6)(70.5mmol)的懸浮液來濃縮液態(tài)氨(200ml)溶液。向這一所得黃色溶液分批加入5g溶液(217mmol)直至混合物保持深藍(lán)色。然后將其攪拌40分鐘。加入大約10-15g固體nh4cl直至顏色消失并且使用氮流蒸發(fā)溶劑以提供粗化合物(7)，所得粗化合物不需純化就使用。通過以下步驟制備hgt4001：加入3.6g化合物(3)(7mmol)和10ml三乙胺(71.8mmol)至氯仿(200ml)，并使用真空和氮?dú)鈱⑺萌芤好摎?，并快速將所得溶液加入至化合?7)，并室溫在氮?dú)庀聰嚢杷没旌衔铩?天后，加入200ml水并用氯仿(2x500ml)萃取混合物。將有機(jī)萃取物用鹽水(200ml)洗滌、干燥(na2so4)、過濾并蒸發(fā)溶劑?？焖偕V(硅膠，200g，在氯仿中使用1％三乙胺中和；在氯仿中的2-5％乙醇)提供1.25ghgt4001(兩步的產(chǎn)率為35％)。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.61(s,1h),7.00(s,1h),5.33(d,1h),3.93(s,2h),2.58-2.46(m,1h),2.29(d,2h),1.91(m,5h),1.61-0.84(m,33h),0.66(s,3h).13cnmr(300mhz,cdcl3)δ141.6,135.3,134.3,121.4,118.1,56.8,56.2,50.3,50.2,42.4,39.8,39.6,39.1,36.8,36.2,35.8,31.9,29.1,28.3,28.1,24.4,23.9,22.9,22.6,21.0,19.4,18.8,11.9。ms(apci,pos)515(m+1)。元素分析：c31h50n2s2,c(72.32計(jì)算值)，實(shí)際值72.04；h(9.79計(jì)算值)，實(shí)際值9.84；n(5.44，計(jì)算值)，實(shí)際值5.41。實(shí)施例2–hgt4002的制備根據(jù)反應(yīng)2所示的下示通用合成方案制備化合物1-(2-(((3s,10r,13r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1h-環(huán)戊[a]菲-3-基)二硫烷基)乙基)胍(在本文中稱為“hgt4002”)。反應(yīng)2可通過加入5.0g化合物(9)(28.2mmol)和6.82g化合物(2)(31mmol)至100ml氯仿(100ml)中并室溫?cái)嚢杷奶煲孕纬扇芤簛碇苽滂b定為以上反應(yīng)2中化合物(10)的中間體化合物叔-丁基(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)氨基甲酸酯。蒸發(fā)溶劑并且將所得黃色固體用快速色譜(sio2，在己烷中的50-100％乙酸乙酯)純化以提供9.0g不純化合物(10)。nmr顯示存在所需物質(zhì)(56重量％)，連同原料化合物(2)(24％)及以下鑒定的二硫化物化合物(11)(20％)。將獲得的混合物在以下步驟使用，而不經(jīng)過進(jìn)一步純化。1hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.55-8.45(m,1h),7.9-7.8(m,2h),7.3-7.2(m,1h),7.07(bt,j＝5hz,1h),3.25-3.15(m,2h),2.87(t,j＝7hz,2h),1.37(s,9h)。ms(apci,pos)287(m+1),231(m+1-c4h8)。通過加入2.0g化合物(10)(56％純，3.9mmol)至無水二氯甲烷(12ml)中，并然后向其中加入tfa(6ml)來制備中間體化合物雙n,n’–叔丁基-1-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)胍氨基甲酸酯(14)，并且將所得溶液室溫?cái)嚢?小時(shí)。蒸發(fā)溶劑并且高真空干燥殘余物以提供粗化合物(13)(tfa鹽)。將化合物(13)鹽溶解于25ml無水二氯甲烷中，加入過量三乙胺(7ml)，然后加入2.7g化合物(12)(7.0mmol)并將反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢柽^夜，然后用氯仿(175ml)稀釋并用水(2x50ml)和鹽水(50ml)洗滌。將有機(jī)溶液干燥(na2so4)、過濾并蒸發(fā)溶劑。通過快速色譜(sio2，在氯仿中的0-10％甲醇)純化殘余物以提供1.9g不純化合物(14)。nmr顯示存在所需化合物(14)(73重量％)，連同以下鑒定的二硫化物化合物(15)(27重量％)。將混合物用于以下步驟，而不需進(jìn)一步純化。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ11.48(bs,1h),8.86(bt,1h),8.55-8.5(m,1h),7.65-7.6(m,2h),7.25-7.15(m,1h),3.8-3.65(m,2h),2.99(t,j＝6hz,2h),1.51(s,9h),1.49(s,9h)。ms(apci,pos)：復(fù)合物，未檢測(m+1)。通過加入1.6g化合物(14)(73％純，2.8mmol)至無水二氯甲烷(33ml)中，向其中加入tfa(11ml)來制備鑒定為以上反應(yīng)2中化合物(16)的中間體化合物1-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)胍三氟乙酸鹽，并將所得溶液室溫?cái)嚢柽^夜。蒸發(fā)溶劑并將殘余物在高真空下干燥以提供粗化合物(16)(tfa鹽)，所述粗化合物隨后用于以下步驟而不需純化。通過將化合物(16)的tfa鹽溶解于無水二氯甲烷(50ml)中，然后加入過量三乙胺(5ml)來制備hgt4002。加入1.13g硫膽固醇(1)(2.8mmol)并且室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物過夜，然后用氯仿(200ml)稀釋并用水(2x50ml)和鹽水(100ml)洗滌。將所得有機(jī)溶液干燥(na2so4)、過濾并蒸發(fā)溶劑。通過快速色譜(sio2，在氯仿中的0-30％乙醇)和在丙酮中研磨來純化殘余物以提供80mghgt4002。1hnmr(300mhz,dmso-d6)δ7.60-6.90(寬s,4h),5.35(d,1h),3.39(t,2h),2.84(t,2h),2.72(m,1h),2.28(m,2h),1.91(m,5h),1.58-1.28(m,10h),1.20-0.82(m,23h),0.65(s,3h).)。13cnmr(300mhz,dmso-d6)δ157.5,141.5,121.5,56.7,56.1,50.1,49.6,42.4,38.3,36.7,36.2,35.7,31.9,29.0,28.3,27.9,24.4,23.7,23.2,22.9,21.0,19.5,19.1,12.2。ms(apci,pos):520(m+1)。元素分析：c30h53n3s2-sio2,c(62.13計(jì)算值)，實(shí)際值62.33；h(9.21計(jì)算值)，實(shí)際值9.08；n(7.25，計(jì)算值)，實(shí)際值7.07；s(11.06，計(jì)算值)，實(shí)際值10.83。實(shí)施例3–hgt4003的制備根據(jù)反應(yīng)3所示的下示通用合成方案來制備化合物2-((2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)-n,n-二甲基乙胺(在本文中稱為“hgt4003”)。反應(yīng)3通過將11.37g化合物(18)(90.3mmol)滴加至9.73g化合物(17)(90.3mmol)和18.64gk2co3(135.1mmol)在60mlacn中的攪拌的混合物來制備鑒定為以上反應(yīng)3中化合物(19)的中間體化合物3-(芐硫基)丙烷-1,2-二醇。將所得混合物回流加熱2小時(shí)，并將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后過濾反應(yīng)混合物，并用20mlacn沖洗固體。蒸發(fā)濾液并通過柱色譜(洗脫劑：在己烷中的10-100％etoac)來純化灰色液體殘余物以得到17.03g透明液體狀化合物(19)(95％)。通過加入nah(在礦物油中60％，0.82g，20.5mmol)至1.56g化合物(19)(7.88mmol)和6.91g化合物(20)(21.00mmol)在thf(200ml)中在n2下的攪拌的混合物來制備鑒定為以上反應(yīng)3中化合物(21)的中間體化合物芐基(2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)硫烷。將所得混合物回流加熱44個(gè)小時(shí)。在反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，將所述混合物用et2o(400ml)稀釋并用水(300ml)和鹽水(300ml)洗滌。將有機(jī)層用無水na2so4干燥并蒸發(fā)，并且通過柱色譜(洗脫劑：在己烷中的0-20％etoac)來純化黃色液體殘余物以得到黃色液體狀化合物(21)(2.04g，37.3％)。通過加入化合物(21)(0.7g，1.01mmol)的et2o(30ml)溶液至液體nh3(30ml)來制備鑒定為以上反應(yīng)3中化合物(22)的中間體化合物2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙烷-1-硫醇，并且將中間體化合物在2頸rbf中在-78℃在n2下濃縮，然后加入小片na(90mg，3.91mmol)。當(dāng)tlc顯示化合物(21)完全消失時(shí)，將所得混合物在-78℃攪拌30min并且加入340mgnh4cl(6.34mmol)。反應(yīng)混合物的深藍(lán)色在10min內(nèi)褪色至淺黃色并且去除干冰丙酮浴。用n2吹掃反應(yīng)混合物，同時(shí)逐漸升溫至室溫。在通過n2(減少反應(yīng)混合物的體積至約20ml)已將大部分nh3吹離后，加入水性hcl(3n,30ml)。用dcm(60ml)萃取該混合物。將dcm萃取物用無水na2so4干燥并蒸發(fā)。通過柱色譜(洗脫劑：在己烷中的0-20％etoac)來純化黃色液體殘余物以得到490mg淺黃色液體狀的化合物(22)(80％)。將鑒定為以上反應(yīng)3中化合物(24)的中間體化合物n,n-二甲基-2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙胺、2.8g化合物(2)(12.7mmol)和1.41g化合物(23)(10mmol)在dcm(30ml)中混合。用n2吹掃混合物10分鐘，同時(shí)攪拌混合物并且加入1.5mlet3n(11.2mmol)。將所得溶液室溫?cái)嚢?6小時(shí)并且加至230g硅膠柱。用40-100％etoac/己烷洗脫柱，然后用8-10％meoh/dcm洗脫柱以得到0.72g黃色液體狀化合物(24)(34％)。通過將487mg化合物(22)(0.81mmol)和180mg化合物(24)(0.84mmol)在2mldcm中組合，然后在n2下室溫?cái)嚢?6小時(shí)來制備hgt4003。用柱色譜純化反應(yīng)溶液三次(洗脫劑：在己烷中的20-100％etoac)以得到252mg黃色液體狀hgt4003(44％)。還從柱色譜純化獲得213mg以下反應(yīng)4所鑒定的化合物(25)(37％)。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ5.36-5.33(m,8h),3.65(m,1h),3.56-3.50(m,4h),3.43(td,2h),2.96-2.74(m,8h),2.60(t,2h),2.25(s,6h),2.04(m,8h),1.62-1.50(m,5h),1.39-1.22(m,32h),0.88(t,6h).13cnmr(300mhz,cdcl3)δ130.3,128.0,71.8,71.6,70.6,58.8,45.5,41.4,36.9,31.6,30.1,29.7,29.5,29.4,27.3,26.2,25.7,22.6,14.2。ms(apci,pos):709(m+1)。元素分析：c43h81no2s2,c(72.92計(jì)算值)，實(shí)際值72.75；h(11.53計(jì)算值)，實(shí)際值11.50；n(1.98，計(jì)算值)，實(shí)際值2.08；s(9.05，計(jì)算值)，實(shí)際值8.95。反應(yīng)4可替換的hgt4003合成路徑描述于以上反應(yīng)4中，其采用吡啶基二硫化物雙(烷基)中間體。通過將1.35g化合物(22)(2.24mmol)和0.54g化合物(2)(2.45mmol)在10mlchcl3中組合并在n2下室溫?cái)嚢?6小時(shí)來制備鑒定為以上反應(yīng)4中化合物(25)的中間體化合物2-((2,3-雙((9z,12z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)吡啶。通過柱色譜來純化反應(yīng)溶液三次(洗脫劑：己烷中的0-20％etoac)以得到1.1g淺黃色液體狀的化合物(25)(67％)。將1.09g化合物(23)(7.71mmol)加入至化合物(25)(1.1g,1.54mmol)和et3n(2.6ml,18.5mmol)的chcl3(20ml)溶液中并在n2下攪拌。16小時(shí)后的tlc顯示化合物(25)完全消失。然后將反應(yīng)溶液用水性naoh(1n,20ml)洗滌、用無水na2so4干燥并蒸發(fā)。通過柱色譜(洗脫劑：己烷中的5-100％etoac)來純化黃色液體殘余物以得到0.37g淺黃色液體狀的hgt4003(34％)。實(shí)施例4經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)乙醇注射方法來形成包括hgt4001、dope和dmg-peg2000并包封有優(yōu)化密碼子的螢火蟲熒光素酶(ffl)mrna(seqidno：1)的脂質(zhì)納米顆粒。(ponsa，等，int.j.pharm.(1993)95：51-56.)提前制備濃度為50mg/ml的脂質(zhì)的乙醇原液并將其貯藏于-20℃。通過以下步驟來合成優(yōu)化密碼子的螢火蟲熒光素酶(ffl)mrna：體外轉(zhuǎn)錄來自編碼基因的質(zhì)粒dna模板，然后加入5’帽結(jié)構(gòu)(capl)(fechter，p.等，j.gen.virology(2005)86：1239-1249)和3’聚(a)尾巴(通過凝膠電泳確定其長大約為200個(gè)核苷酸)。如下所示，存在于每個(gè)fflmrna產(chǎn)物中的5’和3’非翻譯區(qū)分別由seqidno：4中的x和y來表示。優(yōu)化密碼子的螢火蟲熒光素酶(seqidno：3)：xauggaagaugccaaaaacauuaagaagggcccagcgccauucuacccacucgaagacgggaccgccggcgagcagcugcacaaagccaugaagcgcuacgcccuggugcccggcaccaucgccuuuaccgacgcacauaucgagguggacauuaccuacgccgaguacuucgagaugagcguucggcuggcagaagcuaugaagcgcuaugggcugaauacaaaccaucggaucguggugugcagcgagaauagcuugcaguucuucaugcccguguugggugcccuguucaucgguguggcuguggccccagcuaacgacaucuacaacgagcgcgagcugcugaacagcaugggcaucagccagcccaccgucguauucgugagcaagaaagggcugcaaaagauccucaacgugcaaaagaagcuaccgaucauacaaaagaucaucaucauggauagcaagaccgacuaccagggcuuccaaagcauguacaccuucgugacuucccauuugccacccggcuucaacgaguacgacuucgugcccgagagcuucgaccgggacaaaaccaucgcccugaucaugaacaguaguggcaguaccggauugcccaagggcguagcccuaccgcaccgcaccgcuuguguccgauucagucaugcccgcgaccccaucuucggcaaccagaucauccccgacaccgcuauccucagcguggugccauuucaccacggcuucggcauguucaccacgcugggcuacuugaucugcggcuuucgggucgugcucauguaccgcuucgaggaggagcuauucuugcgcagcuugcaagacuauaagauucaaucugcccugcuggugcccacacuauuuagcuucuucgcuaagagcacucucaucgacaaguacgaccuaagcaacuugcacgagaucgccagcggcggggcgccgcucagcaaggagguaggugaggccguggccaaacgcuuccaccuaccaggcauccgccagggcuacggccugacagaaacaaccagcgccauucugaucacccccgaaggggacgacaagccuggcgcaguaggcaagguggugcccuucuucgaggcuaaggugguggacuuggacaccgguaagacacugggugugaaccagcgcggcgagcugugcguccguggccccaugaucaugagcggcuacguuaacaaccccgaggcuacaaacgcucucaucgacaaggacggcuggcugcacagcggcgacaucgccuacugggacgaggacgagcacuucuucaucguggaccggcugaagagccugaucaaauacaagggcuaccagguagccccagccgaacuggagagcauccugcugcaacaccccaacaucuucgacgccggggucgccggccugcccgacgacgaugccggcgagcugcccgccgcagucgucgugcuggaacacgguaaaaccaugaccgagaaggagaucguggacuauguggccagccagguuacaaccgccaagaagcugcgcggugguguuguguucguggacgaggugccuaaaggacugaccggcaaguuggacgcccgcaagauccgcgagauucucauuaaggccaagaagggcggcaagaucgccguguaayx＝gggauccuacc(seqidno：5)y＝uuugaauu(seqidno：6)將fflmrna以1mg/ml的最終濃度在-80℃貯藏于水中直至使用。經(jīng)由ribogreen測定(invitrogen)來確定所有mrna的濃度。通過在0.1％triton-x100存在和不存在下進(jìn)行ribogreen測定來計(jì)算mrna的包封。分別在1xpbs和1mmkcl溶液中使用malvernzetasizer儀器來確定粒徑(動(dòng)態(tài)光散射(dls))和ζ電位。將等分的50mg/ml基于咪唑的陽離子脂質(zhì)hgt4001、dope和dmg-peg2000的乙醇溶液混合并用乙醇稀釋至3ml的最終體積。單獨(dú)地，從1mg/ml原液來制備fflmrna的緩沖水溶液(10mm檸檬酸鹽/150mmnacl，ph4.5)。將脂質(zhì)溶液快速注射至mrna水溶液內(nèi)并搖振以產(chǎn)生在20％乙醇中的最終懸浮液。將所得納米懸浮液過濾、用1xpbs(ph7.4)滲濾、濃縮并貯藏于2-8℃。最終濃度＝0.69mg/mlco-ffmrna(包封的)。zave＝70.3nm(dv(50)＝43.2nm；dv(90)＝80.3nm)。實(shí)施例5本實(shí)施例說明基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒提供高度有效遞送多核苷酸構(gòu)建體至一種或多種靶細(xì)胞、組織和器官的方法。經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)乙醇注射方法形成了基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒。(ponsa，等，int.j.pharm.(1993)95：51-56.)提前制備濃度為50mg/ml的脂質(zhì)的乙醇原液并將其貯藏于-20℃。通過以下步驟來合成優(yōu)化密碼子的螢火蟲熒光素酶(ffl)mrna：體外轉(zhuǎn)錄來自編碼基因的質(zhì)粒dna模板，然后加入5’帽結(jié)構(gòu)(capl)(fechter，p.等，j.gen.virology(2005)86∶1239-1249)和3’聚(a)尾巴(通過凝膠電泳確定其長大約為200個(gè)核苷酸)。存在于每個(gè)mrna產(chǎn)物中5’和3’非翻譯區(qū)分別由seqidno:4中的x和y表示。將fflmrna以1mg/ml的最終濃度在-80℃下貯藏在水中直至使用。經(jīng)由ribogreen測定(invitrogen)來確定所有mrna的濃度。通過在0.1％triton-x100存在和不存在下進(jìn)行ribogreen測定來計(jì)算mrna的包封。分別在1xpbs和1mmkcl溶液中使用malvernzetasizer儀器來確定粒徑(動(dòng)態(tài)光散射(dls))和ζ電位。將等分的50mg/mlhgt4003、dope、膽固醇和dmg-peg2000的乙醇溶液混合并用乙醇稀釋至3ml的最終體積。單獨(dú)地，從1mg/ml原液來制備fflmrna的緩沖水溶液(10mm檸檬酸鹽/150mmnacl，ph4.5)。將脂質(zhì)溶液快速注射至mrna水溶液內(nèi)并搖振以產(chǎn)生在20％乙醇中的最終懸浮液。將所得納米顆粒懸浮液過濾、用1xpbs(ph7.4)滲濾、濃縮并貯藏于2-8℃。最終濃度＝1.27mg/mlco-ffmrna(包封的)。zave＝60.9nm(dv(50)＝47.9nm；dv(90)＝75.3nm)。為了確定基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒是否能夠遞送包封的多核苷酸構(gòu)建體至一種或多種靶細(xì)胞，給cd-1小鼠注射單劑量的基于hgt4003的、包封有fflmrna的脂質(zhì)納米顆粒并在四小時(shí)后將其處死。如下所討論，經(jīng)由靜脈內(nèi)(iv)、腦室內(nèi)(icv)或鞘內(nèi)(it)施用途徑之一給動(dòng)物施用單劑量的基于hgt4003的、包封有fflmrna的脂質(zhì)納米顆粒。在生物發(fā)光測定中確定在fflmrna表達(dá)后在動(dòng)物的肝、脾、腦和脊髓中產(chǎn)生的螢火蟲熒光素酶蛋白的活性。簡而言之，使用promega熒光素酶測定系統(tǒng)(物品#e1500/e4500promega)進(jìn)行生物發(fā)光測定。如下進(jìn)行組織制備：將部分所需(快速冷凍的)組織樣品解凍、用ro/di水洗滌并置于陶瓷珠均質(zhì)管中。將組織用裂解緩沖液處理并均質(zhì)化。在進(jìn)行五次冷凍/解凍循環(huán)時(shí)，然后在4℃離心，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管。重復(fù)并將組織萃取物貯藏在-80℃。通過加入10ml熒光素酶測定緩沖液至熒光素酶測定底物并經(jīng)由渦旋混合來制備熒光素酶測定試劑。將20μl勻漿樣品上樣至96孔板，然后將每個(gè)樣品的20μl板對照上樣。單獨(dú)地，將120μl熒光素酶測定試劑上樣至96孔平底板的每個(gè)孔并且使用bioteksynergy2儀器將每個(gè)板插入至合適的室內(nèi)，并且以相對光單位(rlu)檢測發(fā)光度。通過施用單次大劑量的靜脈內(nèi)(iv)注射至研究動(dòng)物來評估本文所述的基于hgt4003的、包封有fflmrna的脂質(zhì)納米顆粒制劑。在四小時(shí)后，將動(dòng)物處死并且從每只動(dòng)物收獲肝和脾。檢測并分析經(jīng)由從遞送的外源ffl信使產(chǎn)生的ffl蛋白的發(fā)光度。圖1說明使用靜脈內(nèi)施用的基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒系統(tǒng)的實(shí)例，并且顯示與脾相比在肝中富集產(chǎn)生的超過數(shù)量級的ffl蛋白(分別為2.34x106rlu/蛋白mg對比1.71x105rlu/蛋白mg)，這說明基于hgt4003的納米顆粒的使用提供包封的物質(zhì)在肝中超過在脾中的富集。此外，通過經(jīng)由腦室內(nèi)(icv)或硬膜內(nèi)(it)施用途徑向研究動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)施用單次大劑量注射來評估基于hgt4003的、包封有fflmrna的脂質(zhì)納米顆粒制劑。四小時(shí)后，將動(dòng)物處死并從每只動(dòng)物收集腦和脊髓。檢測并分析經(jīng)由從遞送的外源ffl信使產(chǎn)生的ffl蛋白的發(fā)光度。如圖2所說明，在施用基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒之后，與it施用途徑相比，在icv施用途徑之后ffl蛋白的產(chǎn)生富集于腦中。在施用了(與所選的施用途徑無關(guān))基于hgt4003的、包封有ffl-mrna的脂質(zhì)納米顆粒制劑的每只動(dòng)物中觀察到高于基線的可檢測的發(fā)光信號。從高于背景的發(fā)光信號的存在推斷出外源施用的fflmrna的表達(dá)和來自此類fflmrna的螢火蟲熒光素酶蛋白的產(chǎn)生。在動(dòng)物的肝中觀察到的發(fā)光度增強(qiáng)超過了在脾中觀察到的相似信號，這表明脂質(zhì)納米顆粒在肝細(xì)胞和組織中的富集。類似地，當(dāng)經(jīng)由icv施用途徑施用基于hgt4003的、包封有fflmrna的納米顆粒時(shí)，相對于it路徑施用之后，其產(chǎn)生的ffl蛋白富集于腦中。相應(yīng)地，本實(shí)施例說明基于hgt4003的脂質(zhì)納米顆粒提供高度有效遞送多核苷酸構(gòu)建體至一種或多種靶細(xì)胞、組織和器官的方法。實(shí)施例6–凍干脂質(zhì)體制劑經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)乙醇注射方法形成脂質(zhì)納米顆粒(ponsa，等，int.j.pharm.(1993)95:51-56.)提前制備濃度為50mg/ml的脂質(zhì)的乙醇原液并將其貯藏于-20℃。將密碼子優(yōu)化的螢火蟲熒光素酶(ffl)mrna(seqidno:3)以最終濃度為1mg/ml在-80℃貯藏于水中直至使用。經(jīng)由ribogreen測定(invitrogen)來確定所有fflmrna的濃度。通過在0.1％triton-x100存在和不存在下進(jìn)行ribogreen測定來計(jì)算mrna的包封。分別在1xpbs和1mmkcl溶液中使用malvernzetasizer儀器來確定粒徑(動(dòng)態(tài)光散射(dls))和粒徑。使用293t細(xì)胞來評估包封的mrna制劑的體外活性，并且將與所選的制劑等量的10μgmrna與293t細(xì)胞一起在37℃下孵育8小時(shí)。使用perkinelmerbriteliteplus試劑盒來測量螢光素酶的產(chǎn)生。通常，通過將制備的脂質(zhì)體在包含凍干保護(hù)劑(蔗糖)的溶液中冷凍并隨后通過真空升華去除任何水或水分，來進(jìn)行脂質(zhì)納米顆粒的凍干。特別地，在凍干前，存在于脂質(zhì)體制劑中的緩沖液經(jīng)由離心由10％蔗糖來代替。然后將所得脂質(zhì)納米顆粒溶液進(jìn)行凍干工藝，所述凍干工藝的特征在于冷凍、初級干燥和二級干燥步驟的特定參數(shù)，所述參數(shù)如下表1所鑒定。在進(jìn)行下述物理表征和生化分析之前，用合適量的純化水復(fù)溶凍干餅狀物。表1實(shí)施例7將脂質(zhì)納米顆粒的制劑制備為包含包封于c12-200：dope：chol：dmg-peg2000(40：30：20：10，n/p2)脂質(zhì)納米顆粒中的螢火蟲熒光素酶mrna(ffl)。然后根據(jù)表1示出的方案，將制備的脂質(zhì)納米顆粒制劑的一部分批次凍干。根據(jù)上述方案將觀察到的新鮮(未凍干)和凍干脂質(zhì)納米顆粒制劑的物理性質(zhì)對比，并發(fā)現(xiàn)兩者的性質(zhì)一致。如在下表2中所說明，新鮮和凍干脂質(zhì)納米顆粒的平均粒徑(zave)分別為103.8nm和117.0nm。新鮮脂質(zhì)納米顆粒的多分散性指數(shù)(pdi)是0.236，相比而言凍干脂質(zhì)納米顆粒的多分散性指數(shù)為0.247。新鮮脂質(zhì)納米顆粒的dv50和dv90分別為60.2nm和156nm，相比而言凍干脂質(zhì)納米顆粒的dv50和dv90分別為49.0nm和176nm。相應(yīng)地，觀察到的物理特征還表明新鮮和凍干脂質(zhì)納米顆粒都是穩(wěn)定的，并且此外粒徑保持相對相當(dāng)。表2批次5926-48zave(nm)pdidv50(nm)dv90(nm)凍干前103.80.23660.2156凍干后117.00.24749.0176實(shí)施例8將脂質(zhì)納米顆粒的制劑制備為包含包封于dlinkc2-dma：dope：chol：dmg-peg2000(50：25：20：5，n/p5)脂質(zhì)納米顆粒中的螢火蟲熒光素酶mrna(ffl)。根據(jù)下表5示出的方案將制備的脂質(zhì)納米顆粒制劑的一個(gè)批次冷凍。通過在包含凍干保護(hù)劑(蔗糖)中冷凍制備的脂質(zhì)體并隨后通過真空升華去除任何水或水分，來進(jìn)行凍干工藝。特別地，在凍干前，脂質(zhì)體制劑中的緩沖液經(jīng)由離心由10％蔗糖替代。然后將所得脂質(zhì)體溶液進(jìn)行凍干工藝，所述凍干工藝的特征在于冷凍、初級干燥和二級干燥步驟的特定參數(shù)，所述參數(shù)如下表3所鑒定。在下述的物理表征和生化分析前，用合適量的純化水復(fù)溶凍干餅狀物。表3使用制備的新鮮(未凍干)和凍干制劑來遞送包封的fflmrna至293t細(xì)胞，并且根據(jù)上述方案來確定發(fā)光度。如下表4所說明，觀察到凍干前新鮮脂質(zhì)納米顆粒的發(fā)光度值為4.21x106，相對而言在凍干制劑復(fù)溶之后觀察到的發(fā)光度值為2.65x106。新鮮和凍干脂質(zhì)納米顆粒的平均粒徑(zave)分別為89.11nm和96.41nm。新鮮脂質(zhì)納米顆粒的多分散性指數(shù)(pdi)是0.205，相比而言凍干脂質(zhì)納米顆粒的多分散性指數(shù)為0.204。新鮮脂質(zhì)納米顆粒的dv50和dv90分別為63.8nm和117nm，相比而言凍干脂質(zhì)納米顆粒的dv50和dv90分別為65.1nm和135nm。如表6所顯示，在凍干期間較好地維持了粒徑和包封效率。新鮮和凍干脂質(zhì)納米顆粒的fflmrna的包封效率分別為93％和87％。此外，觀察到的物理特征表明新鮮和凍干脂質(zhì)納米顆粒都是穩(wěn)定的并且此外粒徑保持相對相當(dāng)。表4實(shí)施例9將脂質(zhì)納米顆粒的制劑制備為包括紅細(xì)胞生成素(epo)mrna(seqidno：4)，所述mrna位于分別在5’和3’端的seqidno：1和seqidno：2的側(cè)翼并包封于dlinkc2-dma：dope：chol：dmg-peg2000(50∶25∶20∶5，n/p5)脂質(zhì)納米顆粒中。根據(jù)表3示出的方案，將制備的脂質(zhì)納米顆粒制劑的一個(gè)批次凍干。人類紅細(xì)胞生成素(epo)mrna(seqidno：4)augggggugcacgaauguccugccuggcuguggcuucuccugucccugcugucgcucccucugggccucccaguccugggcgccccaccacgccucaucugugacagccgaguccuggagagguaccucuuggaggccaaggaggccgagaauaucacgacgggcugugcugaacacugcagcuugaaugagaauaucacugucccagacaccaaaguuaauuucuaugccuggaagaggauggaggucgggcagcaggccguagaagucuggcagggccuggcccugcugucggaagcuguccugcggggccaggcccuguuggucaacucuucccagccgugggagccccugcagcugcauguggauaaagccgucaguggccuucgcagccucaccacucugcuucgggcucugggagcccagaaggaagccaucuccccuccagaugcggccucagcugcuccacuccgaacaaucacugcugacacuuuccgcaaacucuuccgagucuacuccaauuuccuccggggaaagcugaagcuguacacaggggaggccugcaggacaggggacagauga根據(jù)上述方案對比凍干前后觀察到的脂質(zhì)納米顆粒制劑的物理性質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)兩者性質(zhì)一致。如下表5所說明，新鮮(未凍干)和凍干脂質(zhì)納米顆粒的平均粒徑(zave)分別為85.9nm和95.4nm，這表明新鮮和凍干脂質(zhì)納米顆粒都是穩(wěn)定的。新鮮脂質(zhì)納米顆粒的多分散性指數(shù)(pdi)是0.188，相比而言凍干脂質(zhì)納米顆粒的多分散性指數(shù)為0.231。新鮮脂質(zhì)納米顆粒的dv50和dv90分別為61.0nm和112nm，相比而言凍干脂質(zhì)納米顆粒的dv50和dv90分別為67.2nm和134nm。新鮮和凍干脂質(zhì)納米顆粒的epomrna的包封效率分別為94％和86％。如表7還顯示，在凍干期間較好維持了粒徑和包封效率。最終，使用r&dsystemshumanepoquantikineivdelisa試劑盒測量由293t細(xì)胞產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素蛋白。如表5所述，對于凍干前后的制劑，遞送epomrna至293t之后產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素蛋白是相當(dāng)?shù)?，并且?dāng)對比凍干前后的脂質(zhì)納米顆粒制劑時(shí)無明顯差異存在于紅細(xì)胞生成素蛋白的產(chǎn)生中。表5實(shí)施例10對包封有凍干epomrna的脂質(zhì)納米顆粒進(jìn)行六個(gè)月的穩(wěn)定性研究。確定粒徑分布、mrna包封效率以及epo在cd-1小鼠中的表達(dá)。脂質(zhì)制劑包括了如實(shí)施例9所述的kc2：dope：chol：dmgpeg2k(50：25：20：5)中包封的epomrna。n/p比(定義為陽離子脂質(zhì)中的氮的數(shù)目與核酸中磷酸的數(shù)目的比例)是5。將一個(gè)小瓶貯藏于2-8℃。將一個(gè)小瓶貯藏于室溫。不控制兩個(gè)貯藏條件的濕度。在物理表征和動(dòng)物研究之前，用合適量的注射用水復(fù)溶凍干餅狀物。用malvernzetasizernano-zs獲得粒徑。使用invitrogenribogreen測定試劑盒來確定脂質(zhì)顆粒中的mrna的包封效率。直接檢測未包封的mrna。在0.45％w/vtritonx-100存在下裂解脂質(zhì)納米顆粒后，測量總mrna。將包封效率計(jì)算為(總mrna–未包封的mrna)/總mrnax100％。使用野生型cd-1小鼠評估在單次iv施用兩個(gè)制劑的包封有hepomrna的脂質(zhì)納米顆粒之后epo的相對表達(dá)。在給藥施用后的6小時(shí)，測量血清中epo的水平。四只7周齡的cd-1小鼠(2只雄性，2只雌性)用于這一研究中。在到達(dá)時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)化至2個(gè)處理組，每組含有2只動(dòng)物(每組1只雄性，1只雌性)。在第一天，將動(dòng)物稱重并記錄體重。每只小鼠接受99μgmrna/動(dòng)物的單次iv劑量，而劑量體積為300μl/動(dòng)物。在給藥施用之后的6小時(shí)，將小鼠用co2窒息執(zhí)行安樂死，然后將其開胸并收集最大可獲得量的血液并將血液處理以得到血清。施用的所有處理在單次iv施用之后的cd-1小鼠中耐受良好。可通過elisa來測量hepo的血清水平。在來自接受了任一制劑的所有研究動(dòng)物的血清中觀察到了epo。測試結(jié)果總結(jié)與表6中。觀察到凍干脂質(zhì)納米顆粒在制冷溫度和室溫下貯藏6個(gè)月后，粒徑分布無顯著改變。此外，在貯藏期間脂質(zhì)納米顆粒中mrna的包封效率基本維持不變。這些結(jié)果表明在貯藏期間在凍干構(gòu)造中較好地維持了脂質(zhì)顆粒的完整性。在加速的室溫條件下6個(gè)月的穩(wěn)定性支持在制冷條件下潛在的2年有效期。此外，檢測在靜脈注射復(fù)溶的凍干脂質(zhì)納米顆粒(在制冷溫度或室溫貯藏之后)懸浮液之后的6h時(shí)野生型cd-1小鼠中的血清hepo。這些結(jié)果顯示在貯藏期間在凍干構(gòu)造中，有效地保護(hù)了脂質(zhì)顆粒的完整性。表6縮寫：1)zave(z平均)是強(qiáng)度分布的平均值；2)pdi(多分散性指數(shù))描述分布寬度；3)dv50是體積分布的中值；4)dv90意味著90％的體積分布位于該值之下。實(shí)施例11使用2-羥丙基-β-環(huán)糊精作為凍干保護(hù)劑進(jìn)行包封有mrna的脂質(zhì)納米顆粒的凍干研究。作為對比，還評估了蔗糖凍干保護(hù)劑。通過乙醇稀釋方法將mrna包封入c12-200：dope：chol：dmgpeg2k(40：30：25：5)脂質(zhì)顆粒內(nèi)。n/p比是20。用含有合適量的蔗糖或2-羥丙基-β-環(huán)糊精的水溶液經(jīng)由凍干前的離心來代替制劑中的緩沖液。對所得溶液進(jìn)行凍干工藝，所述凍干工藝的特征在于冷凍、初級干燥和二級干燥步驟的特定參數(shù)。表7描述含有蔗糖的制劑的凍干循環(huán)。表8描述含有2-羥丙基-β-環(huán)糊精的制劑的凍干循環(huán)。在物理表征和生化分析之前，用適合量的純化水復(fù)溶凍干餅狀物。用malvernzetasizernano-zs獲得粒徑。使用invitrogenribogreen測定試劑盒確定脂質(zhì)顆粒中mrna的包封效率。直接檢測未包封的mrna。在0.45％w/v的tritonx-100存在下裂解脂質(zhì)納米顆粒后測量總mrna。將包封效率計(jì)算為(總mrna–未包封的mrna)/總mrnax100％。使用野生型cd-1小鼠評估單次iv施用兩個(gè)制劑的包封有epomrna的脂質(zhì)納米顆粒之后的小鼠中epo的相對表達(dá)。在給藥施用后的6h，測量血清中epo的水平。每組使用三只7周齡的雄性cd-1小鼠。在到達(dá)時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)化至每組含有3只動(dòng)物的處理組。在第一天，將動(dòng)物稱重并記錄體重。每只小鼠接受15μgmrna/動(dòng)物的單次iv劑量，而劑量體積為50μl/動(dòng)物。在給藥施用之后的6h，將小鼠用co2窒息執(zhí)行安樂死，然后將其開胸并收集最大可獲得量的血液并將血液處理以得到血清。施用的所有處理在單次iv施用之后的cd-1小鼠中耐受良好。可通過elisa來測量epo的血清水平。在來自接受了任一制劑的所有研究動(dòng)物的血清中觀察到了epo。表7表8所有測試結(jié)果總結(jié)于表9中。當(dāng)使用與總脂質(zhì)的重量比為6:1的蔗糖作為凍干保護(hù)劑時(shí)，在凍干期間觀察到粒徑生長。然而，當(dāng)甚至以相對低的重量比(5:1)使用2-羥丙基-β-環(huán)糊精替代時(shí)，較好地維持了粒徑。n/p為20。此外，在凍干期間，較好地維持了脂質(zhì)納米顆粒中的mrna的包封效率。這些結(jié)果表明在凍干期間有效地保護(hù)了脂質(zhì)顆粒的完整性。此外，給藥施用后的6小時(shí)的野生型cd-1小鼠中的血清hepo水平在凍干前后是相當(dāng)?shù)??？傊?-羥丙基-β-環(huán)糊精對于用c12-200脂質(zhì)制備的包封有mrna的脂質(zhì)納米顆粒中，是有效的凍干保護(hù)劑。表9縮寫：1)zave(z平均)是強(qiáng)度分布的平均值；2)pdi(多分散性指數(shù))描述分布寬度；3)dv50是體積分布的中值；4)dv90意味著90％的體積分布位于該值之下上述實(shí)施例說明凍干脂質(zhì)納米顆粒制劑顯示相對于制備的未凍干脂質(zhì)納米顆粒相當(dāng)或相等的物理特征，所述物理特征包括相對穩(wěn)定性、脂質(zhì)納米顆粒的粒徑和包封效率。就包封的mrna多核苷酸而言，凍干脂質(zhì)納米顆粒還顯示了相當(dāng)?shù)牡鞍桩a(chǎn)生。例如，評估的幾種凍干脂質(zhì)納米顆粒組合物顯示了通過發(fā)光信號的存在所確定的相當(dāng)?shù)奈灮鹣x熒光蛋白產(chǎn)生，并從而推斷出外源施用的包封的mrna的表達(dá)和/或產(chǎn)生。上述結(jié)果表明本文所述的凍干脂質(zhì)納米顆粒組合物和制劑是穩(wěn)定的并能夠?qū)獾幕衔?如，多核苷酸)的降解最小化。期望在制冷或環(huán)境溫度的貯藏條件下此類凍干脂質(zhì)納米顆粒組合物具有增加的有效期，從而呈現(xiàn)改進(jìn)與此類藥物組合物相關(guān)的可用性和潛在成本的有吸引力的方法。當(dāng)前第1頁12