本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和分子靶向治療領(lǐng)域，具體涉及天然納米囊泡外秘體、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

外泌體(exosome)作為物質(zhì)運(yùn)輸載體在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信息交流中發(fā)揮重要作用，它們可以傳遞多種生物分子調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境，包括mRNA，miRNA及蛋白等。既往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮調(diào)控作用。

本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)來源于腫瘤細(xì)胞的外泌體可在體內(nèi)和體外降低細(xì)胞對索拉菲尼的敏感性，腫瘤來源外泌體可通過保護(hù)索拉菲尼引起的細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)細(xì)胞激活HGF/c-Met/Akt信號(hào)通路激發(fā)藥物敏感性的降低抵抗。因此，本發(fā)明獲得的外泌體具有以下應(yīng)用：1、在體外細(xì)胞上誘導(dǎo)發(fā)生對索拉非尼的敏感性降低；2、在體內(nèi)動(dòng)物荷瘤模型上誘導(dǎo)發(fā)生對索拉非尼的敏感性降低；3、在體內(nèi)外將該外秘體用于保護(hù)細(xì)胞免受藥物引起的細(xì)胞凋亡；4、在體內(nèi)外將該外秘體用于激活細(xì)胞的HGF/c-Met/Akt信號(hào)通路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開并提供了一種來源于腫瘤細(xì)胞的天然脂質(zhì)納米囊泡結(jié)構(gòu)即外秘體的制備方法，及其在制備調(diào)控肝細(xì)胞癌對索拉非尼敏感性以及c-Met信號(hào)通路制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明通過差速離心的方法提取獲得腫瘤細(xì)胞的外泌體，這些外泌體可以在體內(nèi)和體外明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的抵抗，且高侵襲腫瘤細(xì)胞來源的外泌體作用更強(qiáng)。腫瘤來源的外泌體可通過保護(hù)化療藥物引起的細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞激活HGF/c-Met/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)藥物抵抗。因此，本發(fā)明獲得的外泌體具有以下應(yīng)用：1、在體外細(xì)胞上誘導(dǎo)發(fā)生對索拉非尼的敏感性降低；2、在體內(nèi)動(dòng)物荷瘤模型上誘導(dǎo)發(fā)生對索拉非尼的敏感性降低；3、在體內(nèi)外將該外秘體用于保護(hù)細(xì)胞免受藥物引起的細(xì)胞凋亡；4、在體內(nèi)外將該外秘體用于激活細(xì)胞的HGF/c-Met/Akt信號(hào)通路。

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

附圖說明

圖1不同細(xì)胞系來源的外泌體的特征

圖2熒光顯微鏡檢測示MHCC-97H來源的外泌體被肝癌細(xì)胞內(nèi)化、吸收

圖3肝癌細(xì)胞來源的外泌體誘導(dǎo)肝癌索拉非尼抵抗，索拉菲尼聯(lián)合肝癌細(xì)胞來源的外泌體組裸鼠皮下腫瘤體積明顯大于單獨(dú)應(yīng)用索拉菲尼組，且高侵襲肝癌細(xì)胞來源的外泌體促索拉菲尼抵抗效果強(qiáng)于低侵襲來源的外泌體組

圖4肝癌來源的外泌體體外誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞索拉菲尼抵抗

圖5肝癌細(xì)胞來源的外泌體體外逆轉(zhuǎn)索拉菲尼引起的肝癌細(xì)胞凋亡

圖6 TUNEL法檢測肝癌來源的外泌體體內(nèi)對索拉菲尼引起的肝癌細(xì)胞凋亡的影響

圖7肝癌細(xì)胞來源的外泌體降低索拉菲尼引起的凋亡相關(guān)蛋白caspase和PARP水平

圖8肝癌細(xì)胞來源的外泌體通過HGF/c-Met/Akt信號(hào)通路影響索拉菲尼抵抗

具體實(shí)施方式

實(shí)施例 外秘體的制備及對索拉非尼敏感性調(diào)控的體內(nèi)外效應(yīng)研究

1材料和方法

1.1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721來自上海生科院細(xì)胞庫，MHCC-97H，MHCC-97L和LO2來自復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所。MHCC-97H，MHCC-97L用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，LO2用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞系培養(yǎng)在37℃、含5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中。

1.2外泌體抽提

MHCC-97L，MHCC-97H和LO2細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清(超速離心過夜去除外泌體)的相應(yīng)培養(yǎng)基中。48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，按先前文獻(xiàn)描述的通過差速離心的方法提取相應(yīng)的外泌體[Thery C,Amigorena S,Raposo G,Clayton A:Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.Curr Protoc Cell Biol 2006,Chapter 3:3-22.]。最后，采用BCA蛋白濃度測定外泌體內(nèi)的蛋白含量；Western blotting方法檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD9和CD63。提取的外泌體存放于80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3動(dòng)物模型

所有的實(shí)驗(yàn)程序都遵循中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)法規(guī)。25只雄性裸鼠(4-6周齡)購于海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有裸鼠經(jīng)利多卡因局部浸潤麻醉后(0.25％)在右腋窩皮下注射SMMC-7721細(xì)胞(1×10⁷細(xì)胞/200μL PBS每只)。當(dāng)腫瘤達(dá)到體積50-100mm³時(shí)，將鼠隨即分為5組(n＝5，分別為對照組，索拉菲尼組，索拉菲尼+LO2外泌體組，索拉菲尼+MHCC97L外泌體組，索拉菲尼+MHCC97H外泌體組)。索拉非尼(100mg/kg，Selleck，USA)經(jīng)裸鼠腹腔注射，同時(shí)裸鼠瘤體皮下注射不同來源的外泌體(100μg總蛋白/100μL PBS)。皮下注射等體積PBS作為對照。每2天檢查裸鼠腫瘤體積。皮下注射處理二十五天后，所有小鼠經(jīng)水合氯醛(5％,100μL/10g)麻醉后頸椎脫臼法處死。

1.4細(xì)胞活力分析

用MTT法檢測細(xì)胞存活率。簡言之，5×10³接種在96孔板上。經(jīng)索拉菲尼單獨(dú)或聯(lián)合不同來源外泌體共同孵育24或48小時(shí)，20μL MTT溶液(0.5％)添加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4h后，培養(yǎng)基中取出，150μL DMSO添加到每孔并搖床震蕩10min。最后用分光光度計(jì)測定490nm的有色溶液的吸光度。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三遍。

1.5Western blot分析

肝癌細(xì)胞經(jīng)含1％蛋白酶抑制劑(Thermo，USA)的RIPA裂解緩沖液(碧云天，中國)裂解，等量的蛋白質(zhì)經(jīng)10％SDS-PAGE電泳。CD9、CD63、GAPDH、caspase-9，caspase-3，PARP，c-Met，p-met，AKT，P-AKT、VEGFR2和p-VEGFR2等抗體來自美國CST公司。MET抑制劑crizotinib(PF-02341066)和磷酸化Akt抑制劑MK-2206 2hcl購自中國Selleck化學(xué)公司。一抗孵育后經(jīng)與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二次抗體孵育4h。蛋白條帶采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Millipore，USA)顯示。

1.6熒光顯微鏡分析

MHCC-97H來源的外泌體經(jīng)CM-DIL(Sigma，USA)標(biāo)記，方法如下，100μg MHCC-97H來源的外泌體經(jīng)1ml PBS稀釋，2μl CM-DIL與1ml外泌體懸液室溫孵育15min。然后加入18mL PBS，4℃下120000g離心2小時(shí)，除去上清，沉淀經(jīng)20mL PBS重懸，再次4℃下120000g離心2小時(shí)。含CM-Dil標(biāo)記的外泌體沉淀經(jīng)200μl PBS重懸。SMMC-7721-GFP細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞爬片上至匯合度約80％。在培養(yǎng)基中加入含CM-Dil標(biāo)記的外泌體溶液，在37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。培養(yǎng)后的細(xì)胞，PBS洗兩次，然后經(jīng)4％多聚甲醛固定10分鐘。爬片經(jīng)抗淬滅劑處理，利用熒光顯微鏡觀察分析。

1.7TUNEL分析

裸鼠皮下腫瘤標(biāo)本經(jīng)常規(guī)方法石蠟包埋、切片。凋亡細(xì)胞采用TUNEL法檢測。操作步驟按照原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物，中國)指示。簡言之，20mg/mL的蛋白酶K試劑在室溫下與細(xì)胞孵育30min，經(jīng)平衡溶液孵育10秒鐘。細(xì)胞用PBS洗一遍后，37℃下經(jīng)100ul Streptacidin-FITC處理1小時(shí)。然后，細(xì)胞再次經(jīng)PBS洗滌三遍，每個(gè)樣本滴加100ul的DAPI工作液，避光室溫5min。PBS浸泡5min，清洗3次。最后細(xì)胞經(jīng)熒光顯微鏡(Olympus BX41，日本)觀察拍照。

1.8ELISA分析

細(xì)胞上清中的肝細(xì)胞生長因子濃度檢測應(yīng)用ELISA試劑盒方法(依科賽，中國)，操作步驟按照試劑盒指示。簡而言之，在細(xì)胞經(jīng)索拉非尼和肝癌細(xì)胞來源的外泌體處理48h后，5000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞上清。含10％FBS上清作為實(shí)驗(yàn)對照。

1.9統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異分析應(yīng)用t檢驗(yàn)或ANOVA法分析。P值小于0.05，被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果：

2.1腫瘤來源外泌體提取及特征鑒定

為了檢測腫瘤細(xì)胞來源的外泌體在肝癌細(xì)胞索拉菲尼耐藥中的作用，我們首先從兩種不同侵襲潛力的肝癌細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離外泌體。我們選擇MHCC97H和MHCC97L兩種普通的肝癌細(xì)胞系。MHCC97H細(xì)胞在本研究代表較高侵襲潛力。我們應(yīng)用超速離心方法從上述兩種腫瘤細(xì)胞中提取外泌體，利用透射電鏡及qNano instrument檢測，見外泌體鏡下成圓形，直徑約40-120nm(圖1)。兩種腫瘤細(xì)胞來源的外泌體均表達(dá)標(biāo)志蛋白CD9和CD63(圖 1)。

由本部分結(jié)果可知我們成功分離制備獲得了腫瘤細(xì)胞來源的外秘體。

2.2腫瘤來源的外泌體可被肝癌細(xì)胞吸收

為檢測外泌體是否可被肝癌細(xì)胞吸收內(nèi)化，我們采用MHCC-97H來源的外泌體，進(jìn)行CM-DIL染料標(biāo)記，具體操作步驟過程間材料和方法部分。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)CM-Dil標(biāo)記的外泌體可像胞內(nèi)囊泡一樣被SMMC-7721-GFP細(xì)胞吸收內(nèi)化(圖2)。研究表明，肝癌細(xì)胞來源的exosomes可以被細(xì)胞吸收和內(nèi)化。

由本部分結(jié)果可知我們分離制備獲得的腫瘤細(xì)胞來源的外秘體可以被細(xì)胞吸收和內(nèi)化。

2.3腫瘤來源的外泌體體內(nèi)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼抵抗

為檢測腫瘤來源外泌體是否可誘導(dǎo)肝癌化療抵抗，我們建立了裸鼠皮下移植瘤模型，然后聯(lián)合注射索拉菲尼和腫瘤來源的外泌體。如圖3所示，索拉菲尼聯(lián)合MHCC97H和MHCC97L外泌體注射組腫瘤明顯大于單獨(dú)索拉菲尼注射組；聯(lián)合外泌體注射組明顯抑制索拉菲尼化療效果，腫瘤生長更快。有意思的是，高侵襲肝癌來源的外泌體(MHCC97H)組效果較低侵襲組(MHCC97L)效果更明顯。各組腫瘤體積及重量見圖3。高侵襲肝癌來源的外泌體組腫瘤體積幾乎是對照組腫瘤體積2倍，重量約為3倍。

由本部分結(jié)果可知我們分離制備獲得的腫瘤細(xì)胞來源的外秘體可以下調(diào)體內(nèi)動(dòng)物模型移植荷載的細(xì)胞對索拉非尼的敏感性。

2.4腫瘤來源的外泌體體外誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼抵抗

為檢測體外實(shí)驗(yàn)中腫瘤來源的外泌體是否可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721對索拉菲尼抵抗，我們首先明確了索拉菲尼可劑量依賴的抑制SMMC7721細(xì)胞增殖。然后我們將SMMC7721細(xì)胞加入特定濃度的索拉菲尼，并根據(jù)目的與不同來源的外泌體共培養(yǎng)。然后應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MHCC97H和MHCC97L外泌體處理組較單獨(dú)應(yīng)用索拉菲尼組細(xì)胞增殖率明顯升高。并且。MHCC97H外泌體組較MHCC97L外泌體組促細(xì)胞增殖效果更明顯(圖4)。

由本部分結(jié)果可知我們分離制備獲得的腫瘤細(xì)胞來源的外秘體可以下調(diào)體外細(xì)胞對索拉非尼的敏感性。

2.5腫瘤來源的外泌體抑制索拉菲尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡

為檢測腫瘤來源的外泌體是否可影響索拉菲尼促細(xì)胞凋亡作用，我們應(yīng)用流式和TUNEL方法分別檢測肝癌來源的外泌體在體內(nèi)、體外對索拉菲尼引起的肝癌細(xì)胞凋亡的影響。并應(yīng)用Western blot檢測不同濃度的索拉菲尼對SMMC7721細(xì)胞cleaved caspase-9,cleaved caspase-3和cleaved PARP等凋亡蛋白的影響，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MHCC97H和MHCC97L外泌體處理后，體外、體內(nèi)索拉菲尼引起的肝癌細(xì)胞凋亡率明顯降低(圖5，6)。cleaved caspase-9,cleaved caspase-3和cleaved PARP等凋亡蛋白較索拉菲尼處理組表達(dá)降低，肝癌來源的外泌體可一定程度的逆轉(zhuǎn)索拉菲尼引起的促凋亡作用(圖5-7)，并且高侵襲肝癌細(xì)胞系MHCC97H來源的外泌體較低侵襲肝癌細(xì)胞系MHCC97L來源的外泌體效果更明顯。

由本部分結(jié)果可知我們分離制備獲得的腫瘤細(xì)胞來源的外秘體在體內(nèi)和體外可以抑制索拉菲尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.6腫瘤來源的外泌體通過HGF/c-Met/Akt通路影響索拉菲尼抵抗

為探究腫瘤來源的外泌體對索拉菲尼抵抗的作用因素，我們檢測了不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中HGF的水平。我們結(jié)果顯示，腫瘤來源的外泌體處理48小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清HGF含量較對照組增高3倍(圖8)，我們用Western blot法檢測了各組磷酸化的Met，Akt的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MHCC97H和MHCC97L外泌體處理后，p-Met和p-Akt較索拉菲尼組升高(圖8)。

由本部分結(jié)果可知我們分離制備獲得的腫瘤細(xì)胞來源的外秘體在體外細(xì)胞上可以激活HGF/c-Met/Akt通路。