本發(fā)明屬于抗病毒研究技術領域，具體涉及一氧化碳釋放分子-2制劑及其在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物上的應用和檢測方法。

背景技術：

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine repsoductive and respiratory syndrome,PRRS)，又稱豬藍耳病，是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine repsoductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的，能引起妊娠母豬繁殖障礙(后期出現流產、弱胎、死胎、木乃伊胎等)及各年齡段豬特別是仔豬呼吸道癥狀(間質性肺炎)和高死亡率為主要特征的豬重要傳染病，因此對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。

豬繁殖與呼吸綜合征對整個養(yǎng)豬行業(yè)構成嚴重威脅，由于人們對該病免疫逃逸的分子機制缺乏了解，目前疫苗的使用也不能提供有效且可持續(xù)的疾病控制，特備是對那些RNA類病毒更是無能為力；同時基于對健康安全食品的關注和需求，動物抗生素的使用已引起越來越多消費者的反對。因此，開發(fā)有效的抗病毒藥物及制定新型抗病毒策略仍然極為重要和迫切。

CORM-2(Tricarbonyldichlororuthenium(II)dimer)，中文名稱是一氧化碳釋放分子-2，其結構式如式I所示：

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一氧化碳釋放分子-2制劑，以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。

本發(fā)明的另一個目的是提供一氧化碳釋放分子-2制劑在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物上的應用。

本發(fā)明的另一個目的是提供一氧化碳釋放分子-2制劑的檢測方法。

本發(fā)明通過體外實驗發(fā)現CORM-2具有明顯抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制的作用，為通過藥物治療增強對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的防控提供有力支持。因此，本發(fā)明提供一種CORM-2在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物上的應用，同時本發(fā)明提供一種CORM-2在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制制劑。

本發(fā)明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：

本發(fā)明通過體外實驗發(fā)現CORM-2具有明顯抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制的作用，為通過藥物治療增強對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的防控提供有力支持。因此，本發(fā)明提供一種CORM-2在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物上的應用，同時本發(fā)明提供一種CORM-2在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制制劑中的應用。

一種抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的藥物制劑，包括有效量的CORM-2和藥學上可接受的輔料。優(yōu)選地，所述藥物制劑為注射制劑或口服制劑。更優(yōu)選地，所述注射制劑為凍干粉針劑；所述口服制劑為散片劑、膠囊劑或顆粒劑。

本發(fā)明首先采用qPCR、western blot、TCID₅₀和間接免疫熒光技術檢測CORM-2這種藥物對豬繁殖與呼吸綜合征病毒在Marc-145細胞中復制的影響。然后再通過qPCR，western blot和TCID₅₀檢測CORM-2對豬繁殖與呼吸綜合征病毒在PAM細胞復制的影響，在上述結果的基礎上對COMR-2的抗病毒效果進行評價。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明的CORM-2生產工藝成熟，可以為抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的藥物制備提供充足的原料。

2、本發(fā)明的CORM-2抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的效果明顯，本發(fā)明通過體外實驗發(fā)現，CORM-2能顯著抑制PRRSV在Marc-145細胞和PAM細胞中復制與增殖。

3、本發(fā)明使用方便，藥品為粉末制劑，2-8℃密封保存即可保存，易于運輸，且即溶即用。

附圖說明

圖1是qPCR檢測不同濃度CORM-2處理后PRRSV ORF7 mRNA表達。

圖2是western blot檢測不同濃度CORM-2處理對PRRSV感染Marc-145細胞的影響。

圖3是不同濃度CORM-2處理后Marc-145細胞培養(yǎng)上清PRRSV TCID₅₀的測定。

圖4間接免疫熒光檢測不同濃度CORM-2處理對PRRSV N蛋白表達的影響。圖4為合并紅光和藍光的結果，其中，中間的藍色部分為細胞核部分，由DAPI染色；左側的紅色熒光為標記了TRITC的病毒N蛋白。

圖5是qPCR檢測不同濃度CORM-2處理后PAM細胞中PRRSV ORF7mRNA表達。

圖6是western blot檢測不同濃度CORM-2處理對PRRSV感染PAM細胞的影響。

圖7是不同濃度CORM-2處理后PAM細胞培養(yǎng)上清PRRSV TCID₅₀的測定。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實施例中如無特殊說明，均為本領域常規(guī)實驗技術。

本發(fā)明實施例中選用Marc-145細胞(恒河猴腎細胞MA-104的衍生細胞系)作為PRRSV高致病毒株GD-HD的營養(yǎng)基質，為PRRSV繁殖提供營養(yǎng)，因此選用Marc-145細胞不對本發(fā)明的范圍做任何限定。

實施例中所用材料來源：

CORM-2購自Sigma公司；DMEM，RPMI1640、胎牛血清(FBS)購自Gibco；GD-HD-PRRSV由西北農林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)免疫生物學課題組分離；FastStart Universal SYBR Green Master購自Roche公司；Primescript RT reagent Kit購自大連寶生；滅活CORM-2(iCORM-2)的制備如下所述：CORM-2溶于DMSO后，在37℃，5％CO₂的潮濕條件下孵育24h，以充分釋放一氧化碳。Marc-145細胞(恒河猴腎細胞MA-104的衍生細胞系)登載于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號GDC041)的目錄中，處于公開狀態(tài)，科學工作者可向該菌種保藏中心索取。豬肺泡巨噬細胞(PAM)來源詳見下文所述。針對PRRSV N蛋白的特異性單克隆抗體由西北農林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)免疫生物學課題組制備。

實施例1 qPCR檢測細胞內PRRSV ORF7基因mRNA相對表達量樣品的收集

PRRSV接種80％匯合度的Marc-145細胞，37℃孵育1h，吸棄病毒液，細胞用1×PBS洗3次，分別加入含有不同濃度的CORM-2(50μM、100μM、150μM)以及3％胎牛血清的DMEM維持液培養(yǎng)基于37℃，5％CO₂的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；同時用不含CORM-2的3％胎牛血清的DMEM維持液培養(yǎng)基及加入含150μM iCORM-2的維持液培養(yǎng)基作為對照，24hpi收集細胞及上清。

細胞樣品總RNA提取

(1)每10⁷個/細胞加入1ml Trizol，吹打混勻至無肉眼可見沉淀，室溫靜止5min。

(2)向上述勻漿裂解液中加入氯仿(1/5Trizol的體積量)，蓋緊離心管蓋，用渦旋振蕩儀振蕩15s。待溶液充分乳化(無明顯分層現象)后，再室溫靜置5min。

(3)12000g，4℃離心5min。

(4)從離心機中小心取出離心管，此時勻漿分為三層，無色的上清、中間白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。小心吸取上清轉移至另一新的離心管中(切記勿吸出白色中間層)。

(5)向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10min。

(6)12000g 4℃離心10min；離心后，試管底部出現白色沉淀。

(7)RNA沉淀的清洗：小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75％乙醇1ml(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，12000g 4℃離心5min，小心棄去乙醇，應盡量使乙醇揮發(fā)干凈。

(8)RNA溶解：室溫干燥沉淀，加入適量的RNase-free水溶解，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存待用。

實時熒光定量PCR(qPCR)檢測的方法與步驟

(1)總RNA濃度的測定：每個吸取2.0μl總RNA樣品，使用BioTek微孔定量方法測定所提取的樣品總RNA的濃度(ng/μl)；

(2)反應混合液的配制：按下列組份在冰上配制反應混合液qPCR反轉錄反應體系，如表1所示。

表1

(3)進行反轉錄反應：反轉錄條件如下，如表2所示。

表2

qPCR檢測引物及檢測方法

qPCR檢測引物序列，如表3所示。

表3

cDNA樣品稀釋：將反轉錄獲得的cDNA按照1:10(10μl cDNA+90μl ddH2O)比例進行稀釋并充分混勻置于冰上待做進一步檢測。

qPCR檢測：

qPCR反應混合液配制如下，如表4所示。

表4

將上述各成分依次加入EP管中混合均勻，將混合液轉移至qPCR反應八連管中，7.5μl/孔，然后取稀釋好的cDNA分別加入八連管中，2.5μl/孔，蓋好八連管蓋子后，輕彈管壁充分混勻后立即進行qPCR反應。

(4)qPCR反應條件，如表5所示。

表5

從細胞內PRRSV ORF7基因相對定量(圖1)檢測結果可以看出，隨著CORM-2濃度的增加，病毒ORF7基因的表達逐漸降低，且與對照組比較差異顯著，而滅活的iCORM-2對PRRSV ORF7基因表達無顯著影響。

實施例2Western blot檢測CORM-2對PRRSV感染Marc-145細胞的影響

Western blot檢測蛋白樣品來自實施例1所收集的細胞樣品。

(1)準備：用自來水沖洗燒杯、電泳儀及其配件，然后用去離子水沖洗干凈，晾干備用。玻璃板和梳子分別沖洗干凈后再用去離子水沖洗，晾干備用。

(2)配制12％分離膠先組裝好膠板，根據所需要的分離膠濃度按照下表查找每種成分的使用量及比例，如表6所示。

表6 12％分離膠配方

在燒杯中依次加入超純水、30％丙烯酰胺、1.5M Tris-HCl緩沖液、10％APS在抽氣機上將混合液中的空氣充分抽干后再加入10％SDS，最后加TEMED。加入TEMED后充分混勻，立即用1ml移液器加入到膠板中。然后，在膠上輕輕加入去離子水封閉，以防蒸發(fā)。分離膠室溫30min左右即可凝固。然后按照下表配制5％積層膠，如表7所示。

表7 5％的積層膠配方

燒杯中依次加入超純水、30％丙烯酰胺、1.0M Tris-HCl緩沖液、10％SDS、10％APS、此時，倒掉分離膠上的超純水，并用濾紙小心吸干殘留水分，再將TEMED加入燒杯中，混勻后立即用移液器加入到分離膠上，插入合適的梳子。積層膠20min左右即可完全凝固。

(3)加樣：小心拔掉梳子，組裝好電泳儀，然后倒入1×Running Buffer，將蛋白Marker和樣品依次加入膠孔中，并做好記錄。

(4)跑膠：Bio-Rad電泳儀固定在200V跑膠，當溴酚藍染帶剛剛要跑出時停止跑膠。

(5)轉膜：PVDF膜的處理：將事先裁好的和膠條一樣大小的PVDF膜浸入甲醇中，活化15s，然后將膜直接浸入轉膜液中，濾紙則直接浸入轉膜液中，使其平衡。轉膜：采用Bio-Rad轉膜儀，從負極到正極依次為海綿、3層濾紙、膠條、PVDF膜、3層濾紙、海綿。用鏟子輕輕趕出濾紙、膠條、膜之間的氣泡后，固定好夾子開始用150mA恒定電流在冰水混合物種開始轉膜。

(6)免疫反應：

a.轉膜完畢后，將PVDF膜小心取出，置于封閉液中室溫輕搖孵育1h。

b.棄掉封閉液，用PBS’T在搖床上劇烈搖晃洗膜，5min×4次。

c.加入用封閉液稀釋好的針對目的蛋白的一抗，4℃搖床輕搖孵育過夜。

d.棄掉一抗，PBS’T在搖床上劇烈搖晃洗膜，5min×4次。

e.加入HRP-標記的用封閉液稀釋好的二抗，室溫輕搖孵育1h。

f.棄掉二抗，PBS’T洗膜，5min×4次。

(7)ECL發(fā)光試劑盒顯色。

從圖2可以看出，當CORM-2以濃度梯度依賴性方式抑制PRRSV N蛋白表達，而iCORM-2對N蛋白表達無顯著影響。

實施例3不同濃度CORM-2處理后Marc-145細胞培養(yǎng)上清PRRSV TCID₅₀的測定

(1)鋪板，將胰酶消化好的Marc145細胞調整密度為1×10⁵個/ml，加到96空細胞培養(yǎng)板中，175μl/well大約24h長成單層。

(2)在96孔細胞培養(yǎng)板中用無血清的DMEM培養(yǎng)基將病毒液(病毒液來自實施例1所收集上清)作連續(xù)10倍的梯度稀釋，從10^-1～10^-10。

(3)將稀釋好的病毒接種到Marc145單層細胞上，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μL，正常細胞對照作兩縱排，37℃，5％CO₂孵育1h后換成3％FBS+DMEM維持液并置于37℃，5％CO₂的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(4)逐日觀察并記錄結果，一般需要觀察5～7天。

(5)TCID₅₀的計算：Karber法計算如下：lgTCID₅₀＝L-D(s-0.5)；L：最高稀釋度的對數；D：稀釋度對數之間的差；S：陽性孔比率總和。

從圖3可以看出，隨著CORM-2濃度的增加，上清中PRRS病毒的滴度在下降，且呈劑量依賴性。而iCORM-2對上清病毒滴度無顯著抑制作用。

實施例4間接免疫熒光法檢測不同濃度CORM-2處理對病毒N蛋白表達的影響

(1)鋪板：將Marc-145細胞以1×10⁵個細胞/ml的密度加到24孔細胞培養(yǎng)板上，每孔500μl，大約24h達到80％匯合度。

(2)接毒：PRRSV接毒量為0.1MOI，37℃孵育1h，棄掉病毒液，1×PBS洗3次，加入含不同濃度CORM-2的3％FBS+DMEM維持液后繼續(xù)培養(yǎng)。

(3)固定：培養(yǎng)約24h等細胞稍出現CPE現象，將毒液棄掉，加入400μl/孔的75％乙醇(需事先放在-20℃預冷)，4℃固定30min。

(4)洗板：棄掉固定液，在洗板機上震蕩洗板，400μl/孔PBS洗5min/次×4次，在生物安全柜中將24孔板吹干。

(5)孵育一抗：每孔加入150μl用PBS稀釋好的抗PRRSV N蛋白的單抗6D10(1:300稀釋)，37℃孵育1h。

(6)洗板：在洗板機上震蕩洗板，400μl/孔PBS洗5min/次×4次。

(7)孵育二抗：每孔加入150μl用PBS稀釋好的TRITC標記的羊抗鼠IgG熒光二抗(1:300稀釋)，37℃避光孵育1h。

(8)染細胞核：在熒光二抗孵育將要結束的最后5min，加入100μl/孔的4’,6’-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染色細胞核(DAPI用PBS按1:10000比例稀釋)。

(9)洗板：在洗板機上震蕩洗板，400μl/孔PBS洗5min/次×4次。

(10)觀察熒光：去掉水，避光干燥后鏡檢?；蚣尤?00μl PBS后直接鏡檢。

從圖4可以看出，隨著CORM-2的增加，標記了TRITC的N蛋白表達(左側的紅色熒光)在減少，且呈劑量依賴性。而不加CORM-2的對照組和iCORM-2處理組N蛋白表達并無顯著變化。從而更加確認CORM-2在PRRSV感染Marc-145細胞過程中可以發(fā)揮抗病毒作用。

實施例5不同濃度CORM-2處理后PAM細胞中PRRSV ORF7 mRNA表達的檢測

PAM細胞的分離

(1)將托盤、廢物缸置于生物安全柜中經紫外燈照射進行滅菌。

(2)將從豬體內采集得到的完整的肺臟用含雙抗的PBS沖洗干凈。

(3)肺臟置于托盤中，用止血鉗夾住食管，將肺臟輕輕上提，用剪刀從氣管打結點稍下2cm處剪去扎口，用10ml吸管吸取含雙抗的PBS從此處灌入肺臟，體積約150ml-250ml，輕輕揉捏拍打肺臟，然后將吸管插入氣管中，不斷的吸出灌洗液至滅菌藍口瓶中；如此反復灌洗肺臟2～4次，盡量灌洗出肺泡巨噬細胞。

(4)收集得到的灌洗液用不銹鋼篩網過濾至新的無菌藍口瓶中。

(5)過濾后的灌洗液分裝到50ml離心管中，500r/min離心10min。

(6)棄去上清，加入20ml含雙抗PBS重懸細胞，500r/min離心10min，洗滌細胞1次。

(7)棄去上清，用10ml 10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，將所有管中的PAM重懸并合入一個管中，準備細胞計數。

(8)對獲得的PAM細胞稀釋后進行計數。

(9)根據計數結果，依照不同試驗目的，加入相應體積的10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞密度鋪板，多余的PAM細胞進行凍存。

(10)根據細胞數量，按每管1ml，每毫升2×10⁷個細胞密度，計算所需的凍存液體積，依照血清：DMSO＝9:1比例配置凍存液。

(11)500r/min離心10min，棄去上清，用凍存液將細胞重懸并分裝至凍存管中，按要求標記清楚后裝入程序降溫盒中于-80℃過夜，次日轉入液氮中進行冷凍保存。

樣品收集

原代PAM細胞以5×10⁵個細胞/孔的密度鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中。待細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)上清，加入含PRRSV但不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃孵育1h，吸棄病毒液，分別加入含有不同濃度CORM-2(50μM、100μM、150μM)的3％胎牛血清的RPMI1640維持液培養(yǎng)基于37℃，5％CO₂的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；同時用不含CORM-2的3％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基及加入150μM iCORM-2的維持液培養(yǎng)基作為對照，24hpi收集細胞及上清。

qPCR檢測方法同實施例1中所描述的方法。

從PAM細胞內PRRSV ORF7基因qPCR檢測結果(圖5)可以看出，隨著CORM-2濃度的增加，病毒ORF7基因的表達逐漸降低，且與對照組比較差異顯著，而滅活的iCORM-2對PRRSV ORF7基因表達無顯著影響。

實施例6Western blot檢測不同濃度CORM-2對PRRSV感染PAM細胞的影響

Western blot檢測樣品來自實施例5所收集的細胞樣品。

Western blot檢測方法同實施例2中所描述的方法。

Western blot檢測結果如圖6所示，與未經CORM-2處理對照組相比，CORM-2以濃度依賴性方式抑制PRRSV N蛋白表達，而iCORM-2對N蛋白表達無顯著影響。

實施例7不同濃度CORM-2處理后PAM細胞培養(yǎng)上清PRRSV TCID₅₀的測定

TCID₅₀測定上清樣品來自實施例5所收集的細胞培養(yǎng)上清。

TCID₅₀測定方法同實施例3中所描述的方法。

TCID₅₀測定結果如圖7所示，與未經CORM-2處理對照組相比，CORM-2濃度梯度依賴性降低PAM細胞培養(yǎng)上清中子代病毒滴度，而iCORM-2對上清TCID₅₀無顯著影響。

以上對本發(fā)明的具體實施方式進行了說明，但本發(fā)明并不以此為限，只要不脫離本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明還可以有各種變化。