本發(fā)明涉及止血凝膠技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微晶纖維素接枝改性胎牛皮膠原纖維制備的止血凝膠。
背景技術(shù)：
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在外科和創(chuàng)傷手術(shù)中經(jīng)常會(huì)伴隨著創(chuàng)面的大量出血，從而使患者面臨極大的生命危險(xiǎn)，因此制備快速有效的止血材料一直作為醫(yī)用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的止血材料存在不易攜帶和消毒保存的缺點(diǎn)，且止血幾乎靠機(jī)械作用，止血效果不好。近年來(lái)，人們研制出生物可吸收止血材料，其中動(dòng)物皮膠原基材料作為一種生物性能良好的醫(yī)用材料，與人體具有良好的組織相容性，可生物降解且無(wú)毒副作用，同時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖和創(chuàng)口的復(fù)合；并且通過(guò)其特有的微孔結(jié)構(gòu)和良好的粘附性，促進(jìn)生物因子的生長(zhǎng)擴(kuò)散，誘導(dǎo)并促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)傷口的愈合。
目前，普遍的動(dòng)物皮膠原提取制備方法為酸酶結(jié)合提取法，主要包括原料的預(yù)處理、脫脂、酶解消化、鹽析、離心和純化等步驟，但存在所得皮膠原純度和產(chǎn)率低、成本高等問(wèn)題，并且會(huì)因提取過(guò)程中處理不當(dāng)而使皮膠原降低或失去生物力學(xué)性能，從而影響其止血效果。針對(duì)這一問(wèn)題，本公司從皮膠原的提取方法入手，并結(jié)合對(duì)提取皮膠原的改性處理以及助劑的添加制備止血凝膠材料，在低成本的基礎(chǔ)上提高止血效果、生物相容性、生物降解性和使用安全性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種使用方便、止血效果好且具有優(yōu)異生物相容性與生物降解性的利用微晶纖維素接枝改性胎牛皮膠原纖維制備的止血凝膠。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
利用微晶纖維素接枝改性胎牛皮膠原纖維制備的止血凝膠，包括如下步驟：
(1)胎牛皮預(yù)處理：以可溯源純化胎牛皮為原料，將其完全展開(kāi)后用保鮮膜包裹好，并置于-5～0℃環(huán)境中冷凍5～8h，再用溫度10-15℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％的小蘇打與三聚磷酸鈉混合水溶液浸泡10～15min，然后在去離子水沖淋下用海綿刷刷洗表面2～3次；
(2)膠原纖維提取溶劑的制備：按照摩爾比1.2～1.5:1的比例將環(huán)丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超聲頻率40kHz、功率50W下超聲處理15～30min，再于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理3～5min，然后加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?0～60min，待混合溶液自然冷卻至50-55℃后加入等重量的5-10℃去離子水，充分?jǐn)嚢韬箪o置分層，取水相，即得提取溶劑；
(3)膠原纖維溶液的制備：將上述刷洗后的胎牛皮送入冷凍干燥機(jī)中，干燥至含水量為10-15％后利用碎皮機(jī)粉碎成粒度為2-3mm的顆粒，再加入上述所制提取溶劑中，充分分散后靜置10～15min，靜置結(jié)束后轉(zhuǎn)入球磨機(jī)中，球磨至細(xì)度小于50μm，然后加入pH＝3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，充分混合后利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機(jī)對(duì)所得混合物處理10～15s，處理結(jié)束后轉(zhuǎn)入0～5℃環(huán)境中靜置3～5h，隨后加入聚丙烯酸和聚氧化乙烯，并加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?5～30min，最后過(guò)270目篩，所得濾液即為膠原纖維溶液；
(4)改性膠原纖維溶液的制備：向上述所制膠原纖維溶液中加入微晶纖維素、聚乙二醇6000和L-天冬氨酸，分散均勻后于35～40℃密封靜置1～2h，充分混合，然后于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理2～3min，再次充分混合，并利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機(jī)處理10～15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷卻降溫，待溫度降至0～5℃后保溫?cái)嚢?0～15min，即得改性膠原纖維溶液；
(5)止血凝膠的制備：向上述所制改性膠原纖維溶液中加入聚乙醇酸、聚卡波菲、維生素K和氨基己酸，充分混合均勻后分裝入模具中，并利用γ射線消毒滅菌，最后經(jīng)包裝后于0～5℃條件下低溫保存。
所述步驟(1)中小蘇打與三聚磷酸鈉的用量質(zhì)量比為2～3:1。
所述步驟(3)中胎牛皮、提取溶劑、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、聚丙烯酸和聚氧化乙烯的用量質(zhì)量比10～15:40～50:0.5～1:0.5～1:0.5～1。
所述步驟(3)中聚丙烯酸使用前經(jīng)過(guò)化學(xué)改性，其改性方法為：將聚丙烯酸和酪氨酸加入兩倍重量份乙醇中，分散均勻后加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?0min，再加入白藜蘆醇和乙二胺四乙酸二鈉，繼續(xù)于回流狀態(tài)下保溫?cái)嚢?0min，所得混合物自然冷卻至35-40℃后立即轉(zhuǎn)入0-5℃環(huán)境中靜置8h，然后送入噴霧干燥機(jī)中，干燥后所得固體經(jīng)研磨制成粉末。
所述聚丙烯酸、酪氨酸、白藜蘆醇和乙二胺四乙酸二鈉的用量質(zhì)量比為10～15:1～2:3～6:0.5～1。
所述步驟(4)中膠原纖維溶液、微晶纖維素、聚乙二醇6000和L-天冬氨酸的用量質(zhì)量比25～30:3～6:1～2:0.5～1。
所述步驟(5)中改性膠原纖維溶液、聚乙醇酸、聚卡波菲、維生素K和氨基己酸的用量質(zhì)量比25～30:2～3:1～2:0.5～1:0.5～1。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明以可溯源純化胎牛皮為原料，提取制備膠原纖維溶液，并利用微晶纖維素接枝改性所提取的膠原纖維，以及輔以多種助劑制得止血凝膠，該止血凝膠可直接覆蓋到出血位置，發(fā)揮止血效果，且止血迅速，有效減少出血量的同時(shí)促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)；同時(shí)具有優(yōu)異的生物相容性和生物降解性，使用安全性高，使用后無(wú)任何毒副作用。
具體實(shí)施方式：
為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1
(1)胎牛皮預(yù)處理：以可溯源純化胎牛皮為原料，將其完全展開(kāi)后用保鮮膜包裹好，并置于-5～0℃環(huán)境中冷凍8h，再用溫度10-15℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％的小蘇打與三聚磷酸鈉(小蘇打、三聚磷酸鈉的用量質(zhì)量比為3:1)混合水溶液浸泡15min，然后在去離子水沖淋下用海綿刷刷洗表面2次。
(2)膠原纖維提取溶劑的制備：按照摩爾比1.2:1的比例將環(huán)丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超聲頻率40kHz、功率50W下超聲處理30min，再于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理5min，然后加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?0min，待混合溶液自然冷卻至50-55℃后加入等重量的5-10℃去離子水，充分?jǐn)嚢韬箪o置分層，取水相，即得提取溶劑。
(3)膠原纖維溶液的制備：將上述刷洗后的15份胎牛皮送入冷凍干燥機(jī)中，干燥至含水量為10-15％后利用碎皮機(jī)粉碎成粒度為2-3mm的顆粒，再加入上述所制50份提取溶劑中，充分分散后靜置15min，靜置結(jié)束后轉(zhuǎn)入球磨機(jī)中，球磨至細(xì)度小于50μm，然后加入0.5份pH＝3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，充分混合后利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機(jī)對(duì)所得混合物處理15s，處理結(jié)束后轉(zhuǎn)入0～5℃環(huán)境中靜置5h，隨后加入1份聚丙烯酸和0.5份聚氧化乙烯，并加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?0min，最后過(guò)270目篩，所得濾液即為膠原纖維溶液。
(4)改性膠原纖維溶液的制備：向上述所制25份膠原纖維溶液中加入3份微晶纖維素、1份聚乙二醇6000和0.5份L-天冬氨酸，分散均勻后于35～40℃密封靜置2h，充分混合，然后于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理3min，再次充分混合，并利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機(jī)處理15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷卻降溫，待溫度降至0～5℃后保溫?cái)嚢?5min。
(5)止血凝膠的制備：向上述所制25份改性膠原纖維溶液中加入2份聚乙醇酸、2份聚卡波菲、0.5份維生素K和0.5份氨基己酸，充分混合均勻后分裝入模具中，并利用γ射線消毒滅菌，最后經(jīng)包裝后于0～5℃條件下低溫保存。
聚丙烯酸的改性：將15份聚丙烯酸和1份酪氨酸加入兩倍重量份乙醇中，分散均勻后加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?0min，再加入5份白藜蘆醇和0.5份乙二胺四乙酸二鈉，繼續(xù)于回流狀態(tài)下保溫?cái)嚢?0min，所得混合物自然冷卻至35-40℃后立即轉(zhuǎn)入0-5℃環(huán)境中靜置8h，然后送入噴霧干燥機(jī)中，干燥后所得固體經(jīng)研磨制成粉末。
實(shí)施例2
(1)胎牛皮預(yù)處理：以可溯源純化胎牛皮為原料，將其完全展開(kāi)后用保鮮膜包裹好，并置于-5～0℃環(huán)境中冷凍8h，再用溫度10-15℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％的小蘇打與三聚磷酸鈉(小蘇打、三聚磷酸鈉的用量質(zhì)量比為3:1)混合水溶液浸泡15min，然后在去離子水沖淋下用海綿刷刷洗表面2次。
(2)膠原纖維提取溶劑的制備：按照摩爾比1.2:1的比例將環(huán)丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超聲頻率40kHz、功率50W下超聲處理30min，再于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理5min，然后加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?0min，待混合溶液自然冷卻至50-55℃后加入等重量的5-10℃去離子水，充分?jǐn)嚢韬箪o置分層，取水相，即得提取溶劑。
(3)膠原纖維溶液的制備：將上述刷洗后的15份胎牛皮送入冷凍干燥機(jī)中，干燥至含水量為10-15％后利用碎皮機(jī)粉碎成粒度為2-3mm的顆粒，再加入上述所制45份提取溶劑中，充分分散后靜置15min，靜置結(jié)束后轉(zhuǎn)入球磨機(jī)中，球磨至細(xì)度小于50μm，然后加入0.5份pH＝3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，充分混合后利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機(jī)對(duì)所得混合物處理15s，處理結(jié)束后轉(zhuǎn)入0～5℃環(huán)境中靜置5h，隨后加入0.5份聚丙烯酸和0.5份聚氧化乙烯，并加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?0min，最后過(guò)270目篩，所得濾液即為膠原纖維溶液。
(4)改性膠原纖維溶液的制備：向上述所制30份膠原纖維溶液中加入3份微晶纖維素、1.5份聚乙二醇6000和0.5份L-天冬氨酸，分散均勻后于35～40℃密封靜置2h，充分混合，然后于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理3min，再次充分混合，并利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機(jī)處理15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷卻降溫，待溫度降至0～5℃后保溫?cái)嚢?5min。
(5)止血凝膠的制備：向上述所制25份改性膠原纖維溶液中加入2份聚乙醇酸、1份聚卡波菲、0.5份維生素K和0.5份氨基己酸，充分混合均勻后分裝入模具中，并利用γ射線消毒滅菌，最后經(jīng)包裝后于0～5℃條件下低溫保存。
聚丙烯酸的改性：將15份聚丙烯酸和2份酪氨酸加入兩倍重量份乙醇中，分散均勻后加熱至回流狀態(tài)保溫?cái)嚢?0min，再加入5份白藜蘆醇和0.5份乙二胺四乙酸二鈉，繼續(xù)于回流狀態(tài)下保溫?cái)嚢?0min，所得混合物自然冷卻至35-40℃后立即轉(zhuǎn)入0-5℃環(huán)境中靜置8h，然后送入噴霧干燥機(jī)中，干燥后所得固體經(jīng)研磨制成粉末。
對(duì)實(shí)施例1和2所制備的止血凝膠進(jìn)行性能測(cè)定，結(jié)果如下：
外觀：凝膠狀，表面光滑，無(wú)肉眼可見(jiàn)之雜質(zhì)；
水分含量：≤80％(wt)；
凝膠強(qiáng)度：100～500g/cm2；
重金屬含量：≤10μg/g(m/m)；
脂質(zhì)體：≤1％(m/m)；
灰分：≤2％(m/m)；
pH值：≥4.0；
生物降解性：體內(nèi)一月內(nèi)全部降解；
抗菌/抑菌性能：對(duì)大腸桿菌、金球菌、白色念珠菌和綠膿桿菌的抑菌率均≥50％；
溶血率：≤5％；
細(xì)胞毒性：細(xì)胞毒性反應(yīng)不大于1級(jí)；
無(wú)菌試驗(yàn)：無(wú)菌；
致敏試驗(yàn)：無(wú)遲發(fā)性超敏反應(yīng)；
皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)：原發(fā)性刺激指數(shù)PII<0.4；
外源性DNA含量：外源性DNA殘留量應(yīng)≤10ng/ml(m/v)
熱源：無(wú)熱源；
急性全身毒性：無(wú)急性全身毒性；
遺傳毒性：無(wú)遺傳毒性；
凝膠時(shí)間：≤30s；
止血時(shí)間：≤1min。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。