本發(fā)明涉及一種生物抗菌細(xì)菌纖維素敷料及其制備方法。系通過原花青素為交聯(lián)劑，細(xì)菌纖維素與生物防腐劑ε一聚賴氨酸結(jié)合后制得，具有廣譜抗菌活性。
背景技術(shù)：
敷料是臨床上使用廣泛的一種用以覆蓋瘡、傷口或其他損害的醫(yī)用材料。傳統(tǒng)的敷料主要包括天然紗布、合成纖維類敷料、泡沫類敷料、水凝膠類敷料等。天然高分子材料因具有良好的生物相容性、可降解性以及傳統(tǒng)敷料所具有的優(yōu)勢特點(diǎn)，成為制備敷料的首選原料。敷料良好的吸水性，在使其具有創(chuàng)面清爽、干燥等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，也為細(xì)菌等微生物繁殖提供了溫床。因此，具有抗菌功能的敷料受到了人們大量關(guān)注。而傳統(tǒng)的負(fù)載銀等無機(jī)抗菌劑對(duì)人體的傷害較大，天然有機(jī)抗菌劑，如乳酸鏈球菌、殼聚糖等表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢，但其通常不具有廣譜抗菌性。為維持這類抗菌材料的力學(xué)性能，常使用戊二醛等人工合成交聯(lián)劑，但這類合成交聯(lián)劑具有毒性，會(huì)影響高分子材料的性能且不利于創(chuàng)面的恢復(fù)。因此需要選用生物安全的交聯(lián)劑來避免交聯(lián)材料帶來的副作用。
細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose，簡稱BC)，是具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的納米級(jí)生物高分子聚合物，與植物纖維素相比，不含有半纖維素、木質(zhì)素等雜質(zhì)，且其純度、聚合度高，持水性好，拉伸強(qiáng)度和彈性模量高，具有良好的生物適應(yīng)性和可降解性，目前已廣泛應(yīng)用于食品、造紙、醫(yī)療等領(lǐng)域。其天然的多孔結(jié)構(gòu)，表面豐富的羥基，使其可以充當(dāng)基體和增強(qiáng)體來制備具有特殊功能的復(fù)合材料。使用BC作為傷口敷料能夠迅速吸收傷口血液和組織液，防止傷口感染化膿，又能為慢性傷口附近的組織再生提供濕潤的環(huán)境促進(jìn)傷口愈合和減輕疼痛。同時(shí)纖維素不會(huì)和傷口粘連，不會(huì)造成二次傷害，剝離時(shí)也不會(huì)有殘留。
ε一聚賴氨酸(ε-polylysine，簡稱ε-PL)是一種由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的賴氨酸同聚物，由25-35個(gè)賴氨酸殘基通過α-羧基和ε-氨基連接而成。ε一聚賴氨酸是一種對(duì)人體安全無毒的聚陽離子多肽，能夠抑制革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性菌、真菌甚至某些病毒，具有抑菌譜廣泛的特點(diǎn)。自從通過小鼠實(shí)驗(yàn)證明ε一聚賴氨酸安全性后，日本、韓國、美國等國家將其作為天然食品防腐劑并廣泛應(yīng)用。
原花青素(Procyanidins，簡稱PA)是一種分子結(jié)構(gòu)非常特殊的生物類黃酮，能夠溶在水和大多數(shù)有機(jī)溶劑中，含有很多酚羥基，是國際上公認(rèn)的天然抗氧化劑，其氧化能力是維生素C的20倍，維生素E的50倍，并能夠清除人體內(nèi)自由基。它的提取過程一般是從葡萄籽或法國海岸松樹皮中提取出來。在人體內(nèi)具有非常強(qiáng)的活性，對(duì)人體無毒無害。
據(jù)檢索，發(fā)現(xiàn)以下相關(guān)文獻(xiàn)和專利。
專利201010218930.6，公開了“一種生物抗菌棉纖維或棉布及其制備方法”，其使用ε一聚賴氨酸作為抑菌劑，使其與經(jīng)過高碘酸鈉氧化處理的棉纖維或棉布進(jìn)行接枝反應(yīng)，或直接與未氧化處理的棉纖維或棉布進(jìn)行吸附結(jié)合，從而制備出一種具有抗菌抑菌效果的棉纖維或棉布。
專利200810053871.4，公開了“有抑菌性能的細(xì)菌纖維素管的制備方法”，其利用具有滲氧透功能的管材為載體，利用木醋桿菌在載體表面生物合成細(xì)菌纖維素管，然后將細(xì)菌纖維素管與ε一聚賴氨酸復(fù)合制備具有抑菌性能的細(xì)菌纖維素管的制備方法。
專利201110009673.X，公開了“用于急性創(chuàng)傷的細(xì)菌纖維素基抗菌干膜及制備方法和應(yīng)用”，抗菌干膜組分包括：細(xì)菌纖維素干膜和抗菌劑，細(xì)菌纖維素基抗菌干膜的載藥量為0.3-6.0mg/cm2；其制備包括：將細(xì)菌纖維素濕膜切成膜片，干燥后，浸漬于預(yù)先配制好的無機(jī)抗菌劑溶液中，經(jīng)二次干燥制得。
專利201510128924.4，公開了“一種原花青素交聯(lián)明膠抗菌敷料及其制備方法”，其包括以下步驟：(1)配制一定濃度的明膠溶液，澆鑄到模具中；(2)將步驟(1)所得的明膠冷凍干燥48小時(shí)以上，獲得結(jié)構(gòu)均勻的明膠海綿支架；(3)分別配制一定濃度的原花青素溶液和抗生素溶液；(4)將步驟(2)得到的明膠海綿支架浸泡到(3)得到的原花青素溶液中進(jìn)行交聯(lián)，同時(shí)加入抗生素溶液，使抗生素小分子進(jìn)入明膠內(nèi)部；(5)將步驟(4)得到的負(fù)載抗生素的交聯(lián)明膠水凝膠冷凍干燥后，即得到一種新的抗菌敷料。其制備的材料具有較好的理化性能和生物相容性，并且成型可控，可用于醫(yī)療領(lǐng)域中創(chuàng)面的修復(fù)和替代，其制備工藝簡單，設(shè)備簡易，原料價(jià)廉易得。
Nguyen等人發(fā)表的“Potential of a nisin-containing bacterial cellulose film to inhibit Listeria monocytogenes on processed meats”一文中，制備了可以抵抗革蘭氏陽性斯特菌的nisin/BC復(fù)合材料，將其應(yīng)用于香腸的真空包裝表面，最適濃度和接觸時(shí)間分別為2500IU/ml和6h，在冷凍保存14d后與對(duì)照組相比，斯特菌顯著減少到2log CFU/g。
Wei等人發(fā)表的“Preparation and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry films with antibacterial properties”一文中，將凍干的BC膜浸入在苯扎氯銨(benzalkonium chloride)溶液中，這屬于陽離子表面活性劑抗菌劑，接下來冷凍干燥。制備的BC抗菌膜在0.102％的苯扎氯銨溶液中的BC干膜的載藥能力大約為0.116mg/cm；其具有高的吸水能力，在去離子水中膨脹倍數(shù)為26.2，在鹽水中為37.3；獲得了一個(gè)穩(wěn)定而持久的至少24小時(shí)的抗菌活性，特別是抵抗金黃色葡萄球菌和枯草桿菌等革蘭氏陽性菌上。
賈原媛發(fā)表的“細(xì)菌纖維素生物醫(yī)學(xué)材料的性能改進(jìn)”一文中，BC濕膜被ε-聚賴氨酸溶液處理后在一定濃度的丙三醇溶液中浸泡并干燥，經(jīng)過對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，BC干膜經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的ε-PL溶液處理后抑菌效果最佳，但隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加BC膜顏色變深，其透光性下降。
Zhu等人發(fā)表的”Characterization of Bacteriostatic Sausage Casing：A Composite of Bacterial Cellulose Embedded with epsilon-Polylysine“一文中，將BC管浸泡在生物防腐劑ε-PL溶液中使ε-PL嵌入到細(xì)菌纖維素膜上制得抑菌腸衣。通過表征結(jié)果表明，這種ε-PL/BC復(fù)合膜不僅能夠抑制革蘭氏陽性菌，而且對(duì)革蘭氏陰性菌同樣有抑制作用，可以延長產(chǎn)品的貨架期。這種綠色、環(huán)保、環(huán)境友好型的復(fù)合膜必將在包裝材料方面有好的應(yīng)用。
然而，BC上未交聯(lián)的EPL涂層是水溶性的，這導(dǎo)致在水溶液中快速地溶解。因此，需要通過交聯(lián)過程固定EPL分子到BC上。而文獻(xiàn)中大部分所使用的交聯(lián)劑對(duì)人體有害。因此，本發(fā)明以細(xì)菌纖維素為基質(zhì)，使用生物防腐劑ε一聚賴氨酸作為抑菌劑，天然抗氧化劑原花青素為交聯(lián)劑，通過溶液浸泡以及交聯(lián)技術(shù)，從而制備出一種具有廣譜抗菌活性、安全性高的抗菌復(fù)合敷料。因此本專利獲得的具有抗菌功效的生物安全性敷料具有廣闊的市場前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種生物抗菌細(xì)菌纖維素敷料及其制備方法。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種生物抗菌細(xì)菌纖維素敷料及其制備方法，包括以下步驟：
(1)將BC膜切成圓形狀，并在去離子水中清洗幾次；
(2)分別配置ε-PL和PA水溶液；
(3)將步驟(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的ε-PL水溶液中，140r/min震蕩24h；
(4)配置PBS磷酸鹽緩沖液；
(5)將步驟(3)中的復(fù)合膜，在37℃下，浸泡在100mL的(4)為緩沖液的PA水溶液中，140r/min震蕩2h；
(6)將復(fù)合樣本從溶液中取出并在去離子水中沖洗至中性，制得一種新的抗菌敷料。
所述的BC膜來源于液體培養(yǎng)基發(fā)酵制得，液體發(fā)酵基主要成分為(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白陳5，Na2HPO45，檸檬酸銨1，鹽酸調(diào)節(jié)初始pH至6.0；用打孔器將BC膜切成直徑為15mm-20mm的圓狀。
所述的ε-PL水溶液的濃度為0.1-1wt％。
所述的PA水溶液的濃度為0.5-0.8wt％
所述的PBS磷酸鹽緩沖液的制備方法為：氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，調(diào)節(jié)pH至7.4，定容到1L，然后高壓蒸汽滅菌，室溫保存。
有益效果：
由于EPL是聚陽離子物質(zhì)，在水中會(huì)解離出-NH3+，而BC納米纖維表面含有大量羥基，是聚陰離子物質(zhì)。BC浸入到EPL溶液后，由于在-NH3+以及-OH之間的離子極性作用，BC納米纖維吸收EPL分子。未交聯(lián)的EPL涂層是水溶性的，這導(dǎo)致在水溶液中快速地溶解。因此，需要通過交聯(lián)過程固定EPL分子到BC上。PA分子交聯(lián)EPL分子主要是通過在EPL上的C＝O基團(tuán)以及PA上的-OH基團(tuán)間的氫鍵作用，這可使BC納米纖維在交聯(lián)之后，形成了穩(wěn)定的EPL涂層，而且保留下來了-NH3基團(tuán)。
本發(fā)明所使用的原料均為生物高分子材料，不含對(duì)人體有害的化學(xué)藥品，屬于純綠色化生產(chǎn)過程。制得的細(xì)菌纖維素抗菌濕膜具有輕便柔軟、生物相容性好、吸濕性高、透氣性好，抗菌性持久等優(yōu)點(diǎn)，且制備方法簡便易行，成本低廉，應(yīng)用于抗菌敷料中具有良好的抗菌效果，通過控制發(fā)酵參數(shù)可制備出裁剪成任意大小、形狀及厚度的產(chǎn)品，不粘連也不刺激皮膚，丟棄后在環(huán)境中能迅速降解，可作為一種綠色環(huán)保的功能性抗菌敷料。
具體實(shí)施方式
為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于提到的實(shí)施例表示的范圍。
實(shí)施例1
一種生物抗菌細(xì)菌纖維素敷料及其制備方法，包括以下步驟：
(1)將液體培養(yǎng)基發(fā)酵制得的BC膜，用打孔器切成直徑為15mm的的圓形狀，并在去離子水中清洗幾次；
(2)配置0.1wt％的ε-PL水溶液和0.5wt％的PA水溶液；
(3)將步驟(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的0.1wt％的ε-PL水溶液中，140r/min震蕩24h；
(4)配置PBS磷酸鹽緩沖液，其配置方法為：氯化鈉8g，氯化鉀.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，pH調(diào)至7.4。
(5)將步驟(3)中的復(fù)合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.5wt％的(4)為緩沖液的PA水溶液中，140r/min震蕩2h；
(6)將復(fù)合樣本從溶液中取出并在去離子水中沖洗至中性，制得一種新的抗菌敷料。
實(shí)施例2
一種生物抗菌細(xì)菌纖維素敷料及其制備方法，包括以下步驟：
(1)將液體培養(yǎng)基發(fā)酵制得的BC膜，用打孔器切成直徑為15mm的的圓形狀，并在去離子水中清洗幾次；
(2)配置0.25wt％的ε-PL水溶液和0.5wt％的PA水溶液；
(3)將步驟(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的0.25wt％的ε-PL水溶液中，140r/min震蕩24h；
(4)配置PBS磷酸鹽緩沖液，其配置方法為：氯化鈉8g，氯化鉀.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，pH調(diào)至7.4。
(5)將步驟(3)中的復(fù)合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.5wt％的(4)為緩沖液的PA水溶液中，140r/min震蕩2h；
(6)將復(fù)合樣本從溶液中取出并在去離子水中沖洗至中性，制得一種新的抗菌敷料。
實(shí)施例3
一種生物抗菌細(xì)菌纖維素敷料及其制備方法，包括以下步驟：
(1)將液體培養(yǎng)基發(fā)酵制得的BC膜，用打孔器切成直徑為15mm的的圓形狀，并在去離子水中清洗幾次；
(2)配置0.5％的ε-PL水溶液和0.5％的PA水溶液；
(3)將步驟(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的0.5％的ε-PL水溶液中，140r/min震蕩24h；
(4)配置PBS磷酸鹽緩沖液，其配置方法為：氯化鈉8g，氯化鉀.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，pH調(diào)至7.4。
(5)將步驟(3)中的復(fù)合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.5wt％的(4)為緩沖液的PA水溶液中，140r/min震蕩2h；
(6)將復(fù)合樣本從溶液中取出并在去離子水中沖洗至中性，制得一種新的抗菌敷料。
實(shí)施例4
一種生物抗菌細(xì)菌纖維素敷料及其制備方法，包括以下步驟：
(1)將液體培養(yǎng)基發(fā)酵制得的BC膜，用打孔器切成直徑為15mm的的圓形狀，并在去離子水中清洗幾次；
(2)配置0.75％的ε-PL水溶液和0.8％的PA水溶液；
(3)將步驟(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的0.75％的ε-PL水溶液中，140r/min震蕩24h；
(4)配置PBS磷酸鹽緩沖液，其配置方法為：氯化鈉8g，氯化鉀.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，pH調(diào)至7.4。
(5)將步驟(3)中的復(fù)合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.8wt％的(4)為緩沖液的PA水溶液中，140r/min震蕩2h；
(6)將復(fù)合樣本從溶液中取出并在去離子水中沖洗至中性，制得一種新的抗菌敷料。
實(shí)施例5
一種生物抗菌細(xì)菌纖維素敷料及其制備方法，包括以下步驟：
(1)將液體培養(yǎng)基發(fā)酵制得的BC膜，用打孔器切成直徑為15mm的的圓形狀，并在去離子水中清洗幾次；
(2)配置1％的ε-PL水溶液和0.8％的PA水溶液；
(3)將步驟(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的1％的ε-PL水溶液中，140r/min震蕩24h；
(4)配置PBS磷酸鹽緩沖液，其配置方法為：氯化鈉8g，氯化鉀.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，pH調(diào)至7.4。
(5)將步驟(3)中的復(fù)合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.8wt％的(4)為緩沖液的PA水溶液中，140r/min震蕩2h；
(6)將復(fù)合樣本從溶液中取出并在去離子水中沖洗至中性，制得一種新的抗菌敷料。
將實(shí)施例1-5制得的抗菌細(xì)菌纖維素敷料，進(jìn)行抗菌效果測試，具體情況請(qǐng)見表1。
表1
本發(fā)明不限于這里的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。