本發(fā)明涉及納米顆粒的制備與生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種粒徑可控的阿霉素納米顆粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

長期以來，科研工作者的一直致力于研究一種能制備粒徑可控的有機(jī)聚合物納米顆粒的方法。過去幾十年里，在納米顆粒的生物學(xué)及藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用方面做出了大量研究，并且有幾種不同類型的納米顆粒已經(jīng)得到不同領(lǐng)域、不同程度的應(yīng)用。例如，修飾相應(yīng)的具有靶向性的分子的金納米顆粒、超順磁性納米粒子，可用于顯示體內(nèi)腫瘤細(xì)胞；藥物分子修飾到納米粒子上，通過一定的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可以使抗腫瘤藥物在病灶部位緩慢釋放，這可以大大降低抗癌藥物的副作用，同時延長藥物作用時間，提高藥物抗腫瘤效果；此外，納米顆粒還可應(yīng)用于影像學(xué)，用于實(shí)時動態(tài)檢測如MRI、PET等。

然而，納米顆粒的合成與應(yīng)用上依然面臨諸多問題，例如，納米顆粒的大小與形態(tài)不易控制，生物安全性低及免疫原性強(qiáng)，人體循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定不好，進(jìn)而很難順利到達(dá)病灶，體內(nèi)不易降解等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供一種粒徑可控的阿霉素納米顆粒。

本發(fā)明的另一目的是提供所述阿霉素納米顆粒的制備方法。

本發(fā)明提供的粒徑可控的阿霉素納米顆粒以聚乙二醇維生素E琥珀酸酯為內(nèi)核，由聚乙二醇-阿霉素與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精通過自組裝包裹所述內(nèi)核形成。

具體來說，本發(fā)明的粒徑可控的阿霉素納米顆粒包括外層、中間層以及內(nèi)核，其中，內(nèi)核為聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)，中間層為聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精(p(IB-alt-MAnh)-CD)，其在納米顆粒的 組裝中起到橋梁作用，阿霉素可憑借超分子作用嵌入到環(huán)糊精的疏水內(nèi)腔中，而聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)中的疏水鏈段則可與內(nèi)核相互作用，起到連接內(nèi)核與外層的作用。外層則為聚乙二醇-阿霉素(mPEG-DOX)，其結(jié)構(gòu)如下所示：

在主-客體分子自組裝過程中，利用環(huán)糊精內(nèi)腔的疏水性以及阿霉素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)相互作用，阿霉素端嵌入到環(huán)糊精的內(nèi)腔中，連接阿霉素的聚乙二醇端形成親水的外層。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，可根據(jù)粒徑的要求調(diào)整聚乙二醇維生素E琥珀酸酯的用量。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述聚乙二醇維生素E琥珀酸酯內(nèi)核的質(zhì)量為所述聚乙二醇-阿霉素與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精總質(zhì)量的0.05～20倍；優(yōu)選為0.1～10倍；更優(yōu)選為0.2～5倍。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，內(nèi)核還可包含其他活性成分，尤其是可與阿霉素聯(lián)用增加抗腫瘤活性的抗腫瘤藥物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述內(nèi)核中還含有紫杉醇納米晶體，紫杉醇與阿霉素聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同增效作用，因而能大大提高納米顆粒的抗腫瘤活性，通過調(diào)節(jié)紫杉醇的用量可以調(diào)節(jié)紫杉醇納米晶體的大小，進(jìn)而也可調(diào)節(jié)納米顆粒粒徑大?。欢?，紫杉醇的結(jié)構(gòu)也可更好地與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)中的烯鍵端結(jié)合，從而形成更加穩(wěn)定的納米顆粒。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，所述聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精為聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)與己二胺-β-環(huán)糊精通過偶聯(lián)反應(yīng)所得。其制備過程在EDC/NHS作用下，可以在DMSO等溶劑中進(jìn)行，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值為8.0～9.0，室溫?cái)嚢?8～72小時，反應(yīng)結(jié)束后以磷酸鹽緩沖液透析(pH8.0～9.0)36～48小時，冷凍干燥后即得，并于低溫保存。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，所述聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)的平均分子量可以為5000～10000。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，所述聚乙二醇-阿霉素中聚乙二醇的聚合度n可以為45～450，分子量可以為2000～20000。

聚乙二醇-阿霉素的制備可采用已有方法，也可如以下過程：將mPEG-酰肼與阿霉素溶解于無水的極性溶劑中，加入過量三乙胺，室溫，避光，攪拌48～72h使其反應(yīng)完全，純化。mPEG-酰肼與阿霉素的摩爾比可以為1:0.2～5，優(yōu)選為1:1.5～2.0。反應(yīng)過程中可使用NaOH溶液等調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使其保持在8.0～10.0，優(yōu)選為8.5～9.0。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，還可包含有表面活性劑、乳化劑中的一種或多種，可部分或全部替代內(nèi)核為聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)。例如，可以為表面活性劑IGEPAL CO-520、乳化劑PluronicF 127等。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

S1：將聚乙二醇-阿霉素與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精溶于水中超聲條件下進(jìn)行自組裝，冷凍干燥得到超分子復(fù)合物；

S2：將聚乙二醇維生素E琥珀酸酯以及可選的紫杉醇納米晶體溶于無水乙醇中制得乳濁液；

S3：將步驟S1所得的超分子復(fù)合物溶于水中，再將步驟S2所得乳濁液加入到其中，揮干無水乙醇，0.45μm濾膜過濾后離心即得所述阿霉素納米顆粒。

上述制備方法中，步驟S2所得的乳濁液中，聚乙二醇維生素E琥珀酸酯以及可選的紫杉醇納米晶體形成納米膠束形態(tài)。

上述制備方法中，所述聚乙二醇-阿霉素與所述聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精的質(zhì)量比為1:50～60。

上述制備方法中，所述步驟S1中，將聚乙二醇-阿霉素與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精溶于水中，調(diào)節(jié)pH值為8.0～9.0，進(jìn)行自組裝。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒利用了p(IB-alt-MAnh)與mPEG-DOX間的主-客體自組裝反應(yīng)形成納米顆粒，mPEG-DOX分子中腙鍵具有酸敏性，在酸性環(huán)境下，mPEG-DOX釋放出阿霉素分子，而在生物體生理環(huán)境下(pH7.35～7.45)，mPEG-DOX不會發(fā)生水解，不會釋放阿霉素分子。另一方面， 本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒加入了具有表面活性的分子TPGS，同時包裹疏水性的抗腫瘤藥物紫杉醇(PTX),調(diào)節(jié)紫杉醇用量可調(diào)節(jié)納米顆粒大小。TPGS與PTX組成疏水內(nèi)核，有助于疏水性的藥物紫杉醇在機(jī)體內(nèi)的運(yùn)輸，尺寸越小納米顆粒越易于進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)部。本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒到達(dá)腫瘤組織內(nèi)之后，mPEG-DOX發(fā)生分解，DOX、PTX得以釋放，二者聯(lián)合用藥，具有協(xié)同作用，可明顯提高抗腫瘤活性，藥物的靶向性更強(qiáng)，治療效果大大增強(qiáng)。

不同于傳統(tǒng)的通過化學(xué)鍵的形成與斷裂的方法制備的納米顆粒，本發(fā)明的納米顆粒制備過程簡單，反應(yīng)條件溫和，原料易于獲取，采用超聲方式組裝最終所得的納米顆粒，通過改變超聲條件也可調(diào)節(jié)顆粒大小。本發(fā)明的納米顆粒具有良好的生物安全性及組織相容性，利用超分子間的主-客體自組裝反應(yīng)制備納米顆粒，可修飾阿霉素甚至多種組合的抗癌藥物，以發(fā)揮抗腫瘤藥物的協(xié)同作用，大大增強(qiáng)藥物療效。此外，本發(fā)明制備的納米顆粒具有酸敏性，在腫瘤組織的酸性環(huán)境中更利于藥物的釋放。另一方面，通過調(diào)節(jié)TPGS的用量，可以方便調(diào)控納米顆粒的粒徑，同時還能起到納米橋作用，使形成的納米顆粒在生物體生理環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例制得的p(IB-alt-MAnh)-CD的¹H-NMR圖。

圖2為p(IB-alt-MAnh)-CD對乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞株及抗阿霉素乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR細(xì)胞的毒性測試結(jié)果圖表。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例制得的mPEG-DOX的¹H-NMR圖。

圖4A-4C為本發(fā)明實(shí)施例中不同的紫杉醇濃度條件下DLS測得的納米顆粒粒徑分布圖及透射電鏡結(jié)果；其中，圖4A表示PTX濃度為0.5mg/ml時所得納米顆粒粒徑分布圖及其透射電鏡，圖4B表示PTX濃度為1mg/ml時所得納米顆粒粒徑分布圖及其透射電鏡，圖4C表示PTX濃度為2mg/ml時所得納米顆粒粒徑分布圖及其透射電鏡。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例制得的納米顆粒的FT-IR圖譜。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，以使本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)更清 楚。但應(yīng)該指出，實(shí)施例用于理解本發(fā)明的構(gòu)思，本發(fā)明的范圍并不僅僅局限于本文中所列出的實(shí)施例。

如沒有特別說明，實(shí)施例所使用的原料均為市售產(chǎn)品、所使用的操作均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作。

實(shí)施例粒徑可控的阿霉素納米顆粒的制備

1、聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精(p(IB-alt-MAnh)-CD)的制備

(1)將聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)(p(IB-alt-MAnh)，Mn(0.5K-1K)溶于DMSO中，濃度為5-15mg/ml；

(2)加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽摩爾比2-3倍于馬來酸酐的重復(fù)鏈數(shù)；

(3)調(diào)整所得溶液的pH至8.0-9.0；

(4)10-20min內(nèi)加入N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(EDC:NHS摩爾比＝1:1)；

(5)將己二胺-β-環(huán)糊精溶于DMSO中(濃度為0.01-0.1mg/ml)，磁力攪拌，得到己二胺-β-環(huán)糊精溶液；

(6)在步驟(4)加入NHS后15-20min，將所得的含p(IB-alt-MAnh)的溶液以60-80滴/分鐘的速度加入到步驟(5)的己二胺-β-環(huán)糊精溶液中，同時劇烈攪拌，室溫?cái)嚢?8-72小時；

(7)將步驟(6)所得的溶液進(jìn)行磷酸鹽緩沖液透析(pH 8.0-9.0)36-48小時，

(8)冷凍干燥得到白色粉末固體，置于-20℃保存。

該反應(yīng)過程如下圖式所示：

反應(yīng)產(chǎn)物p(IB-alt-MAnh)-CD溶于氧化氘做¹H-NMR，結(jié)果如圖1所示。

為進(jìn)一步探索該物質(zhì)的生物相容性，選用細(xì)胞為人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及MCF-7ADR細(xì)胞進(jìn)行測試(參照[1]R.Namgung,Y.Mi Lee,J.Kim,Y.Jang,B.Lee,I.Kim,P.Sokkar,Y.M.Rhee,A.S.Hoffman,W.J.Kim,Poly-cyclodextrin and poly-paclitaxel nano-assembly for anticancer therapy.Nature Communications 5(2014).[2]X.Xu,X.Chen,Z.Wang,X.Jing,Ultrafine PEG–PLA fibers loaded with both paclitaxel and doxorubicin hydrochloride and their in vitro cytotoxicity.Eur J Pharm Biopharm 72(1)(2009)18-25.)，結(jié)果如圖2所示，圖中橫坐標(biāo)表示p(IB-alt-MAnh)-CD的濃度，縱坐標(biāo)表示對細(xì)胞系的細(xì)胞活性。

2、化合物mPEG-DOX的制備

(1)將鹽酸阿霉素溶于二甲基亞砜中(濃度為1-100mg/ml)，磁力攪拌；

(2)加入適量三乙胺，為鹽酸阿霉素的1.5倍當(dāng)量；

(3)加入NaOH溶液調(diào)整溶液pH至堿性(pH＝8.5-9.0)；

(4)加入mPEG-HZ(Mw＝2000-20000)，室溫，避光，磁力攪拌72h；

(5)加入大量乙醚進(jìn)行沉淀(10-15倍于溶液體積)；

(6)真空干燥，得到mPEG-DOX紅色粉末，置于-20℃保存。

該反應(yīng)過程示如下圖式：

產(chǎn)物mPEG-DOX以氘代二甲基亞砜為溶劑，¹H-NMR結(jié)果如圖3所示。

3、p(IB-alt-MAnh)-CD/mPEG-DOX納米顆粒的制備

(1)將p(IB-alt-MAnh)(10mg)、mPEG-DOX(0.2mg)溶于去離子水2ml中；

(2)調(diào)節(jié)pH至8.0-9.0，室溫，避光，超聲，60～100W,20K HZ；

(3)冷凍干燥，得到粉末樣固體；

(4)將凍干后的固體粉末，溶于去離子水，濃度為3mg/ml；

(5)超聲，60～100W,20K HZ，10-20min，標(biāo)記為A；

(6)將Paclitaxel(PTX)(分別為1mg/ml,2mg/ml,5mg/ml)，維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)(質(zhì)量比TPGS:PTX＝2：1)溶于無水乙醇，充分?jǐn)嚢瑁瑯?biāo)記為B；

(7)微量注射泵將B逐滴加入A中(1.0-1.5ml/min)，同時劇烈攪拌,完全加入后超聲60-100W,20K HZ 10-20min；

(8)室溫，避光，磁力攪拌24h，使無水乙醇完全揮發(fā)；

(9)0.45μm濾膜過濾；

(10)14000rpm，10-15min離心；

(11)去上清，沉淀重懸，超聲(100W，15min)。

測動態(tài)光散射(馬爾文ZS90)，結(jié)果如圖4A-4C所示，分別表示PTX濃度為1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml條件下，動態(tài)光散射測得納米顆粒粒徑大 小，PTX濃度為0.5mg/ml時所得納米顆粒平均粒徑為88.7±4.5nm，PTX濃度為1mg/ml時所得納米顆粒平均粒徑為136.5±6.1nm，PTX濃度為2mg/ml時所得納米顆粒平均粒為214.5±7.4nm；磷鎢酸染色，透射電鏡檢測納米顆粒形態(tài)。此外，圖5的FT-IR結(jié)果表明納米顆粒中含有p(IB-alt-MAnh)-CD，mPEG-HZ、TPGS、PTX。

由實(shí)施例可知，本發(fā)明的納米顆?？赏ㄟ^內(nèi)核紫杉醇的量控制納米顆粒的粒徑，由此使其粒徑可控，從而有利于增強(qiáng)納米顆粒的穩(wěn)定性。

除非特別限定，本發(fā)明所用術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。

本發(fā)明所描述的實(shí)施方式僅出于示例性目的，并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在本發(fā)明的范圍內(nèi)作出各種其他替換、改變和改進(jìn)，因而，本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，而僅由權(quán)利要求限定。