相關(guān)申請的交叉引用本申請要求美國臨時申請第61/222,851號(2009年7月2日提交)和第61/312,827號(2010年3月11日提交)的優(yōu)先權(quán)。關(guān)于聯(lián)邦資助下的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明受NIH-NRRA，臨床與轉(zhuǎn)化科學中心基金；NSFSTC項目協(xié)議號ECS-9876771；ICMICP50CA86438；NIHSAIRP基金號R24CA83084；和NIH中心基金號P30CA08748的政府資助。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基于二氧化硅的熒光納米顆粒和使用所述納米顆粒檢測、診斷或治療諸如癌癥的疾病的方法。
背景技術(shù)：
：：早期的腫瘤診斷和治療選擇對獲得治療上的成功和長期存活率至關(guān)重要。在早期，許多腫瘤都被定位并且能夠通過手術(shù)治療。然而，利用當前的成像技術(shù)常常難以呈現(xiàn)清晰可辨的腫瘤邊緣。這造成數(shù)量不成比例的侵入性活組織檢查。需要高特異性、分子靶向性探針，用于盡早檢測出正常細胞和腫瘤細胞間的分子差異，例如受體表達水平的癌癥特異性變化。當與高分辨成像技術(shù)結(jié)合時，特異性分子靶向探針極大地改善檢測靈敏性，便于癌癥的表征、監(jiān)測和治療。目前的熒光成像探針通常由單個常規(guī)的熒光團(例如有機染料、熒光蛋白)、熒光蛋白(例如GFP)和半導體量子點(Q-dot)組成。單個熒光團通常不穩(wěn)定并且用于成像的亮度有限。與染料相似，熒光蛋白往往顯示激發(fā)態(tài)相互作用，其可以導致隨機閃爍、淬火和光致漂白。量子點通常由諸如Pb2+或Cd2+的重金屬離子形成，并因此有毒。Burnsetal.“Fluorescentcore-shellsilicananoparticles:towards“LabonaParticle”architecturesfornanobiotechnology”,Chem.Soc.Rev.,2006,35,1028–1042。具有導電層和二氧化硅核的熒光納米顆粒已為人所知并且在治療劑的調(diào)節(jié)遞送中有應用(美國專利號6,344,272和6,428,811)?，F(xiàn)有熒光納米顆粒的缺點是其亮度有限并且作為熒光探針在分散系統(tǒng)中的可檢測性低。本發(fā)明基于多功能熒光二氧化硅的納米顆粒具有優(yōu)于其他熒光探針的許多優(yōu)點。所述納米顆粒無毒，并且具有用于分子診斷和治療的優(yōu)異的光物理性質(zhì)(包括熒光效率和耐光性)、高生物相容性和獨特的藥物代謝動力學。所述納米顆粒的尺寸相對小，并且具有產(chǎn)生優(yōu)異的腎清除率的表面PEG涂層。本發(fā)明的熒光納米顆粒包含熒光核和二氧化硅殼。所述納米顆粒的核-殼結(jié)構(gòu)、大的表面積和不同的表面化學可以同時向靶細胞遞送多個功能性。例如，可以利用靶向部分、醫(yī)學成像用造影劑、治療劑或其他試劑使所述納米顆粒功能化。所述納米顆粒表面上的靶向部分可以為腫瘤配體，該腫瘤配體在與軛合有納米顆粒的治療劑結(jié)合時使納米顆粒成為用于靶向并潛在地治療癌癥的理想載體。Websteretal.Opticalcalciumsensors:developmentofagenericmethodfortheirintroductiontothecellusingconjugatedcellpenetratingpeptides.Analyst,2005；130:163-70。所述基于二氧化硅的納米顆?？梢詷擞浻杏糜赑ET、SPECT、CT、MRI和光學成像的造影劑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供基于二氧化硅的熒光納米顆粒，所述納米顆粒包含：基于二氧化硅的核，所述核具有位于其內(nèi)的熒光化合物；包圍至少一部分所述核的二氧化硅殼；與所述納米顆粒連接的有機聚合物；約1至約20個與所述納米顆粒連接的配體；和與所述納米顆粒連接的造影劑或螯合劑。所述納米顆粒的直徑為約1nm至約25nm，或約1nm至約8nm。所述可以與納米顆粒連接的有機聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸酯、聚乳酸、糖、脂、聚谷氨酸(PGA)、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚乙酸乙烯酯(PVA)或它們的組合。所述配體能夠結(jié)合至少一個細胞成分，例如腫瘤標志物。與所述納米顆粒連接的所述配體的數(shù)量可以為約1至約10個。所述配體的實例包括肽、蛋白、生物聚合物、合成的聚合物、抗原、抗體、微生物、病毒、受體、半抗原、酶、激素、化合物、病原體、毒素、表面改性劑或它們的組合。諸如三肽RGD、環(huán)肽cRGD、奧曲肽(octreotate)、EPPT1和α-MSH的肽類似物的肽也包含在本發(fā)明中。包含RGD序列的任何線性、環(huán)形或支鏈肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。諸如包括89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I和177Lu在內(nèi)的放射性核素的造影劑可以與本發(fā)明的納米顆粒連接?；蛘?，所述納米顆粒與適于結(jié)合放射性核素的螯合劑(例如DFO、DOTA、TETA和DTPA)連接?？梢酝ㄟ^正電子發(fā)射斷層顯像(PET)、單光子發(fā)射計算機斷層顯像(SPECT)、計算機斷層顯像(CT)、磁共振成像(MRI)、光學成像(例如包括近紅外熒光(NIRF)成像在內(nèi)的熒光成像)、生物發(fā)光成像或它們的組合檢測本發(fā)明的納米顆粒。可以使治療劑與納米顆粒連接。所述治療劑包括抗生素，抗菌素，抗增殖劑，抗腫瘤劑，抗氧化劑，內(nèi)皮細胞生長因子，凝血酶抑制劑，免疫抑制劑，抗血小板聚集劑，膠原蛋白合成抑制劑，治療性抗體，一氧化氮供體，反義寡核苷酸，傷口愈合劑，治療性基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，細胞外基質(zhì)成分，血管擴張劑，溶栓劑，抗代謝物，生長因子激動劑，抗有絲分裂劑，他汀類，類固醇，類固醇和非類固醇抗炎劑，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，自由基清除劑，PPAR-γ激動劑，小干擾RNA(siRNA)，微RNA和抗癌化療劑。本發(fā)明包括的治療劑還包括放射性核素，例如90Y、131I和177Lu。所述治療劑可以具有放射性標記，例如通過結(jié)合放射性氟18F而進行標記。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的血液停留半衰期可以為約2小時至約25小時，約3小時至約15小時，或約4小時至約10小時。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的腫瘤停留半衰期可以為約5小時至約5天，約10小時至約4天，或者約15小時至約3.5天。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的腫瘤停留半衰期與血液停留半衰期之比可以為約2至約30，約3至約20，或者約4至約15。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的腎清除率可以在約24小時后為約10％ID(起始劑量)至約100％ID，在約24小時后為約30％ID至約80％ID，在約24小時后為約40％ID至約70％ID。在一個實施方式中，在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的血液停留半衰期為約2小時至約25小時，納米顆粒的腫瘤停留半衰期可以為約5小時至約5天，納米顆粒的腎清除率在約24小時后為約30％ID至約80％ID。當將施用量約為100倍人劑量當量的納米顆粒施用于受試者時，在約10至約14天內(nèi)在受試者中基本沒有觀察到貧血，體重降低，激動，呼吸加快，胃腸道功能紊亂(GIdisturbance)，行為異常，神經(jīng)功能障礙，血液異常，臨床化學異常，器官病理學上與藥物相關(guān)的病變，死亡，或它們的組合。納米顆粒的多價提高(multivalencyenhancement)可以為約2倍至約4倍。本發(fā)明還提供了基于二氧化硅的熒光納米顆粒，所述基于二氧化硅的熒光納米顆粒包含：基于二氧化硅的核，所述核包含位于其內(nèi)的熒光化合物；包圍至少一部分所述核的二氧化硅殼；與所述納米顆粒連接的有機聚合物；和與所述納米顆粒連接的配體；其中所述納米顆粒的直徑為約1nm至約15nm。在向受試者施用所述納米顆粒后，所述納米顆粒的血液停留半衰期為約2小時至約25小時，所述納米顆粒的腫瘤停留半衰期可以為約5小時至約5天，所述納米顆粒的腎清除率在約24小時后為約30％ID至約80％ID。與所述納米顆粒連接的配體數(shù)量為約1至約20個，或約1至約10個。所述納米顆粒的直徑為約1nm至約8nm。諸如放射性核素的造影劑可以與納米顆粒連接?；蛘?，可以使螯合劑與納米顆粒連接?？梢酝ㄟ^PET、SPECT、CT、MRI、光學成像、生物發(fā)光成像或它們的組合檢測納米顆粒。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的血液停留半衰期可以為約3小時至約15小時，或約4小時至約10小時。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的腫瘤停留半衰期可以為約10小時至約4天，或者約15小時至約3.5天。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的腫瘤停留半衰期與血液停留半衰期之比可以為約2至約30，約3至約20，或者約4至約15。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的腎清除率可以在約24小時后為約40％ID至約70％ID。本發(fā)明還提供了基于二氧化硅的熒光納米顆粒，所述基于二氧化硅的熒光納米顆粒包含：基于二氧化硅的核，所述核包含位于其內(nèi)的熒光化合物；包圍至少一部分所述核的二氧化硅殼；與所述納米顆粒連接的有機聚合物；和與所述納米顆粒連接的配體；其中所述納米顆粒的直徑為約1nm至約8nm。在向受試者施用納米顆粒后，納米顆粒的腫瘤停留半衰期與血液停留半衰期之比可以為約2至約30，納米顆粒的腎清除率可以在約24小時后為約30％ID至約80％ID。本發(fā)明進一步提供了檢測細胞成分的方法，所述方法包括以下步驟：(a)使所述細胞與基于二氧化硅的熒光納米顆粒接觸，所述基于二氧化硅的熒光納米顆粒包含：基于二氧化硅的核，所述核包含位于其內(nèi)的熒光化合物；包圍至少一部分所述核的二氧化硅殼；與所述納米顆粒連接的有機聚合物；約1至約20個與所述納米顆粒連接的配體；和與所述納米顆粒連接的造影劑或螯合劑；和(b)通過至少一種成像技術(shù)監(jiān)測所述納米顆粒與所述細胞或細胞成分的結(jié)合。本發(fā)明進一步提供了靶向腫瘤細胞的方法，所述方法包括向癌癥患者施用有效量的基于二氧化硅的熒光納米顆粒，所述基于二氧化硅的熒光納米顆粒包含：基于二氧化硅的核，所述核包含位于其內(nèi)的熒光化合物；包圍至少一部分所述核的二氧化硅殼；與所述納米顆粒連接的有機聚合物；與所述納米顆粒連接并且能夠結(jié)合腫瘤標志物的配體；和至少一種治療劑。所述納米顆?？梢跃哂蟹派湫詷擞??？梢酝ㄟ^但不限于以下途徑向患者施用納米顆粒：口腔、靜脈、鼻、皮下、局部、肌內(nèi)或透皮。附圖描述圖1a顯示了裸二氧化硅(灰色)和涂布有PEG(黑色)的含Cy5的二氧化硅的納米顆粒的粒徑的動態(tài)光散射(DLS)曲線(數(shù)均)。圖1b顯示了覆蓋在用裸二氧化硅納米顆粒注射后45分鐘的裸鼠可見光成像上的、在光譜上分離的Cy5顆粒熒光(假色)的體內(nèi)成像。圖1c顯示了覆蓋在用PEG化Cy5納米顆粒注射后45分鐘的裸鼠可見光成像上的、在光譜上分離的Cy5顆粒熒光(假色)的體內(nèi)成像。圖1d顯示了利用共配準(co-registered)的PET-CT的體內(nèi)生物分布研究。上行為注射標記有24I的涂布有PEG的納米顆粒后24小時的系列共配準PET-CT圖像，側(cè)邊為獨立獲得的顯微CT(microCT)和顯微PET(microPET)掃描。下行為系列顯微PET成像。圖2a顯示了Cy5染料(淺灰)、3.3±0.06nm直徑(深灰，平均值±標準差，n＝9)和6.0±0.1nm直徑(黑色，平均值±標準差，n＝6)含Cy5且涂布有PEG的納米顆粒的熒光關(guān)聯(lián)色譜(FCS)數(shù)據(jù)和單指數(shù)擬合，其顯示了由不同物質(zhì)的不同流體動力學尺寸導致的擴散時間的差異。圖2b顯示了Cy5染料(淺灰)、3.3nm直徑(深灰)和6.0nm直徑(黑色)的涂布有PEG的納米顆粒的吸收和發(fā)射譜。圖2c顯示了由FCS曲線測定的以每分子/顆粒的計數(shù)率(countrate)計算的游離染料(淺灰)、3.3nm直徑(深灰)和6.0nm直徑(黑色)的納米顆粒的相對亮度比較。圖2d顯示了Cy5染料(淺灰)、3.3nm直徑(深灰)和6.0nm直徑(黑色)的涂布有PEG的納米顆粒在約3.5mW激光激發(fā)下的光致漂白數(shù)據(jù)。圖3a顯示了直徑6.0nm的納米顆粒在注射后10分鐘至48小時的不同時間點由血液(黑色)和組織：肝臟(淺灰)、肺(中低灰)、脾(中灰)和腎(中高灰)滯留的起始顆粒劑量的百分數(shù)(％ID)(n＝3只小鼠，平均值±標準差)。圖3b顯示了3.3nm(淺灰)和6.0nm(黑色)直徑的納米顆粒的滯留顆粒濃度的曲線和相關(guān)對數(shù)衰減擬合(associatedlogarithmicdecayfit)以及半衰期。圖3c顯示了3.3nm(淺灰)和6.0nm(黑色)直徑納米顆粒的估測顆粒排泄的曲線以及相關(guān)對數(shù)擬合和半衰期(平均值±標準差，n＝9(每個時間點3只小鼠))。圖4顯示了納米顆粒在沒有荷載腫瘤的小鼠和具有皮下C6異種移植物的荷載腫瘤的小鼠中的體內(nèi)生物分布。(A)裸二氧化硅顆粒；(B)PEG化RGD顆粒。圖5顯示了利用流式細胞術(shù)檢測的在Cy5通道中作為時間(a)和顆粒濃度(b)的函數(shù)的cRGD化點和PEG化點(即納米顆粒)的總特異結(jié)合數(shù)據(jù)。圖6顯示了用于αvβ3-整合素靶向和表征的多模態(tài)(multimodal)C點設計。圖6a顯示了表面荷載的放射性標記和肽并且核包含反應性染料分子(插圖)的124I-cRGDY-PEG化核-殼二氧化硅納米顆粒的示意圖。圖6b顯示了溶液中的Cy5染料(黑色)、涂布有PEG的點(PEG點，紅色)和涂布有PEG且標記有cRGDY的點(藍色，在紅色數(shù)據(jù)組之下)的測定值的FCS結(jié)果和單指數(shù)擬合，其顯示不同流體動力學尺寸導致的擴散時間差異。圖6c顯示了游離染料與源自FCS曲線的涂布有PEG的點和cRGDY-PEG點的流體動力學尺寸(平均值+標準差(s.d.),n＝15)和相對亮度比較，以及相應的染料和顆粒濃度。圖7顯示了利用尺寸排阻柱色譜的124I-RGDY-PEG-點的純化和質(zhì)量控制。各洗脫級分(fraction)中通過γ-計數(shù)檢測的124I-RGD-點和124I-PEG-點的放射性(右列)和124I-RGDY-PEG-點和124I-PEG-點的相應熒光信號強度(Cy5，左列)。圖8顯示了利用兩種細胞類型的124I-cRGDY-PEG-點、cRGDY肽和抗-αvβ3抗體的競爭性整合素受體結(jié)合研究。圖8a顯示了通過γ-計數(shù)的124I-cRGDY-PEG-點和M21細胞的高親和性特異結(jié)合。插圖顯示了結(jié)合數(shù)據(jù)的Scatchard分析，描繪對結(jié)合受體的放射性配體(B)和未結(jié)合受體的放射性配體(或游離的放射性配體，F(xiàn))的濃度之比，或者結(jié)合-游離之比(B/F)與結(jié)合受體的濃度B的曲線；斜率代表解離常數(shù)Kd。圖8b顯示了在用cRGDY-PEG-點溫育前利用流式細胞術(shù)和過量的未放射性標記的cRGD或抗-αvβ3抗體檢測M21細胞的αvβ3-整合素受體阻滯。圖8c顯示了利用流式細胞術(shù)檢測的與缺乏表面整合素表達的M21L細胞相比cRGDY-PEG-點與M21的特異結(jié)合。圖8d顯示了通過流式細胞術(shù)檢測的cRGDY-PEG-點與HUVEC細胞的特異結(jié)合。各誤差棒表示三個重復的平均值+標準差。圖9顯示了靶向和非靶向顆粒探針的藥物代謝動力學和排泄圖。圖9a顯示了124I-cRGDY-PEG-點在注射后(p.i.)4至168小時的多個時間在荷載有M21腫瘤的小鼠中的生物分布。插圖顯示了檢測血液停留半衰期(T1/2)的這些數(shù)據(jù)的典型曲線。圖9b顯示了124I-PEG-點在注射后4至96小時的生物分布。圖9c顯示了在注射后達168小時收集的尿液樣本中未放射性標記的cRGDY-PEG-點的清除率圖(n＝3只小鼠，平均值+標準差)。圖9d顯示了在注射后達168小時的間隔的糞的相應累積％ID/g(n＝4只小鼠)。對于生物分布研究，誤差棒代表平均值±標準差。圖10顯示了急性毒性測定的結(jié)果。圖10a顯示了H&E染色的肝臟的400x代表圖(上圖)和H&E染色的腎臟的200x代表圖(下圖)。通過靜脈注射用單劑量的未放射性標記的127I-RGDY-PEG-點或涂布127I-PEG的點(對照載體)處理小鼠，并在14天后收集器官。圖10b顯示了毒性研究中各處理組的平均日體重。圖10a中的比例尺為100μm。圖11顯示了腫瘤選擇性靶向的系列體內(nèi)PET成像。圖11a顯示了在注射后4小時時全身冠狀線方向的顯微PET圖，其表現(xiàn)出M21(左，箭頭)和M21L(中間，箭頭)腫瘤攝取分別為3.6％ID/g和0.7％ID/g，并且在24小時(右)增強了M21腫瘤造影。圖11b顯示了124I-cRGDY-PEG-點在過表達αvβ3整合素的M21腫瘤(黑色，n＝7只小鼠)和不表達αvβ3整合素的M21L腫瘤(淺灰色，n＝5只小鼠)以及124I-PEG-點在M21腫瘤(深灰色，n＝5只小鼠)中的體內(nèi)攝取。圖11c顯示了124I-cRGDY-PEG-點(黑色)和124I-PEG-點(灰色)的M21腫瘤-肌肉比。圖11d顯示了cRGDY標記的探針和未標記的探針在體內(nèi)的和離體的M21腫瘤攝取的相關(guān)性。圖12顯示了利用多尺度近紅外光學熒光成像的淋巴結(jié)定位。圖12a顯示了在手術(shù)暴露的活動物中注射后1小時時，腫瘤位點(T)和引流腹股溝淋巴結(jié)(ILN)和腋窩淋巴結(jié)(ALN)以及交通淋巴管(棒，LC)的全身熒光成像。圖12b顯示了相應的共配準白光和高分辨率熒光圖像(上行)以及僅熒光的圖像(下行)，其揭示了包括高內(nèi)皮微靜脈(HEV)在內(nèi)的局部淋巴結(jié)和遠處淋巴結(jié)的淋巴結(jié)下部構(gòu)造。(b)中的較大比例尺為500μm。圖13a顯示了利用自發(fā)性小型豬黑素瘤模型用于對引流已知的原發(fā)性黑素瘤位點的淋巴結(jié)流域和區(qū)域性淋巴管定位的實驗設備。圖13b顯示了在腫瘤位點周圍皮下注射多模態(tài)顆粒(124I-RGD-PEG-點)后5分鐘的小視野PET圖像。圖14a顯示了全身動態(tài)18F-氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)PET掃描，其顯示了通過頸內(nèi)淋巴結(jié)病變位點的徑向、冠狀線方向和軸向的圖像。圖14b顯示了融合的18F-FDGPET-CT掃描，其顯示了通過頸內(nèi)淋巴結(jié)病變位點的徑向、冠狀線方向和軸向的圖像。圖14c顯示了小型豬全身圖像。圖15顯示了與圖14相同的圖像組，但是在與上背上的脊柱相鄰的原發(fā)性黑素瘤病變的水平上。圖16a顯示了在腫瘤位點周圍皮下4象限注射(4-quadrantinjection)124I-RGD-PEG-點后1小時時間后的高分辨動態(tài)PET圖像。圖16b顯示了在腫瘤位點周圍皮下4象限注射(4-quadrantinjection)124I-RGD-PEG-點后1小時時間后的合并PET-CT圖像。圖16c顯示了Cy5成像(上圖)、切除的淋巴結(jié)(上第二幅圖)和H&E染色(下兩幅圖)。圖17顯示了具有位于核內(nèi)的熒光染料和PEG表面涂層的納米顆粒的圖。用三鍵修飾所述納米顆粒，用于隨后與DFO和用疊氮基功能化的Tyr3-奧曲肽兩者的“鏈接化學(clickchemistry)”。圖18顯示了PEG衍生物的結(jié)構(gòu)。使用標準化學反應用于產(chǎn)生具有三鍵的功能化PEG，然后通過硅烷基團使其與納米顆粒共價連接。圖19顯示了DFO衍生物的結(jié)構(gòu)。圖20a顯示了Tyr3-奧曲肽的結(jié)構(gòu)。圖20b顯示了用于引入至Tyr3-奧曲肽中的含疊氮基的酸的合成。圖21a顯示了具有核內(nèi)的NIR熒光染料、PEG表面涂層、DFO螯合劑和Tyr3-奧曲肽的功能化的納米顆粒的產(chǎn)生圖。圖21b顯示了修飾有Tyr3-奧曲肽的多模態(tài)89Zr標記的納米顆粒(PET和熒光)的產(chǎn)生圖。圖22顯示了表現(xiàn)cRGF-PEG-納米顆粒與溶酶示蹤紅(lysotrackerred)之間在胞吞途徑中的共定位的顯微圖像。具體實施方式本發(fā)明提供了可以準確檢測、表征、監(jiān)測和治療諸如癌癥的疾病的基于二氧化硅的熒光納米顆粒。所述納米顆粒的直徑范圍包括約0.1nm至約100nm，約0.5nm至約50nm，約1nm至約25nm，約1nm至約15nm，或者約1nm至約8nm。所述納米顆粒具有位于納米顆粒內(nèi)的熒光化合物，并且具有比游離熒光化合物高的亮度和熒光量子產(chǎn)率。所述納米顆粒還顯示高的生物穩(wěn)定性和生物相容性。為了便于所述納米顆粒的高效尿液排泄，所述納米顆粒可以涂布有有機聚合物，例如聚乙二醇(PEG)。所述納米顆粒的小尺寸、二氧化硅基和有機聚合物涂層使所述納米顆粒在體內(nèi)施用時的毒性最小。為了靶向特定的細胞類型，所述納米顆?？蛇M一步軛合至配體，該配體能夠與與特定細胞類型有關(guān)的細胞成分(例如細胞膜或其他細胞內(nèi)成分)結(jié)合，例如腫瘤標志物或信號轉(zhuǎn)導通路中間物。在一個實施方式中，可以使治療劑與所述納米顆粒連接。為了使所述納米顆粒不僅可通過光學熒光成像(例如熒光成像)檢測而且可通過諸如正電子發(fā)射斷層顯像(PET)、單光子發(fā)射計算機斷層顯像(SPECT)、計算機斷層顯像(CT)和磁共振成像(MRI)的其他成像技術(shù)檢測，也可以使所述納米顆粒軛合諸如放射性核素的造影劑。所述納米顆粒的性質(zhì)使得能夠通過腎臟排泄，并且與正常組織相比選擇性攝取并滯留在腫瘤中。這與在體內(nèi)無毒一起形成有望轉(zhuǎn)化至臨床的獨特產(chǎn)品。納米顆?？梢跃哂信潴w和造影劑兩者。配體允許納米顆粒通過在配體和細胞成分之間的特異結(jié)合而靶向特定的細胞類型。這種靶向與多模態(tài)成像組合具有多種用途。例如，納米顆?？梢杂糜趯η吧诹馨徒Y(jié)(SLN)定位，用于標記腫瘤邊緣或神經(jīng)結(jié)構(gòu)，從而使外科醫(yī)生能夠在直接可視下切除惡性病灶并消除在手術(shù)期間的并發(fā)癥。配體還可以促進納米顆粒進入細胞或促進屏障運輸，例如用于測定細胞內(nèi)環(huán)境。所述納米顆?？梢耘c配體和有或沒有放射性標記的治療劑偶聯(lián)。所述放射性標記可以又作為用于形成多治療平臺的治療劑。這種偶聯(lián)使治療劑能夠通過配體與細胞成分之間的特異結(jié)合而被遞送至特定細胞類型。治療劑的這種特定靶向保證了疾病位點的選擇性治療，并使副作用最小。本發(fā)明的熒光納米顆粒包含：基于二氧化硅的核，所述核包含位于其內(nèi)的熒光化合物；和位于所述核上的二氧化硅殼。所述二氧化硅殼可以包圍至少一部分所述核?；蛘?，所述納米顆?？梢詢H具有核而沒有殼。所述納米顆粒的核可以包含反應性熒光化合物和共反應性有機硅烷化合物的反應產(chǎn)物。在另一個實施方式中，納米顆粒的核可以包含反應性熒光化合物和共反應性有機硅烷化合物的反應產(chǎn)物，和二氧化硅。所述核的直徑可以為約0.05nm至約100nm，約0.1nm至約50nm，約0.5nm至約25nm，約0.8nm至約15nm，或者約1nm至約8nm。所述納米顆粒的殼可以是生成二氧化硅的化合物的反應產(chǎn)物。所述納米顆粒的殼可以具有多個層。例如，所述二氧化硅殼可以為約1至約20層，約1至約15層，約1至約10層，或者約1至約5層。所述殼的厚度可以為約0.01nm至約90nm，約0.02nm至約40nm，約0.05nm至約20nm，約0.05nm至約10nm，或者約0.05nm至約5nm。所述納米顆粒的二氧化硅殼可以覆蓋僅部分納米顆?；蛲暾念w粒。例如，所述二氧化硅殼可以覆蓋約1％至約100％，約10％至約80％，約20％至約60％，或者約30％至約50％納米顆粒。所述二氧化硅殼可以為固體，即基本無孔，中多孔，例如半多孔，或多孔。本發(fā)明的熒光納米顆粒可以通過以下步驟而合成：使具有反應性部分的熒光化合物(例如反應性熒光染料)與有機硅烷化合物(例如共反應性有機硅烷化合物)共價軛合以形成熒光二氧化硅前體，所述反應性部分包括但不限于馬來酰亞胺、碘乙酰胺、硫代硫酸酯、胺，N-羥基琥珀酰亞胺酯、4-磺酸基-2,3,5,6-四氟苯基(STP)酯、磺酸基琥珀酰亞胺酯、磺酸基二氯苯酚酯、磺酰氯、羥基、異硫氰酸酯、羧基；和使所述熒光二氧化硅前體反應以形成熒光核；使熒光化合物(例如反應性熒光染料)共價軛合至有機硅烷化合物(例如共反應性有機硅烷化合物)，以形成熒光二氧化硅前體；和使所述熒光二氧化硅前體與生成二氧化硅的化合物(例如四烷氧基硅烷)反應，以形成熒光核；和使所形成的核與生成二氧化硅的化合物(例如四烷氧基硅烷)反應，以在核上形成二氧化硅殼，從而產(chǎn)生熒光納米顆粒。所述熒光單分散性核-殼納米顆粒的合成基于一種具有兩個步驟的方法。首先，使有機染料分子四甲基若丹明異氰酸酯(TRITC)共價軛合至二氧化硅前體并濃縮以形成富含染料的核。然后，添加二氧化硅凝膠單體以形成包圍熒光核物質(zhì)的更密的二氧化硅網(wǎng)絡，防止可能對耐光性有害的溶劑相互作用。制備途徑的多樣性可以根據(jù)期望的納米顆粒應用而引入不同的熒光化合物，例如熒光有機化合物或染料。可以引入至富含染料的核的熒光化合物可以覆蓋整個紫外可見光譜(UV-Vis)至近紅外(IR)吸收譜和發(fā)射譜。美國專利申請第10/306,614、10/536,569和11/119,969號。Wiesneretal.,Peg-coatedCore-shellSilicaNanoparticlesandMathodsofManufactireandUse,PCT/US2008/74894。為了合成緊密的核-殼納米顆粒，將染料前體加入至包含適量氨、水和溶劑的反應容器中，并使反應過夜。通過使感興趣的特定近紅外染料和3-氨基丙基三乙氧基硅烷之間以1:50的摩爾比例進行加成反應(排除水氣)，合成染料前體。在富含染料的緊密核的合成完成后，隨后加入正硅酸四乙酯(TEOS)以培養(yǎng)包圍核的二氧化硅殼。通過使TEOS與染料前體共凝聚(co-condensing)并使混合物反應過夜，實現(xiàn)膨脹的核-殼納米顆粒的合成。在膨脹的核的合成完成后，加入額外的TEOS以培養(yǎng)包圍核的二氧化硅殼。通過使所有試劑、染料前體和TEOS共凝聚并使混合物反應過夜，實現(xiàn)均質(zhì)納米顆粒的合成。納米顆?？梢砸肴魏我阎臒晒饣衔?，例如熒光有機化合物、染料、顏料或它們的組合物。已知多種在化學上合適的反應性熒光染料，參見例如MOLECULARPROBESHANDBOOKOFFLUORESCENTPROBESANDRESEARCHCHEMICALS,第6版，R.P.Haugland編輯(1996)。典型的熒光團為，例如熒光芳香族或雜芳香族化合物，如芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)、花青、羰花青、喹諾酮(carbostyryl)、卟啉、水楊酸酯、鄰氨基苯甲酸酯、薁、苝、吡啶、喹啉、香豆素(包括羥基香豆素和氨基香豆素及其氟化衍生物)，以及類似化合物，參見例如美國專利第5,830,912、4,774,339、5,187,288、5,248,782、5,274,113、5,433,896、4,810,636和4,812,409號。在一個實施方式中，近紅外熒光(NIFR)染料Cy5位于本發(fā)明的納米顆粒的二氧化硅核內(nèi)。近紅外發(fā)射探針顯示降低的組織衰減和自身熒光。Burnsetal.“Fluorescentsilicananoparticleswithefficienturinaryexcretionfornanomedicine”,NanoLetters,2009,9(1),442-448。可以用于本發(fā)明的非限制性熒光化合物包括Cy5，Cy5.5(也被稱為Cy5++)，Cy2，異硫氰酸熒光素(FITC)，四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)，藻紅蛋白，Cy7，熒光素(FAM)，Cy3，Cy3.5(也作為Cy3++)，德克薩斯紅，LightCycler-Red640，LightCyclerRed705，四甲基羅丹明(TMR)，羅丹明，羅丹明衍生物(ROX)，六氯熒光素(HEX)，羅丹明6G(R6G)，羅丹明衍生物JA133，Alexa熒光染料(如AlexaFluor488、AlexaFluor546、AlexaFluor633、AlexaFluor555和AlexaFluor647)，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，碘化丙啶，AMCA，光譜綠(SpectrumGreen)，光譜橙(SpectrumOrange)，光譜淺綠(SpectrumAqua)，麗絲胺(Lissamine)，和熒光過渡金屬絡合物，如銪?？梢允褂玫臒晒饣衔镞€包括熒光蛋白，如GFP(綠色熒光蛋白)，增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，藍色熒光蛋白及其衍生物((BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)，青色熒光蛋白及其衍生物(CFP、ECFP、Cerulean、CyPet)和黃色熒光蛋白及其衍生物(YFP、Citrine、Venus、YPet)。WO2008142571,WO2009056282,WO9922026?？梢允褂靡阎慕宦?lián)劑修飾納米顆粒的二氧化硅殼表面，以引入表面官能團。交聯(lián)劑包括但不限于二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、N,N'-亞甲基-雙-丙烯酰胺、烷基醚、糖、肽、DNA片段或其他已知的在功能上等同的試劑?？梢酝ㄟ^例如使用碳二亞胺、羧酸酯、酯、醇、尿素、醛、胺、硫氧化物、氮氧化物、鹵化物或本領(lǐng)域已知的其他任何合適的化合物的偶聯(lián)反應，使配體與本發(fā)明的納米顆粒軛合。美國專利第6,268,222號?？梢允褂袡C聚合物與本發(fā)明的納米顆粒連接，例如連接至納米顆粒的表面?？梢允褂袡C聚合物連接至本發(fā)明的納米顆粒的二氧化硅殼?？梢杂糜诒景l(fā)明的有機聚合物包括PEG，聚乳酸酯，聚乳酸，糖，脂，聚谷氨酸(PGA)，聚乙醇酸，聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)，聚乙酸乙烯酯(PVA)及它們的組合。有機聚合物與納米顆粒的連接可以通過共價鍵或非共價鍵，例如離子鍵、氫鍵、疏水鍵、配位、粘附和物理吸附而實現(xiàn)。在一個實施方式中，納米顆粒與PEG共價軛合，其中PEG阻止血清蛋白的吸附，促進有效尿液排泄并降低納米顆粒的聚集。Burnsetal.“Fluorescentsilicananoparticleswithefficienturinaryexcretionfornanomedicine”,NanoLetters,2009,9(1),442-448?？梢詫{米顆粒的表面進行修飾以引入至少一種官能團?？梢詫B接至納米顆粒的有機聚合物(例如PEG)進行修飾，以引入至少一種官能團。例如，所述官能團可以為馬來酰亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯。官能團的引入使得能使多種配體、造影劑和/或治療劑與納米顆粒連接?？梢允古潴w與本發(fā)明的納米顆粒連接。所述配體能夠結(jié)合至少一種細胞成分。所述細胞成分可與特定細胞類型相關(guān)或者在特定細胞類型(例如癌細胞或特定組織和器官的特異性細胞)中具有提高的水平。因此，所述納米顆?？梢园邢蛱囟ǖ募毎愋?，并/或提供用于疾病的治療和診斷的靶向遞送。如本文所使用的，術(shù)語“配體”指能夠用于鑒定、檢測、靶向、監(jiān)測或修飾身體狀態(tài)或狀況(例如疾病狀態(tài)或狀況)的分子或?qū)嶓w。例如，可將配體用于檢測特定受體的存在與否、特定受體的表達水平或者特定受體的代謝水平。所述配體可以為，例如肽，蛋白，蛋白片段，肽激素，糖((即凝集素)，生物聚合物，合成聚合物，抗原，抗體，抗體片段(例如Fab、納米抗體)，適體，病毒或病毒成分，受體，半抗原，酶，激素，化合物，病原體，微生物或其組分，毒素，表面改性劑，如改變納米顆?；蚺c納米顆粒相連的分析物的表面性質(zhì)或組織相容性的表面活性劑，及它們的組合。優(yōu)選的配體為，例如抗體，如單克隆或多克隆抗體和受體配體。在另一個實施方式中，配體是聚-L-賴氨酸(pLysine)?？梢允箍乖c納米顆粒連接。連接有抗原的納米顆?？捎糜诮臃N。術(shù)語“細胞成分”或“細胞的成分”是指，例如受體、抗體、半抗原、酶、激素、生物聚合物、抗原、核酸(DNA或RNA)、微生物、病毒、病原體、毒素、它們的組合和類似成分。所述細胞成分可以位于細胞上(例如跨膜受體)或者位于細胞內(nèi)。在一個實施方式中，所述細胞成分為腫瘤標志物。如本文所使用的，術(shù)語“腫瘤標志物”指在癌細胞中但不在正常細胞中表達或過表達的分子、實體或物質(zhì)。例如，某些受體的過表達與多種類型的癌癥有關(guān)。能夠結(jié)合腫瘤標志物的配體可以軛合至本發(fā)明的納米顆粒的表面，從而使納米顆粒能夠特異地靶向腫瘤細胞?？梢允古潴w與本發(fā)明的納米顆粒直接連接或者通過連接劑連接。配體與納米顆粒的連接可以通過共價鍵或非共價鍵，例如離子鍵、氫鍵、疏水鍵、配位、粘附和物理吸附而實現(xiàn)?？梢詫⑴潴w涂布在納米顆粒的表面。所述配體可以被滲吸(imbibed)至納米顆粒的表面內(nèi)。如本文所使用的，“滲吸”指同化或吸入?？梢允古潴w與熒光納米顆粒的表面相連，或者當殼為多孔或者覆蓋部分核時可以使配體與核相連。當配體通過連接劑與納米顆粒相連時，所述連接劑可以為任何合適的分子，例如功能化的PEG。PEG可以具有多個官能團，用于與納米顆粒和配體的連接。所述顆粒可以具有荷載有能與多個配體連接的不同官能團的不同類型的功能化PEG。這可以提高多價作用和/或在靶位點造影，從而可以設計并優(yōu)化在體內(nèi)具有提高的靶向檢測、治療和感應的復雜的多模態(tài)平臺。多種不同的配體都可以與納米顆粒連接。例如，可以使三肽Arg-Gly-Asp(RGD)與納米顆粒連接?；蛘撸梢允弓h(huán)肽cRGD(其可以包含其他氨基酸，例如cRGDY)與納米顆粒連接。包含RGD序列的任何線性、環(huán)狀或支鏈肽都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。RGD與αvβ3整合素結(jié)合，αvβ3整合素在血管生成過程中在活化的內(nèi)皮細胞表面過表達并在多種類型的腫瘤細胞中過表達。已經(jīng)顯示αvβ3整合素的表達水平與腫瘤的侵襲性緊密關(guān)聯(lián)。Ruoslahtietal.Newperspectivesincelladhesion:RGDandintegrins.Science1987；238:491.Gladsonetal.Glioblastomaexpressionofvitronectinandalphavbeta3integrin.Adhesionmechanismfortransformedglialcells.J.Clin.Invest.1991；88:1924-1932.Seftoretal.Roleofthealphavbeta3integrininhumanmelanomacellinvasion.Proc.Natl.Acad.Sci.1992；89:1557-1561?；蛘?，合成肽EPPT1可以為與納米顆粒連接的配體。源自單克隆抗體(ASM2)結(jié)合位點的EPPT1靶向低糖基化的MUC1(uMUC1)。作為跨膜受體，MUC1在正常組織中被大幅糖基化；然而，其在幾乎所有的人上皮細胞腺癌中都過表達并被異常地低糖基化，并參與腫瘤病理過程。Mooreetal.InvivotargetingofunderglycosylatedMUC-1tumorantigenusingamultimodalimagingprobe.CancerRes.2004；64:1821-7.Pateletal.MUC1playsaroleintumormaintenanceinaggressivethryroidcarcinomas.Surgery.2005；138:994-1001。為了靶向uMUC1，包括針對uMUC1的單克隆抗體在內(nèi)的特異抗體可以可選地與納米顆粒軛合。在一個實施方式中，α-促黑色素細胞刺激激素(α-MSH)是與納米顆粒相連的配體。α-MSH的肽類似物能夠與在黑素瘤細胞中過表達的G-蛋白偶聯(lián)受體家族的黑皮質(zhì)素-1受體(MC1R)結(jié)合。Loiretal.CellMol.Biol.(Noisy-le-grand)1999,45:1083-1092.在另一個實施方式中，14-氨基酸生長激素抑制素的肽類似物奧曲肽是與納米顆粒連接的配體。半衰期比生長激素抑制素長的奧曲肽(Octreotide)能夠結(jié)合生長激素抑制素受體(SSTR)。G-蛋白偶聯(lián)受體家族的成員SSTR在數(shù)種人腫瘤的表面過表達。Reubietal.DistributionofSomatostatinReceptorsinNormalandTumor-Tissue.Metab.Clin.Exp.1990；39:78-81.Reubietal.Somatostatinreceptorsandtheirsubtypesinhumantumorsandinperitumoralvessels.Metab.Clin.Exp.1996；45:39-41。其他生長激素抑制素類似物可以可選地與納米顆粒軛合，以靶向SSTR，例如Tyr3-奧曲肽(Y3-OC)、奧曲肽(TATE)、Tyr3-奧曲肽(Y3-TATE)和111In-DTPA-OC。這些生長激素抑制素類似物可用于癌癥的PET診斷性成像和靶向放療。deJongetal.Internalizationofradiolabelled[DTPA0]octreotideand[DOTA0,Tyr3]octreotide:peptidesforsomatostatinreceptortargetedscintigraphyandradionuclidetherapy.Nucl.Med.Commun.1998；19:283-8.deJongetal.Comparisonof111In-LabeledSomatostatinAnaloguesforTumorScintigraphyandRadionuclideTherapy.CancerRes.1998；58:437-41.Lewisetal.Comparisonoffour64Cu-labeledsomatostatinanalogsinvitroandinatumor-bearingratmodel:evaluationofnewderivativesforPETimagingandtargetedradiotherapy.JMedChem1999；42:1341-7.Krenningetal.SomatostatinReceptorScintigraphywithIndium-111-DTPA-D-Phe-1-OctreotideinMan:Metabolism,DosimetryandComparisonwithIodine-123-Tyr-3-Octreotide.JNucl.Med.1992；33:652-8。與納米顆粒相連的配體數(shù)量可以為約1至約20個，約2至約15個，約3至約10個，約1至約10個，或者約1至約6個。與納米顆粒相連的少量配體有助于維持滿足腎臟清除截留尺寸范圍的本發(fā)明納米顆粒的流體動力學直徑。Hilderbrandetal.,Near-infraredfluorescence:applicationtoinvivomolecularimaging,Curr.Opin.Chem.Biol.,14:71-9,2010。所測定的配體數(shù)量可以是與一個以上的納米顆粒連接的配體的平均數(shù)量?；蛘?，可以測定一個納米顆粒以確定所連接的配體數(shù)量。可以通過任何合適的方法測定與納米顆粒連接的配體數(shù)量，所述方法可以與配體性質(zhì)有關(guān)或者可以與配體性質(zhì)無關(guān)。例如，可以利用絕對顆粒濃度和用于cRGD肽的試劑的起始濃度的基于FCS的測定，估測與顆粒結(jié)合的cRGD肽的數(shù)量?？梢栽趬A性條件下和Biuret分光光度法在比色學上評價每個納米顆粒RGD肽的平均數(shù)量和RGD與功能化PEG基團的偶聯(lián)效率。還可以通過核磁共振(NMR)、光學成像、放射性分析等測定與納米顆粒連接的配體數(shù)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定所述方法。可以使造影劑與本發(fā)明的納米顆粒連接，用于醫(yī)學或生物學成像。如本文所使用的，術(shù)語“造影劑”指用于增強結(jié)構(gòu)或流體在醫(yī)學或生物學成像中的可視性的物質(zhì)、分子或化合物。術(shù)語“造影劑”還指產(chǎn)生造影的分子。本發(fā)明涵蓋的成像技術(shù)包括正電子發(fā)射斷層顯像(PET)、單光子發(fā)射計算機斷層顯像(SPECT)、計算機斷層顯像掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、光學生物發(fā)光成像、光學熒光成像及它們的組合。本發(fā)明涵蓋的造影劑可以是本領(lǐng)域已知用于PET、SPECT、CT、MRI和光學成像的任何分子、物質(zhì)或化合物。所述造影劑可以是放射性核素、放射金屬、正電子發(fā)射體、β發(fā)射體、γ發(fā)射體、α發(fā)射體、順磁性金屬離子、高級順磁性金屬離子。所述造影劑包括但不僅限于碘、氟、銅、鋯、镥、砹、釔、鎵、銦、锝、釓、鏑、鐵、錳、鋇和硫酸鋇?？梢杂米髋c本發(fā)明的納米顆粒連接的造影劑的放射性核素包括但不限于89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I和177Lu。造影劑可以直接與納米顆粒軛合?；蛘?，造影劑可以通過連接劑或螯合劑間接與納米顆粒軛合?？梢詫︱蟿┻M行修飾以結(jié)合放射性核素?？梢赃B接至本發(fā)明的納米顆粒的螯合劑可以包括，但不限于1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、去鐵銨(DFO)和三亞乙基四胺(TETA)。適合使本發(fā)明的納米顆粒成像、檢測、記錄或測定本發(fā)明的納米顆粒的方式還可以包括，例如流式細胞儀、激光掃描細胞儀、熒光微酶標儀、熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、明視野顯微鏡、高通量掃描系統(tǒng)和類似裝置。可以同時使用或連續(xù)使用一種以上成像技術(shù)，以檢測本發(fā)明的納米顆粒。在一個實施方式中，將光學成像用作靈敏性高通量掃描工具，用以在同一受試者中獲得多個時間點，從而可以對腫瘤標志物水平進行半定量評價。這抵消了利用PET獲得的相對降低的瞬時分辨率，但需要PET用以獲得足以獲得體積測定數(shù)據(jù)的深度滲透，并用以檢測、定量和監(jiān)測受體和/或其他細胞標志物水平的變化，作為評價疾病進展或改善以及將患者分級至合適的治療方案的方式。可以使治療劑與熒光納米顆粒連接，用于例如疾病的靶向治療?？梢砸愿叨忍禺惖姆绞交蛘呔植炕绞綄⒅委焺┻f送至病變位點，以在病變位點釋放治療劑?；蛘撸梢圆会尫胖委焺?。與配體軛合的熒光納米顆?？梢杂糜趯⒅委焺┌邢蜻f送至多個系統(tǒng)內(nèi)的期望部位，例如在細胞或細胞成分上或者細胞或細胞成分內(nèi)，生物體體內(nèi)，例如人體內(nèi)，或者跨越血腦屏障?？梢允怪委焺┡c納米顆粒直接或間接連接?？梢允怪委焺┍晃罩炼趸铓さ目障痘蚩變?nèi)，或者涂布至熒光納米顆粒的二氧化硅殼上。在二氧化硅殼沒有覆蓋全部表面的其他實施方式中，治療劑可以與熒光核相連，例如通過物理吸附或者通過鍵合相互作用?？梢允怪委焺┡c和熒光納米顆粒結(jié)合的配體相連。所述治療劑還可以與有機聚合物或造影劑相連。例如，可以通過PEG使治療劑與納米顆粒相連。PEG可以具有用于與納米顆粒和治療劑相連的多個官能團。所述顆粒可以具有荷載能夠與多種治療劑結(jié)合的不同官能團的不同類型的功能化PEG。所述治療劑可以與納米顆粒共價連接或非共價連接。如本文使用的，術(shù)語“治療劑”指可用于人或其他動物疾病的診斷、治愈、減緩、治療或預防的物質(zhì)。此類治療劑包括美國官方藥典、美國官方順勢療法藥典、美國國家官方處方集或它們的附錄認可的物質(zhì)?？梢岳帽景l(fā)明的熒光納米顆?；蜻B接熒光的納米顆粒引入的治療劑包括核苷，核苷類似物，小干擾核糖核酸(siRNA)，微RNA，寡肽，多肽，抗體，COX-2抑制劑，細胞凋亡啟動子，尿道試劑，陰道試劑，血管擴張劑、神經(jīng)變性劑(例如帕金森氏癥)，肥胖藥劑，眼科試劑，骨質(zhì)疏松癥的試劑，副交感神經(jīng)阻斷藥，擬副交感神經(jīng)藥，抗麻醉藥，前列腺素，心理治療藥，呼吸系統(tǒng)藥，鎮(zhèn)靜劑，安眠藥，皮膚和粘膜試劑，抗菌劑，抗真菌劑，抗腫瘤藥，心臟保護劑，心血管藥，抗血栓藥，中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，膽堿酯酶抑制劑，避孕藥，多巴胺受體激動劑，勃起功能障礙的藥物，生育劑，胃腸藥，痛風藥，激素，免疫調(diào)節(jié)劑，適當功能化的止痛藥或全身麻醉劑或局部麻醉劑，抗驚厥藥，抗糖尿病藥，抗纖維化藥，抗感染藥，暈車劑，肌肉松弛劑，免疫抑制劑，偏頭痛藥，非類固醇消炎藥(NSAID)，戒煙藥，或抗交感神經(jīng)藥(參見，Physicians'DeskReference,第55版,2001,MedicalEconomicsCompany,Inc.,Montvale,N.J.,第201-202頁)?？梢耘c本發(fā)明的納米顆粒連接的治療劑包括，但不限于DNA烷化劑，拓撲異構(gòu)酶抑制劑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑，鉑化合物，抗代謝藥物，長春花生物堿類(vincalkaloids)，紫杉烷類，埃博霉素，酶抑制劑，受體拮抗劑，治療性抗體，酪氨酸激酶抑制劑，硼輻射增敏劑(即萬珂(velcade))，化療聯(lián)合治療劑。DNA烷化劑的非限制性實例為氮芥(nitrogenmustard)，例如雙氯乙基甲胺(Mechlorethamine)，環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide)(異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide)，曲磷胺(Trofosfamide))，苯丁酸氮芥(Chlorambucil)(美法侖(Melphalan)、潑尼莫司汀(Prednimustine))，苯達莫司汀(Bendamustine)，烏拉莫司汀(Uramustine)和雌莫司汀(Estramustine)；亞硝基尿，如卡莫司汀(Carmustine)(BCNU)，洛莫司汀(Lomustine)(司莫司汀(Semustine))，福莫司汀(Fotemustine)，尼莫司汀(Nimustine)，雷莫司汀(Ranimustine)和鏈脲菌素(Streptozocin)；烷基磺酸酯，例如白消安(Busulfan)(甘露舒凡(Mannosulfan)、蘇消安(Treosulfan))；氮丙啶(Aziridine)，例如卡波醌(Carboquone)、噻替哌(ThioTEPA)、三亞胺醌(Triaziquone)、三亞乙基亞胺(Triethylenemelamine)；肼(甲基芐肼(Procarbazine))；三氮烯(Triazene)，例如達卡巴嗪(Dacarbazine)和替莫唑胺(Temozolomide)；六甲蜜胺(Altretamine)和二溴甘露醇(Mitobronitol)。拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的非限制性實例包括喜樹堿衍生物，包括CPT-11(伊立替康(irinotecan))、SN-38、APC、NPC、喜樹堿、拓撲替康(topotecan)、甲磺酸依沙替康(exatecanmesylate)、9-硝基喜樹堿、9-氨基喜樹堿、勒托替康(lurtotecan)、魯吡替康(rubitecan)、silatecan、吉馬替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、依喜替康(extatecan)、BN-80927、DX-8951f和MAG-CPT，如PommierY.(2006)Nat.Rev.Cancer6(10):789-802和美國專利公開第200510250854號中所描述；原小檗堿類生物堿及其衍生物，包括小檗紅堿和甲氧檗因(coralyne)，如Lietal.(2000)Biochemistry39(24):7107-7116和Gattoetal.(1996)CancerRes.15(12):2795-2800中的描述；鄰二氮雜菲衍生物，包括苯并[i]菲啶、兩面針堿(Nitidine)和花椒路寧(fagaronine)，如Makheyetal.(2003)Bioorg.Med.Chem.11(8):1809-1820中的描述；Terbenzimidazole及其衍生物，如Xu(1998)Biochemistry37(10):3558-3566中的描述；和蒽環(huán)類抗生素的衍生物，包括阿霉素、道諾霉素和米托蒽醌，如Foglesongetal.(1992)CancerChemother.Pharmacol.30(2):123-125,Crowetal.(1994)J.Med.Chem.37(19):31913194,以及Crespietal.(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.136(2):521-8中的描述。拓撲異構(gòu)酶II抑制劑包括，但不限于依托泊甙和替尼泊甙。拓撲異構(gòu)酶I和II雙重抑制劑包括，但不限于Saintopin和其他四并苯醌(Naphthecenedione)，DACA和其他吖啶-4-甲酰胺，茚托利辛(Intoplicine)和其他苯并吡啶吲哚(BenzoPyridoindole)、TAS-I03和其他7H-茚[2,1-c]喹啉-7-酮、吡唑啉吖啶、XR11576和其他苯并吩嗪，XR5944和其他二聚化合物，7-氧代-7H-二苯[f,ij]異喹啉和7-氧代-7H-苯并[e]萘嵌間二氮雜苯，和蒽基氨基酸軛合物，如DennyandBaguley(2003)Curr.Top.Med.Chem.3(3):339-353中所描述。一些試劑抑制拓撲異構(gòu)酶II并具有DNA插入活性，例如但不限于蒽環(huán)類抗生素(阿柔比星，道諾霉素，阿霉素，表阿霉素，去甲氧柔紅霉素，氨柔比星，吡柔比星，戊柔比星(Valrubicin)，佐柔比星(Zorubicin))和蒽二酮(米托蒽醌和吡蒽醌)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑的實例包括，但不限于二甲基-塞來昔布(DMC)，奈非那韋(nelfinavir)，塞來昔布(celecoxib)和硼放射增敏劑(即萬珂(硼替佐米(Bortezomib))?；阢K的化合物的非限制性實例包括卡鉑、順鉑、奈達鉑、奧沙利鉑、四硝酸三鉑，賽特鉑(Satraplatin)，Aroplatin、樂鉑(Lobaplatin)和JM-216(參見McKeageetal.(1997)J.Clin.Oncol.201:1232-1237，和大體上,CHEMOTHERAPYFORGYNECOLOGICALNEOPLASM,CURRENTTHERAPYANDNOVELAPPROACHES,SeriesBasicandClinicalOncology,Angiolietal.編輯,2004)。抗代謝物試劑的非限制性實例包括：基于葉酸的試劑，即二氫葉酸還原酶抑制劑，例如氨基喋呤，甲氨蝶呤和培美曲塞(Pemetrexed)；胸苷酸合成酶抑制劑，如雷替曲塞(Raltitrexed)，培美曲塞；基于嘌呤的試劑，即腺苷脫氨酶抑制劑，如噴司他汀(Pentostatin)，硫嘌呤，如硫鳥嘌呤(Thioguanine)和巰基嘌呤(Mercaptopurine)，鹵化/核糖核苷酸還原酶抑制劑，如克拉屈濱(Cladribine)，氯法拉濱(Clofarabine)，氟達拉濱(Fludarabine)，或鳥嘌呤/鳥苷：硫嘌呤，如硫鳥嘌呤；或基于嘧啶的試劑，即胞嘧啶/胞苷：去甲基化劑，阿扎胞苷(Azacitidine)和地西他濱(Decitabine)，DNA聚合酶抑制劑，如阿糖胞苷(Cytarabine)，核糖核苷酸還原酶抑制劑，如吉西他濱(Gemcitabine)，或胸腺嘧啶/胸苷：胸苷酸合成酶抑制劑，如氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU的等同物包括其前藥、類似物及衍生物，如5'-脫氧-5-氟尿苷(去氧氟尿苷(doxifluroidine))，1-四氫呋喃基-5-氟尿嘧啶(替加氟(ftorafur))，卡培他濱(Capecitabine)(希羅達(Xeloda))，S-I(MBMS-247616，由替加氟(tegafur)和兩種調(diào)節(jié)物5-氯-2,4-二羥基吡啶和氧嗪酸鉀組成)，雷替曲噻(ralititrexed,tomudex)，諾拉曲塞(nolatrexed)(Thymitaq，AG337)，LY231514和ZD9331，如例如Papamicheal(1999)TheOncologist4:478-487中所描述的。長春花生物堿類的實例包括，但不限于長春堿(Vinblastine)，長春新堿(Vincristine)，長春氟寧(Vinflunine)，長春地辛(Vindesine)和長春瑞賓(Vinorelbine)。紫杉烷類的實例包括，但不限于多西他賽(docetaxel)，拉洛他賽(Larotaxel)，奧他賽(Ortataxel)，紫杉醇(Paclitaxel)和替司他賽(Tesetaxel)。埃博霉素的一個例子是伊沙匹隆(iabepilone)。酶抑制劑的實例包括，但不限于法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(替吡法尼(Tipifamib))；CDK抑制劑(Alvocidib，Seliciclib)；蛋白酶體抑制劑(硼替佐米(Bortezomib))，磷酸二酯酶抑制劑(阿那格雷(Anagrelide)，咯利普蘭(rolipram))；IMP脫氫酶抑制劑(噻唑呋林(Tiazofurine))；和脂氧合酶抑制劑(馬索羅酚(Masoprocol))。受體拮抗劑的實例包括，但不僅限于ERA(阿曲森坦(Atrasentan))；維甲酸X受體(蓓薩羅丁(Bexarotene))和性類固醇(睪內(nèi)酯(Testolactone))。治療性抗體的實例包括，但不限于抗HER1/EGFR抗體(西妥昔單抗(Cetuximab)，帕尼單抗(Panitumumab)；抗HER2/neu(erbB2)受體抗體(曲妥珠單抗(Trastuzumab)；抗EpCAM抗體(卡妥索單抗(Catumaxomab)，依決洛單抗(Edrecolomab)；抗VEGF-A抗體(貝伐單抗(Bevacizumab)；抗CD20抗體(利妥昔單抗(Rituximab)，托西莫單抗(Tositumomab)，替伊莫單抗(Ibritumomab)；抗CD52抗體(阿侖單抗(Alemtuzumab))，以及抗CD33抗體(吉妥單抗(Gemtuzumab))。美國專利第5,776,427和7,601,355號。酪氨酸激酶抑制劑的實例包括，但不限于對以下的抑制劑：ErbB:HER1/EGFR(厄洛替尼(Erlotinib)，吉非替尼(Gefitinib)，拉帕替尼(Lapatinib)，凡德他尼(Vandetanib)，舒尼替尼(Sunitinib)，來那替尼(Neratinib)；HER2/neu(拉帕替尼，來那替尼)；III類RTK：C-kit(阿西替尼(Axitinib)，舒尼替尼(Sunitinib)，索拉非尼(Sorafenib)，F(xiàn)LT3(來他替尼(Lestaurtinib)，PDGFR(阿西替尼，舒尼替尼，索拉非尼)和VEGFR(凡德他尼(Vandetanib)，司馬沙尼(Semaxanib)，西地拉尼(Cediranib)，阿西替尼，索拉非尼)；bcr-abl(伊馬替尼(Imatinib)，尼羅替尼(Nilotinib)，達沙替尼(Dasatinib)；Src(博舒替尼(Bosutinib)和Janus激酶2(來他替尼)。可以與本發(fā)明的納米顆粒連接的化療劑也可以包括安吖啶(amsacrine)，曲貝替定(Trabectedin)，類視色素(阿利維甲酸(Alitretinoin)，維甲酸(Tretinoin)，三氧化二砷，天冬酰胺消耗劑(asparaginedepleter)天門冬酰胺酶/培門冬酶(Pegaspargase)，塞來昔布，脫羰秋水仙堿(Demecolcine)，伊利司莫(Elesclomol)，依沙蘆星(Elsamitrucin)，依托格魯(Etoglucid)，氯尼達明(Lonidamine)，硫蒽酮(Lucanthone)，丙脒腙(Mitoguazone)，米托坦(Mitotane)，奧利默森(Oblimersen)，坦羅莫司(temsirolimus)，伏立諾他(Vorinostat)?？梢耘c本發(fā)明的熒光納米顆粒連接、相連或結(jié)合的具體治療劑的實例為氟氧頭孢(flomoxef)；福提霉素類(fortimicin(s)))；慶大霉素類(gentamicin(s))；葡氨苯砜苯丙砜(glucosulfonesolasulfone)；短桿菌肽S(gramicidinS))；短桿菌肽類(gramicidin(s))；格帕沙星(grepafloxacin)；胍甲四環(huán)素(guamecycline)；海他西林(hetacillin)；異帕米星(isepamicin))；交沙霉素(josamycin)；卡那霉素類(kanamycin(s))；氟氧頭孢；福提霉素類；慶大霉素類；葡氨苯砜苯丙砜；短桿菌肽S；短桿菌肽類；格帕沙星；胍甲四環(huán)素；海他西林；異帕米星；交沙霉素；卡那霉素類；桿菌肽(bacitracin)；班貝霉素類(Bambermycin(s))；比阿培南(biapenem)；溴莫普林(brodimoprim)；丁胺菌素(butirosin)；卷曲霉素(capreomycin)；羧芐青霉素(carbenicillin)；碳霉素(carbomycin)；卡蘆莫南(carumonam)；頭孢羥氨芐(cefadroxil)；頭孢孟多(cefamandole)；頭孢曲嗪(cefatrizine)；頭孢拉宗(cefbuperazone)；頭孢克定(cefclidin)；頭孢地尼(cefdinir)；頭孢妥侖(cefditoren)；頭孢吡肟(cefepime))；頭孢他美(cefetamet)；頭孢克肟(cefixime)；頭孢甲肟(cefinenoxime)；頭孢米諾(cefininox)；克拉屈濱(cladribine)；阿帕西林(apalcillin)；阿哌環(huán)素(apicycline)；安普霉素(apramycin)；阿貝卡星(arbekacin)；阿撲西林(aspoxicillin)；疊氮氯霉素(azidamfenicol)；氨曲南(aztreonam)；頭孢地嗪(cefodizime)；頭孢尼西(cefonicid)；頭孢哌酮(cefoperazone)；頭孢雷特(ceforamide)；頭孢噻肟(cefotaxime)；頭孢替坦(cefotetan)；頭孢替安(cefotiam)；頭孢唑蘭(cefozopran)；頭孢咪唑(cefpimizole)；頭孢匹胺(cefpiramide)；頭孢匹羅(cefpirome)；頭孢丙烯(cefprozil)；頭孢沙定(cefroxadine)；頭孢特侖(cefteram)；頭孢布烯(ceftibuten)；頭孢唑喃(cefuzonam)；頭孢氨芐(cephalexin)；頭孢來星(cephaloglycin)；頭孢菌素C(cephalosporinC)；頭孢拉定(cephradine)；氯霉素(chloramphenicol)；金霉素(chlortetracycline)；克林沙星(clinafloxacin)；克林霉素(clindamycin)；羥甲金霉素(clomocycline)；多粘菌素(colistin)；環(huán)青霉素(cyclacillin)；氨苯砜(dapsone)；去甲金霉素(demeclocycline)；地百里砜(diathymosulfone)；地貝卡星(dibekacin)；雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin)；6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)；硫鳥嘌呤；卡培他濱；多西紫杉醇(docetaxel)；依托泊苷；吉西他濱；拓撲替康；長春瑞濱；長春新堿；長春堿；替尼泊苷；美法侖；甲氨蝶呤(methotrexate)；2-對硫烷基苯胺基乙醇(2-p-sulfanilyanilinoethanol)；4,4'-二胺二苯砜(4,4'-sulfinyldianiline)；4-對氨苯磺酰氨基水楊酸(4-sulfanilamidosalicylicacid)；布托啡諾(butorphanol)；納布啡(nalbuphine)；鏈脲霉素(streptozocin)；阿霉素；道諾霉素；普卡霉素；去甲氧柔紅霉素；絲裂霉素C(mitomycinC)；噴司他汀；米托蒽醌；阿糖胞苷(cytarabine)；磷酸氟達拉濱(fludarabinephosphate)；布托啡諾；納布啡；鏈脲霉素；阿霉素；道諾霉素；普卡霉素；去甲氧柔紅霉素；絲裂霉素C；噴司他汀；米托蒽醌；阿糖胞苷(cytarabine)；磷酸氟達拉濱；醋地砜(acediasulfone)；乙酰砜(acetosulfone)；丁胺卡那霉素(amikacin)；兩性霉素B(amphotericinB)；氨芐青霉素(ampicillin)；阿托伐他汀(atorvastatin)；依那普利(enalapril)；雷尼替丁(ranitidine)；環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)；普伐他汀(pravastatin)；克拉霉素(clarithromycin)；環(huán)孢素(cyclosporin)；法莫替丁(famotidine)；醋酸亮丙瑞林(leuprolide)；阿昔洛韋(acyclovir)；紫杉醇(paclitaxel)；阿奇霉素(azithromycin)；拉米夫定(lamivudine)；布地奈德(budesonide)；沙丁胺醇(albuterol)；印地那韋(indinavir)；二甲雙胍(metformin)；阿侖膦酸鹽(alendronate)；尼扎替丁(nizatidine)；齊多夫定(zidovudine)；卡鉑(carboplatin)；美托洛爾(metoprolol)；阿莫西林(amoxicillin)；雙氯滅痛(diclofenac)；賴諾普利(lisinopril)；頭孢曲松(ceftriaxone)；卡托普利(captopril)；沙美特羅昔萘酸酯(salmeterolxinafoate)；亞胺培南(imipenem)；西司他汀(cilastatin)；貝那普利(benazepril)；頭孢克洛(cefaclor)；頭孢他啶(ceftazidime)；嗎啡(morphine)；多巴胺(dopamine)；卡馬風(bialamicol)；氟伐他汀(fluvastatin)；非那米丁(phenamidine)；鬼臼酸2-乙肼(podophyllinicacid2-ethylhydrazine)；吖啶黃(acriflavine)；氯阿唑丁(chloroazodin)；砷凡納明(arsphenamine)；amicarbilide；氨喹脲(aminoquinuride)；喹那普利(quinapril)；羥嗎啡酮(oxymorphone)；丁丙諾啡(buprenorphine)；氟尿苷(floxuridine)；地紅霉素(dirithromycin)；強力霉素(doxycycline)；依諾沙星(enoxacin)；恩維霉素(enviomycin)；依匹西林(Epicillin)；紅霉素(erythromycin)；白霉素類leucomycin(s))；林可霉素(lincomycin)；洛美沙星(lomefloxacin)；魯斯霉素(lucensomycin)；賴甲霉素(lymecycline)；甲氯環(huán)素(meclocycline)；美羅培南(meropenem)；美他環(huán)素(methacycline)；小諾霉素(micronomicin)；麥迪霉素類(midecamycin(s))；米諾環(huán)素(minocycline)；拉氧頭孢(moxalactam)；莫匹羅星(mupirocin)；那氟沙星(nadifloxacin)；納他霉素(natamycin)；新霉素(neomycin)；奈替米星(netilmicin)；諾氟沙星(norfloxacin)；竹桃霉素(oleandomycin)；土霉素(oxytetracycline)；對-磺胺?；S胺(p-sulfanilylbenzylamine))；帕尼培南(panipenem)；巴龍霉素(paromomycin)；帕珠沙星(pazufloxacin)；青霉素N(penicillinN)；匹哌環(huán)素(pipacycline)；吡哌酸(pipemidicacid)；多粘菌素(polymyxin)；伯霉素(primycin)；喹那西林(quinacillin)；核糖霉素(ribostamycin)；利福酰胺(rifamide)；利福平(rifampin)；利福霉素SV(rifamycinSV)；利福噴丁(rifapentine)；利福昔明(rifaximin)；瑞斯托霉素(ristocetin)；利替培南(ritipenem)；羅地霉素(rokitamycin)；吡咯烷甲基四環(huán)素(rolitetracycline)；羅沙米星(rosaramycin)；羅紅霉素(roxithromycin)；柳氮磺嘧啶(salazosulfadimidine)；山環(huán)素(sancycline)；西索米星(sisomicin)；司帕沙星(sparfloxacin)；大觀霉素(spectinomycin)；螺旋霉素(spiramycin)；鏈霉素(streptomycin)；磺胺柯定(succisulfone)；琥珀氨苯砜(sulfachrysoidine)；磺胺洛西酸(sulfaloxicacid)；磺胺柯衣定(sulfamidochrysoidine)；對氨基苯磺酸(sulfanilicacid)；索發(fā)克松(sulfoxone)；替考拉寧(teicoplanin)；替馬沙星(temafloxacin)；替莫西林(temocillin)；四氧普林(tetroxoprim)；甲砜霉素(thiamphenicol)；噻唑砜(thiazolsulfone)；硫鏈絲菌素(thiostrepton)；替卡西林(ticarcillin)；替吉莫南(tigemonam)；妥布霉素(tobramycin)；妥舒沙星(tosufloxacin)；甲氧芐啶(trimethoprim)；妥布霉素(trospectomycin)；曲伐沙星(trovafloxacin)；結(jié)核放線菌素(tuberactinomycin)；萬古霉素(vancomycin)；重氮絲氨酸(azaserine)；克念菌素類(candicidin(s))；氯苯甘醚(chlorphenesin)；制皮菌素類(dermostatin(s))；非律平(filipin)；制霉色基素(fungichromin)；甲帕霉素(mepartricin)；制霉菌素(nystatin)；寡霉素類(oligomycin(s))；培里霉素A(perimycinA)；殺結(jié)核菌素(tubercidin)；6-氮雜尿苷(6-azauridine)；6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)；阿克拉霉素類(aclacinomycin(s))；安西他賓(ancitabine)；安曲霉素(anthramycin)；阿扎胞苷(azacitadine)；重氮絲氨酸(azaserine)；博萊霉素類(bleomycin(s))；雙香豆素乙酯(ethylbiscoumacetate)；亞乙基雙香豆素(ethylidenedicoumarol)；伊洛前列素(iloprost)；拉米非班(lamifiban)；他前列烯(taprostene)；噻氯香豆素(tioclomarol)；替羅非班(tirofiban)；氨普立糖(amiprilose)；布西拉明(bucillamine)；胍立莫司(gusperimus)；龍膽酸(gentisicacid)；葡美辛(glucamethacin)；乙二醇水楊酸(glycolsalicylate)；甲氯芬那酸(meclofenamicacid)；甲芬那酸(mefenamicacid)；美沙拉嗪(mesalamine)；尼氟滅酸(niflumicacid)；奧沙拉嗪(olsalazine)；奧沙西羅(oxaceprol)；S-腺苷基甲硫氨酸(S-enosylmethionine)；水楊酸(salicylicacid)；雙水楊酸(salsalate)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；托芬那酸(tolfenamicacid)；洋紅霉素(carubicin)；嗜癌菌素A(carzinophillinA)；氯脲霉素(chlorozotocin)；色霉素類(chromomycin(s))；二甲葉酸(denopterin)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；依達曲沙(edatrexate)；依氟鳥氨酸(eflornithine)；甲基羥基玫瑰樹堿(elliptinium)；依諾他濱(enocitabine)；表阿霉素(epirubicin)；甘露醇芥(mannomustine)；美諾立爾(menogaril)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；莫哌達醇(mopidamol)；麥考酚酸(mycophenolicacid)；諾拉霉素(nogalamycin)；橄欖霉素類(olivomycin(s))；培洛霉素(peplomycin)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；潑尼莫司汀(prednimustine)；甲基芐肼(procarbazine)；蝶羅呤(pteropterin)；嘌呤霉素(puromycin)；雷莫司汀(ranimustine)；鏈黑菌素(streptonigrin)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；酶酚酸(mycophenolicacid)；丙考達唑(procodazole)；羅莫肽(romurtide)；西羅莫司(sirolimus)；雷帕霉素(rapamycin)；他克莫司(tacrolimus)；丁胺卡因(butethamine)；苯醇胺(fenalcomine)；羥丁卡因(hydroxytetracaine)；納依卡因(naepaine)；奧索卡因(orthocaine)；匹多卡因(piridocaine)；水楊醇(salicylalcohol)；3-氨基-4-羥丁酸(3-amino-4-hydroxybutyricacid)；醋氯芬酸(aceclofenac)；阿明洛芬(alminoprofen)；氨芬酸(amfenac)；溴芬酸(bromfenac)；溴柳氯苯胺(bromosaligenin)；布馬地宗(bumadizon)；卡洛芬(carprofen)；雙氯芬酸(diclofenac)；二氟尼柳(diflunisal)；地他唑(ditazol)；恩芬那酸(enfenamicacid)；依托度酸(etodolac)；依托芬那酯(etofenamate)；芬度柳(fendosal)；非普地醇(fepradinol)；氟滅酸(flufenamicacid)；(N-[[5-[[(1,4-二氫-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)甲基]甲基氨基]-2-噻吩基]羰基]-L-谷氨酸，三甲曲(trimetrexate)，殺結(jié)核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，長春地辛(vindesine)，佐柔比星(zorubicin)；阿加曲班(argatroban)；雙香豆素醚(coumetarol)或雙香豆素(dicoumarol)。其他治療劑的列表可見于，例如Physicians'DeskReference,55thed.,2001,MedicalEconomicsCompany,Inc.,Montvale,N.J.；USPNDictionaryofUSANandInternationalDrugNames,2000,TheUnitedStatesPharmacopeialConvention,Inc.,Rockville,Md.；以及TheMerckIndex,12thed.,1996,Merck&Co.,Inc.,WhitehouseStation,N.J.。當本發(fā)明的納米顆粒用于靶向放療中時，所述治療劑還可以包括放射性核素。在一個實施方式中，低能量β-發(fā)射的放射性核素，例如177Lu-螯合的構(gòu)建體與本發(fā)明的納米顆粒相連，并用于治療相對較小的腫瘤載荷或微轉(zhuǎn)移性疾病。在另一個實施方式中，較高能量β-發(fā)射體，例如釔-90(90Y)可用于治療較大的腫瘤載荷。碘-131(131I)也可以用于放療?？梢詫λ黾{米顆粒的表面進行修飾以引入至少一個官能團。可以對與納米顆粒結(jié)合的有機聚合物(例如PEG)進行修飾以引入至少一個官能團。例如，所述官能團可以為馬來酰亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯。官能團的引入使得能夠使多種配體、造影劑和/或治療劑與納米顆粒連接。在一個實施方式中，治療劑通過NHS酯官能團與納米顆粒(表面或有機聚合物涂層)相連。例如，酪氨酸激酶抑制劑如達沙替尼(BMS)或化療劑(例如紅豆杉醇)可以通過酯鍵與納米顆粒偶聯(lián)。然后，該酯鍵在體內(nèi)酸性環(huán)境下或通過酶促而被切割。該方法可用于向受試者遞送前藥，其中該藥物在體內(nèi)由顆粒釋放。本發(fā)明人通過將小分子抑制劑達沙替尼與納米顆粒的PEG分子偶聯(lián)而對前藥方法進行了測試。根據(jù)生物分布的結(jié)果和人藥物劑量計算，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該納米顆粒具有獨特的生物學性質(zhì)，包括與治療劑的腫瘤和隨后的腫瘤組織聚集相比相對快速地從血液清除，這提示前藥方法是可行的。功能化的納米顆?？梢远啻畏?，從而確保腫瘤中的藥物濃度大于由腫瘤組織的IC-50說明的藥物濃度，但對其他器官組織，例如心臟、肝臟或肺不是劑量限定性的?？梢詫χ委焺┖图{米顆粒分別進行放射性標記或者光標記，從而允許獨立監(jiān)測治療劑和納米顆粒。在一個實施方式中，放射性氟化(即18F)的達沙替尼與通過NHS酯鍵連接至納米顆粒的PEG-3400部分偶聯(lián)。放射性氟至關(guān)重要，原因是其能夠獨立地監(jiān)測藥物分布和藥物自放射性碘化(124I)的熒光(Cy5)納米顆粒的釋放中的時間依賴性變化。因此，本發(fā)明人可以分別地監(jiān)測前藥(達沙替尼)和納米顆粒。與不使用雙標記方法的現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，這允許對前藥設計進行優(yōu)化。在另一個實施方式中，放射性治療碘分子(即I-131)，或其他治療性γ-發(fā)射體或α-發(fā)射體通過馬來酰亞胺官能團與PEG軛合，其中所述治療劑在體內(nèi)可不從PEG解離。為了使本發(fā)明的納米顆粒易于供給多種配體、造影劑或螯合劑，可以對納米顆粒的表面進行修飾以引入官能團。還可以用可引入官能團的有機聚合物(例如PEG)或螯合劑對納米顆粒進行修飾。同時，對配體、造影劑或治療劑進行修飾以引入能夠在合適的條件下與納米顆粒上或和納米顆粒連接的PEG上或螯合劑上的官能團反應的官能團。因此，具有反應性官能團的任何配體、造影劑或治療劑都可以容易地與納米顆粒軛合。這種一般性方法在本文中稱為“鏈接化學”，其可允許大量的多功能性以開發(fā)多模態(tài)性應用。在本發(fā)明中，任何合適的反應機制都可以經(jīng)過改造適合“鏈接化學”，前提是能夠?qū)崿F(xiàn)配體、造影劑或螯合劑與納米顆粒的容易且受控制的連接。在一個實施方式中，將游離的三鍵引入至已經(jīng)與納米顆粒的殼共價軛合的PEG上。同時，將疊氮鍵引入至目標配體(或造影劑、螯合劑)上。當在銅催化劑存在下混合PEG化的納米顆粒與配體(或造影劑、螯合劑)時，發(fā)生疊氮基與三鍵的環(huán)化加成，導致配體與納米顆粒的軛合。在第二實施方式中，可以將馬來酰亞胺官能團和巰基引入至納米顆粒和目的配體(或造影劑、螯合劑)上，其中，所述納米顆粒具有馬來酰亞胺官能團，所述配體(或造影劑、螯合劑)具有巰基，或者反之亦然。馬來酰亞胺的雙鍵易于與巰基反應，形成穩(wěn)定的碳-硫鍵。在第三實施方式中，可以將活化的酯官能團，例如羥基琥珀酰亞胺基酯基和氨基引入至納米顆粒和目的配體、造影劑或螯合劑上。所述活化的酯基易于與氨基反應以形成穩(wěn)定的碳-氮酰胺鍵。在向受試者施用本發(fā)明的納米顆粒后，所述納米顆粒的血液停留半衰期可以為約2小時至約25小時，約3小時至約20小時，約3小時至約15小時，約4小時至約10小時，或者約5小時至約6小時。血液停留半衰期越長意味著循環(huán)越長，這可以使更多的納米顆粒聚集在體內(nèi)的靶位點。血液停留半衰期可以通過以下評價。首先將所述納米顆粒施用于受試者(例如小鼠、小型豬或人)。在施用后的不同時間點，采集血液樣本以通過合適的方法測定納米顆粒的濃度。在向受試者施用本發(fā)明的納米顆粒后，所述納米顆粒的腫瘤停留半衰期可以為約5小時至約5天，約10小時至約4天，約15小時至約3.5天，約20小時至約3天，約2.5天至約3.1天，約1天至約3天，或者約73.5小時。所述納米顆粒的腫瘤停留半衰期與血液停留半衰期之比可以為約2至約30，約3至約20，約4至約15，約4至約10，約10至約15，或者約13。在一個實施方式中，為了估測血液、腫瘤和其他主要器官/組織中帶放射性標記的納米顆粒的停留(或清除)半衰期數(shù)值(T1/2)，通過在施用納米顆粒后的固定時間處死多組小鼠計算每克的注射劑量的百分數(shù)值(％ID/g)。收集血液、腫瘤和器官，稱重并在閃爍γ-計數(shù)器上計數(shù)。針對隨注射時間放射性衰減對％ID/g值進行校正。使所產(chǎn)生的各組織的時間-活性濃度數(shù)據(jù)與減小的單指數(shù)函數(shù)擬合，以估測組織/器官T1/2值。在向受試者施用本發(fā)明的納米顆粒后，所述納米顆粒的腎清除率可以在約24小時外為約10％ID(初始劑量)至約100％ID，在約24小時外為約20％ID至約90％ID，在約24小時外為約30％ID至約80％ID，在約24小時外為約40％ID至約70％ID，在約24小時外為約40％ID至約60％ID，在約24小時外為約40％ID至約50％ID，或者在約24小時外為約43％ID。腎清除率可以通過以下進行評價。首先將所述納米顆粒施用于受試者(例如小鼠、小型豬或人)。在施用后的不同時間點，采集尿液樣本以通過合適的方法測定納米顆粒的濃度。在一個實施方式中，根據(jù)以下測定腎清除率(例如隨時間排泄在尿液中的納米顆粒級分)。向受試者施用本發(fā)明的納米顆粒，并在某時間段(例如168小時)后收集尿液樣本。利用熒光分析和由混合有已知濃度顆粒的尿液樣本的背景校正后的熒光信號測定值產(chǎn)生的連續(xù)稀釋校正曲線來測定各時間點的顆粒濃度(％ID)。濃度值和小鼠平均日尿量的估測值用于計算排泄的累計％ID/g尿液。在另一個實施方式中，通過利用例如γ-計數(shù)在類似時間間隔檢測尿液樣本活性(每分鐘計數(shù))，并在納米顆粒施用后計算累計尿液排泄，來測定具有放射性標記的納米顆粒的腎清除率。在第三實施方式中，為了估測累計糞排泄，在施用納米顆粒后在類似的時間間隔收集代謝籠內(nèi)的糞，并利用γ-計數(shù)計算樣本的活性。當將施用量約為100倍人劑量當量的納米顆粒施用于受試者時，在約10至約14天內(nèi)在受試者中基本沒有觀察到貧血，體重降低，激動，呼吸加快，胃腸道功能紊亂，行為異常，神經(jīng)功能障礙，血液異常，臨床化學異常，器官病理學上與藥物相關(guān)的病變，死亡，或它們的組合。當本發(fā)明的納米顆粒包含至少一個相連的配體時，納米顆粒的多價提高(例如與單獨的配體相比)可以為約1.5倍至約10倍，約2倍至約8倍，約2倍至約6倍，約2倍至約4倍，或者約2倍?？紤]到現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的納米顆粒顯示在體外和體內(nèi)意外的物理化學和生物參數(shù)。例如，所估測的連接有配體的納米顆粒的血液停留半衰期(例如，連接有cRGD的納米顆粒為約5.5小時)顯著長于相應的配體(例如，cRGD為約13分鐘)。Montetet.al.MultivalenteffectsofRGDpeptidesobtainedbynanoparticledisplay.JMedChem.49,6087-6093(2006)。延長的血液停留半衰期可以增強探針的生物利用度，促進腫瘤靶向，并在較長時間內(nèi)產(chǎn)生較高的腫瘤攝取。在一個實施方式中，所靶向的納米顆粒的腫瘤停留半衰期(即連接有配體的納米顆粒)是血液停留半衰期的13倍，然而未靶向的納米顆粒的腫瘤停留半衰期(即沒有連接配體的對應納米顆粒)僅為血液停留半衰期的5倍。這種區(qū)別提示靶向納米顆粒比非靶向納米顆粒顯著高的腫瘤組織聚集。在某些實施方式中，考慮到與納米顆粒連接的配體數(shù)量，本發(fā)明的納米顆粒顯示意外的高親和力結(jié)合(例如連接有cRGD的納米顆粒的Kd為0.51nM，IC50為1.2nM)，多價提高(例如，與單獨的cRGD肽相比，連接有cRGD的納米顆粒具有大于2倍的提高)，顯著不同的腫瘤攝取(例如在施用后72小時，相對于涂布PEG的納米顆粒，連接有cRGD的PEG納米顆粒顯示腫瘤攝取不同，增加約3-4倍)，和基于腫瘤-肌肉攝取比例而相對于正常肌肉顯著的腫瘤造影(例如施用后72小時約3-5倍)。在一個實施方式中，在最大腫瘤攝取時(注射納米顆粒后約4小時)，在表達整合素的腫瘤中發(fā)現(xiàn)連接有配體的納米顆粒的活性-濃度比對照(例如在不表達整合素的腫瘤中連接有配體的納米顆粒，或者在表達整合素的腫瘤中沒有連接配體的相應納米顆粒)高3倍。此外，與非靶向納米顆粒(即沒有連接配體的相應納米顆粒)相對于正常肌肉降低的腫瘤組織造影相比，靶向納米顆粒(即連接有配體的納米顆粒)的腫瘤-肌肉攝取比相對于正常肌肉顯示增強的腫瘤組織造影，這提示靶向納米顆粒為腫瘤選擇性的。在另一個實施方式中，靶向和非靶向納米顆粒在相同時間內(nèi)均顯示高效的腎臟排泄。在注射后頭24小時幾乎一半的注射劑量被排泄，96小時后約72％被排泄，這提示在注射后第一天發(fā)生大量排泄。相比之下，靶向納米顆粒的糞排泄譜顯示24小時和96小時分別平均有7％和15％的注射劑量被排泄。非毒性納米顆粒的物理化學和生物參數(shù)，及其多模態(tài)成像能力(例如PET和光學成像)擴展了其潛在的生物醫(yī)藥應用的范圍。所述應用包括長期監(jiān)測：納米顆粒的延長的血液循環(huán)時間和相應的生物利用度凸顯了其用于早期和長期監(jiān)測疾病處理的不同階段(例如診斷性篩選、治療前評價、治療性干預和治療后監(jiān)測)的多功能性，而沒有毒性考慮造成的限制；(b)改善的治療滲透：靶向納米顆粒的清除性質(zhì)(例如其腎清除率低于現(xiàn)有技術(shù)的分子探針)可用于不同類型的生物應用。例如，所述納米顆粒尤其可用于血管化不良且相對不可接近的實體瘤的情況，其中在全身施用后試劑在實體瘤中的定位通常較慢；(c)多模態(tài)成像能力：這些模態(tài)可以以多種比例(即全身與細胞水平之比)組合，用于獲得補充性深度靈敏性生物信息。例如，在SLN定位中，通過PET可從分布和數(shù)量方面對深淋巴結(jié)(deepnode)定位，而淺表淋巴結(jié)的更準確、詳細的定位可以通過熒光成像獲得；和(d)靶向治療：與來自血液的靶向納米顆粒的清除率相比，來自腫瘤的靶向納米顆粒的較長的清除率可經(jīng)開發(fā)用于組合診斷性/治療性應用，其中所述納米顆粒可用作放射治療性或藥物遞送載體。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的納米顆粒的藥物組合物。本發(fā)明的所述藥物組合物可以以合適的藥物單元劑型的形式經(jīng)口施用。本發(fā)明的所述藥物組合物可被制備成許多形式，包括片劑、硬或軟凝膠膠囊、含水溶液、懸液和脂質(zhì)體以及諸如成型聚合凝膠的其它緩釋制劑。適合本發(fā)明的納米顆?；蚪M合物的施用模式包括但不限于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、直腸、舌下、粘膜、鼻、眼、皮下、肌內(nèi)、透皮、脊髓、陰道、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、支氣管和淋巴管施用，以及用于活性成分的全身遞送的其它劑型。本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來施用，包括但不限于透皮(通過貼劑、凝膠、霜、膏或離子導入的被動遞送)；靜脈內(nèi)(推注、輸注)；皮下(輸注，植入劑)；經(jīng)粘膜(口含及舌下，例如口溶型片劑、薄片、薄膜和泡騰制劑；結(jié)膜(滴眼液)；直腸(栓劑，灌腸劑))；或皮內(nèi)(推注，輸注，植入劑)。所述組合物可以局部遞送?？诜后w藥物組合物的形式可以為，例如水或油懸液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑，或者可以以干產(chǎn)品的形式提供，在使用前用水或其他合適的載體重溶。此類液體藥物組合物可以包含常規(guī)添加劑，例如助懸劑、乳化劑、非水載體(其可以包括食用油)或防腐劑。本發(fā)明的納米顆粒藥物組合物還可以經(jīng)配制用于腸胃外施用(例如通過注射，如推注或連續(xù)輸注)，并且可以以添加有防腐劑的安培瓶、預填充注射器、小體積輸注容器或多劑量容器內(nèi)的單位劑型呈現(xiàn)。所述藥物組合物可以采取諸如油中或含水載體中的懸液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配制用試劑，例如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸景l(fā)明的藥物組合物可以為通過消毒固體的無菌分離或者通過從溶液凍干而獲得的粉末形式，所述粉末形式在使用前用合適的載體(如不含熱原質(zhì)的無菌水)重溶。對于局部施用于表皮，所述藥物組合物可以被配制成膏、霜或洗劑，或者透皮貼劑的活性成分。合適的透皮遞送系統(tǒng)公開于，例如A.Fisheretal.(美國專利第4,788,603號),或R.Bawaetal.(美國專利第4,931,279號、第4,668,506號以及第4,713,224號)中。膏和霜可以，例如與加有合適增稠劑和/或膠凝劑的含水或油性基料一起配制。洗劑可以與含水或油性基料一起配制，且通常還包含一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、助懸劑、增稠劑或著色劑。例如如美國專利第4,140,122、4,383,529或4,051,842號所公開的，所述藥物組合物還可以經(jīng)離子導入而遞送。適合在口腔中局部遞送的藥物組合物包括單位劑型，例如在調(diào)味基料(通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠)中包含本發(fā)明的藥物組合物的糖錠；在惰性基料(例如凝膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠)中包含所述藥物組合物的錠劑，例如凝膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠；粘膜粘附性凝膠；和在合適的液體載體中包含所述藥物組合物的漱口水。對于局部施用于眼，所述藥物組合物可以以滴劑、凝膠(gel)(S.Chraietal.,美國專利第4,255,415號)、膠(gum)(S.L.Linetal.,美國專利第4,136,177號)或經(jīng)延長釋放的眼睛插入物(A.S.Michaels,美國專利第3,867,519號和H.M.Haddadetal.,美國專利第3,870,791號)的形式施用。需要時，通過例如與某些親水性聚合物基質(zhì)(例如包含天然凝膠、合成聚合物凝膠或它們的混合物)組合使用，上述藥物組合物可以經(jīng)改變以產(chǎn)生所應用的治療性化合物的緩釋。其中的載體為固體的適合直腸施用的藥物組合物最優(yōu)選以單位劑量栓劑的形式呈現(xiàn)。合適的載體包括可可脂和本領(lǐng)域常用的其他材料，并且可以通過藥物組合物與軟化或熔化載體的混合然后冷卻并在模具中成型而容易地形成所述栓劑。適合陰道施用的藥物組合物可以以除了納米顆粒和治療劑外還包含載體的陰道栓劑、棉塞、霜、凝膠、糊、泡沫或噴霧的形式提供，此類載體是本領(lǐng)域熟知的。對于通過吸入施用，本發(fā)明的藥物組合物通常由吹入器、噴霧器或壓力包或遞送氣溶膠噴霧的其他常規(guī)方法而遞送。壓力包可以包含合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在壓力氣溶膠的情況下，可以通過提供閥門確定劑量單位，以遞送經(jīng)計量的量?；蛘?，對于通過吸入或噴射施用，本發(fā)明的藥物組合物可以采取干粉組合物的形式，例如藥物組合物與諸如乳糖或淀粉的合適粉末基料的粉末混合物。所述粉末組合物可以以單位劑型在例如膠囊或藥筒或凝膠或泡罩包裝(blisterpack)中，由此借助于吸入器或吹入器可以施用所述粉末。對于皮內(nèi)施用，本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)液體噴霧，例如經(jīng)塑料瓶噴霧器而施用，典型地為(異丙去甲腎上腺素吸入器-Wintrop)和(異丙去甲腎上腺素吸入器-Riker)。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含其他輔料，例如調(diào)味料、染料、抗微生物劑或防腐劑。還應該理解，治療中需要使用的藥物組合物的量不僅隨所選擇的治療劑而不同，還隨施用途徑、所治療的疾病性質(zhì)和患者的年齡與狀況而不同，并且最終取決于服務的內(nèi)科醫(yī)生或外科醫(yī)生的判斷。對于這些因素的評價，參見J.F.Brienetal.,Europ.J.Clin.Pharmacol.,14,133(1978)；和Physicians'DeskReference,CharlesE.Baker,Jr.,Pub.,MedicalEconomicsCo.,Oradell,N.J.(第41版,1987)。通常，在與本發(fā)明的熒光納米顆粒組合使用時，治療劑的劑量可低于單獨施用治療劑或者以常規(guī)藥物劑型施用時的劑量。熒光納米顆粒對靶位點(例如位于細胞表面的受體)的高特異性，可以提供相對高度定位的治療劑濃度，或者可選擇地，在延長時間內(nèi)提供治療劑的緩釋。本發(fā)明的納米顆?；蚪M合物可以施用于受試者。所述受試者可以是哺乳動物、優(yōu)選人。所述哺乳動物包括、但不限于小鼠、大鼠、兔、猿、牛、羊、豬、狗、貓、農(nóng)場動物、運動動物、寵物、馬和靈長類。本發(fā)明進一步提供了用于檢測細胞成分的方法，所述方法包括以下步驟：(a)使所述細胞與基于二氧化硅的熒光納米顆粒接觸，所述納米顆粒包含基于二氧化硅的核，所述核包含位于其內(nèi)的熒光化合物；包圍至少一部分所述核的二氧化硅殼；與所述納米顆粒連接的有機聚合物；與所述納米顆粒連接的約1至約20個配體；和與所述納米顆粒連接的造影劑或螯合劑；和(b)通過至少一種成像技術(shù)監(jiān)測所述納米顆粒與細胞或細胞成分的結(jié)合(和/或潛在的細胞內(nèi)攝取)。所述成像技術(shù)可以為PET、SPECT、CT、MRI、光學生物發(fā)光或熒光成像及它們的組合?？梢栽诰哂写x活性的完整細胞中、完整細胞裂解物中、在透化細胞中、在固定細胞中或者利用部分純化的細胞成分在無細胞環(huán)境中檢測并確定細胞成分的位置。所述接觸的量和持續(xù)時間可取決于例如處理方法的診斷或治療目標或兩者，所述診斷或治療目標例如經(jīng)上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導通路中間物(即Akt,NF-κB)、疾病狀態(tài)或狀況的熒光檢測，治療劑的遞送。接觸的量或持續(xù)時間還取決于熒光納米顆粒相對于目的分析物的濃度和用于處理的細胞狀態(tài)。本發(fā)明進一步提供了靶向腫瘤細胞的方法，所述方法包括包括：向癌癥患者施用有效量的基于二氧化硅的熒光納米顆粒，所述納米顆粒包含：基于二氧化硅的核，所述核包含位于其內(nèi)的熒光化合物；包圍至少一部分所述核的二氧化硅殼；與所述納米顆粒連接的有機聚合物；與所述納米顆粒連接并且能夠結(jié)合腫瘤標志物的配體；和至少一種治療劑。所述納米顆粒可以具有放射性標記。可以通過但不限于以下途徑向患者施用納米顆粒：口腔、靜脈、鼻、皮下、局部、肌內(nèi)或透皮。在某些實施方式中，理想地，例如同時或依次使用具有不同性質(zhì)(例如不同的熒光化合物、配體、有機聚合物涂層、造影劑、治療劑)的兩種或更多種類型的熒光納米顆粒的混合物，以發(fā)掘靶向腫瘤細胞的不同成分或不同腫瘤細胞群的好處。本發(fā)明的方法和組合物可用于幫助內(nèi)科醫(yī)生或外科醫(yī)生鑒別和表征疾病區(qū)域，例如癌癥和炎癥/感染過程，包括但不限于皮膚癌(黑素瘤)、頭頸癌、前列腺癌、腦癌和腸癌，以區(qū)分病變組織和正常組織，例如檢測利用常規(guī)操作的顯微鏡難以檢測的腫瘤邊緣，例如在腦手術(shù)中，以幫助指導治療性或手術(shù)介入，例如通過確定病灶是否為癌性而應切除或者非癌性的而應保留，或者從外科上對疾病分期，例如術(shù)中淋巴結(jié)分期、前哨淋巴結(jié)(SLN)定位，例如為保留重要神經(jīng)結(jié)構(gòu)(腮腺內(nèi)神經(jīng))的神經(jīng)保留過程。本發(fā)明的方法和組合物可用在轉(zhuǎn)移性疾病的檢測、治療響應監(jiān)測、SLN定位/靶向、神經(jīng)保留過程、殘留疾病檢測、治療劑的靶向遞送(與診斷性/治療性平臺組合)、非靶向的荷載藥物的納米顆粒的局部遞送(導管遞送)、血腦屏障治療、炎癥/缺血性疾病的治療(即腦、心臟、尿道、膀胱)、疾病的組合治療和傳感(例如內(nèi)參比pH傳感、氧傳感)等。本發(fā)明的方法和組合物還可用于疾病的檢測、表征和/或確定定位，尤其是早期疾病、疾病嚴重度或者與疾病有關(guān)的狀況、疾病分期和/或監(jiān)測疾病。發(fā)射信號的存在、不存在或水平可指示疾病狀況。本發(fā)明的方法和組合物還可用于監(jiān)測和/或指導各種治療性介入，例如基于手術(shù)和導管的過程，并且監(jiān)測包括基于細胞的治療在內(nèi)的藥物治療。本發(fā)明的方法還可用于疾病或疾病狀況的診斷?？梢岳帽景l(fā)明的方法和組合物鑒定并表征留存于疾病位點或形成疾病邊緣的細胞亞群，例如干細胞樣細胞(“癌干細胞”)和/或炎性細胞/吞噬細胞。對于前述各項，可以(在治療前、過程中或后)檢測或監(jiān)測的此類疾病或疾病狀況的實例包括癌癥(例如黑素瘤、甲狀腺癌、大腸癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、皮膚癌、腦癌、胃腸癌、口腔癌、腎癌、食道癌、骨癌)，其可用于鑒別發(fā)生癌癥和/或惡性疾病的易感性提高的受試者，即這些受試者易于發(fā)生癌癥和/或惡性疾病，炎癥(例如，由存在的癌前病變引起的炎性疾病)，心血管疾病(例如，動脈粥樣硬化和血管炎性疾病、缺血、中風、血栓)，皮膚病(例如卡波濟氏肉瘤、牛皮癬)，眼科疾病(例如黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變)，傳染病(例如細菌、病毒、真菌和寄生蟲感染，包括獲得性免疫缺陷綜合癥)，免疫疾病(例如自身免疫性疾病、淋巴瘤、多發(fā)性硬化癥、類風濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如神經(jīng)退行性疾病，如帕金森氏癥或阿爾茨海默氏癥)，遺傳性疾病，代謝性疾病，環(huán)境疾病(例如鉛、汞和放射性中毒、皮膚癌)，骨相關(guān)疾病(例如骨質(zhì)疏松癥、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的骨腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎)和神經(jīng)變性疾病。本發(fā)明的方法和組合物因此可用于，例如確定腫瘤和/或共存的干細胞樣細胞(“癌干細胞”)的存在和/定位，炎性細胞的存在和/或定位，包括例如在瘤周區(qū)活化的巨噬細胞的存在，血管病的存在和定位，包括在冠狀動脈和外周動脈內(nèi)、擴大的動脈瘤區(qū)、頸動脈內(nèi)的不穩(wěn)定斑和缺血區(qū)域內(nèi)具有急性堵塞(即易損的斑)的風險的區(qū)域。本發(fā)明的方法和組合物還可用于鑒定和評價細胞死亡、損傷、凋亡、壞死、缺氧和血管發(fā)生。PCT/US2006/049222。提供以下實例的目的僅在于例示而非限制本發(fā)明。實施例1.涂布有PEG的納米顆粒的制備和表征根據(jù)如PCT/US2008/074894和Stoberetal.Controlledgrowthofmonodispersedsilicaspheresinthemicronsizerange.ColloidInterfaceSci.1968；26:62-69.Ohnishietal.J.Mol.Imaging2005,4:172–181.中公開的公認方法合成包含NIR發(fā)射染料(Cy-5)的納米顆粒并通過PEG化使其功能化。使Cy5馬來酰亞胺與共反應性有機硅烷化合物(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷反應，形成熒光二氧化硅前體。該熒光二氧化硅前體與正硅酸四乙酯共濃縮，形成基于二氧化硅的熒光核。將具有以甲氧基為末端的聚乙二醇鏈(PEG，約0.5kDa)的PEG-硅烷化合物甲氧(聚乙烯氧)丙基]–三甲氧硅烷加入至基于二氧化硅的熒光核中，以在所述核上形成PEG涂層。利用生理鹽水(含0.15MNaCl的H2O)使具有PEG涂層的納米顆粒透析通過3500MWCOSnakeskin透析膜，并進行無菌過濾。在注射前，所有樣本在其峰吸收波長(640nm)都是光密度匹配的。通過動態(tài)光散射(DLS)和熒光關(guān)聯(lián)光譜(FCS)完成流體動力學尺寸測定。簡而言之，利用HeNe激光(λ＝632.8nm)在BrookhavenInstrumentsCompany200SMstatic/DLS系統(tǒng)上測定經(jīng)水透析的顆粒。由于染料吸收與激發(fā)源的重疊，利用15分鐘的整合時間獲得可接受的信噪比。對于FCS，利用水來透析顆粒，稀釋至0.15MNaCl中，并在ZeissLSM510Confocor2FCS(HeNe633nm激發(fā))上測定。在所有測定前針對尺寸對所述儀器進行校準。由FCS曲線確定以每個分子/顆粒的計數(shù)率計算的PEG化納米顆粒和游離染料的相對亮度的比較。實施例2.涂布有PEG的納米顆粒的腎清除率合成流體動力學半徑為約3nm的熒光核-殼二氧化硅納米顆粒。如動態(tài)光散射(DLS)結(jié)果(圖1a)所顯示的，發(fā)現(xiàn)這些納米顆粒的直徑為6至10nm。6nm和3.3nm數(shù)量級的裸(無PEG涂層)二氧化硅納米顆粒在裸鼠中的體內(nèi)全身NIR熒光成像顯示在注射后45分鐘相當大的腎清除率，并且在肝臟中仍具有顯著聚集(圖1b)。在隨后的24小時過程中發(fā)生至肝腸循環(huán)中的最終排泄。基于這些結(jié)果，根據(jù)PCT/US2008/074894中的方法，利用以甲氧基為末端的聚乙二醇鏈(PEG,約0.5kDa)共價涂布顆粒，以防止調(diào)理素作用(opsonization)并進一步增強顆粒清除，同時保持小的流體動力學尺寸。通過NIR熒光成像，這種處理降低了注射后45分鐘時的肝臟滯留并導致腎臟向膀胱內(nèi)的過濾提高(圖1c)，膀胱熒光至(outto)24小時可見。探針被很好地耐受，在研究期間沒有觀察到不良反應或動物死亡。在注射涂布有124I-標記的PEG涂布的納米顆粒后24小時的系列共配準PET-CT成像(圖1d，上行)證明少量殘留膀胱活性，以及在肝臟/胃腸道上的活性(中間)，側(cè)面為獨立獲得的顯微CT和顯微PET掃描。系列顯微PET成像證明了在NIR熒光成像上的發(fā)現(xiàn)。基于血液活性在96小時時間內(nèi)的時間依賴性變化，發(fā)現(xiàn)標記有124I的PEG化納米顆粒的血液停留半衰期為7.3小時。發(fā)現(xiàn)標記有124I且結(jié)合有RGD的納米顆粒的血液停留半衰期為5.6小時。根據(jù)這些體內(nèi)數(shù)據(jù)，在兩組PEG化的含Cy5顆粒上進行具有涂層的納米顆粒的更詳細的生物分布和清除率研究，以評價探針尺寸對生物分布的影響。如通過熒光關(guān)聯(lián)光譜(FCS)所測定的，產(chǎn)生了流體動力學直徑為3.3±0.06和6.0±0.1nm的納米顆粒(圖2a)。在體內(nèi)研究前，對顆粒的光物理性質(zhì)進行了研究，以確定其相比游離染料的性能水平。如通過吸收譜和發(fā)射譜(圖2b)和FCS(圖2c)所測定的，盡管粒徑極小，但二氧化硅包裹的染料分子顯示由粒徑?jīng)Q定的超過游離染料的光物理增強(包括亮度的顯著增加)。當利用高能量635nm激光照射時，與游離染料相比，直徑為3.3nm和6.0nm的納米顆粒的光致漂白半衰期分別提高2倍和3倍(圖2d)。因此，發(fā)現(xiàn)這些納米顆粒探針比其游離染料對應物更亮且更耐光。除了由全身成像半定量評價體內(nèi)納米顆粒的性能外，還利用熒光酶標儀進行組織勻漿和流體的離體分析，這可以對在NIR熒光成像中觀察到的變化進行校準定量。將樣本分成“滯留”(肝臟、腎臟、肺、脾勻漿以及血液)和“排泄”(尿)來源的顆粒熒光組，進行背景校正并基于校準曲線轉(zhuǎn)化為每只動物的初始劑量的百分數(shù)(％ID)。組織分析顯示了在主要器官中的最小顆粒滯留，大多數(shù)熒光來自循環(huán)血液(圖3a)。將以“滯留”成分之和計算的凈顆粒滯留與指數(shù)衰減曲線擬合，以確定排泄動力學(圖3b)。較大的顆粒顯示較長的組織半衰期(t1/2(3.3nm)＝190分鐘,t1/2(6.0nm)＝350分鐘)和較大的起始器官滯留。48小時后，6nm的顆粒在體內(nèi)顯示最小滯留(R總(6.0nm)＝2.4±0.6％ID)。根據(jù)每單位時間排泄的平均尿量的保守性估計，利用在處死時收集的尿液樣本連同連續(xù)稀釋校準數(shù)據(jù)來估測總的腎清除率。通過該方法，對兩個顆粒尺寸隨時間排泄的％ID進行估測(圖3c)。實施例3.與αvβ3整合素靶向肽軛合的熒光二氧化硅納米顆粒(黑素瘤模型)為了合成對腫瘤標志物αvβ3整合素具有高親和力的多模態(tài)納米顆粒，通過Cys-馬來酰亞胺連接鍵使線性RGD六肽(CGGRGD)與所述納米顆粒軛合。向雄性無胸腺裸鼠的側(cè)腹內(nèi)皮下注射C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞。以約0.5cm的直徑向小鼠靜脈注射裸二氧化硅納米顆?；騊EG化的RGD納米顆粒(約500nm/kg)。圖4顯示了無腫瘤小鼠和有腫瘤小鼠的體內(nèi)生物分布。利用流式細胞術(shù)研究靶向性(結(jié)合有RGD)和非靶向性(涂布有PEG)納米顆粒與ανβ3-整合素陽性的人黑素瘤細胞系(M21細胞)和整合素陰性的人黑素瘤細胞系(M21L細胞)的體外結(jié)合性質(zhì)(圖5a、5b)。實施例4.與αvβ3整合素靶向肽軛合的熒光二氧化硅納米顆粒和淋巴結(jié)定位(黑素瘤模型)本發(fā)明人利用生物相容性材料二氧化硅，二氧化硅具有能夠被準確調(diào)整至對腎清除率最優(yōu)的粒徑。本發(fā)明人將小靶向肽和放射性標記連接至顆粒表面，用于在明確表征的體內(nèi)人黑素瘤模型中進行系列PET成像測定，并利用包封的近紅外(NIR)染料和多尺度光學熒光成像方法對引流淋巴結(jié)和淋巴管定位。Ballouetal.,Sentinellymphnodeimagingusingquantumdotsinmousetumormodels.BioconjugateChem.18,389-396(2007)。Kimetal.,Near-infraredfluorescenttypeIIquantumdotsforsentinellymphnodemapping.Nat.Biotechnol.22,93-97(2003)。Tanakaetal,Image-guidedoncologicsurgeryusinginvisiblelight:completedpre-clinicaldevelopmentforsentinellymphnodemapping.JSurgOncol.13,1671-1681(2006)。本發(fā)明人還進行了毒性測定并衍生了人正常器官放射劑量。具體地，本發(fā)明人合成了直徑為約7nm、近紅外(NIR)染料包封的核-殼二氧化硅納米顆粒，用PEG鏈涂布并利用少量(約6-7)靶向肽和放射性標記進行表面功能化。利用多模態(tài)分子成像方法，本發(fā)明人證明這些探針同時無毒、顯示高親和性/親和力結(jié)合、高效排泄以及在腫瘤和正常組織之間顯著不同的攝取和差異。通過NIR染料熒光實現(xiàn)的對淋巴結(jié)和淋巴管的靈敏檢測、定位和探詢凸顯了這種多模態(tài)平臺用于在臨床背景下檢測轉(zhuǎn)移性疾病和對其進行分期的明顯的潛在優(yōu)勢，同時擴大了可被檢測的淋巴結(jié)尺寸的下限值。材料和方法cRGDY-PEG納米顆粒和PEG-納米顆粒的合成按照之前的描述，通過改良的型二氧化硅濃縮制備顆粒。Wiesneretal.,Peg-coatedCore-shellSilicaNanoparticlesandMathodsofManufactireandUse,PCT/US2008/74894。Larson,etal.,Silicananoparticlearchitecturedeterminesradiativepropertiesofencapsulatedchromophores.Chem.Mater.20,2677-2684(2008)。Bogush,etal.,PreparationofMonodisperseSilicaParticles:ControlofSizeandMassFraction.J.Non-Cryst.Solids,104,95–106(1988)。Sadasivan,etal.,AlcoholicSolventEffectonSilicaSynthesis—NMRandDLSInvestigation.J.Sol-GelSci.Technol.12,5–14(1998)。Herz,etal.,LargeStokes-ShiftFluorescentSilicaNanoparticleswithEnhancedEmissionoverFreeDyeforSingleExcitationMultiplexing.MacromolRapidCommun.30,1907-1910(2009)。TyrosineresidueswereconjugatedtoPEGchainsforattachmentofradioiodineorstableiodinemoieties.Hermanson,BioconjugateTechniques,(AcademicPress,London,第2版,2008)。在放射性標記前所有樣本在其峰吸收波長(640nm)都是光密度匹配的。通過半胱氨酸-馬來酰亞胺連接鍵將cRGD肽與功能化PEG鏈相連，并利用絕對顆粒濃度和用于cRGD肽的試劑的起始濃度的基于FCS的測定估測與顆粒結(jié)合的cRGD肽的數(shù)量。通過熒光關(guān)聯(lián)光譜(FCS)檢測的流體動力學尺寸和相對亮度比較測定將經(jīng)水透析的顆粒稀釋至生理鹽水(含0.15MNaCl的H2O)中并利用HeNe633nm激發(fā)在ZeissLSM510Confocor2FCS上進行測定。在所有測定前針對尺寸對儀器進行校準。利用擴散時間差異評價染料和顆粒物質(zhì)的流體動力學尺寸的變化。利用每分子/顆粒的計數(shù)率進行游離染料和PEG納米顆粒以及RGDY-PEG納米顆粒的相對亮度比較。C點軛合物(Cdotconjugate)的放射性標記利用IODOGEN方法(Pierce,Rockford,IL)進行cRGDY-PEG和PEG-納米顆粒的放射性標記。Piatyszek,etal.,Iodo-genmediatedradioiodinationofnucleicacids.J.Anal.Biochem.172,356–359(1988)。通過γ-計數(shù)和利用Varian熒光計(激發(fā)650nm/發(fā)射680)計算的熒光測定活性。細胞和細胞培養(yǎng)將人黑素瘤M21和M21變體(M21-L,αv陰性)細胞系保持在RPMI1640培養(yǎng)基/10％胎牛BSA、2mML-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素(CoreMediaPreparationFacility,MemorialSloanKetteringCancerCenter,NewYork)中。將人臍帶靜脈節(jié)內(nèi)皮細胞(HUVEC)培養(yǎng)在M199培養(yǎng)基/10％胎牛血清、20μg/ml內(nèi)皮細胞生長因子、50μg/ml肝磷脂、青霉素和鏈霉素中。124I-cRGD-PEG-納米顆粒的體外細胞結(jié)合和分子特異性為了測定顆粒對M21細胞的結(jié)合和特異性，用含10μg/mlI型膠原(BDBiosciences,Bedford,MA)的磷酸緩沖鹽水(PBS)涂布24孔平板，并進行溫育(37℃,30分鐘)。將M21細胞(3.0-4.0×105細胞/孔)培養(yǎng)至匯合并用RPMI1640培養(yǎng)基/0.5％胎牛血清蛋白(BSA)洗滌。向孔中加入124I-cRGD-PEG-納米顆粒(0–4.0ng/ml)并溫育細胞(25℃,4小時)，用RPMI1640培養(yǎng)基/0.5％BSA洗滌，并溶解在0.2MNaOH中。利用針對碘-124校準的1480自動γ計數(shù)器(PerkinElmer)測定放射性。在100倍過量的cRGD(PeptidesInternational,Louisville,KY)存在下測定非特異性結(jié)合。產(chǎn)生結(jié)合數(shù)據(jù)的標準曲線并利用線性回歸分析(MicrosoftExcel2007)進行分析以產(chǎn)生受體-結(jié)合參數(shù)(Kd,Bmax,IC50)。利用光學檢測方法的體外細胞結(jié)合研究針對溫育次數(shù)和顆粒濃度的范圍，利用流式細胞術(shù)測定cRGDY-PEG-納米顆粒和PEG-納米顆粒與M21細胞的最大差異結(jié)合，并將最佳值用于競爭性結(jié)合和特異性研究中。用RPMI1640培養(yǎng)基/0.5％BSA洗滌細胞(3.0×105細胞/孔)，利用0.25％胰蛋白酶/EDTA分離，并在微離心管中沉淀(在1400rpm、25℃離心5分鐘)。將沉淀重懸在BDFACSFlow溶液(BDBiosciences,SanJose,CA)中并在Cy5通道中分析以測定與顆粒結(jié)合的探針的百分數(shù)(FACSCalibur,BectonDickinson,MountainView,CA)。在過量cRGD和/或小鼠單克隆抗人整合素αvβ3熒光素軛合抗體(Millipore,Temecula,CA)存在下使cRGDY-PEG-納米顆粒(2.5ng/ml)與M21、M21L和HUVEC細胞一起溫育，之后另外進行競爭性結(jié)合研究，并通過流式細胞術(shù)進行分析。為了評價RGDY-PEG納米顆粒相對于cRGD肽的潛能，進行抗附著實驗。用含玻連蛋白的PBS(5μg/ml)涂布96孔微滴定板，然后用200μlRPMI/0.5％BSA(1小時,37℃)涂布96孔微滴定板。利用處于RPMI/0.1％BSA的含不同濃度的cRGDY-PEG-納米顆?；騝RGD肽的一式四份地溫育細胞(3×104/100μl/孔)(30分鐘,25℃)，并加入至涂布有玻連蛋白的板中(30分鐘,37℃)。用RPMI/0.1％BSA輕柔地洗滌孔以除去未附著的細胞，用4％PFA固定附著的細胞(20分鐘,25℃)并用亞甲基藍染色(1小時,37℃)以用于光密度的測定，所述光密度的測定利用TecanSafire酶標儀(λex＝650nm,λem＝680nm,12nm帶寬)而計算。以cRGD肽與cRGDY-PEG-點IC50值之比計算多價提高倍數(shù)。Montet,etal.,MultivalenteffectsofRGDpeptidesobtainedbynanoparticledisplay.JMedChem.49,6087-6093(2006)。動物模型和腫瘤接種根據(jù)紀念斯?。瓌P特琳癌癥中心的機構(gòu)動物管理和使用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeofMemorialSloan-KetteringCancerCenter)批準的方案并遵循美國國立衛(wèi)生研究院動物福利健康指導方針(NationalInstitutesofHealthguidelinesforanimalwelfare)進行所有動物實驗。向雄性無胸腺nu/nu小鼠(6-8周齡,TaconicFarmsInc,Hudson,NY)提供含碘化鉀的水溶液以在體內(nèi)阻止胸腺對任何游離放射性碘的攝取，并如在他處10詳述的，使動物隨意保持于HarlanTekladGlobalDiet2016。為了產(chǎn)生M21或M21L異種移植物，將等體積的細胞(約5×106/100μl)和基質(zhì)膠(matrigel)皮下共注射至不同小鼠的后肢中。利用測徑器規(guī)則地測定腫瘤尺寸，獲得平均腫瘤體積為200mm3。體內(nèi)藥物代謝動力學和停留半衰期(T1/2)測定通過靜脈注射124I-cRGDY-PEG-納米顆?；?24I-PEG-納米顆粒(約20μCi/小鼠)后在規(guī)定時間處死小鼠組，并收集、稱重和在針對124I校準的閃爍γ-計數(shù)器中對血液、腫瘤和器官進行計數(shù)，從而計算針對注射時間的放射性衰減校準的時間依賴性活性濃度(％ID/g)。將所產(chǎn)生的各個組織的時間-活性濃度數(shù)據(jù)與減少的多指數(shù)函數(shù)擬合，以分別測定所述函數(shù)的T1/2和A的值，組織/器官停留半衰期和零時間截距。利用之前描述的方法估測隨時間排泄于尿液中的顆粒級分。Burns,etal.,FluorescentSilicaNanoparticleswithEfficientUrinaryExcretionforNanomedicine,NanoLetters9,442-8(2009)。簡而言之，向小鼠靜脈注射200μl未標記的cRGDY-PEG-納米顆粒或PEG-納米顆粒，在168小時的時間內(nèi)收集多個尿液樣本(每個時間點的小鼠為n＝3)。利用熒光分析和連續(xù)稀釋校準曲線測定各個時間點的顆粒濃度，其中所述校準曲線是由混合有已知濃度顆粒(％ID)的尿液樣本的背景校正熒光信號測定而產(chǎn)生的。然后，利用濃度數(shù)值和小鼠日平均尿量的估值用于計算隨時間排泄的累積尿液％ID/g。為了評價累積糞排泄，在靜脈注射200μl124I-cRGDY-PEG-納米顆粒(每個時間點的小鼠為n＝4)后，使用代謝籠在類似時間間隔收集糞。利用針對124I校準的γ-計數(shù)器計算樣本活性。放射量測定從分析學上求源自各組織的時間活性函數(shù)的積分(同時需要考慮放射性衰減的影響)，以獲得相應的累積活性(即放射性衰減的總數(shù))。然后，假定此類放射的完全局部吸收并忽略穿透性放射(即γ-射線)的作用，通過使累積活性和非穿透性放射(正電子)的124I平衡劑量常數(shù)相乘，從而計算小鼠器官吸收的124I劑量。Eckerman,etal.,RadionuclideDataandDecaySchemes,第2版，Reston,VA:SocietyofNuclearMedicine；1989。通過對小鼠和人(70-kg標準男性)之間的總體重和器官質(zhì)量的差異的調(diào)整，將小鼠正常器官累積活性轉(zhuǎn)化為人正常器官累積活性。Cristy,etal.,Specificabsorbedfractionsofenergyatvariousagesfrominternalphotonsources(I-VII).OakRidgeNationalLaboratoryReportORNL/TM-8381/V1-7.Springfield,VA:NationalTechnicalInformationService,DeptofCommerce；1987。將所計算的人正常器官累積活性輸入至OLINDA放射量測定計算機程序中，以利用核醫(yī)學學會醫(yī)用內(nèi)放射劑量測定委員會(MedicalInternalDosimetry(MIRD)CommitteeoftheSocietyofNuclearMedicine)的形式，計算標準男性的器官吸收劑量。Loevinger,etal.,MIRDPrimerforAbsorbedDoseCalculations(SocietyofNuclearMedicine,NewYork,1991)。Stabin,etal.,OLINDA/EXM:thesecond-generationpersonalcomputersoftwareforinternaldoseassessmentinnuclearmedicine.JNuclMed.46,1023-1027(2005)。急性毒性研究和組織病理學在6組雄性和雌性B6D2F1小鼠(7周齡，JacksonLaboratories,BarHarbor,ME)中進行急性毒性測試。在單次靜脈注射(200μl)中，處理組(n＝6只雄性,n＝6只雌性)接受未標記的靶探針(127I-RGDY-PEG-納米顆粒)，對照組(n＝6只雄性,n＝6只雌性)接受未標記的碘化PEG-納米顆粒(載體,127I-RGDY-PEG-納米顆粒)。對未處理的對照(n＝2只雄性,n＝2只雌性)進行額外測定。在注射后14天內(nèi)每日觀察小鼠發(fā)病/死亡和體重變化的癥候，進行大體尸體剖檢(grossnecropsy)，組織病理學，并在注射后第7和第14天采血用于進行血液和血清化學分析(圖10和表3)。腫瘤特異性靶向的連續(xù)PET成像利用專門的小動物PET掃描儀(Focus120顯微PET；ConcordeMicrosystems,Nashville,TN)進行成像。在整個掃描期間將具有M21或M21L后肢腫瘤的小鼠保持在以2L/分鐘的含2％異氟烷麻醉的氧中。在向所有小鼠靜脈注射200μCi124I-cRGDY-PEG-納米顆?；?24I-PEG-納米顆粒時開始一小時的列表模式獲取(list-modeacquisition)，然后為在96小時的間隔內(nèi)的連續(xù)30分鐘靜態(tài)圖像。針對掃描儀響應的不均勻性、死亡時間計數(shù)損失(deadtimecountloss)、隨機計數(shù)和注射時間的物理衰減校正圖像數(shù)據(jù)。通過使用所計算的系統(tǒng)校準因子將所重建的圖像中的體素(Voxel)計數(shù)率轉(zhuǎn)化為活性濃度(％ID/g)。通過使用ASIPro軟件(ConcordeMicrosystems,Nashville,TN)進行所重建的圖像的三維目的區(qū)域(ROI)分析，以測定在腫瘤中探針攝取的平均值、最大值和標準差(SD)。通過源自圖像的腫瘤％ID/g值除以γ-計數(shù)器肌肉％ID/g值，獲得腫瘤-肌肉活性濃度比。利用組合的NIR熒光成像和顯微術(shù)的淋巴結(jié)定位通過4象限瘤周施用向具有后肢腫瘤的裸鼠注射等體積的50μlcRGDY-PEG-點樣本并允許自由行動。在30分鐘至1小時間隔后，利用2％異氟烷/98％氧混合物麻醉小鼠，并沿小鼠的腹面垂直進行表面旁中線切割以通過外科手術(shù)將來自后肢的區(qū)域暴露于與腫瘤處于身體同側(cè)的腋窩。利用裝備有650±20nmNIR激發(fā)和710nm長通發(fā)射濾光片的目測熒光顯微鏡進行局部區(qū)域淋巴結(jié)(例如腹股溝、腋窩)和引流淋巴管(包括腋區(qū))的原位光學成像。如之前所報道的，另外獲得全身光學圖像(CambridgeResearchInstrumentsMaestroimager)并進行光譜展開。Burns,etal.,FluorescentSilicaNanoparticleswithEfficientUrinaryExcretionforNanomedicine,NanoLetters9,442-8(2009)。統(tǒng)計學分析利用單尾Mann-WhitneyU檢驗(P<0.05被認為是具有統(tǒng)計學顯著性)進行比較接受靶向/非靶向探針或具有M21/M21L腫瘤的腫瘤小鼠組的統(tǒng)計學分析。對于生物分布研究，在各個時間點比較124I-cRGDY-PEG-(n＝7只小鼠)和124I-PEG-納米顆粒(對照,n＝5只小鼠)的組織特異性平均％ID/g值，并且血液、腫瘤和主要器官在注射后4和96小時以及腫瘤和其它組織在注射后24小時都觀察到了示蹤劑活性的統(tǒng)計學顯著性差異(表1)。對于腫瘤靶向研究，發(fā)現(xiàn)M21腫瘤小鼠(n＝7)和M21L腫瘤小鼠(n＝5)以及接受對照探針的小鼠(n＝5)之間的平均％ID/g值的差異在注射后4小時(對于兩個對照為p＝0.0015)最大，在注射后24小時(分別為p＝0.0015和p＝0.004)、48小時(分別為p＝0.001和p＝0.003)、72小時(分別為p＝0.015和0.005)和96小時(對于M21-M21L為p＝0.005)保持顯著提高。發(fā)現(xiàn)124I-cRGDY-PEG-納米顆粒(n＝7)與124I-PEG-納米顆粒(n＝5)的腫瘤-肌肉比注射后24小時(p＝0.001)和注射后72小時(p＝0.006)具有統(tǒng)計學顯著性，但在注射后4小時(p＝35)沒有統(tǒng)計學顯著性。利用非線性回歸分析(SigmaPlot,Systat,v.11.0)測定尿液校準曲線(R2＝0.973,p＝0.01)以及尿液(R2>0.95,p＝0.047)和糞(R2>0.995,p<0.002)累積％ID排泄曲線的擬合度值(R2)以及其相關(guān)p值。結(jié)果納米顆粒設計和表征根據(jù)之前公開的方法制備涂布有末端為甲氧基的聚乙二醇(PEG)鏈(PEG約0.5kDa)的Cy5染料包封的核-殼二氧化硅納米顆粒(最大發(fā)射波長>650nm)。Burns,etal.,FluorescentSilicaNanoparticleswithEfficientUrinaryExcretionforNanomedicine,NanoLetters,9,442-8(2009)。Ow,etal.,Brightandstablecore-shellfluorescentsilicananoparticles.NanoLett.5,113–117(2005)。中性PEG涂布防止網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)的非特異攝取(調(diào)理素作用)。具有雙功能的PEG的使用能夠?qū)崿F(xiàn)少量(每個顆粒約6-7)αvβ3整合素靶向的環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGDY)肽配體的連接以保持便于高效腎清除率的小的流體動力學尺寸。通過酪氨酸連接劑的使用使肽配體額外標記有124I，以提供能夠通過PET三維定量成像的信號(124I-cRGDY-PEG-點,圖6A)；當已經(jīng)很大程度上清除背景活性并且使腫瘤-背景差異最大時，壽命相對長的124I(物理半衰期：4.2天)的重要應用優(yōu)勢在于足量信號持續(xù)足夠長的時間以允許施用后至少數(shù)天的放射檢測。通過放射性薄層色譜法，具有放射性標記的靶向納米顆粒的純度為>95％。通過FCS測定，不具有放射性標記的靶向納米顆粒的穩(wěn)定性為約1年。通過FCS分析，顆粒被完整排泄至尿液中。如本文所使用的，“點”和“納米顆粒”可以互用。含有用于124I標記的酪氨酸殘基且涂布有PEG的顆粒用作對照探針(124I-PEG-點)。通過尺寸排阻色譜對放射性標記的樣本的純化(圖7)產(chǎn)生>95％的放射化學產(chǎn)率。通過熒光關(guān)聯(lián)色譜(FCS)測定非放射性cRGDY-PEG-點和PEG-點的流體動力學直徑為約7nm(圖6B和6C)。測定cRGDY-PEG-點的相對亮度平均比游離染料高200％(圖6C)，這與之前的結(jié)果一致。Burns,etal.,FluorescentSilicaNanoparticleswithEfficientUrinaryExcretionforNanomedicine,NanoLetters,9,442-8(2009)。Larson,etal.,Silicananoparticlearchitecturedeterminesradiativepropertiesofencapsulatedchromophores.Chem.Mater.20,2677-2684(2008)?；谶@些物理化學性質(zhì)，發(fā)明人預期在靶向顆粒的選擇腫瘤攝取和滯留與腎清除率之間獲得有利平衡，由此使靶向組織定位最大同時使正常組織毒性和放射劑量最小。體外受體結(jié)合研究為了研究124I-cRGDY-PEG-點和124I-PEG點對腫瘤和血管內(nèi)皮表面的體外結(jié)合親和性和特異性，使用了過表達αvβ3整合素(M21)和不表達αvβ3整合素(M21L)的黑素瘤和人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細胞系。利用流式細胞術(shù)，在顆粒濃度范圍(0-8ng/ml)和溫育時間(達5小時)內(nèi)觀察到了cRGDY-PEG-點的高度特異的線性可飽和結(jié)合，在4小時和約2.0ng/ml顆粒濃度具有最大差異結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。在用過量的非放射性標記cRGD初始溫育M21細胞并然后加入多種濃度的具有放射性標記的靶向探針后，利用γ-計數(shù)法測試124I-cRGDY-PEG點的受體結(jié)合特異性(圖8A)。對結(jié)合數(shù)據(jù)的Scatchard分析獲得解離平衡常數(shù)Kd為0.51nM(圖8A，插圖)和受體濃度Bmax為2.5pM。根據(jù)Bmax值，估測αvβ3整合素受體密度為1.0×104/M21細胞，合理地與之前公開的該細胞系的估測值5.6×104一致。Cressman,etal.,BindinganduptakeofRGD-containingligandstocellularαvβ3integrins.IntJPeptResTher.15,49-59(2009)。在4-37℃的溫度范圍內(nèi)還觀察到了整合素特異性M21細胞攝取的遞增性增加，這提示受體介導的細胞內(nèi)化導致總體攝取(數(shù)據(jù)未顯示)。通過流式細胞術(shù)，利用靶向探針的額外競爭性結(jié)合研究顯示了受體介導的與抗-αvβ3整合素抗體的結(jié)合被完全抑制(圖8B)。利用過量的cRGDY或抗-αvβ3整合素抗體均沒有觀察到受體與M21L細胞結(jié)合的量級(M21為約10％)的顯著降低(圖8C)。通過額外的γ-計數(shù)研究證明了這些結(jié)果，并且經(jīng)測定124I-cRGDY-PEG-點的50％結(jié)合抑制濃度IC50為1.2nM。利用抗附著試驗和M21細胞發(fā)現(xiàn)，cRGDY-PEG-點相對于同數(shù)cRGD肽的關(guān)聯(lián)多價提高倍數(shù)大于2.0(數(shù)據(jù)未顯示)。Montet,etal.,MultivalenteffectsofRGDpeptidesobtainedbynanoparticledisplay.JMedChem.49,6087-6093(2006)。Li,etal.,64Cu-labeledtetramericandoctomericRGDpeptidesforsmall-animalPEToftumorαvβ3integrinexpression.J.NuclMed.48,1162-1171(2007)。與M21細胞類似，通過流式細胞術(shù)過量抗體有效地抑制了cRGDY-PEG-點受體與HUVEC細胞的結(jié)合(圖8D)。生物分布和清除率研究通過向M21腫瘤異種移植物小鼠模型靜脈施用示蹤劑劑量((約0.2納摩)的124I-cRGDY-PEG點和124I-PEG-點，評價了時間依賴性生物分布和腎臟以及肝膽管的清除率(圖9)。雖然在注射后(p.i.)196小時時間間隔計算了靶向探針的組織活性濃度(每克的注射劑量的百分數(shù)(％ID/g))，但124I-cRGDY-PEG點(圖9A)和124I-PEG-點示蹤劑(圖9B)的比較被限定于96小時窗口，原因是在第1周沒有獲得后者的數(shù)據(jù)。在注射后4和96小時觀察到了血液、腫瘤和主要器官以及在注射后24小時觀察到了腫瘤和數(shù)個其它組織的示蹤劑活性的統(tǒng)計學顯著性(p<0.05)差異(表1)。靶向探針在注射后第1周幾乎被完全從軀體清除(約3％ID)。這些示蹤劑的血液、腫瘤和主要器官停留半衰期(T1/2)示于表2(第2和5列)。代表性數(shù)據(jù)組(血液停留)示于圖9A的插圖中。測定124I-PEG-點的相對長血液T1/2值為7.3±1.2小時。在連接cRGDY肽以合成124I-cRGDY-PEG-點后，T1/2值略降低至5.6±0.15小時，但伴隨有較高的探針生物利用度(表2，第3列)。發(fā)現(xiàn)124I-cRGDY-PEG-點的腫瘤T1/2值是血液的約13倍，相比之下124I-PEG-點僅為5倍差異(表2，第2和5列)。表1：比較124I-cRGDY-PEG-點和124I-PEG-點的生物分布研究表2+70-kg標準男性，U(上)，L(下)，§小鼠黑素瘤模型，ξ遠低于其他組織的骨骼活性(未報道)前述生物分布數(shù)據(jù)通過適當質(zhì)量調(diào)整轉(zhuǎn)化至男性，得到人正常器官放射劑量并發(fā)現(xiàn)與其它常用診斷性放射示蹤劑的相當(表2，第8、9列)。與靶向探針無毒且導致非組織特異性病理影響(即非急性毒性)的發(fā)現(xiàn)(圖10和表3)一起，計劃了利用這些試劑首先在男性中的靶向和非靶向分子成像應用。表3N：正常，U：沒有獲得，NP：不存在，1：最小，2：中間，F(xiàn)：焦點，MF：多焦點在證明127I-RGD-PEG點在靜脈施用于小鼠后無毒的另一個研究中，利用約100倍人劑量當量的127I-RGD-PEG點在2周的時間內(nèi)進行正式單劑量毒性測試。127I-PEG點用作對照顆粒?？傊?，方法如以下所述。在急性毒性研究中使用了28只8周齡B6D2F1小鼠，并將其分成處理組和對照組。處理組(n＝6只雄性+6只雌性)通過靜脈接受劑量為1×10-9摩爾/小鼠的一個劑量的127I-PEG化RGD二氧化硅納米顆粒，而對照組(n＝6只雄性+6只雌性)接受相同量的載體。在給藥和臨床化學后第7天每組處死兩只小鼠(每組1只雄鼠和1只雌鼠)，在尸體解剖時進行血液學和組織特異性組織病理學檢查。所有剩余的動物(每組n＝5只雄性+5只雌性)都在處理后觀察14天。將4只未經(jīng)處理的小鼠(2只雄性和2只雌性)用作對照。研究的結(jié)論是在給藥過程中或者隨后的14天觀察期沒有觀察到不利事件。沒有觀察到死亡或發(fā)病。臨床觀察包括無以下情況：貧血，體重降低，激動，呼吸加快，胃腸道功能紊亂，行為異常，神經(jīng)功能障礙，血液異常，臨床化學異常，器官病理學上與藥物相關(guān)的病變。因此，以1×10-9摩爾/小鼠的127I-PEG化RGD二氧化硅納米顆粒的單次注射(等同于階段0成像研究所需的PEG化RGD二氧化硅納米顆粒劑量的100倍過量的劑量)在B6D2F1小鼠中是安全的且無毒。通過尿液樣本的熒光測定分析，發(fā)現(xiàn)直徑約7nm的靶向探針和非靶向探針在168小時時間內(nèi)的有效腎臟排泄?；谶B續(xù)稀釋校準方案，對熒光信號進行背景校正并轉(zhuǎn)化為顆粒濃度(％ID/μl)(圖9C插圖，表4第2列)。Burns,etal.,FluorescentSilicaNanoparticleswithEfficientUrinaryExcretionforNanomedicine,NanoLetters,9,442-8(2009)。濃度值以及平均尿液排泄率的年齡依賴性保守估測允許計算所排泄的累積％ID(表4第4列)。Drickamer,Ratesofurineexcretionbyhousemouse(musdomesticus):differencesbyage,sex,socialstatus,andreproductivecondition.J.Chem.Ecol.21,1481–1493(1995)。觀察到幾乎一半的注射劑量(約43％ID)在注射后開始的24小時都被排泄和在注射后96小時約72％ID被排泄(圖9C)，這表明在注射后第1天發(fā)生了大量排泄。在注射后168小時時，在尿液中沒能檢測到顯著的顆粒熒光。124I-cRGDY-PEG-點的糞排泄譜表明，在24小時和96小時分別清除了平均7％ID和15％ID注射劑量(圖9D)。在注射靶向探針后的多個時間點獲得的尿液樣本的FCS分析揭示，顆粒被完整地排泄而沒有釋放出包封的染料(數(shù)據(jù)未顯示)。表4：尿液濃度和累積排泄數(shù)據(jù)連續(xù)全身PET研究在靜脈注射124I-cRGDY-PEG-點或124I-PEG-點(對照)后的多個時間點對M21和M21L皮下后肢移植物小鼠模型中的整合素表達進行PET成像。在注射后4小時(左：M21腫瘤；中間：M21L腫瘤)和24小時(右：M21腫瘤)的代表性全身冠狀線方向的顯微PET圖像示于圖11A。從這些圖像清楚可見過表達αvβ3整合素的M21腫瘤的特異性靶向。顯示了接受靶向124I-cRGDY-PEG-點的M21(n＝7)和M21L(對照)腫瘤(n＝5)組以及接受非靶向124I-PEG-點示蹤劑的M21腫瘤小鼠的平均腫瘤％ID/g和標準差(圖11B)。在最大腫瘤攝取時(注射后約4小時)，在M21腫瘤中觀察到活性-濃度比對照高三倍。除1小時(p＝0.27)外，在注射后所有時間點(p<0.05)的差異都具有統(tǒng)計學顯著性。源自圖像的124I-cRGDY-PEG-點的腫瘤-肌肉攝取(％ID/g)比揭示了在隨后的時間(在注射后約24-72小時)的增強的腫瘤造影，而124I-PEG-點的則減弱(圖11C)。該發(fā)現(xiàn)表明124I-cRGDY-PEG-點實際上是腫瘤選擇性的，其在起始的24小時期間由于血液活性被清除而變得較明顯(比較圖11C和圖9A的插圖)。在124I-cRGDY-PEG-點和124I-PEG點兩者的源自PET的腫瘤組織％ID/g值與相應的離體γ-計數(shù)腫瘤％ID/g值之間發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學顯著相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r＝0.94,P<0.0016，圖11D)，這證明了PET用于非侵入性取得的定量生物分布數(shù)據(jù)的準確性。體內(nèi)NIR熒光成像和顯微術(shù)本發(fā)明人利用發(fā)明人的用于對局部/區(qū)域性淋巴結(jié)和淋巴管定位的小靶向納米顆粒進行了體內(nèi)熒光成像研究，由此克服前述限制。重要地，多模態(tài)性質(zhì)和本發(fā)明人的靶向顆粒探針的小尺寸可以被開發(fā)用以使在4象限腫瘤周施用后在本發(fā)明人的黑素瘤模型中的淋巴結(jié)尺寸和淋巴管分支的范圍可視化，從而模擬術(shù)中人前哨淋巴結(jié)定位過程。最初，在4小時的時間內(nèi)利用靶向或非靶向顆粒探針在完整的小鼠中進行系列NIR熒光顯微術(shù)。靶向探針的瘤周施用揭示了在該間隔向相鄰腹股溝部和腘部淋巴結(jié)的引流和持續(xù)可視化，其中較小和/或較遠的淋巴結(jié)和淋巴管較難以可視。相比之下，非靶向探針產(chǎn)生局部淋巴結(jié)的較短期(約1小時)可視化，觀察到其逐漸減弱的熒光信號(數(shù)據(jù)未顯示)。一旦手術(shù)暴露，發(fā)現(xiàn)該觀察結(jié)果是來自腫瘤位點的與靶向探針所觀察到的延長滯留相比較快速的顆粒擴散所造成的。本發(fā)明人接著利用活動物的全身光學成像(圖12A)和NIR熒光顯微術(shù)(圖12B)在多個空間尺度上進行代表性淋巴結(jié)定位，以使接受手術(shù)的活動物中從瘤周區(qū)至腹股溝和腋窩淋巴結(jié)的淋巴管引流可視化。此外，較高分辨率的熒光圖像(圖12B，下行)允許包括高內(nèi)皮微靜脈在內(nèi)的更詳細淋巴結(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)可視化，這促進了循環(huán)初始淋巴細胞向淋巴結(jié)內(nèi)的流通，并且這可能對淋巴結(jié)分期和檢測疾病較早期階段的微轉(zhuǎn)移的能力具有重要意義。通過在腋窩區(qū)內(nèi)的熒光顯微術(shù)還使較小、較不強的淋巴管分支可視化(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，靶向探針的小尺寸不僅允許靠近腫瘤的初始引流(或前哨淋巴結(jié))可視化，還能夠使較遠的淋巴結(jié)和待可視化的淋巴管引流模式可視化。討論本發(fā)明人報道了無毒、高親和性且被高效清除的二氧化硅納米顆粒用于腫瘤選擇性靶向和淋巴結(jié)定位，從而成功解決了目前與其他顆粒技術(shù)相關(guān)的數(shù)個難題。這是首個靶向納米顆粒，該納米顆粒基于其有利性質(zhì)而可以被描述為在臨床上可被轉(zhuǎn)化為組合的光學PET探針。與其小尺寸(直徑約7nm)相關(guān)的該多模態(tài)探針的互補性質(zhì)可通過能夠使在不同空間、時間和靈敏度尺度獲得的成像數(shù)據(jù)無縫整合而有利于臨床評估，從而潛在地為控制腫瘤生物學的基礎(chǔ)分子過程提供了新思路。本發(fā)明人的體外結(jié)果顯示了約7nm靶向顆粒探針與M21和HUVEC細胞的受體結(jié)合特異性。利用細胞類型相同但使用了所述肽的單價形式的受體結(jié)合實驗已經(jīng)報道了類似結(jié)果。Cressman,etal.,BindinganduptakeofRGD-containingligandstocellularαvβ3integrins.IntJPeptResTher.15,49-59(2009)。重要地，結(jié)合cRGDY的顆粒探針的多價提高和延長的血液和腫瘤滯留時間T1/2值是與顆粒平臺相關(guān)的重要性質(zhì)，而在利用所述肽的單價形式時沒有發(fā)現(xiàn)該性質(zhì)。所估測的124I-PEG-點示蹤劑的相對長的血液T1/2值(7.3±1.2小時)可能與涂布有在化學上為中性的PEG的表面有關(guān)，其使探針在生物學上為惰性且顯著較不易于被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)吞噬。發(fā)現(xiàn)124I-cRGDY-PEG-點示蹤劑的T1/2值降低至5.6±0.15小時，這極有可能是被靶向整合素和/或更具活性的巨噬細胞活性識別的結(jié)果。然而，這顯著長于之前公開的現(xiàn)有cRGDY肽示蹤劑的血液T1/2值(約13分鐘)，并在較長的時間內(nèi)產(chǎn)生較高的探針生物利用度，促進腫瘤靶向并產(chǎn)生較高的腫瘤攝取。Montet,etal.,MultivalenteffectsofRGDpeptidesobtainedbynanoparticledisplay.JMedChem.49,6087-6093(2006)。此外，124I-cRGDY-PEG-點的腫瘤T1/2值是血液的約13倍，相比之下124I-PEG-點的腫瘤T1/2值與血液的差異僅為5倍，這提示前者的靶向組織定位顯著高于后者。體內(nèi)數(shù)據(jù)的此類機制性解釋可被開發(fā)用以改善臨床診斷、治療計劃和治療監(jiān)測方法。本研究的結(jié)果強調(diào)了強大、可定量且具有高靈敏度的成像工具PET帶來的用于非介入性地提取與受體表達水平、結(jié)合親和性和特異性有關(guān)的分子信息的明顯優(yōu)勢。與周圍的正常結(jié)構(gòu)相比，在M21腫瘤中的較高聚集和從M21腫瘤中的較慢清除使得能夠區(qū)分特異性腫瘤攝取機制和正常組織中的非特異性機制(即組織灌注、滲漏)。然而，少部分的M21腫瘤攝取大概可歸因于血管滲透性的改變(即增強的滲透性和滯留作用)。Seymour,Passivetumortargetingofsolublemacromoleculesanddrugconjugates.Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.9,135-187(1992)。根據(jù)所觀察的％ID/g在接受對照示蹤劑(124I-PEG-點，圖11B)的小鼠中提高，這種非特異性攝取模式反映了在注射后較早時間點的相對少部分的總腫瘤攝取(124I-PEG-點，圖11B)。在注射后1小時時，在M21腫瘤中沒有觀察到相對于對照的顯著的％ID/g提高。該觀察結(jié)果可反映在第1小時內(nèi)差異灌注的影響，而在隨后的注射后時間(即24小時)主要觀察到腫瘤聚集和滯留。此外，與臨床上批準的肽示蹤劑18F-半乳糖RGD相比，發(fā)現(xiàn)124I-cRGDY-PEG-點34在M21腫瘤中的攝取是它的幾乎2倍，同時額外產(chǎn)生了多價結(jié)合、延長血液循環(huán)時間和提高腎清除率的優(yōu)勢。組合的光學-PET探針的一個優(yōu)勢是評價尺寸為或遠低于PET掃描儀的分辨率界限(即所謂的部分容積效應)的解剖結(jié)構(gòu)的能力，其可破壞病變內(nèi)的活性檢測和定量。例如，在小動物模型中，考慮到所觀察的淋巴結(jié)尺寸通常處于系統(tǒng)空間分辨率的量級(1-2mm)，因此PET成像不能充分解決小局部/區(qū)域性淋巴結(jié)內(nèi)的轉(zhuǎn)移性疾病的評估，而這種評估在臨床上對黑素瘤分期和治療至關(guān)重要。通過利用第二互補敏感成像模式，可以獲得近紅外(NIR)熒光成像、揭示淋巴結(jié)病變的功能圖和淋巴引流情況。Ballou,etal.,Sentinellymphnodeimagingusingquantumdotsinmousetumormodels.BioconjugateChem.18,389-396(2007)。雖然需要進一步工作以研究與轉(zhuǎn)移病灶有關(guān)的淋巴結(jié)內(nèi)cRGDY-PEG-點熒光分布，從而確定是否能夠?qū)崿F(xiàn)該病灶的靈敏定位，但這些結(jié)果明顯證明了利用此類組合光學PET探針工作的優(yōu)勢。在臨床中，不能夸大此類組合平臺用于腫瘤分期和治療的好處。該納米探針的延長的血液循環(huán)時間和所產(chǎn)生的生物利用度凸顯了其用作用于早期和長期監(jiān)測疾病控制的不同階段(診斷性篩選、治療前評價、治療性干預和治療后監(jiān)測)的通用工具的用途，而不受出于毒性考量帶來的限制。其他重要優(yōu)勢是，雖然快速清除的探針可用于本身快速的靶向組織定位的某些應用，但許多試劑在全身施用后在血管化通常較弱且另外相對難以接近的實體瘤中的定位將可能是緩慢的。因此，由于靶組織定位的動力學不再受限，當前的納米顆粒平臺擴展了此類試劑的應用范圍。此外，通過PET可以在其生物分布和數(shù)量方面對深淋巴結(jié)定位，同時可以通過NIR熒光成像獲得淺表淋巴結(jié)的更準確、更詳細定位。最后，除了其多價提高外，來自腫瘤的靶向探針相對于來自血液的相對延長的滯留可經(jīng)開發(fā)作為放療或藥物遞送載體而用于未來的治療診斷應用。實施例5.與αvβ3整合素靶向肽和/或uMUC1靶向肽軛合的熒光二氧化硅納米顆粒(甲狀腺癌和鱗狀細胞癌(SCC)模型)通過巰基-馬來酰亞胺連接鍵使具有半胱氨酸末端官能團的cRGD肽(PeptidesInternational)與PEG化的納米顆粒連接。所述納米顆?？扇芜x通過合成肽配體EPPT1而被進一步功能化。在粒徑、尺寸分布和光致漂白的基礎(chǔ)上進一步表征所述納米顆粒。納米顆粒-肽軛合物的表征為了在每個顆粒基礎(chǔ)上評價光物理性質(zhì)，利用分光光度法、光譜熒光分光光度法和多光子熒光關(guān)聯(lián)光譜(FCS)測定粒徑、亮度和尺寸分布。通過掃描電子顯微鏡和動態(tài)光散射(DLS)測定結(jié)果確證尺寸數(shù)據(jù)。Owetal.Brightandstablecore-shellfluorescentsilicananoparticles.NanoLetters2005；5,113。可以在堿性條件下利用Biuret分光光度法在比色學上評價每個納米顆粒的RGD肽平均數(shù)量以及RGD與功能化PEG基團的偶聯(lián)效率(λ＝450nm,最大吸光度)。使用Iodogen51(Pierce,Rockford,IL)，通過酪氨酸連接劑對納米顆粒軛合物進行碘化以產(chǎn)生放射性標記(124I)(T1/2約4天)和穩(wěn)定(127I)形式。通過使用尺寸排阻色譜純化終產(chǎn)物。RGD-納米顆粒和RGD-EPPT-納米顆粒的體外靶向特異性和生物分布圖的評價利用抗整合素和抗uMUC1抗體，相對于已知αvβ3整合素陰性和αvβ3整合素陽性(分別為M21-L和M21人黑素瘤細胞系)以及uMUC1-陰性和uMUC1-陽性(分別為U8728、H-29細胞系)對照，對甲狀腺和鱗狀細胞癌(SCC)細胞系中的αvβ3整合素和uMUC1表達圖進行評價。選擇高表達αvβ3-整合素和/或MUC1的細胞系用于與RGD-納米顆粒和RGD-EPPT-納米顆粒的差異結(jié)合研究，以及用于體內(nèi)成像。定量細胞結(jié)合實驗評價腫瘤細胞的標記效率，并利用放射碘化的納米顆粒軛合物(124I-RGD-納米顆粒、124I-RGD-EPPT-納米顆粒)進行測試腫瘤、器官和流體內(nèi)攝取的生物分布研究。為了利用光學NIFR成像比較納米顆粒軛合物的PET攝取數(shù)據(jù)和最初所觀察的數(shù)據(jù)，還對各納米顆粒軛合物進行碘化以產(chǎn)生放射性標記(124I)和穩(wěn)定(127I)形式。利用RGD-點和RGD-EPPT-C-點的熒光顯微術(shù)。通過熒光顯微術(shù)將使與對照細胞系相比RGD-納米顆粒和RGD-EPPT-納米顆粒與高表達αvβ3-整合素和/或MUC1的甲狀腺癌/SCC細胞系的差異結(jié)合可視化。動物模型。根據(jù)機構(gòu)動物管理和使用委員會批準的方案并遵循NIH動物福利指導方針進行所有動物實驗。體內(nèi)生物分布：向雄性無胸腺裸鼠(6-8周齡，每種腫瘤的n＝5)的兩側(cè)腹皮下(s.c.)注射不同組織來源的整合素-陰性/-陽性或uMUC1-陰性/-陽性腫瘤(每種腫瘤的n＝3)。在直徑(i.d.)為0.5cm時，向小鼠靜脈注射(IV)124I-標記的納米顆粒軛合物(約500nm/kg)。在0.5、1和24小時后處死動物，移取腫瘤、器官和流體用以稱重和計數(shù)(γ-計數(shù)器)。生物分布的結(jié)果將被表示為每克組織所注射的劑量的百分數(shù)。定量細胞結(jié)合實驗。通過在潮濕的CO2氣氛下于37℃將高表達αvβ3-整合素和/或MUC1的固定數(shù)量的肉瘤細胞和濃度預先選定的帶124I標記的納米顆粒軛合物一起溫育1小時，對標記效率進行評價。充分洗滌細胞，用0.1％TritonX裂解，并在γ-計數(shù)器中對細胞裂解物進行計數(shù)。利用體內(nèi)多模態(tài)(PET-NIRF)成像評價腫瘤特異性靶向的相對差異作為高通量診斷篩選工具，光學NIRF成像可以以提高的靈敏度和瞬時分辨率來評價功能化逐步提高的納米顆粒軛合物在體內(nèi)的生物分布的相對差異。還可以獲得腫瘤特異性靶向的半定量數(shù)據(jù)。這些初步研究促進了強表達目的標志物的細胞系的選擇，所述標志物用于利用PET對生物分布和腫瘤特異性靶向進行更詳細的定量。在1周的時間內(nèi)進行全身microPETTM和NIRF光學成像，以評價側(cè)腹腫瘤內(nèi)的不同攝取。利用離體腫瘤的熒光顯微術(shù)確證這些研究的結(jié)果。系列體內(nèi)NIFR成像。向小鼠兩側(cè)注射αvβ3整合素-陰性和αvβ3整合素-陽性細胞或uMUC1-陰性和uMUC1-陽性細胞(每種腫瘤的n＝5)。在腫瘤達到直徑約0.5cm時，靜脈注射穩(wěn)定的碘化和未碘化的納米顆粒軛合物(RGD,127I-RGD、RDG-EPPT、127I-RGD-EPPT)。在0、0.5、1、2、4、6、12和24小時利用MaestroTM體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)(CRI,Woburn,MA)進行系列成像。在第24小時，安樂處死小鼠，并切除主要組織/器官、稱重并置于6孔板中用于離體成像。采用光譜解混算法(spectralunmixingalgorithms)利用目的區(qū)域(ROI)在腫瘤、所選擇的組織和參考注射液上分析熒光發(fā)射，以除去自動熒光。用組織的平均熒光強度除以注射液值允許對各注射納米顆粒軛合物在各種組織/器官之間進行比較。動態(tài)MicroPET成像獲取和分析。向兩組荷載腫瘤的小鼠(每種腫瘤的n＝5)注射放射性標記有124I的納米顆粒軛合物(放射示蹤劑)，并利用Focus120microPETTM(ConcordeMicrosystems,TN)進行1小時的動態(tài)PET成像。在靜脈注射約25.9MBq(700μCi)放射示蹤劑時啟動1小時列表模式(listmode)獲取。通過濾波反投影在128x128x96矩陣中重構(gòu)所產(chǎn)生的列表模式數(shù)據(jù)。利用ASIProTM軟件(ConcordeMicrosystems,TN)進行所重構(gòu)的圖像的目的區(qū)域分析，以確定腫瘤、其他器官/組織和左心室(LV)內(nèi)的放射示蹤劑攝取(％ID/g)的平均值和標準差。從注射后24、48和72小時時間點的靜態(tài)圖像獲得額外數(shù)據(jù)。利用三區(qū)間、四參數(shù)動態(tài)模型表征示蹤劑的體內(nèi)行為。為了該分析，利用放置于左心室上的目的區(qū)域計算動脈輸入。實施例6.小型豬的淋巴結(jié)定位由于這些系統(tǒng)通常太麻煩且以操作組使用時費用昂貴，或者可能不能提供必要的視場或組織造影，目前實際上還不能實現(xiàn)淋巴結(jié)流域的實時術(shù)中掃描。此外，也不能獲得在臨床上具有希望的含生物穩(wěn)定性熒光團的試劑用以增強組織造影進而用于延長的淋巴結(jié)定位/切除過程，所述試劑產(chǎn)生改良的圖像物理學特征和比親本染料長的循環(huán)有效期。利用該動物研究，本發(fā)明人證明多模態(tài)顆粒探針和實時分子成像設備技術(shù)兩者的優(yōu)勢可被容易地轉(zhuǎn)換為未來的多種人類臨床試驗。通過提供現(xiàn)有狀態(tài)的靶向可視化工具(該工具便于檢測轉(zhuǎn)移性SLN并能夠準確描繪相鄰解剖學的淋巴結(jié))以使損傷重要結(jié)構(gòu)的風險最小化，此類改革性技術(shù)可顯著影響標準的術(shù)中癌護理。優(yōu)點包括頭和頸內(nèi)淋巴結(jié)疾病傳播和腫瘤程度的延長的實時體內(nèi)術(shù)中定位。通過PET可對深淋巴結(jié)定位，而通過NIR熒光成像可獲得表面淋巴結(jié)的準確且詳細的定位。所述顆粒探針的小尺寸還可以擴展可被靈敏檢測的淋巴結(jié)尺寸的下限。所提議的無毒多模態(tài)平臺和組合診斷/治療方法的凈效應對于這種高致死性疾病的疾病分期、診斷和臨床結(jié)果具有重要意義。疾病靶向除了黑素瘤外，許多其他腫瘤(即乳房、肺和腦)也過表達ανβ3整合素受體并且可用作疾病靶標。轉(zhuǎn)移性黑素瘤的預后非常差，并且存活中值小于1年11。成功控制依賴于早鑒別和癌的適當手術(shù)切除。在美國，原發(fā)疾病的手術(shù)移除、篩查和治療區(qū)域性淋巴結(jié)傳播是準確對疾病分期和量身治療的護理標準。最近修訂的分期指導認為用顯微鏡可見的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在是導致存活大幅降低的晚期疾病的特點。對病理性淋巴結(jié)狀況的了解對早期風險層化、結(jié)果預測的改善和患者子群的選擇至關(guān)重要，而這可能受益于輔助治療(治療性淋巴結(jié)切除、化療)或臨床試驗。前哨淋巴結(jié)(SLN)定位在黑素瘤分期中慣常使用的SLN定位技術(shù)鑒定荷載腫瘤轉(zhuǎn)移的最高風險的具體淋巴結(jié)。該方法鑒別患有轉(zhuǎn)移性疾病的患者用于進一步的治療。標準護理技術(shù)依賴于在原發(fā)性腫瘤周圍注射用于SLN定位的放射性锝(99mTc)膠體硫染料，然后是術(shù)中使用γ探針測定所暴露的淋巴結(jié)流域內(nèi)淋巴結(jié)構(gòu)中的放射性。在原發(fā)性腫瘤周圍注射的藍色染料可幫助描繪來自相鄰組織的小SLN，但該技術(shù)不可靠且易于發(fā)生并發(fā)癥。當前的SLN定位和活組織檢查技術(shù)具有局限性，并且與其他解剖學位點相比SLN在頭和頸內(nèi)的非定位占較高比率。頭和頸區(qū)以其不可預測的轉(zhuǎn)移性疾病譜而為人所知。原發(fā)性病變在該區(qū)域與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的緊密相接使得由于來自注射位點的干擾而難以在術(shù)中使用γ探針。重要的是，目前的技術(shù)不能使外科醫(yī)生看見前哨淋巴結(jié)并可靠地使之與相鄰脂肪或其他組織區(qū)分，從而使重要結(jié)構(gòu)(即神經(jīng))在切除以鑒定和收集該淋巴結(jié)的過程中具有受損害的風險。淋巴結(jié)的小尺寸和在引流情況中的寬變化帶來了額外的挑戰(zhàn)，從而導致約10％的非定位率。納米顆粒大多臨床前研究都使用了RGD肽或肽-軛合物放射示蹤劑作為用于使ανβ3整合素表達成像的靶向配體。18F-半乳糖-RGD和99mTc-NC100692是已經(jīng)成功用于患者中用以診斷疾病的肽示蹤劑。肽示蹤劑被快速清除，這可導致受體結(jié)合降低和來自非特異組織分散的背景信號提高。這些性質(zhì)限制了肽示蹤劑用于長期監(jiān)測的潛能。相比之下，也已經(jīng)用于使沿腫瘤神經(jīng)脈管系統(tǒng)的整合素表達成像的納米顆粒探針(約10-100nm)已經(jīng)延長了循環(huán)半衰期，用于進行較長期的監(jiān)測(即數(shù)天)。納米顆粒通常大于抗體和放射性藥物(<10kDa)，并且由于改變了腫瘤脈管滲透性而與跨膜轉(zhuǎn)運減慢、RES攝取提高和非特異性攝取增強有關(guān)。用于該SLN定位研究的直徑7nm的靶向納米顆粒大概與白蛋白分子的平均直徑相當并且比典型抗體的平均直徑小2-3倍。相對于肽示蹤劑，靶向顆粒探針較不易于溢出并且與增強腫瘤靶向的延長的循環(huán)半衰期有關(guān)。重要的是，124I-cRGDY-PEG-點證明了對M21腫瘤中的臨床轉(zhuǎn)換所必需的重要的體外和體內(nèi)性質(zhì)。材料和方法向自發(fā)性黑素瘤辛克萊小型豬(Sinclairminiatureswine)(10-12kg,Sinclair研究中心,MO)靜脈注射5mCi18F-氟-脫氧葡萄糖(18F-FDG)，用于淋巴結(jié)和/或器官轉(zhuǎn)移的全身掃描。利用臨床上的PET掃描儀使小型豬在注射后40分鐘接受1小時的動態(tài)18F-FDGPET全身PET掃描，用以篩選轉(zhuǎn)移性疾病，然后是用于解剖學定位的CT掃描獲取。然后，在18F-FDGPET后48小時在腫瘤位點的周圍以4象限譜給小型豬皮下注射多模態(tài)124I-RGD-PEG-點，并且進行第二動態(tài)PET-CT掃描以評價額外的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。將小型豬置于操作室用于鑒定淋巴結(jié)。利用大視野近紅外熒光相機系統(tǒng)、較小視野的改良內(nèi)診鏡和改良的立體顯微鏡進行光學熒光成像，用于在暴露的手術(shù)床內(nèi)獲得較高分辨率的熒光影像。利用經(jīng)臨床批準的手握式PET設備通過γ計數(shù)在操作床內(nèi)術(shù)中進行熒光信號的驗證，以對術(shù)中從皮膚和淋巴結(jié)內(nèi)以及淋巴結(jié)流域獲得的靶向點進行透皮定位。切除原發(fā)性黑素瘤皮膚病變并且進行切口以允許進入前哨淋巴結(jié)。利用手握式PET和多尺度光學成像系統(tǒng)證明淋巴結(jié)鑒別，并切除可疑淋巴結(jié)。樣本送于轉(zhuǎn)移瘤的組織學評價和光學共聚焦顯微術(shù)，以證明存在惡性和納米顆粒熒光兩者。出于關(guān)聯(lián)目的，收集前哨淋巴結(jié)后，切除完整的淋巴結(jié)流域，并利用組織學方法(和根據(jù)需要用于黑素瘤的免疫組化標記物)、熒光顯微術(shù)和手握式PET探針進行進一步評價。通過在成像上的顯示，該步驟有助于鑒定淋巴結(jié)流域內(nèi)的任何其他惡性淋巴結(jié)和相鄰淋巴結(jié)內(nèi)存在的124I-RGD-PEG-點的數(shù)量。順次向動物的四肢皮下施用124I-RGD-PEG-點。利用光學成像系統(tǒng)和手握式PET探針跟蹤124I-RGD-PEG-點至腹股溝/腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)運，用以證明轉(zhuǎn)移沿淋巴通路的持續(xù)時間。通過手術(shù)暴露引流淋巴結(jié)流域并觀察淋巴結(jié)引流的情況。從各個位點收集前哨淋巴結(jié)以證明組織的淋巴管性質(zhì)。安樂處死動物，并在動物設施的尸體剖檢房切除在成像上觀察到的任何進一步的病變。討論全身18F-氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)PET-CT掃描顯示了與上背上的脊柱相鄰的原發(fā)性黑素瘤病變以及在動物右側(cè)后部的頸內(nèi)的單個淋巴結(jié)，兩者均渴求FDG(FDG-avid)，并且懷疑為轉(zhuǎn)移性疾病。在腫瘤位點周圍皮下4象限注射124I-RGD-PEG-點(其額外鑒定出另外兩個高代謝淋巴結(jié)以及引流淋巴管)后，證明了該發(fā)現(xiàn)。最終掃描解釋指向3個潛在的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。在手握式PET探針在前哨淋巴結(jié)的位置鑒定并證明了提高的計數(shù)率后，從兩側(cè)進行來自頸內(nèi)的其他淋巴結(jié)流域的原發(fā)性病變、高代謝淋巴結(jié)和組織的手術(shù)切除。通過病理學分析使在所切除的正后方前哨淋巴組織中測定的補綴熒光信號與黑素瘤轉(zhuǎn)移瘤的位點相關(guān)聯(lián)。所有高代謝淋巴結(jié)樣本都被染成黑色，并發(fā)現(xiàn)與黑素瘤細胞的獨特聚團的存在相關(guān)聯(lián)。因此，被送至病理學用于H&E和其他已知黑素瘤標志物的染色的手術(shù)所切除的組織的結(jié)果證明了多模態(tài)成像的發(fā)現(xiàn)。圖13a顯示了利用自發(fā)性小型豬黑素瘤模型用于對淋巴結(jié)流域和引流已知原發(fā)性黑素瘤位點的區(qū)域性淋巴管定位的實驗裝置。需要這種中等尺寸的小型豬模型用以模擬人體內(nèi)前哨淋巴結(jié)(SLN)活組織檢查方法的應用，并更準確地概括人類疾病。圖13b顯示了在腫瘤位點周圍皮下注射多模態(tài)顆粒(124I-RGD-PEG-點)后5分鐘的小視野PET圖像。腫瘤區(qū)、淋巴結(jié)和引流腫瘤位點的淋巴管為活性提高的區(qū)域(黑色)。圖14顯示了全身動態(tài)18F-氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)PET掃描(圖14a)和合并的18F-FDGPET-CT掃描(圖14b)，其顯示了通過頸內(nèi)淋巴結(jié)疾病的位點的徑向、冠狀線方向和軸向的圖像。進行18F-FDGPET掃描以對靜脈施用放射性標記的納米顆粒探針后和施用前的轉(zhuǎn)移性疾病的位點定位。在動物右側(cè)的頸后觀察到了單個高代謝淋巴結(jié)(箭頭，軸向圖像，上圖/下圖)，并在小型豬全身圖像上進行鑒定(圖14c)。圖15顯示了與圖14相同的圖像組，但是在與上背上的脊柱相鄰的原發(fā)性黑素瘤病變的水平上。鑒定了渴求PET(PET-avid)的病變(箭頭，軸向，上圖/下圖)，并且在全身小型豬圖像上進行了鑒定(圖15c)。圖16顯示了模仿了臨床方法在1小時的時間內(nèi)在腫瘤位點周圍皮下4象限注射124I-RGD-PEG-點后的高分辨率動態(tài)PET(圖16a)和合并PET-CT圖像(圖16b)。在頸內(nèi)發(fā)現(xiàn)三個高代謝淋巴結(jié)(箭頭)，這提示轉(zhuǎn)移性疾病。切除右后SLN并進行全身近紅外(NIR)熒光成像。在全身光學成像上，在所切割的淋巴結(jié)內(nèi)是可檢測Cy5熒光信號(圖16c，上圖，Cy5成像)。在通過H&E染色的淋巴結(jié)的低倍(箭頭)和高倍橫截面圖(下方兩幅圖)上，該黑色染色的淋巴結(jié)(箭頭，SLN)的病理學分析證明了侵襲性黑素瘤細胞的聚團，并且發(fā)明人預期黑素瘤特異性，其可利用特殊染色進一步證明(MelanA,HMB45,PNL2,and“melanomaassociatedantigen”biogenexcloneNKI/C3)。另外，發(fā)明人還根據(jù)共聚焦熒光顯微術(shù)和高分辨率數(shù)字放射自顯影術(shù)預期顆粒與這些轉(zhuǎn)移性細胞聚團的共定位，這可證明轉(zhuǎn)移性疾病的檢測。實施例7.與MC1R靶向肽軛合的熒光二氧化硅納米顆粒(黑素瘤模型)對于多模態(tài)(PET-NIRF)成像實驗，替換納米顆粒表面的靶向肽和放射性標記經(jīng)以測定靶向特異性、結(jié)合親和性/親和力和檢測靈敏度。利用用于靶向殺傷表達MC1R的黑素瘤細胞的治療性放射性標記(镥-177,177Lu,t1/2＝6.65天)合成納米顆粒。組合的定量PET和光學成像結(jié)果與腫瘤組織放射自顯影和跨越空間尺度的光學成像相關(guān)聯(lián)。對于細胞顯微術(shù)，使用用于合并反射比和熒光成像的體內(nèi)共聚焦熒光掃描儀。實施例8.用于靶向放療的熒光納米顆粒利用131I-RGD納米顆粒進行劑量擴大研究，并利用18F-FDGPET在6周的時間內(nèi)每周對治療的響應進行監(jiān)測。利用平面γ相機成像進行納米顆粒平臺的時間依賴性腫瘤攝取和放射量測定。體內(nèi)成像數(shù)據(jù)與所切除的腫瘤樣本的γ計數(shù)相關(guān)聯(lián)。使用雄性裸鼠(6-8周齡，CharlesRiverLabs,MA)用于在注射M21人黑素瘤細胞(含5x105細胞的PBS)后產(chǎn)生后肢異種移植物模型。允許腫瘤生長10-14天直至尺寸為0.5-0.9cm3?；?31I-的靶向放療研究。將治療性放射核素131I用作用于靶向放射的放射性標記。在不導致動物死亡且體重降低小于20％(MTD)的131I最高可能劑量的估測中，在荷載有腫瘤的裸鼠中進行劑量放大研究。為向血液54施用200拉德(rad)劑量，需要10MBq的施用活性，其將270拉德的劑量遞送至腫瘤。利用經(jīng)設計允許修復和節(jié)約骨髓的劑量分割，施用10MBq的4個劑量，以獲得大于1000拉德的腫瘤劑量。131I允許利用針孔瞄準儀的平面γ相機成像，用以檢測納米顆粒的時間依賴性腫瘤攝取和放射量測定。18F-FDGPET允許定量監(jiān)測腫瘤響應，因此提供了補充信息?；谠摂?shù)據(jù)和荷載有紫杉醇的納米顆粒的體內(nèi)效果的數(shù)據(jù)，進行利用131I-RGD-納米顆粒軛合物的治療研究。兩組荷載腫瘤的小鼠(n＝10/組)接受4個以每周一次共4周靜脈施用的131I-RGD-納米顆粒軛合物的10.4MBq活性，或鹽水載體(對照，n＝10))，并在6周的時間內(nèi)進行監(jiān)測。在腫瘤體積(通過測徑器測定)的基礎(chǔ)上對治療響應/進展進行定量。還通過SPECT成像(GammaMedica)，在6周時間的時間內(nèi)使來自治療組的所有小鼠都每周成像一次(約1小時時間)。18F-FDGPET成像獲取和分析。荷載腫瘤的兩組小鼠(n＝10/組)在治療前并且然后以每周為基礎(chǔ)在治療后6周的間隔內(nèi)進行初始PET掃描。向小鼠靜脈注射(i.v.)500μCi18F-FDG并在治療前和治療后利用Focus120microPETTM(ConcordeMicrosystems,TN)獲得靜態(tài)10分鐘PET圖像。通過濾過反投影在128x128x96矩陣中重構(gòu)所獲得的數(shù)據(jù)。利用ASIProTM軟件(ConcordeMicrosystems,TN)進行所重構(gòu)的圖像的目的區(qū)域(ROI)分析，以確定腫瘤內(nèi)放射示蹤劑攝取(％ID/g)的平均值和標準差。在研究結(jié)束時處死動物并切除腫瘤用于γ計數(shù)。實施例9.與放射性核素螯合劑和MC1R靶向肽軛合的熒光納米顆粒將PEG化納米顆粒與靶向肽和結(jié)合高特異活性放射性標記的大環(huán)螯合劑軛合。利用標準方法，將使用NHS酯或馬來酰亞胺衍生的可商購高純度兩臂活化的PEG與納米顆粒的二氧化硅殼軛合。兩個功能化PEG基團(NHS酯或馬來酰亞胺)中的任一者可用于與肽-螯合劑構(gòu)建體環(huán)狀肽Re-[Cys3,4,10,D-Phe7]α-MSH3-13(ReCCMSH(Arg11))或1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸(DOTA)連接螯合劑的進一步軛合。如以下所討論的，所衍生的PEG與納米顆粒表面的共價連接的進行方式使得暴露不同的官能團用于連接DOTA和肽-螯合劑構(gòu)建體。功能化納米顆粒的合成和物理化學表征通過建立以下部分與所衍生的PEG基團的共價鍵合來合成功能化的納米顆粒。(A)DOTA螯合劑，其用于隨后用發(fā)射正電子的放射金屬(即64Cu)的高特異性活性放射性標記，以利用PET成像可進行診斷性檢測。利用標準的Fmoc化學使DOTA與功能化PEG軛合，并通過色譜進行螯合納米顆粒的純化。通過在60℃溫育反應混合物30分鐘使64Cu和177Lu與DOTA結(jié)合，然后進行凝膠過濾或高壓液相色譜純化?；蛘?，通過DOTA-功能化PEG(放射性金屬)或酪氨酸功能化PEG(124I)可以使諸如124I、86Y、68Ga和89Zr的PET核素與納米顆粒軛合。以177LuCl3形式獲得的單個光子發(fā)射物177Lu與用于放療的DOTA絡合。(B)通過錸環(huán)化αMSH黑素瘤靶向肽類似物(ReCCMSH(Arg11))。有必要證明PEG化納米顆粒表面的DOTA螯合劑與ReCCMSH(Arg11)部分的比例。按照以下進行功能化納米顆粒制備物的表征。(A)利用64Cu通過標準的同位素稀釋實驗測定每個納米顆粒的DOTA螯合劑的平均數(shù)。簡而言之，將64Cu加入至含已知量的ReCCMSH(Arg11)-納米顆粒的溶液中。將經(jīng)溫育的溶液點在涂布二氧化硅凝膠的玻璃板上，在1:110％乙酸銨-甲醇(含EDTA)中顯影，并通過放射性-TLC分析。雖然標記有64Cu的ReCCMSH(Arg11)-納米顆粒將保持在原點，但結(jié)合EDTA的64Cu將遷移。相對于向反應混合物中添加的64Cu的總納摩爾數(shù)對百分標記效率作曲線。由該曲線的拐點計算每個納米顆粒所連接的螯合劑數(shù)量。(B)利用分光光度法(λ＝435nm，最大吸光度)和已知的ReCCMSH(Arg11)的消光系數(shù)估測每個納米顆粒的ReCCMSH(Arg11)肽的平均數(shù)以及ReCCMSH(Arg11)與功能化PEG基團的偶聯(lián)效率。引入錸所帶來的優(yōu)勢是可在產(chǎn)物的小樣本上進行錸濃度的高靈敏吸光度測定。用以評價腫瘤特異性靶向和治療響應的黑素瘤模型中的多功能納米顆粒體外和體內(nèi)光學PET成像比較64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)-納米顆粒與天然的64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)構(gòu)建體，以檢測納米顆粒的靶向能力。競爭性結(jié)合實驗。使用MC1R受體陽性的B16/F1鼠黑素瘤細胞系。利用125I-(Tyr2)-NDP7(與MC1R具有皮摩爾親和力的放射性碘化的MSH類似物)測定ReCCMSH(Arg11)肽的IC50值，即抑制50％放射性配體結(jié)合所需的肽濃度。在25℃將單細胞和含約50,000cpm125I-(Tyr2)-NDP的0.5ml結(jié)合介質(zhì)一起溫育3小時，其中所述結(jié)合介質(zhì)含25mmol/LN-(2-羥乙基)-哌嗪-N-(2-乙烷磺酸)、0.2％BSA和0.3mmol/L1,10-鄰二氮雜菲],其中(Arg11)CCMSH的濃度范圍為10-13至10-5mol/L。分別收集并計算細胞和介質(zhì)中的放射性，用Kell軟件包(Biosoft,MO)處理數(shù)據(jù)以計算Re(Arg11)CCMSH肽的IC50值。受體定量實驗。向孔內(nèi)添加5x105B16/F1細胞試樣，在200μLRPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在含濃度增加的125I-(Tyr2)-NDP(2.5-100nCi)的0.5mL結(jié)合介質(zhì)(含25mMHEPES的MEM,pH7.4)存在下在37℃溫育1.5小時。用0.5mL、pH7.4的冰冷0.2％BSA/0.01MPBS洗滌細胞兩次，并在γ-計數(shù)器中測定與細胞級分相關(guān)的活性水平。通過將細胞和非放射性NDP的終濃度為10μM的125I-(Tyr2)-NDP一起溫育測定非特異性結(jié)合。通過對游離125I-(Tyr2)-NDP的特異結(jié)合比和特異結(jié)合的濃度(fmol/百萬細胞)作曲線獲得斯卡查德圖(Scatchardplots)，結(jié)合位點的最大數(shù)Bmax為線性回歸線的X截距。向雄性裸鼠(6-8周齡)的后肢皮下注射B16/F1鼠黑素瘤細胞系(含5×105細胞的PBS)。使腫瘤生長10-14天直至尺寸為0.5-0.9cm3。生物分布：向每只具有可觸知的B16/F1腫瘤的小鼠皮下注射少量64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)-納米顆粒軛合物(約10μCi,0.20μg)。在所選擇的注射后的時間點(2、4、24、48、72小時；每個時間點n＝4-5)處死動物，移除期望的組織，稱重并計算累積放射性。將注射有天然放射性標記性構(gòu)建體64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)(約10μCi,0.20μg)的其他小鼠(n＝5)用作對照組，并在注射后1小時進行評價。為了測定體內(nèi)攝取特異性，給另外一組小鼠(2小時時間點)預注射20μgNDP以用作注射64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)納米顆粒軛合物緊前的受體阻斷物。對主要器官和組織進行稱重和γ計數(shù)，并測定每克的注射劑量百分數(shù)(％ID/g)。系列體內(nèi)NIRF成像。與以下PET研究平行，在荷載腫瘤的動物(n＝10)的靜脈注射前和注射后利用可調(diào)的680nm掃描NIR激光束和CCD進行NIR(熒光斷層成像，F(xiàn)MT225,Visen,Woburn,MA)。使小鼠保持持續(xù)的異氟烷麻醉，并置于手提式多模態(tài)成像盒(與本發(fā)明的FMT2500和Focus120microPET兩者兼容)中用于在注射前和注射后(1、2、4、6、12、24、48和72小時)的FMT掃描。利用Visen的所有權(quán)軟件重建在1-10分鐘的時間內(nèi)檢測的NIR熒光圖像，并重疊于小鼠正常圖像之上。成像數(shù)據(jù)是定量的，原因是所測定的強度與NIR熒光團濃度正相關(guān)，從而能夠?qū)Υa(chǎn)生的絕對熒光團濃度作參變量圖，用于與所得PET成像數(shù)據(jù)共配準。動態(tài)PET成像獲取和分析。將兩組荷載腫瘤的小鼠(n＝5/組)置于成像盒中，用于共配準連續(xù)PET-光學研究。給小鼠靜脈注射(i.v.)：一組為放射性標記的64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)納米顆粒軛合物，第二組為天然的64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)構(gòu)建體。注射后，利用Focus120microPETTM(ConcordeMicrosystems,TN)獲取動態(tài)1小時PET圖像。1小時列表模式圖像采集在靜脈注射放射性標記探針(約1mCi)時開始。通過濾過反投影在128x128x96矩陣中重構(gòu)所產(chǎn)生的列表模式數(shù)據(jù)。利用ASIProTM軟件(ConcordeMicrosystems,TN)進行所重構(gòu)的圖像的目的區(qū)域(ROI)分析，以確定腫瘤、其它器官/組織和左心室(LV)內(nèi)放射示蹤劑攝取(％ID/g)的平均值和標準差。數(shù)據(jù)的示蹤劑動力模建允許包括遞送、清除率和分布容積在內(nèi)的藥物動力學參數(shù)的估測。如所示，利用置于左心室上的目的區(qū)域測定動脈血輸入(作為血液活性的測定值)。從注射后24小時、48小時、72小時的時間點的靜態(tài)圖像獲得額外的數(shù)據(jù)。組織的熒光顯微術(shù)和放射自顯影。顯示空間尺度逐漸減小的光學成像技術(shù)(即全身熒光成像、熒光肉眼檢測和體內(nèi)熒光共聚焦激光掃描顯微術(shù))的組合用于在注射后72小時在完整的活動物中的腫瘤成像。使小鼠保持持續(xù)的異氟烷麻醉，由此能夠檢測和定位在放大倍率范圍內(nèi)自完整動物/器官水平至細胞水平的熒光信號。利用裝配有Cy5熒光濾波器組和CCD相機的熒光立體顯微鏡(Visen；NikonSMZ1500)進行全動物/肉眼成像。熒光共聚焦激光掃描顯微術(shù)的能力將得到開發(fā)。隨后安樂處死小鼠用于放射自顯影，從而以高分辨率遍及腫瘤體積對示蹤劑生物分布定位。切除腫瘤、快速冷凍、連續(xù)切片(10μ片)并載玻片封固，并將改變切片置于與避光盒內(nèi)的磷板接觸(達1周)。在剩余的連續(xù)切片上進行H&E染色。放射自顯影的結(jié)果將與PET成像數(shù)據(jù)和組織學結(jié)果相關(guān)聯(lián)?？梢钥蛇x擇地使用治療性放射性核素177Lu或90Y用于靶向放療。在不導致動物死亡且體重降低小于20％(MTD)的177Lu最高可能劑量的估測中，在荷載有腫瘤的裸鼠中進行劑量放大研究。評估基于文獻數(shù)值猜測為MTD(或接近MTD)的放射性藥物的劑量。實施例10.經(jīng)功能化以通過“鏈接化學”與配體和造影劑軛合的熒光納米顆粒包含用于隨后與配體(例如肽)和造影劑(例如放射性核素)軛合的通用官能團的納米顆粒的合成為了合成適合高特異活性放射性標記的納米顆粒-肽-螯合劑構(gòu)建體的陣列，可以使用“鏈接化學“法使納米顆粒表面功能化(圖17)。該方法基于由銅催化的作用于疊氮基與三鍵的環(huán)化加成。此類方法允許大量多功能性以開發(fā)多模態(tài)應用。納米顆粒合成和表征。按照圖14中的方案產(chǎn)生被共價連接的PEG基團。通過硅烷基團使PEG共價連接至納米顆粒。使用標準的化學途徑用于產(chǎn)生具有三鍵的功能化PEG。具有三鍵的納米顆粒的功能化。為了合成雙功能化的PEG，第一步采用經(jīng)過詳細研究的活化羧酸酯和脂肪胺的反應(圖18)?；蛘?，可以使用另一種具有合適的三鍵的胺，例如對-氨基苯乙炔。合成的第二步還依賴于熟知的軛合反應。與模型肽和螯合劑軛合的功能化納米顆粒的合成和物理化學表征功能化納米顆粒包含(A)去鐵胺B(DFO)，用于隨后用正電子放射體鋯-89(89Zr)的高特異活性放射性標記和(B)SSTR-靶向肽奧曲肽。具有疊氮鍵的DFO的合成。通過DFO-B與對-疊氮基苯甲酸的反應產(chǎn)生具有疊氮鍵的DFO(圖19)并進行純化?！版溄踊瘜W”反應是在室溫下的1,3-雙極環(huán)加成并且條件常被稱為“Huigsen條件”。雖然通?？梢栽谑覝叵略谝掖贾型瓿煞磻訜岱磻赡芤彩乔‘?shù)?。催化劑通常為Cu(I)Br，但可選擇的催化劑包括Cu(I)I或Cu(II)SO4(和還原劑)。Knoretal.Synthesisofnovel1,4,7,10-tetraazacyclodecane-1,4,7,10-tetraaceticacid(DOTA)derivativesforchemoselectiveattachmenttounprotectedpolyfunctionalizedcompounds.Chemistry,2007；13:6082-90。鏈接反應也可以在沒有任何催化劑的情況下進行?；蛘?，可以將DFO-B中的NH3+基團直接轉(zhuǎn)換成疊氮基。利用疊氮基進行Tyr3-奧曲肽的合成。在肽合成儀上進行Tyr3-奧曲肽(圖20A)的固相肽合成(SPPS)。簡而言之，合成涉及如之前描述用于該肽的Fmoc(9-芴甲氧羰酰氯)法。簡而言之，試驗方案需要25μmol隨后被Fmoc保護的氨基酸，所述氨基酸被1-羥基苯并三唑(HOBt)和2-(1-H苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基亞胺基六氟磷酸酯(HBTU)的組合活化。除非另有說明，否則可商購受Fmoc保護的氨基酸，由Perkin-Elmer(Norwalk,CT)獲得預填充的氨基酸，然而不可獲得預填充形式的那些，例如Daminoacids和Fmoc-Cys(Acm)由BACHEMBioscience,Inc.(KingofPrussia,PA)或Novabiochem(SanDiego,CA)提供。通過將含疊氮基的酸偶聯(lián)至肽的N-末端而將疊氮基(用于“鏈接”化學)引入至肽骨架，而肽仍然受保護且與樹脂連接(圖20B)。功能化納米顆粒的合成。接下來的步驟是將具有疊氮鍵的DFO與具有疊氮鍵的Tyr3-奧曲肽兩者(圖21A和B)軛合至納米顆粒?！版溄踊瘜W”是高選擇性、定量性的且能夠非?？焖龠M行并使用溫和條件。來自DFO和Tyr3-奧曲肽的組合疊氮基的數(shù)量將受到控制而從不超過可獲得的三鍵數(shù)量；三鍵通常<5％過量。功能化納米顆粒表征。通過利用89Zr(或68Ga)的標準同位素稀釋試驗測定每納米顆粒的DFO螯合肽的平均數(shù)量。在回旋加速器上產(chǎn)生89Zr并進行純化。簡而言之，將10濃度的89Zr-草酸鹽加入至含已知量的DFO-衍生納米顆粒的溶液中。在30分鐘的室溫溫育后，將溶液點至涂布二氧化硅凝膠的玻璃板上，在1:110％乙酸銨-甲醇(含EDTA)中顯影，并通過放射性TLC分析。雖然89Zr-DFO衍生的納米顆粒將保持在原點，但非特異結(jié)合結(jié)合至EDTA的89Zr將遷移。將百分標記效率繪作添加至反應混合物的89Zr總納摩爾數(shù)的函數(shù)。然后可以從該曲線的拐點確定與納米顆粒所連接的螯合劑數(shù)量。通過測定Tyr3-奧曲肽的二硫鍵而確定每個納米顆粒的Tyr3-奧曲肽的平均數(shù)。簡而言之，可以通過過量的亞硫酸鈉在pH9.5和室溫下定量切割Tyr3-奧曲肽的二硫鍵?？梢允褂肈TNB或Elman試劑用于通過吸光度測定法定量蛋白中的巰基。其易于與巰基形成混合的二硫化物，從而釋放發(fā)色團5-巰基-2-硝基苯甲酸(最大吸光度為410nm)。僅易于接觸該水溶試劑的蛋白巰基才被修飾?；蛘撸梢允褂脕碜訧nvitrogen的Measure-iTTM巰基測定試劑盒。在合適的腫瘤模型中的體內(nèi)測試利用具有AR42J腫瘤的雌性SCID小鼠產(chǎn)生皮下異種移植物模型。簡而言之，向雌性SCID小鼠的側(cè)腹中皮下注射AR42J細胞(1×107)。使腫瘤生長10-12天至尺寸為0.5-0.9cm3。預期89Zr對DFO-納米顆粒的放射性標記在室溫下進行<15分鐘。通過加入EDTA和隨后的凝膠過濾步驟除去非特異性結(jié)合的89Zr。受體結(jié)合試驗。利用從AR42J腫瘤獲得的膜上的89Zr-DFO-納米顆粒進行受體結(jié)合試驗。通過高純度天然草酸鋯分別與DFO-奧曲肽和DFO-納米顆粒的反應制備競爭性配體natZr-DFO-納米顆粒和natZr-DFO-奧曲肽。通過HPLC證明終產(chǎn)物的純度。利用MilliporeMultiScreen測試系統(tǒng)(Bedford,MA)，根據(jù)之前公開的方法測定IC50值。利用程序GraFit(ErithacusSoftware,U.K.)、LIGAND(NIH,Bethesda,MD)和GraphPadPRISMTM(SanDiego,CA)進行數(shù)據(jù)分析。體外試驗利用細胞分離溶液(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)從單層收集AR42J細胞并以2×106細胞/mL的濃度重懸在新鮮的DMEM培養(yǎng)基中。將約0.3pmol的89Zr-DFO-納米顆粒的試樣添加至10mL細胞中，在持續(xù)攪動下在37℃溫育。在1、5、15、30、45、60和120分鐘，一式三份地除去200μL試樣并置于冰上。通過離心立即分離細胞，并計算化合物至細胞中的攝?。?。生物分布向各個荷載有可觸知的AR42J陽性腫瘤的小鼠靜脈注射少量89Zr-DFO-納米顆粒(約10μCi,0.20μg)。在所選擇的注射后的時間點(1、4、24、48、72小時；n＝4-5)處死動物，移除期望的組織，稱重并計算放射性累積。在注射后1小時研究兩個額外的對照組：(A)用天然放射性標記肽89Zr-DFO-奧曲肽(約10μCi,0.20μg)注射小鼠，和(B)用Tyr3-奧曲肽阻斷(150μg)預注射小鼠以證明89Zr-DFO-納米顆粒的受體介導的累積。對包括血液、肺、肝、脾、腎、腎上腺(STTR陽性)肌肉、皮膚、脂肪、心臟、腦、骨、胰腺(STTR陽性)、小腸、大腸和AR42J腫瘤在內(nèi)的組織進行計數(shù)。通過與經(jīng)稱重、計數(shù)的標準溶液比較來計算每克的百分注射劑量(％ID/g)和每器官的百分注射劑量(％ID/器官)。體內(nèi)NIRF成像。在0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72小時利用MaestroTM體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)(CRI,Woburn,MA)進行系列成像。在72小時，安樂處死小鼠，并切除主要組織/器官、稱重并置于6孔板中用于離體成像。采用光譜解混算法在腫瘤、所選擇的組織和參考注射液上利用目的區(qū)域(ROI)分析熒光發(fā)射，以除去自動熒光。熒光強度和標準差(SD)是5只動物的組的平均數(shù)。用組織平均熒光強度除以注射液數(shù)值允許要在各個組織/器官之間進行的針對各個注射的納米顆粒軛合物的比較。小動物體內(nèi)PET成像。在顯微-FOCUSTM系統(tǒng)(ConcordeMicrosystemsInc,KnoxvilleTN)上進行小動物PET成像。用1-2％異氟烷麻醉荷載有AR42J腫瘤的小鼠(n＝5/組)，置于仰臥位置，并固定在傳統(tǒng)制備的籠子(custompreparedcradle)中。通過尾靜脈使小鼠接受200μCi的89Zr-DFO-奧曲肽-納米顆粒絡合物，并逐側(cè)成像。通過在1小時時間框架內(nèi)連續(xù)從注射時間獲取多個連續(xù)的10分鐘掃描，對動物進行最初成像，然后是在注射后2、4、24、48和72小時的10分鐘靜態(tài)數(shù)據(jù)獲取。從在腫瘤和感興趣的其它器官上所繪的目的區(qū)域(ROI)產(chǎn)生標準攝取值(SUV)。與提供高分辨率的X-射線CT解剖學圖像的microCAT-II相機(ImtekInc.,Knoxville,TN)的組合將實現(xiàn)PET圖像的共配準。利用標志點配準技術(shù)(landmarkregistrationtechnique)和AMIRA圖像顯示軟件(AMIRA,TGSInc,SanDiego,CA)實現(xiàn)顯微CT和PET圖像間的圖像配準。從由直接與動物床相連的基準提供的標志點的顯微CT圖像的嚴格轉(zhuǎn)化進行配準方法。藥物代謝動力學測定。生物分布和動態(tài)PET數(shù)據(jù)將提供89Zr-DFO-奧曲肽-納米顆粒在組織內(nèi)的瞬時濃度，其將可以表征所述試劑的藥物代謝動力學參數(shù)。離體組織的熒光顯微術(shù)和放射自顯影術(shù)。在冷凍切片上進行納米顆粒軛合物在組織中的定位。微PET成像可使本發(fā)明人完整地評價在腫瘤和其它非靶向組織中的整體分布。在成像實驗的急性階段之后，在腫瘤上進行放射自顯影術(shù)，并且該數(shù)據(jù)將與PET成像和組織學結(jié)果兩者相關(guān)聯(lián)。制備連續(xù)切片(約10μm)，以改變用于放射自顯影術(shù)和組織學分析的切片。還通過多通道熒光顯微術(shù)在NIR通道中分析這些切片。實施例11.顆粒內(nèi)化研究本研究的目標是評估本發(fā)明的納米顆粒的結(jié)合和內(nèi)化以估測其在亞細胞器和胞外分泌中的定位。這將有助于研究具有不同靶向部分和連接治療劑的功能化納米顆粒的結(jié)局。例如，診斷性納米顆粒(例如非靶向的涂布PEG的納米顆粒和涂布cRGD-PEG的納米顆粒)和治療性納米顆粒(例如與用于放療的碘連接的cRGD-PEG-納米顆粒，所述碘與酪氨酸激酶抑制劑連接或者與諸如紫杉醇的化療藥連接)兩者。材料和方法內(nèi)化/攝取研究。進行內(nèi)化試驗和共定位研究用于鑒定特定攝取途徑。將包括人M21細胞和小鼠B16細胞在內(nèi)的黑素瘤細胞(約2x105細胞/孔)鋪在8孔腔室載玻片(1.7cm2/孔)或具有12mm圓形蓋玻片的24孔板(1.9cm2/孔)中并在37℃溫育過夜。為了監(jiān)測靶向納米顆粒的內(nèi)化，將細胞與cRGD-PEG點(0.075mg/ml)在37℃一起溫育3小時。為了除去培養(yǎng)基中的未結(jié)合顆粒，用PBS洗滌細胞2次。在裝配有HCXPLAPO:63x1.2NAWaterDICD物鏡的Leica倒置共聚焦顯微鏡(LeicaTCSSP2AOBS)上進行共聚焦顯微術(shù)，以評價cRGD-PEG-點與細胞器特異性染料或抗體的共定位。利用ImageJ軟件1.37版(NIHImage；http://rsbweb.nih.gov/ij/)分析圖像。共定位實驗/結(jié)合染料的標記物。為了鑒定參與C點內(nèi)化的內(nèi)吞小泡，利用結(jié)合染料的標記物在活細胞中進行共定位實驗。用納米顆粒和不同的染料溫育細胞。染料包括：100nM溶酶示蹤紅溫育30分鐘以標記沿內(nèi)體途徑的酸性細胞器；2μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白Alexa488軛合物，以標記再循環(huán)和分選內(nèi)體(網(wǎng)格蛋白依賴性途徑)；1mg/mL70kDa葡聚糖-FITC軛合物在37℃溫育30分鐘，以標記大胞飲體。共定位/細胞器特異性抗體。利用高爾基體和溶酶體的已知標記物進行免疫細胞化學。對于高爾基體，利用Giantin(Abcam,兔多克隆抗體,1:2000)用于人細胞；GM-130(BDPharmingen,1μg/ml)用于小鼠細胞。對于溶酶體，使用LC3B(CellSignaling,兔多克隆抗體,0.5μg/ml)。對于Giantin或LC3B染色，在含10％正常山羊血清/0.2％BSA的PBS中封閉30分鐘。一抗溫育(兔多克隆抗-Giantin抗體，Abcam目錄號#ab24586,1:2000稀釋)或LC3B(CellSignaling,C#2775,0.5ug/ml)進行3小時，然后是與以1:200稀釋的生物素化山羊抗兔IgG(Vectorlabs,cat#:PK6101)一起溫育60分鐘。根據(jù)廠商的說明，利用二抗封閉劑BlockerD,鏈霉親和素-HRPD(VentanaMedicalSystems)和DAB檢測試劑盒(VentanaMedicalSystems)進行檢測。對于GM-130染色，將細胞在含小鼠IgG封閉劑(VectorLabs,Cat#:MKB-2213)的PBS中封閉30分鐘。一抗溫育(單克隆抗GM130抗體,BDPharmingen；Cat#610822,濃度為1ug/mL)進行3小時，然后是60分鐘的以1:200稀釋的生物素化小鼠二抗(VectorLabs,MOMKitBMK-2202)的溫育。根據(jù)廠商的說明，利用二抗封閉劑BlockerD,鏈霉親和素-HRPD(VentanaMedicalSystems)和DAB檢測試劑盒(VentanaMedicalSystems)進行檢測。對于溫度依賴性研究，用cRGD-PEG-納米顆粒在4℃、25℃和37℃溫育納米顆粒，以評價表面結(jié)合顆粒與內(nèi)化顆粒的商(fraction)。對于胞外分泌研究，溫育納米顆粒(0.075mg/ml)4小時，用PBS洗滌腔室載玻片，然后加入新鮮培養(yǎng)基。在0.5、1.0、1.5、2.5、4.5、8.0小時的時間間隔，洗滌細胞、用胰蛋白酶處理并通過熒光計計算細胞和培養(yǎng)基的熒光信號。在劑量響應研究中，以一個范圍的濃度和溫育時間溫育細胞，并利用流式細胞術(shù)進行測定。在活力研究中，在溫育前和溫育后利用臺盼藍排除實驗測定細胞活力，以評價毒性。在延時研究中，在將細胞與納米顆粒軛合物在不同溫育溫度(4℃、25℃和37℃)下一起溫育后，在12小時時間內(nèi)以20分鐘的間隔利用倒置共聚焦顯微鏡研究活細胞內(nèi)納米顆粒內(nèi)化的機制。討論發(fā)現(xiàn)cRGD-PEG-點和PEG-點與溶酶示蹤紅共定位于M21和B16細胞中，這意味著在胞內(nèi)體途徑中的攝取(圖22)。數(shù)據(jù)表明，這些顆粒與轉(zhuǎn)鐵蛋白和葡聚糖的強共定位。不論表面功能性和總電荷，所研究的納米顆粒(流體動力學直徑為6-7nm)似乎遵循相同途徑。兩種細胞類型中的延時成像證明了功能化納米顆粒在少部分所鋪細胞中的內(nèi)化。顆粒被最終遞送至核周區(qū)內(nèi)的小泡結(jié)構(gòu)中。預期利用Giantin(或GM-130)的共定位試驗在高爾基體中不顯示納米顆粒熒光信號。本發(fā)明的范圍不限于以上具體顯示和描述的內(nèi)容。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，對于所描述的材料、構(gòu)型、結(jié)構(gòu)和尺寸的實例而言，存在合適的替代。在本發(fā)明的說明書中引用并討論了包括專利和多個出版物在內(nèi)的多個參考文獻。提供對此類參考文獻的引用和討論僅僅是為了闡明本發(fā)明的內(nèi)容，而不是承認任何參考文獻都是本文描述的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。本說明書中引用和討論的所有參考文獻都通過引用整體引入。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到對本文所描述的內(nèi)容的變化、修飾和其他實施，而這些并不背離本發(fā)明的精神和范圍。雖然已經(jīng)顯示并描述了本發(fā)明的某些實施方式，但進行改變和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。上述描述和附圖所示的事物僅例示本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限制。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3