本發(fā)明屬于納米藥物輸送技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含難溶性中草藥有效成分燈盞乙素苷元的脂質(zhì)體及其制備方法。

背景技術(shù)：

燈盞花，又名燈盞細(xì)辛、地頂草、雙葵花，是菊科植物短葶飛蓬的干燥全草，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)。燈盞花性寒、微苦、甘溫辛，具有消炎止痛、祛風(fēng)除濕、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)的功效，可用于治療心腦血管疾病。最早收錄于《滇南本草》。燈盞花作為一種常見中草藥之一在民間廣為流傳，常見其在苗藥、藏藥、壯藥、白藥等的處方中，其還可以用于風(fēng)濕疼痛，癱瘓等疾病的治療。1977年收納于《中國(guó)藥典》一部，目前，已上市的燈盞花注射液主要用于心腦血管系統(tǒng)疾病的治療。

燈盞乙素為燈盞花的主要有效成分，為多羥基黃酮苷類化合物。研究表明：燈盞乙素在體內(nèi)主要以燈盞乙素苷元的形式吸收。燈盞乙素苷元具有擴(kuò)張血管、抗凝血、以及對(duì)肝、腎功能的保護(hù)作用等；有研究表明燈盞乙素苷元可以跨過血腦屏障，在腦組織中具有較高的濃度，有利于其對(duì)心腦血管疾病的治療。

但是，燈盞乙素苷元存在以下幾點(diǎn)問題：1.燈盞乙素苷元的水溶性極低(約1μg/ml)；2.燈盞乙素苷元穩(wěn)定性較差；溶液的pH值、溫度、體內(nèi)各種酶等因素對(duì)燈盞乙素苷元的穩(wěn)定性均有顯著的影響；3.燈盞乙素苷元蛋白結(jié)合率較高，體內(nèi)半衰期較短。

因此，需要尋找一種適于燈盞乙素苷元的藥物輸送方式。

由于燈盞乙素苷元自身水溶性極低且化學(xué)穩(wěn)定性差，目前尚未有燈盞乙素苷元制劑的研究報(bào)道。而現(xiàn)有的研究和專利申請(qǐng)主要集中在通過化學(xué)修飾，制備燈盞乙素苷元衍生物或前藥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑及其制備與應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑，包括：燈盞乙素苷元和脂質(zhì)體載體，所述脂質(zhì)體具有呈雙分子層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體膜。

優(yōu)選地，所述燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑還包括：位于脂質(zhì)體膜內(nèi)的內(nèi)水相和位于脂質(zhì)體膜外的外水相，所述燈盞乙素苷元被包封于所述內(nèi)水相中。

優(yōu)選地，所述內(nèi)水相包括：醋酸鹽水溶液，所述外水相包括生理等滲溶液。

優(yōu)選地，所述醋酸鹽選自醋酸鈉或醋酸鈣。

優(yōu)選地，所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度是50mM～500mM。更優(yōu)選是150mM～500mM。

優(yōu)選地，所述醋酸鹽水溶液的pH值范圍是5.0～9.0。更優(yōu)選是6.0～8.0。

優(yōu)選地，所述內(nèi)水相中還包括環(huán)糊精。所述環(huán)糊精優(yōu)選為β-環(huán)糊精，更優(yōu)選為羥丙基-β-環(huán)糊精。

優(yōu)選地，所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍大于等于10％(w/w)。更優(yōu)選大于等于20％(w/w)。

優(yōu)選地，所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍小于等于40％(w/w)。

優(yōu)選地，所述外水相的pH范圍是5.0～8.0。更優(yōu)選是6.0～7.0。

優(yōu)選地，所述生理等滲溶液選自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化鈉水溶液。

本發(fā)明第二方面，提供了前述燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的制備方法，包括：

(1)制備內(nèi)水相和外水相均含有醋酸鹽水溶液的空白脂質(zhì)體；

(2)制備內(nèi)水相含有醋酸鹽水溶液、外水相含有生理等滲溶液的空白脂質(zhì)體；

(3)將步驟(2)所得空白脂質(zhì)體與燈盞乙素苷元溶液混合，孵育，去除游離燈盞乙素苷元，獲得燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑。

優(yōu)選地，所述醋酸鹽是醋酸鈉或醋酸鈣。

優(yōu)選地，所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度是50mM～500mM。更優(yōu)選是150mM～500mM。

優(yōu)選地，所述醋酸鹽水溶液的pH值范圍可以是5.0～9.0。更優(yōu)選是6.0～8.0。

優(yōu)選地，所述內(nèi)水相中還還含有環(huán)糊精。所述環(huán)糊精優(yōu)選是β-環(huán)糊精。更優(yōu)選是羥丙基-β-環(huán)糊精。

優(yōu)選地，所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍大于等于10％(w/w)。更優(yōu)選大于等于20％(w/w)。

優(yōu)選地，所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍小于等于40％(w/w)。

優(yōu)選地，所述外水相的pH范圍可以是5.0～8.0。更優(yōu)選是6.0～7.0。

優(yōu)選地，所述生理等滲溶液選自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化鈉水溶液。

優(yōu)選地，所述燈盞乙素苷元溶液中，燈盞乙素苷元的濃度大于等于0.1mg/ml。

優(yōu)選地，所述燈盞乙素苷元溶液包括燈盞乙素苷元和用于增加燈盞乙素苷元溶解度的助溶劑和/或弱堿性鹽。

優(yōu)選地，所述助溶劑選自聚乙二醇、丙二醇或環(huán)糊精。

優(yōu)選地，所述聚乙二醇的分子量是300～400。

優(yōu)選地，所述環(huán)糊精選自甲基-β-環(huán)糊精，羥乙基-β-環(huán)糊精，羥丙基-β-環(huán)糊精，烯丙基-β-環(huán)糊精中的任一種或多種的組合。

優(yōu)選地，所述弱堿性鹽選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或碳酸鉀中的任一種或多種的組合。

本發(fā)明的第三方面，提供一種由前述制備方法獲得的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑。

本發(fā)明的第四方面，提供了前述燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療缺血性腦血管疾病、腦栓塞、或腦出血恢復(fù)期癱瘓。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑顯著提高藥物濃度，使得藥物濃度高達(dá)1.5mg/ml，可臨床應(yīng)用。本發(fā)明利用內(nèi)外水相的pH與醋酸鹽梯度，促進(jìn)燈盞乙素苷元進(jìn)入內(nèi)水相，燈盞乙素苷元以分子、離子等形式在內(nèi)水相中形成穩(wěn)定的晶型或無定型結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)燈盞乙素苷元的穩(wěn)定包封(包封率均在80％以上)。

(2)本發(fā)明利用脂質(zhì)體長(zhǎng)循環(huán)、緩控釋的特點(diǎn)，延長(zhǎng)燈盞乙素苷元在體內(nèi)的半衰期至19.41±3.68hr(終末半衰期)，實(shí)現(xiàn)維持燈盞乙素苷元血藥濃度穩(wěn)定的目標(biāo)。

(3)本發(fā)明利用脂質(zhì)體具有的相對(duì)封閉、穩(wěn)定的內(nèi)水相，實(shí)現(xiàn)制劑中燈盞乙素苷元的長(zhǎng)期穩(wěn)定儲(chǔ)存。根據(jù)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究，本發(fā)明所提供的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體具有良好形態(tài)與包封率，包封率高達(dá)80％以上。

附圖說明

圖1：燈盞乙素苷元甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2：內(nèi)水相中HPCD的含量對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體在白蛋白溶液中釋放速率的影響。

圖3：不同內(nèi)水相燈盞乙素苷元脂質(zhì)體儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

圖4：燈盞乙素苷元原料藥(a，引用于唐浩的碩士論文)與自制燈盞乙素苷元脂質(zhì)體(b)靜脈給藥后燈盞乙素苷元血藥濃度-時(shí)間曲線圖；縱坐標(biāo)單位為ng/ml，橫坐標(biāo)單位為小時(shí)。

具體實(shí)施方式

燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑

本發(fā)明的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑，包括：燈盞乙素苷元和脂質(zhì)體載體。

所述脂質(zhì)體具有呈雙分子層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體膜。所述脂質(zhì)體膜類似于生物膜。

所述脂質(zhì)體的載體材料含有磷脂和膽固醇。本發(fā)明對(duì)于脂質(zhì)體的載體材料及含量并無特別的限制，只要能夠形成穩(wěn)定的、無泄漏的呈雙分子層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體膜即可。一般情況下，只要磷脂和膽固醇的摩爾比例范圍在(80～50)：(20～50)(磷脂：膽固醇)時(shí)，即可形成穩(wěn)定的、無泄漏的呈雙分子層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體膜。這些均在本領(lǐng)域技術(shù)人員所能知曉的知識(shí)范圍內(nèi)。

本發(fā)明實(shí)施例中列舉了：所述磷脂選用氫化豆磷脂(HSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。但是，并不僅限于此。

所述燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑還包括：位于脂質(zhì)體膜內(nèi)的內(nèi)水相和位于脂質(zhì)體膜外的外水相。所述燈盞乙素苷元被包封于所述內(nèi)水相中。

脂質(zhì)體膜內(nèi)的內(nèi)水相和膜外的外水相之間存在醋酸鹽梯度。

所述存在醋酸鹽梯度是指存在醋酸鹽離子濃度與pH的差異。

所述內(nèi)水相包括醋酸鹽水溶液，所述外水相包括生理等滲溶液。

所述醋酸鹽可以是醋酸鈉或醋酸鈣。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是大于等于50mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是大于等于150mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是大于等于300mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是大于等于500mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是50～500mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是50～300mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是50～150mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是150～500mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是150～300mM。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是300～500mM。

所述醋酸鹽水溶液的pH值范圍可以是5.0～9.0。所述醋酸鹽水溶液的pH值范圍可以是6.0～8.0。

本發(fā)明一實(shí)施例中，所述醋酸鹽水溶液的pH值范圍選用7.4，但是并不限于此，只要所述醋酸鹽水溶液的pH值在5.0～9.0的范圍內(nèi)即可。

所述內(nèi)水相中還含有環(huán)糊精。所述環(huán)糊精可以是β-環(huán)糊精。本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述環(huán)糊精選用羥丙基-β-環(huán)糊精(簡(jiǎn)稱HPCD)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是大于等于10％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是大于等于20％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是小于等于40％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是10～40％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是10～20％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是20～40％(w/w)。

所述外水相的pH范圍可以是5.0～8.0。所述外水相的pH范圍還可以是6.0～7.0。

所述生理等滲溶液選自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化鈉水溶液。

％(w/w)是指質(zhì)量質(zhì)量百分濃度，亦即每100g的溶液中含有多少克的溶質(zhì)。

％(w/v)是指質(zhì)量體積百分濃度，亦即每100ml的溶液中含有多少克的溶質(zhì)。

所述燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑可以為注射給藥制劑。

所述注射給藥制劑可選自皮下注射劑型、靜脈注射劑型、肌肉注射劑型或盆腔注射劑型。

燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑的制備方法

本發(fā)明的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑的制備方法，包括：

(1)制備內(nèi)水相和外水相均含有醋酸鹽水溶液的空白脂質(zhì)體；

(2)制備內(nèi)水相含有醋酸鹽水溶液、外水相含有生理等滲溶液的空白脂質(zhì)體；

(3)將步驟(2)所得空白脂質(zhì)體與燈盞乙素苷元溶液混合，孵育，去除游離燈盞乙素苷元，獲得燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑。

所述醋酸鹽可以是醋酸鈉或醋酸鈣。

所述醋酸鹽水溶液中醋酸鹽的濃度可以是50mM～500mM。也可以是150mM～500mM。

所述醋酸鹽水溶液的pH值范圍可以是5.0～9.0。所述醋酸鹽水溶液的pH值范圍可以是6.0～8.0。

本發(fā)明一實(shí)施例中，所述醋酸鹽水溶液的pH值范圍選用7.4，但是并不限于此，只要所述醋酸鹽水溶液的pH值在5.0～9.0的范圍內(nèi)即可。

所述內(nèi)水相中還含有環(huán)糊精。所述環(huán)糊精可以是β-環(huán)糊精。本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述環(huán)糊精選用羥丙基-β-環(huán)糊精(簡(jiǎn)稱HPCD)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是大于等于10％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是大于等于20％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是小于等于40％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是10～40％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是10～20％(w/w)。

所述內(nèi)水相中環(huán)糊精的濃度范圍可以是20～40％(w/w)。

所述外水相的pH范圍可以是5.0～8.0。所述外水相的pH范圍還可以是6.0～7.0。

所述生理等滲溶液選自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化鈉水溶液。

％(w/w)是指質(zhì)量質(zhì)量百分濃度，亦即每100g的溶液中含有多少克的溶質(zhì)。

％(w/v)是指質(zhì)量體積百分濃度，亦即每100ml的溶液中含有多少克的溶質(zhì)。

所述燈盞乙素苷元溶液中，燈盞乙素苷元的濃度在0.1mg/ml以上，例如可以是0.1～2mg/ml。采用所述燈盞乙素苷元溶液，用于主動(dòng)載藥法制備燈盞乙素苷元脂質(zhì)體脂質(zhì)體，能夠提高外水相中燈盞乙素苷元的濃度，使內(nèi)外水相之間具備一定的藥物濃度梯度，便于燈盞乙素苷元沿濃度梯度從外水相擴(kuò)散進(jìn)入內(nèi)水相。

所述燈盞乙素苷元溶液包括燈盞乙素苷元和用于增加燈盞乙素苷元溶解度的助溶劑和/或弱堿性鹽。

所述助溶劑可以是聚乙二醇、丙二醇或環(huán)糊精。

所述聚乙二醇的分子量可以是300～400。所述環(huán)糊精可以是β-環(huán)糊精。所述β-環(huán)糊精可以是羥丙基-β-環(huán)糊精。

所述弱堿性鹽可以是碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或碳酸鉀中的任一種或多種的組合。

本發(fā)明利用燈盞乙素苷元較好的親脂性(logD為2.54(chemspider))，可以以分子形式通過磷脂雙分子層，進(jìn)入內(nèi)水相，并在內(nèi)水相較高的pH條件下，電離為燈盞乙素苷元離子。由于磷脂膜對(duì)離子基本無通透性，因此可以利用脂質(zhì)體內(nèi)外水相的pH梯度，達(dá)到穩(wěn)定包封的燈盞乙素苷元的目的。同時(shí)，將燈盞乙素苷元包裹于脂質(zhì)體內(nèi)水相，也有利于提高其在儲(chǔ)存過程中的化學(xué)穩(wěn)定性。

燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑的用途

上述燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑可用于制備藥物，所述藥物用于治療缺血性腦血管疾病、腦栓塞、或腦出血恢復(fù)期癱瘓。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。

實(shí)施例1不同助溶劑對(duì)燈盞乙素苷元的增溶作用

一、碳酸氫鈉、PEG300、PEG400、丙二醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，羥丙基-β-環(huán)糊精(HPCD)購(gòu)自士峰生物有限公司。

二、不同助溶劑對(duì)燈盞乙素苷元的溶解度的影響：

(1)精密稱量4.9983g碳酸氫鈉溶解于100ml 18.2MΩ水中，得到含量5％的碳酸氫鈉水溶液；精密稱量1.2034mg燈盞乙素苷元溶解于1ml 5％的碳酸氫鈉水溶液中。

(2)分別精密稱量9.8174mg，9.9035mg，9.8665mg燈盞乙素苷元，分別溶解于1mgPEG300、PEG400、丙二醇溶液中，渦旋3min，超聲30min，燈盞乙素苷元充分溶解， 得到燈盞乙素苷元混懸液，將藥物混懸液與18.2MΩ水按照質(zhì)量比1:9，2:8，3:7混合，渦旋3min，得到PEG300、PEG400、丙二醇質(zhì)量百分含量分別為10％、20％和30％的藥物溶液。

(3)精密稱量0.1000gHPCD溶解于18.2MΩ水中，定容至1.0006g，得到10％HPCD水溶液；精密稱量0.2052gHPCD溶解于18.2MΩ水中，定容至1.0454g，得到20％HPCD水溶液；精密稱量0.3026gHPCD溶解于18.2MΩ水中，定容至1.0523g，得到30％HPCD水溶液；精密稱量0.4013gHPCD溶解于18.2MΩ水中，定容至1.0366g，得到40％HPCD水溶液；分別精密稱量9.9113mg，9.9769mg，9.9045mg，9.9217mg燈盞乙素苷元分別置于10％、20％、30％、40％HPCD水溶液中，渦旋3min，得到10％、20％、30％、40％HPCD水溶液的藥物溶液。

(4)將上述14種藥物溶液37℃1000rpm震蕩24h。

(5)將步驟(4)所得樣品，12000g離心15min，取上清，用甲醇稀釋十倍，高效液相(HPLC)進(jìn)樣10μl，考察燈盞乙素苷元在不同增溶劑中的溶解度。

HPLC分析條件：

ODS柱(Agilent，5μm，250×4.6mm)；檢測(cè)溫度為20攝氏度；檢測(cè)波長(zhǎng)為338nm；流速為0.8ml/min；流動(dòng)相為0.1％甲酸的水溶液/0.1％甲酸的甲醇溶液(體積比為45:55)。

三、燈盞乙素苷元甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

(1)精密稱量12.5003mg燈盞乙素苷元溶解于25ml容量瓶中得到濃度為0.5000mg/ml的燈盞乙素苷元甲醇溶解；

(2)按照燈盞乙素苷元甲醇溶液與甲醇溶液體積比1:1混合，梯度稀釋，得到濃度為0.25mg/ml、0.125mg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml一系列燈盞乙素苷元甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)曲并考察回收率。

如圖1所示，燈盞乙素苷元甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝26.07x-22.29(n＝7)，R²＝0.999，回收率均在95％～105％，擬合良好。

表1燈盞乙素苷元在不同助溶劑中溶解度(單位：mg/ml)

燈盞乙素苷元在5％碳酸氫鈉溶解度為0.2mg/ml。

由表1可知，上述五種助溶劑對(duì)燈盞乙素苷元均具有一定的增溶作用，并且隨著助溶劑濃度的提高，燈盞乙素苷元溶解度越高。其中，HPCD增溶作用最明顯，為最佳助溶劑。

一般情況下，采用主動(dòng)載藥法制備燈盞乙素苷元脂質(zhì)體時(shí)，保持外水相中燈盞乙素苷元的濃度在0.1mg/ml以上，例如0.1～2mg/ml，能夠使內(nèi)外水相之間具備足夠的藥物濃度梯度，便于燈盞乙素苷元沿濃度梯度從外水相擴(kuò)散進(jìn)入內(nèi)水相。

實(shí)施例2燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的制備和表征

一、氫化豆磷脂(HSPC)購(gòu)自日本油脂公司(NOF Corporation)，聚乙二醇化磷脂：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及膽固醇購(gòu)自美國(guó)Avanti Polar Lipids公司；燈盞乙素苷元購(gòu)自南京景柱生物科技有限公司；醋酸鈣購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

二、燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的制備

(1)精密稱量479.9毫克膽固醇(CHOL，分子量386.7)，160.9毫克氫化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)和160.8毫克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，加入1毫升乙醇于70攝氏度水浴鍋中水浴以充分溶解混合，得到脂質(zhì)的乙醇混合溶液；

(2)在步驟(1)所得脂質(zhì)的乙醇混合溶液中加入10毫升含20％HPCD的pH 7.40 300mM醋酸鈣緩沖液，并置于70攝氏度中攪拌水浴30分鐘，充分水合脂質(zhì)，得到較均勻的脂質(zhì)體混懸液；

(3)利用脂質(zhì)體擠出儀，將步驟(2)所得脂質(zhì)體混懸液依次擠壓通過孔徑為200nm，100nm，80nm，50nm聚碳酯膜各10次，最終得到粒徑大小約為70nm左右，粒徑分布均勻的空白脂質(zhì)體；

(4)將步驟(3)所制得的脂質(zhì)體置于截留分子量為10000的透析袋中，以與人體等滲的10％的蔗糖水溶液作為透析介質(zhì)，樣品與透析介質(zhì)體積比為1:1000，透析期間換三次透析液，完全除去脂質(zhì)體外水相中的醋酸鈣，得到由10％的蔗糖組成的外水相，以及由醋酸鈣-HPCD溶液組成的內(nèi)水相，和磷脂雙分子層構(gòu)成空白脂質(zhì)體，脂質(zhì)體內(nèi)外水相具有一定的pH和醋 酸鈣濃度梯度。具體地，脂質(zhì)雙分子層內(nèi)水相為醋酸鈣-HPCD水溶液(pH7.40，醋酸鈣濃度300mM，HPCD質(zhì)量濃度20％)、脂質(zhì)雙分子層外水相為蔗糖水溶液(pH為6～7，質(zhì)量體積濃度10％)。

(5)將燈盞乙素苷元溶解于含有30％HPCD(w/w)的Hepes緩沖液(pH6.0，濃度為400mM)中，制備為燈盞乙素苷元溶液(藥物濃度為1.68mg/ml)；

(6)將步驟(4)中所得的內(nèi)水相為醋酸鈣-HPCD溶液的脂質(zhì)體混懸液，與步驟(5)所得的燈盞乙素苷元溶液，按照體積比為1:2混合，并于60攝氏度中孵育40分鐘，得到內(nèi)水相中包含燈盞乙素苷元的脂質(zhì)體混懸液；

(6)將脂質(zhì)體置于截留分子量為10000的透析袋中，以與人體等滲的10％的蔗糖水溶液作為透析介質(zhì)，透析法除去未進(jìn)入內(nèi)水相的燈盞乙素苷元，得到燈盞乙素苷元脂質(zhì)體。

三、燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的表征

1、燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的粒徑

將所得的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體，用18.2MΩ的水稀釋50倍，利用Zetasizer ZS90(馬爾文公司)對(duì)粒徑進(jìn)行分析。所述燈盞乙素苷元脂質(zhì)體載藥前后粒徑均在70nm左右，粒度分布(PDI)均小于0.1。

2、燈盞乙素苷元脂質(zhì)體包封率的檢測(cè)

將透析前后的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑用9倍體積甲醇溶解，12000g離心15min，取上清，HPLC法測(cè)定載藥量。

燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的包封率(EE)按以下公式計(jì)算：

$EE\%=\frac{M\mathrm{int}er}{Mtotal}\×100\%$

其中，M_inter是透析后的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑中燈盞乙素苷元的含量，即被脂質(zhì)體包封的燈盞乙素苷元的含量；M_total是透析前的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑中燈盞乙素苷元的含量，即燈盞乙素苷元的投藥量。結(jié)果表明，所述盞乙素苷元脂質(zhì)體的包封率約為95％。

實(shí)施例3主動(dòng)載藥時(shí)脂質(zhì)體內(nèi)水相的鹽的種類和濃度對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的包封率的影響

一、氯化鈉、醋酸鈉、醋酸鈣均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

二、考察內(nèi)水相中鹽的種類對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體載藥量與包封率的影響：

(1)精密稱量0.8780g氯化鈉，溶解于50ml 18.2MΩ中，得到濃度為300mM的氯化鈉水溶液；

(2)精密稱量2.0403g醋酸鈉，溶解于50ml 18.2MΩ中，得到濃度為300mM的醋酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(3)精密稱量2.3740g醋酸鈣，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為300mM的醋酸鈣水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(4)按照實(shí)施例2中的制備方法，分別制備以300mM的醋酸鈉、醋酸鈣以及氯化鈉為內(nèi)水相的脂質(zhì)體；

(5)按照實(shí)施例2所述的方法，對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行載藥，并考察載藥后脂質(zhì)體的包封率以及粒徑變化。

表2內(nèi)水相中鹽種類對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體包封率、粒徑及粒徑分布的影響

對(duì)比以不同鹽溶液作為內(nèi)水相脂質(zhì)體的包封率(表2)，氯化鈉脂質(zhì)體包封率最低，醋酸鈣脂質(zhì)體包封率最高。醋酸根離子與鈣離子對(duì)提高脂質(zhì)體包封率均具有顯著的影響，醋酸分子可以通過磷脂雙分子層由內(nèi)水相進(jìn)入外水相，維持內(nèi)外水相的pH梯度，促進(jìn)外水相中的燈盞乙素苷元分子持續(xù)進(jìn)入內(nèi)水相，并在內(nèi)水相中發(fā)生電離而帶電荷；鈣離子可以與進(jìn)入內(nèi)水相的、電離后的燈盞乙素苷元形成沉淀，增加藥物在脂質(zhì)體內(nèi)水相中的穩(wěn)定性。因此以醋酸鈉為內(nèi)水相的脂質(zhì)體包封率高于氯化鈉脂質(zhì)體，而以醋酸鈣為內(nèi)水相的脂質(zhì)體包封率最高。

三、考察內(nèi)水相中醋酸鈣的濃度以及HPCD的含量對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體載藥量與包封率的影響：

(1)精密稱量0.4003g醋酸鈣，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為50mM的醋酸鈣水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(2)精密稱量1.1855g醋酸鈣，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為150mM的醋酸鈣水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(3)精密稱量2.3740g醋酸鈣，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為300mM的醋酸鈣水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(4)精密稱量3.9604g醋酸鈣，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為500mM的醋酸鈣水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(5)精密稱量0.3409g醋酸鈉，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為50mM的醋酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(6)精密稱量1.0167g醋酸鈉，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為150mM的醋酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(5)精密稱量2.1206g醋酸鈉，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為300mM的醋酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(6)精密稱量3.3891g醋酸鈉，溶解于50ml 18.2MΩ水中，得到濃度為500mM的醋酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH為7.40；

(7)精密稱量1.1099g HPCD溶解于50mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至11.0008g，得到含10％HPCD的50mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

精密稱量2.0060g HPCD溶解于50mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至10.0073g，得到含20％HPCD的50mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

精密稱量3.9892g HPCD溶解于50mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至9.9033g，得到含40％HPCD的50mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

(8)精密稱量1.0189g HPCD溶解于150mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至10.0021g，得到含10％HPCD的150mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

精密稱量2.0119g HPCD溶解于150mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至10.1005g，得到含20％HPCD的150mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

精密稱量4.0078g HPCD溶解于150mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至9.9904g，得到含40％HPCD的150mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

(9)精密稱量1.0043g HPCD溶解于300mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至10.0176g，得到含10％HPCD的300mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

精密稱量1.9998g HPCD溶解于300mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至10.0074g，得到含20％HPCD的300mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

精密稱量4.1189g HPCD溶解于300mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至10.5982g，得到含40％HPCD的300mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

(10)精密稱量1.0013g HPCD溶解于500mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至9.9995g，得到含10％HPCD的500mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

精密稱量2.2008g HPCD溶解于500mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至11.0147g，得到含20％HPCD的500mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

精密稱量4.0127g HPCD溶解于500mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液中，定容至10.0256g，得到含40％HPCD的500mM pH 7.40醋酸鈣緩沖液；

(7)精密稱量1.0025g HPCD溶解于50mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.0911g，得到含10％HPCD的50mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

精密稱量2.1104g HPCD溶解于50mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.6739g，得到含20％HPCD的50mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

精密稱量4.0198g HPCD溶解于50mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.1051g，得到含40％HPCD的50mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

(10)精密稱量0.9930g HPCD溶解于150mM pH7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.0005g，得到含10％HPCD的150mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

精密稱量2.1114gHPCD溶解于150mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.4782g，得到含20％HPCD的150mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

精密稱量4.0379g HPCD溶解于150mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.10761g，得到含40％HPCD的150mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

(11)精密稱量1.0011g HPCD溶解于300mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.0053g，得到含10％HPCD的300mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

精密稱量2.0388g HPCD溶解于300mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.0527g，得到含20％HPCD的300mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

精密稱量4.0019g HPCD溶解于300mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.0152g，得到含40％HPCD的300mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

(12)精密稱量1.0122g HPCD溶解于500mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.6839g，得到含10％HPCD的500mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

精密稱量2.1008g HPCD溶解于500mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.2036g，得到含20％HPCD的500mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

精密稱量4.0390g HPCD溶解于500mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液中，定容至10.0033g，得到含40％HPCD的500mM pH 7.40醋酸鈉緩沖液；

(13)按照實(shí)施例2所述的方法，分別制備以HPCD含量0、10％、20％、40％的50mM、150mM、300mM、500Mm pH7.40醋酸鈣/醋酸鈉為內(nèi)水相的脂質(zhì)體；

(14)按照實(shí)施例2所述的方法，對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行載藥，并考察載藥后脂質(zhì)體的包封率以及粒徑變化。

表3內(nèi)水相中醋酸鹽種類與濃度和HPCD的濃度對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體包封率、粒徑及粒徑分布的影響

表3顯示了脂質(zhì)體內(nèi)水相鹽的種類和HPCD含量對(duì)于燈盞乙素苷元脂質(zhì)體包封率的影響。其中，以醋酸鈣為內(nèi)水相的脂質(zhì)體包封率高于以醋酸鈉為內(nèi)水相的脂質(zhì)體。該結(jié)果與表2結(jié)果一致。以醋酸鈉為內(nèi)水相的脂質(zhì)體，隨著內(nèi)水相中醋酸鈉的濃度和HPCD的含量增加，燈盞乙素苷元的包封率增加；以醋酸鈣為內(nèi)水相的脂質(zhì)體，當(dāng)內(nèi)水相中醋酸鈣濃度低于300mM時(shí)，隨著內(nèi)水相中醋酸鈣濃度的增大，燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的包封率逐漸增加；但僅在內(nèi)水相中醋酸鈣濃度較低時(shí)(小于等于150mM)，隨著內(nèi)水相中HPCD含量的增加，燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的包封率增加。當(dāng)內(nèi)水相中醋酸鈣濃度高于300mM時(shí)，燈盞乙素苷元脂質(zhì)體包封率較高(>90％)，并且進(jìn)一步增加內(nèi)水相中醋酸鈣濃度和HPCD的含量，并不能進(jìn)一步提高燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的包封率。

此外，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)醋酸鈣緩沖液或醋酸鈉緩沖液的pH范圍在5.0～9.0范圍內(nèi)均可。

實(shí)施例4燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性與體外釋放的考察

一、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自阿拉丁；Dowex樹脂購(gòu)自Sigma公司。

二、不同內(nèi)水相燈盞乙素苷元脂質(zhì)體體外釋放實(shí)驗(yàn)：

(1)精密稱量4.0291g牛血清白蛋白(BSA)粉末，溶解于100ml生理鹽水，配制40mg/ml白蛋白生理鹽水溶液(蛋白濃度與50％血漿中蛋白濃度相當(dāng))；

(2)取實(shí)施例3中制備的內(nèi)水相為pH 7.4 300mM醋酸鈣、pH 7.4 300mM醋酸鈣+10％HPCD、pH 7.4 300mM醋酸鈣+20％HPCD的脂質(zhì)體。

(3)用40mg/ml白蛋白生理鹽水溶液將脂質(zhì)體稀釋40倍，加入足量的Dowex樹脂吸附游離藥物，形成漏槽條件(具體可參考：Silverman,L.；Barenholz,Y.,In vitro experiments showing enhanced release of doxorubicin fromin the presence of ammonia may explain drug release at tumor site.Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine 2015,DOI:10.1016/j.nano.2015.06.007)，于37℃100rpm搖床中震蕩，考察燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的釋放曲線。

如圖2所示，內(nèi)水相中HPCD含量對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體在白蛋白溶液中釋放有顯著的影響。增加內(nèi)水相中HPCD的含量可以顯著減緩燈盞乙素苷元脂質(zhì)體在白蛋白溶液中的釋放。

三、不同內(nèi)水相燈盞乙素苷元脂質(zhì)體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：

取實(shí)施例3中制備的不同內(nèi)水相的脂質(zhì)體混懸液，透析后樣品置于4℃保存，分別于5d，12d，20d，40d取樣，測(cè)定脂質(zhì)體的包封率，考察脂質(zhì)體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

如圖3所示，內(nèi)水相中醋酸鈣的濃度與HPCD的含量對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性均有一定的影響：內(nèi)水相為300mM pH 7.40醋酸鈣+20％HPCD組脂質(zhì)體儲(chǔ)存穩(wěn)定性最佳。當(dāng)內(nèi)水相中醋酸鈣含量較低時(shí)(濃度低于300mM)，燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性隨內(nèi)水相中HPCD含量的增高而增大；當(dāng)內(nèi)水相中醋酸鈣含量較高時(shí)(濃度為300mM)，內(nèi)水相中HPCD含量對(duì)燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性無顯著影響。即適當(dāng)提高內(nèi)水相中醋酸鈣與HPCD含量有利于提高燈盞乙素苷元脂質(zhì)體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

實(shí)施例5燈盞乙素苷元脂質(zhì)體大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究

大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，參考唐浩的碩士論文(唐浩,燈盞乙素苷元抗腦缺血作用研究以及代謝穩(wěn)定衍生物的合成,碩士論文,南京中醫(yī)藥大學(xué),2014.)和鐘大放的文章(C.Y.Gao,X.Y.Chen,D.F.Zhong,Absorption and Disposition of Scutellarin in Rats:A Pharmacokinetic Explanation for the High Exposure of Its Isomeric Metabolite,Drug Metabolism and Disposition,39(2011)2034-2044)。

(1)取200g左右的SD大鼠6只(3只為雌性，3只為雄性)。

(2)取表3中制備的各種燈盞乙素苷元脂質(zhì)體制劑，尾靜脈給藥12.5mg/kg，分別于5min、15min，30min，1h，3h，5h，7h，9h，24h，48h，眼眶取血0.5ml；

(3)3000rpm離心15min，分離血漿，-20℃保存；

(4)取50μl含藥血漿，精密加入含10ng/ml黃芩素的甲醇150μl，旋渦3min，超聲5min，15000r/min離心10min，取出上清液100μl，加入0.1％甲酸水溶液100μL，渦旋混勻，15000r/min離心10min，取上清液至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣10μl，LC-MS法測(cè)量血漿中燈盞乙素苷元的含量。

LC-MS條件：

離子源:ESI源；檢測(cè)方式:正離子模式；采用MRM的方式定量：燈盞乙素苷元母離子 [M+H]⁺：m/z＝287.2，子離子：m/z＝123.0；

毛細(xì)管電壓為3.5kV；離子源溫度:150℃。

表4燈盞乙素苷元原料藥與燈盞乙素苷元脂質(zhì)體靜脈給藥藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(房室模型)

*引用自唐浩論文第二章，表2-2-4。

表5.不同內(nèi)水相的燈盞乙素苷元脂質(zhì)體靜脈注射后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(給藥劑量均為12.5mg/kg，n＝6，房室模型)

燈盞乙素苷元原料藥與燈盞乙素苷元脂質(zhì)體靜脈給藥大鼠體內(nèi)藥時(shí)曲線見圖4，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表4和表5。燈盞乙素苷元原料藥靜脈注射后，在血漿中迅速代謝為燈盞乙素。因此苷元的Cmax很低(7.28μg/ml)，且呈現(xiàn)為一相快速清除(半衰期為12min左右)。而將燈盞乙素苷元包裹在脂質(zhì)體內(nèi)水相中，以較低劑量(12.5mg/kg，約為原料藥給藥劑量的三分之一)靜脈給藥后，苷元的Cmax為原料藥的兩倍(15.61μg/ml)，并呈現(xiàn)兩相清除：快速清除相的半衰期為0.82±0.17h，終末半衰期長(zhǎng)達(dá)19.41±3.68h。脂質(zhì)體的AUC值遠(yuǎn)高于較高劑量燈盞乙素苷元原料藥靜脈給藥AUC值(不換算給藥劑量條件下，脂質(zhì)體AUC為苷元原料藥的17倍)。即脂質(zhì)體制劑通過在血液中緩慢釋放燈盞乙素苷元，顯著延長(zhǎng)燈盞乙素苷元的半衰期，延長(zhǎng)燈盞乙素苷元在體內(nèi)的半衰期至19.41±3.68hr(終末半衰期)，并提高燈盞乙素苷元的生物利用度。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。