本發(fā)明涉及一種納米脂質(zhì)體及其制備方法，尤其涉及一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（(FibroblastGrowthFactor，縮寫：FGF）脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：FGF是一種多功能強(qiáng)力的細(xì)胞因子，其包括酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（aFGF）或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），可促進(jìn)各種組織損傷的修復(fù)，改善傷口的愈合。而且與表皮生長(zhǎng)因子（EGF）相比較，EGF可促進(jìn)I型膠原的合成，導(dǎo)致瘢痕疙瘩形成；而FGF能通過對(duì)αI型前膠原基因表達(dá)的下行調(diào)節(jié)作用，抑制成纖維細(xì)胞的膠原合成，減少成纖維細(xì)胞的膠原蛋白的過量沉積，有助于防止瘢痕疙瘩的產(chǎn)生。此外，aFGF還可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的代謝和膠原蛋白的形成，對(duì)皮膚光澤、滋潤(rùn)、柔軟、減皺、祛粉刺、祛色斑、增白、改善皮膚彈性、損傷皮膚修復(fù)等方面有重要效果。因此，隨著人們生活水平的提高，人們也越來越注重儀容，將FGF應(yīng)用到生活美容和醫(yī)學(xué)美容領(lǐng)域中是一個(gè)重要的研究方向。但是，將FGF應(yīng)用到美容領(lǐng)域中，需要考慮解決FGF的穩(wěn)定性、皮膚吸收性以及與其它活性物質(zhì)的兼容性。脂質(zhì)體可以將活性成分包裹到脂質(zhì)體中，而且還可以將活性成分從其中釋放出來，從而可以極大提高這些活性成分的穩(wěn)定性，同時(shí)，由于脂質(zhì)體膜成分與人體細(xì)胞生物膜的成分極其接近，因此脂質(zhì)體的生物相容性好，安全性高。所以，將FGF與脂質(zhì)體結(jié)合形成FGF脂質(zhì)體，則可以解決FGF應(yīng)用到美容領(lǐng)域中存在的主要問題。然而，現(xiàn)有的FGF脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和皮膚吸收性雖然較單獨(dú)使用FGF有所提高，但其穩(wěn)定性、皮膚吸收性、安全性等性能還不能滿足現(xiàn)有需求，需要進(jìn)一步提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明確有必要提供一種FGF脂質(zhì)體及其制備方法，以解決上述問題。本發(fā)明提供一種FGF脂質(zhì)體的制備方法，其包括以下步驟：制備凍干脂質(zhì)體固體將磷脂和膽固醇按照2:1～5:1的質(zhì)量比溶解于叔丁醇中，形成脂質(zhì)體透明溶液；將凍干保護(hù)劑溶于去離子水中，得到凍干保護(hù)劑水溶液；均勻混合所述脂質(zhì)體透明溶液與所述凍干保護(hù)劑水溶液，得到脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液，且該脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液中的脂質(zhì)體與凍干保護(hù)劑的質(zhì)量比為1:1～1:4；冷凍干燥所述脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液，得到凍干脂質(zhì)體固體；制備懸浮液將FGF蛋白溶于3%甘油水溶液中，得到濃度為0.1～0.5mg/ml的FGF甘油水溶液；再均勻混合所述FGF甘油水溶液與所述凍干脂質(zhì)體固體，使所述凍干脂質(zhì)體固體重新水化；然后進(jìn)行重新整粒處理，得到包含有FGF脂質(zhì)體顆粒和游離FGF蛋白的懸浮液；分離制備成品將所述FGF脂質(zhì)體顆粒從所述懸浮液中分離出來，得到FGF脂質(zhì)體成品?；谏鲜觯鰞龈杀Ｗo(hù)劑水溶液的質(zhì)量百分濃度為4%～6%?；谏鲜觯谒鲋苽鋺腋∫旱牟襟E中，在將所述FGF甘油水溶液與所述凍干脂質(zhì)體固體混合之后，再采用100nm微孔濾膜進(jìn)行整粒處理，得到所述懸浮液?；谏鲜?，所述分離制備成品的步驟包括采用超濾離心法、透析法、凝膠柱層析法或超速離心法對(duì)所述懸浮液進(jìn)行處理，以將所述FGF脂質(zhì)體顆粒和所述游離FGF蛋白進(jìn)行分離?；谏鲜?，所述磷脂為天然大豆磷脂、氫化磷脂、合成磷脂雙肉豆蔻磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂甘油(DMPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)或聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)。基于上述，所述凍干保護(hù)劑為乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖和海藻糖中的一種或多種?；谏鲜?，所述FGF蛋白為bFGF蛋白或者aFGF蛋白。其中，在上述制備FGF脂質(zhì)體的過程中，各個(gè)步驟中所述形成的溶液，比如，所述脂質(zhì)體透明溶液、所述凍干保護(hù)劑水溶液、所述脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液、所述FGF甘油水溶液等各種溶液都需要進(jìn)過滅菌處理，其中滅菌處理的方法可以包括0.22μm微孔濾膜過濾處理法或60鈷15～20kGy射線照射法等。本發(fā)明提供的上述FGF脂質(zhì)體顆粒的制備方法采用叔丁醇作為溶劑溶解磷脂和膽固醇，得到所述脂質(zhì)體透明溶液，再與所述凍干保護(hù)劑水溶液混合，然后經(jīng)凍干后得到結(jié)構(gòu)疏松的凍干脂質(zhì)體固體，加入水相后可迅速水化制成脂質(zhì)體；叔丁醇作為溶劑可溶解由磷脂和膽固醇形成的脂質(zhì)體，毒性小，且可與水溶液以任意比例混勻，凝固點(diǎn)高，可在凍干機(jī)中完全凍結(jié)，蒸汽壓高，有利于升華，節(jié)省凍干時(shí)間。而且叔丁醇毒性低，在凍干過程中，大部分叔丁醇可在一次干燥階段升華，在產(chǎn)品中殘留量低，所以，在脂質(zhì)體制備過程中不需要單獨(dú)蒸發(fā)叔丁醇，從而使得本發(fā)明提供的上述FGF脂質(zhì)體的制備方法比較簡(jiǎn)單。另外，在制備所述FGF脂質(zhì)體的過程中，采用3%甘油水溶液水化所述凍干脂質(zhì)體固體，甘油是一種水溶性物質(zhì)，對(duì)機(jī)體無毒，因此，在制備過程中無需除去甘油。另外，甘油還可以增加所述FGF脂質(zhì)體顆粒的穩(wěn)定性，使得所述FGF脂質(zhì)體顆粒包裹的FGF蛋白具有更好的穩(wěn)定性和皮膚吸收效果細(xì)胞，使所述FGF脂質(zhì)體顆粒具有更好的皮膚透過性。本發(fā)明還提供一種由上述方法制備的FGF脂質(zhì)體，其包括脂質(zhì)體顆粒和包裹在該脂質(zhì)體顆粒中的FGF蛋白。基于上述，所述FGF脂質(zhì)體的粒徑分布范圍為50～250nm，平均粒徑為130～150nm。因此，本發(fā)明提供的FGF脂質(zhì)體顆粒粒徑分布范圍為50～250nm，且90%以上的FGF脂質(zhì)體顆粒的粒徑小于230nm，而且其平均粒徑為130～150nm，保證了該FGF脂質(zhì)體顆粒包裹的FGF蛋白具有更好的穩(wěn)定性和皮膚吸收效果細(xì)胞，使所述FGF脂質(zhì)體顆粒具有更好的皮膚透過性，從而使得所述FGF脂質(zhì)體顆?？蓱?yīng)用于生活美容或醫(yī)學(xué)美容中。此外，本發(fā)明最終的產(chǎn)品為流動(dòng)性良好的粉末，便于使用、運(yùn)輸和貯存。另外，本發(fā)明采用單相溶液凍干-重新水化-擠出法制備所述FGF脂質(zhì)體顆粒，制備方法簡(jiǎn)單易操作、可重復(fù)性高、且具有較高的包封率與載藥量，包封率可達(dá)到83.5%～86.4%；原料成分簡(jiǎn)單無毒，安全穩(wěn)定。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種aFGF脂質(zhì)體的制備方法，該方法包括以下步驟：將0.4g的大豆卵磷脂和0.1g的膽固醇溶解于10g的叔丁醇中形成大豆卵磷脂透明溶液，然后經(jīng)過0.22μm微孔濾膜過濾處理，得到無菌大豆卵磷脂脂質(zhì)體透明溶液；將0.5g的蔗糖溶于去離子水中，得到濃度為5%的蔗糖溶液，然后經(jīng)過0.22μm微孔濾膜過濾處理，得到無菌蔗糖溶液；混合所述無菌大豆卵磷脂脂質(zhì)體透明溶液與所述無菌蔗糖溶液，并采用超聲勻質(zhì)處理成勻相，然后反復(fù)采用0.22μm微孔濾膜過濾，得到大豆卵磷脂脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液，且該大豆卵磷脂脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液中的脂質(zhì)體與蔗糖的質(zhì)量比為1:3；將所述大豆卵磷脂叔丁醇/水共溶液進(jìn)行冷凍干燥24h，得到凍干大豆卵磷脂固體；將20mg的aFGF蛋白溶于3%甘油水溶液中，過濾除菌，得到濃度為0.2mg/ml的aFGF甘油水溶液；再將所述aFGF甘油水溶液與所述凍干大豆卵磷脂固體混合，使所述凍干大豆卵磷脂固體重新水化；然后采用100nm微孔濾膜進(jìn)行重新整粒處理，得到包含有aFGF脂質(zhì)體和游離aFGF蛋白的懸浮液；采用超濾離心法處理所述懸浮液，分離所述aFGF脂質(zhì)體和所述游離aFGF蛋白，得到aFGF脂質(zhì)體顆粒。采用激光粒度儀測(cè)量本實(shí)施例制備出的所述aFGF脂質(zhì)體顆粒的粒徑，測(cè)量出的粒徑為50～250nm、95%的粒徑小于233nm，計(jì)算出平均粒徑為145nm；采用紫外分光光度法測(cè)吸收度，進(jìn)而計(jì)算出所述aFGF脂質(zhì)體顆粒的包封率為84.6%。實(shí)施例2本實(shí)施例還提供一種aFGF脂質(zhì)體的制備方法，該制備方法與實(shí)施例1提供的制備方法基本相同，不同之處在于所采用的原料及其質(zhì)量有所不同。具體地，本實(shí)施例中使用的原料如下：0.4g的DMPC、0.1g膽固醇、0.5g的海藻糖、濃度為5%的海藻糖水溶液、形成的DMPC脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液中的脂質(zhì)體與海藻糖的質(zhì)量比為1:1、13mg的aFGF蛋白、濃度為0.11mg/ml的aFGF甘油水溶液。采用與實(shí)施例1相同的方法，對(duì)本實(shí)施例制備的aFGF脂質(zhì)體顆粒的粒徑及包封率進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果為：粒徑分布范圍為50～210nm，92%的粒徑小于200nm，計(jì)算出平均粒徑為137nm，包封率為85.6%。實(shí)施例3本實(shí)施例還提供一種aFGF脂質(zhì)體的制備方法，該制備方法與實(shí)施例1提供的制備方法基本相同，不同之處在于所采用的原料及其質(zhì)量有所不同，以及采用透析法將aFGF脂質(zhì)體和游離aFGF進(jìn)行分離。本實(shí)施例中使用的原料如下：0.5g的DPPG、0.1g膽固醇、0.8g甘露醇、濃度為6%的甘露醇水溶液、形成的DPPG脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液中的脂質(zhì)體與甘露醇的質(zhì)量比為1:4、45mg的aFGF蛋白、濃度為0.48mg/ml的aFGF甘油水溶液。采用與實(shí)施例1相同的方法，對(duì)本實(shí)施例制備的aFGF脂質(zhì)體顆粒的粒徑及包封率進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果為：粒徑分布范圍為50～200nm，95%的粒徑小于180nm，計(jì)算出平均粒徑為132nm，包封率為86.1%。實(shí)施例4本實(shí)施例還提供一種bFGF脂質(zhì)體顆粒的制備方法，該制備方法與實(shí)施例1提供的制備方法基本相同，不同之處在于所采用的原料及其質(zhì)量有所不同，以及采用60鈷15～20kGy射線照射法進(jìn)行滅菌處理。具體地，本實(shí)施例中使用的原料如下：0.4g大豆卵磷脂、0.1g膽固醇、0.5g蔗糖、濃度為4%的蔗糖溶液、形成的大豆卵磷脂脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液中的脂質(zhì)體與蔗糖的質(zhì)量比為2:1、30mg的bFGF蛋白、濃度為0.35mg/ml的aFGF甘油水溶液。采用與實(shí)施例1相同的方法，對(duì)本實(shí)施例制備的aFGF脂質(zhì)體顆粒的粒徑及包封率進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量結(jié)果為：粒徑分布范圍為50～240nm，94%的粒徑小于227nm，計(jì)算出平均粒徑為149nm，包封率為83.7%。實(shí)施例5本實(shí)施例還提供一種bFGF脂質(zhì)體的制備方法，該制備方法與實(shí)施例1提供的制備方法基本相同，不同之處在于所采用的原料及其質(zhì)量有所不同，以及凝膠柱層析法將bFGF脂質(zhì)體和游離bFGF進(jìn)行分離。本實(shí)施例中使用的原料如下：0.5g的DSPE、0.1g膽固醇、0.6g甘露醇、濃度為6%的甘露醇溶液、形成的DSPE脂質(zhì)體叔丁醇/水共溶液中的脂質(zhì)體與海藻糖的質(zhì)量比為1:3、25mg的bFGF蛋白、濃度為0.23mg/ml的bFGF甘油水溶液。采用與實(shí)施例1相同的方法，對(duì)本實(shí)施例制備的bFGF脂質(zhì)體顆粒的粒徑及包封率進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量結(jié)果為：粒徑分布范圍為50～200nm，96%的粒徑小于190nm，計(jì)算出平均粒徑為130nm，包封率為84.3%。穩(wěn)定性試驗(yàn)分別將上述實(shí)施例1～5提供的FGF脂質(zhì)體、FGF水溶液于溫度4℃、條件下密閉放置。于放置后0、1、2、3月后，檢測(cè)FGF脂質(zhì)體的顏色、包封率、澄清度、粒徑等。分別用ELISA法測(cè)定脂質(zhì)體和水溶液中FGF蛋白的含量，以0月時(shí)脂質(zhì)體和水溶液中aFGF蛋白含量為100％，其它各時(shí)間藥物含量與之作比較，得出藥物含量隨時(shí)間變化百分率，結(jié)果表明，經(jīng)溫度4℃條件下，放置3個(gè)月，F(xiàn)GF蛋白在FGF脂質(zhì)體中藥物含量變化不大，F(xiàn)GF脂質(zhì)體的外觀形態(tài)、粒徑、包封率等變化不大；而FGF蛋白在水溶液中藥物含量降低，證實(shí)FGF蛋白用脂質(zhì)體包封后，能明顯提高藥物的穩(wěn)定性。不同條件下FGF脂質(zhì)體的包封率表樣品0天7天30天60天90天實(shí)施例184.6%83.7%82.9%81.4%80.7%實(shí)施例285.6%84.7%83.9%82.6%81.3%實(shí)施例386.1%84.9%83.7%82.4%81.9%實(shí)施例483.7%82.6%81.5%80.2%79.5%實(shí)施例584.3%83.3%82.4%81.6%80.9%最后應(yīng)當(dāng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)其限制；盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3