本發(fā)明涉及喜樹堿載體制備領(lǐng)域，具體涉及一種可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

藥物發(fā)揮藥效需要兩個(gè)因素，一是藥物到達(dá)病灶，二是藥物在病灶位置具有一定的濃度并保持一定的時(shí)間。

智能藥物控制釋放系統(tǒng)能特異性識(shí)別靶位組織，定時(shí)、定量的將所需劑量的藥物導(dǎo)入人體病灶部位，針對(duì)病變細(xì)胞實(shí)行定向“爆破”。介孔材料作為一種先進(jìn)的藥物載體，具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性、制備簡(jiǎn)單、無免疫原性、且易于被修飾，使得研究者們將目光集中在利用介孔材料進(jìn)行針對(duì)性的腫瘤治療。自從2001年MCM-41型介孔二氧化硅納米粒子首次用于藥物傳輸系統(tǒng)以來，設(shè)計(jì)具有生物相容性和多功能性的介孔二氧化硅已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

喜樹堿(Camptothecin，CPT，CAS號(hào)：7689-03-4)，其結(jié)構(gòu)式如下式所示：

喜樹堿能直接破壞DNA結(jié)構(gòu)，與DNA結(jié)合而使DNA易受內(nèi)切酶的攻 擊，同時(shí)選擇性抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)而影響DNA的復(fù)制，主要對(duì)增殖細(xì)胞敏感，為細(xì)胞周期特異性藥物，作用于S期，對(duì)G1、G2與M期細(xì)胞有輕微的殺傷力。對(duì)多種動(dòng)物腫瘤有抑制作用，與常用抗腫瘤藥無交叉耐藥性。主要應(yīng)用在銀屑病、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、頭頸部癌及膀胱癌的治療。但是在臨床治療中，存在緩解期短(平均2～3個(gè)月)，毒性大，存在抑制骨髓的可能，另外還有引起出血性膀胱炎，出現(xiàn)尿頻，尿痛及血尿等副作用。由于喜樹堿作為惟一的一類作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的抗腫瘤藥，導(dǎo)致研究者迫切需要尋找降低毒性，提高臨床藥效的方法。

戴華胄等(戴華胄,馬麗芳,郭麗,等.PEG化聚酰胺-胺樹狀大分子的合成及其作為喜樹堿藥物載體的研究[J].華西藥學(xué)雜志,2009,24(2):115-117.)制備了PEG化聚酰胺-胺樹狀大分子以作為喜樹堿藥物載體，具有增溶作用與提高釋藥速度，改善其穩(wěn)定性。韓雪等(韓雪.基于殼聚糖的pH響應(yīng)雙重藥物釋放系統(tǒng)研究[J].高分子學(xué)報(bào),2015(12):1471-1476.)制備了基于殼聚糖的喜樹堿藥物載體，避免了喜樹堿的早期泄露，表現(xiàn)出基于pH變化的藥物釋放行為。Victor S.-Y.Lin等(NLin V S Y.A magnetic mesoporous silica nanoparticle-based drug delivery system for photosensitive cooperative treatment of cancer with a mesopore-capping agent and mesopore-loaded drug[J].Nanoscale,2013,5(4):1544-1551.)發(fā)明了一種基于光磁變化以控制喜樹堿釋放的二氧化硅藥物載體，在進(jìn)行光磁刺激時(shí)表現(xiàn)出釋放效應(yīng)。

這些工作中，盡管采用高分子、殼聚糖、二氧化硅等載體負(fù)載喜樹堿，實(shí)現(xiàn)在不同刺激條件下喜樹堿的釋放，但是對(duì)于喜樹堿的釋放速率并未進(jìn)行控制。而藥物從載體釋放的速率直接影響到藥物的藥效，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。對(duì)喜樹堿的藥物負(fù)載，亟需改變藥物釋放動(dòng)力學(xué)，實(shí)現(xiàn)不同給藥需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體及其制備和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)喜樹堿釋放速率的控制，同時(shí)避免其到達(dá)病灶前對(duì)人體組織帶來的副作用。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案為：

一種可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體，結(jié)構(gòu)式如下：

其中，R選自甲基、乙基、異丙基或者苯基。

上述技術(shù)方案中，以巰基修飾的介孔二氧化硅為載體，采用硅氧酯基團(tuán)作為酸響應(yīng)基團(tuán)，利用不同的硅氧酯側(cè)鏈影響其藥物降解速率的特性，通過調(diào)節(jié)其側(cè)鏈基團(tuán)R，使藥物在病灶實(shí)現(xiàn)不同速率的釋放，達(dá)到對(duì)藥物療效的控制。

本發(fā)明還提供一種上述藥物載體的制備方法，包括如下步驟：

1)將喜樹堿、4-二甲基氨基吡啶、咪唑和硅烷基衍生物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入2-羥基乙基丙烯酸酯攪拌反應(yīng)，然后萃取，除去N,N-二甲基甲酰胺，旋蒸，分離得到硅氧酯前藥；

2)將硅氧酯前藥、巰基修飾的介孔二氧化硅與安息香二甲醚置于有機(jī)溶劑中，在紫外光照條件下反應(yīng)，經(jīng)過濾、洗滌、干燥后得到藥物載體。

所述喜樹堿為由珙桐科旱蓮屬植物喜樹的根、皮、果實(shí)提取、合成或半合成制得的生物堿。

所述巰基修飾的介孔二氧化硅由于其比面積大，孔徑豐富，具有良好的生物相容性，能夠作為良好的喜樹堿載體。巰基修飾的介孔二氧化硅的制備方法可以采用共聚合法，使用模板劑制備。

所述步驟1)中使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。

所述步驟1)中采用飽和NaCl溶液除去N,N-二甲基甲酰胺。

所述步驟2)中有機(jī)溶劑可以為無水甲醇或無水乙醇。

所述步驟2)中采用點(diǎn)擊反應(yīng)作為實(shí)現(xiàn)藥物負(fù)載的技術(shù)支持，點(diǎn)擊化學(xué)的反應(yīng)效率高，反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，方法簡(jiǎn)單，提高了藥物載體的制備效率。

優(yōu)選的，所述巰基修飾的介孔二氧化硅粒徑為100-200nm，載藥量為

10％～15％。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的硅烷基衍生物選自二氯二甲硅烷、二氯二乙硅烷、二氯二異丙基硅烷、二氯二苯基硅烷中的一種或幾種。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中的巰基修飾的介孔二氧化硅的制備方法為：將十六烷基三甲基溴化銨溶于水中，調(diào)節(jié)PH至9～10；升溫至60～80℃，加入正硅酸乙酯與巰丙基三甲氧基硅烷進(jìn)行反應(yīng)，過濾、洗滌、干燥得到白色固體；將白色固體溶于有機(jī)溶劑中，加入HCl攪拌反應(yīng)，經(jīng)過濾、洗滌、干燥得到巰基修飾的介孔二氧化硅。上述制備方法中，可以使用一定濃度的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH。所述有機(jī)溶劑可以為無水甲醇或無水乙醇。

優(yōu)選的，所述步驟2)中的硅氧酯前藥與巰基修飾的介孔二氧化硅的質(zhì)量比為1:4～6。

優(yōu)選的，所述步驟1)中喜樹堿、硅烷基衍生物和2-羥基乙基丙烯酸酯三者摩爾比為1:09～1:4～5。

優(yōu)選的，所述步驟1)中硅烷基衍生物為二氯二甲硅烷時(shí)，所述分離為硅 膠柱分離，其流動(dòng)相為正己烷、乙酸乙酯和無水甲醇。

優(yōu)選的，所述步驟1)中硅烷基衍生物為二氯二乙硅烷時(shí)，所述分離為硅膠柱分離，其流動(dòng)相為二氯甲烷和無水甲醇。

本發(fā)明還提供一種上述藥物載體在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。其優(yōu)勢(shì)在于可以控制藥物釋放的速率，同時(shí)避免其到達(dá)病灶前對(duì)人體組織帶來的副作用。在不影響藥效的前提下提高了藥物的利用率，為實(shí)現(xiàn)藥物緩釋開拓了新的前景，具有良好的醫(yī)療研究?jī)r(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

(1)采用硅氧酯基團(tuán)作為酸響應(yīng)基團(tuán)，通過改變硅氧酯側(cè)鏈基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)喜樹堿釋放速率的控制。

(2)采用巰基修飾的介孔二氧化硅作為藥物載體，其比表面積大，孔徑豐富，具有良好的生物相容性。

(3)采用點(diǎn)擊反應(yīng)作為實(shí)現(xiàn)藥物負(fù)載的技術(shù)支持，點(diǎn)擊化學(xué)的反應(yīng)效率高，反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，方法簡(jiǎn)單，提高了藥物載體的制備效率。

附圖說明

圖1為實(shí)施例4和5中不同側(cè)鏈基團(tuán)喜樹堿藥物載體的固態(tài)核磁表征圖；

圖2為試驗(yàn)例3和4中不同側(cè)鏈基團(tuán)喜樹堿藥物載體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例、試驗(yàn)例與附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明。

實(shí)施例1巰基修飾的二氧化硅制備

取1.0g十六烷基三甲基溴化銨與480mL去離子水置于1000mL圓底燒瓶中，加入3.5mL NaOH(2M)調(diào)節(jié)pH，于恒溫水浴鍋中加熱攪拌至70℃， 逐滴加入5.0mL正硅酸乙酯與1.0mL巰丙基三甲氧基硅烷，保持70℃攪拌反應(yīng)2h，經(jīng)過濾、洗滌、干燥得到白色固體。

取上述白色固體1.5g與150mL無水甲醇置于250mL圓底燒瓶中，加入1.5mL HCl，加熱至70℃攪拌反應(yīng)6h，經(jīng)過濾、洗滌、干燥得到巰基修飾的二氧化硅。

實(shí)施例2側(cè)鏈為甲基的硅氧酯前藥制備

取0.5g喜樹堿、0.175g 4-二甲基氨基吡啶、0.681g咪唑溶解于12mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.553g二氯二甲硅烷，攪拌至溶液澄清后，加入0.830g 2-羥基乙基丙烯酸酯，攪拌反應(yīng)4h后用乙酸乙酯萃取，用飽和NaCl溶液除去N,N-二甲基甲酰胺。經(jīng)旋蒸、硅膠柱分離(流動(dòng)相為正己烷：乙酸乙酯：無水甲醇＝7:2:1)后得到側(cè)鏈為甲基的硅氧酯前藥。

實(shí)施例3側(cè)鏈為乙基的硅氧酯前藥制備方法

取0.5g喜樹堿、0.182g 4-二甲基氨基吡啶、0.684g咪唑溶解于12mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.63g二氯二乙硅烷，攪拌至溶液澄清后，加入0.863g 2-羥基乙基丙烯酸酯，攪拌反應(yīng)90h后用乙酸乙酯萃取，用飽和NaCl溶液除去N,N-二甲基甲酰胺。經(jīng)旋蒸、硅膠柱分離(流動(dòng)相為二氯甲烷：無水甲醇＝8:2)后得到側(cè)鏈為乙基的硅氧酯前藥。

實(shí)施例4側(cè)鏈為甲基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體制備

取0.5g巰基修飾的介孔二氧化硅、0.1g側(cè)鏈為甲基的硅氧酯前藥和0.1g安息香二甲醚加入50mL無水甲醇中，在紫外光條件下攪拌反應(yīng)1h，經(jīng)過濾、洗滌、干燥得到側(cè)鏈為甲基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體。

表征：如圖1固態(tài)核磁共振圖所示，δ＝8.7ppm為位移后的甲基側(cè)鏈，δ＝30.1,42.6,50.6,70.4為喜樹堿的特征結(jié)構(gòu)。

結(jié)構(gòu)式如下：

實(shí)施例5側(cè)鏈為乙基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體制備

取0.5g巰基修飾的介孔二氧化硅、0.1g側(cè)鏈為乙基的硅氧酯前藥和0.1g安息香二甲醚加入50mL無水甲醇中，在紫外光條件下攪拌反應(yīng)1h，經(jīng)過濾、洗滌、干燥得到側(cè)鏈為乙基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體。

核磁：如圖1固態(tài)核磁共振圖所示，δ＝21.0ppm為位移后的乙基側(cè)鏈，δ＝30.1,42.6,50.6,70.4為喜樹堿的特征結(jié)構(gòu)。

結(jié)構(gòu)式如下：

試驗(yàn)例1體外釋放效果的評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)方法：取25mg實(shí)施例4制備的側(cè)鏈為甲基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體，分散在125ml pH＝4.0的PBS緩沖液中置于250ml錐形瓶中，加入磁子攪拌置于37℃恒溫水浴鍋中，分別于0,1,2,3,4,5,6,8小時(shí)取樣 5ml進(jìn)行高效液相色譜分析，選用phenomenex Gemini C18(4.6mm×250mm)色譜柱，流動(dòng)相為水：乙腈＝30:70，流速1mL/min，柱溫37℃，檢測(cè)紫外波長(zhǎng)254nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在1h后即檢測(cè)到喜樹堿釋放，釋放率為60％，8h后喜樹堿最終釋放率為65％。

對(duì)比例1體外釋放效果的評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)方法：取25mg實(shí)施例4制備的側(cè)鏈為甲基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體，分散在125ml pH＝7.4的PBS緩沖液中置于250ml錐形瓶中，加入磁子攪拌置于37℃恒溫水浴鍋中，分別于0,1,2,3,4,5,6,8小時(shí)取樣5ml進(jìn)行高效液相色譜分析，選用phenomenex Gemini C18(4.6mm×250mm)色譜柱，流動(dòng)相為水：乙腈＝30:70，流速1mL/min，柱溫37℃，檢測(cè)紫外波長(zhǎng)254nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在0,1,2,3,4,5,6,8h各個(gè)時(shí)間都未檢測(cè)到喜樹堿的釋放。

結(jié)合試驗(yàn)例1和對(duì)比例1可知，在人體正常環(huán)境中pH＝7.4，實(shí)施例4制備的藥物載體未釋放喜樹堿；而處于病灶中的細(xì)胞pH＝4.0，實(shí)施例4制備的藥物載體在1h后即檢測(cè)到喜樹堿釋放，釋放率為60％，8h后喜樹堿最終釋放率為65％?？芍獙?shí)施例4制備的藥物載體可以控制藥物釋放的速率，同時(shí)避免其到達(dá)病灶前對(duì)人體組織帶來的副作用。

試驗(yàn)例2體外釋放效果的評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)方法：取25mg實(shí)施例5制備的側(cè)鏈為乙基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體，分散在125ml pH＝4.0的PBS緩沖液中置于250ml錐形瓶中，加入磁子攪拌置于37℃恒溫水浴鍋中，分別于0,1,2,3,4,5,6,8小時(shí)取樣5ml 進(jìn)行高效液相色譜分析，選用phenomenex Gemini C18(4.6mm×250mm)色譜柱，流動(dòng)相為水：乙腈＝30:70，流速1mL/min，柱溫37℃，檢測(cè)紫外波長(zhǎng)254nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在2h后開始檢測(cè)到喜樹堿釋放，釋放率為15％，6h后喜樹堿達(dá)到最高釋放率為60％。

對(duì)比例2體外釋放效果的評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)方法：取25mg實(shí)施例5制備的側(cè)鏈為乙基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體，分散在125ml pH＝7.4的PBS緩沖液中置于250ml錐形瓶中，加入磁子攪拌置于37℃恒溫水浴鍋中，分別于0,1,2,3,4,5,6,8小時(shí)取樣5ml進(jìn)行高效液相色譜分析，選用phenomenex Gemini C18(4.6mm×250mm)色譜柱，流動(dòng)相為水：乙腈＝30:70，流速1mL/min，柱溫37℃，檢測(cè)紫外波長(zhǎng)254nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在0,1,2,3,4,5,6,8h各個(gè)時(shí)間都未檢測(cè)到喜樹堿的釋放。

結(jié)合試驗(yàn)例2和對(duì)比例2可知，在人體正常環(huán)境中pH＝7.4，實(shí)施例5制備的藥物載體未釋放喜樹堿；而處于病灶中的細(xì)胞pH＝4.0，實(shí)施例5制備的藥物載體在2h后開始檢測(cè)到喜樹堿釋放，釋放率為15％，6h后喜樹堿達(dá)到最高釋放率為60％?？芍獙?shí)施例5制備的藥物載體可以控制藥物釋放的速率，同時(shí)避免其到達(dá)病灶前對(duì)人體組織帶來的副作用。

試驗(yàn)例3生物毒性的評(píng)價(jià)

在5％CO₂，37℃下，孵育至Hela細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，取0,0.1,0.5,and 1μg/mL(實(shí)施例4制備的側(cè)鏈為甲基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體)置于4000細(xì)胞/孔的96孔板中培養(yǎng)48h后，加入0.75mg/ml的 MTT培養(yǎng)液取代血清繼續(xù)培養(yǎng)3h，每孔加入100μl DMSO溶解，通過微孔板分光光度計(jì)在562nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸收值。

經(jīng)分析，在0、0.1μg/mL濃度下無毒性，在0.5、1.0μg/mL濃度下可以抑制40％的癌細(xì)胞生長(zhǎng)。如圖2中的密左斜線柱，與空白載體(橫線柱)和喜樹堿藥物(右斜線柱)相比，實(shí)施例4中制備的藥物載體表現(xiàn)出與喜樹堿藥物相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性。

試驗(yàn)例4生物毒性的評(píng)價(jià)

在5％CO₂，37℃下，孵育至Hela細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，取0,0.1,0.5,and 1μg/mL(實(shí)施例5制備的側(cè)鏈為乙基的可控制喜樹堿釋放速率的藥物載體)置于4000細(xì)胞/孔的96孔板中培養(yǎng)48h后，加入0.75mg/ml的MTT培養(yǎng)液取代血清繼續(xù)培養(yǎng)3h，每孔加入100μl DMSO溶解，通過微孔板分光光度計(jì)在562nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸收值。

經(jīng)分析，在0、0.1μg/mL濃度下無毒性，在0.5、1.0μg/mL濃度下可以抑制40％的癌細(xì)胞生長(zhǎng)。如圖2中的疏左斜線柱，與空白載體(橫線柱)和喜樹堿藥物(右斜線柱)相比，實(shí)施例5中制備的藥物載體表現(xiàn)出與喜樹堿藥物相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性。