專利名稱：Dna與納米層狀羥基磷灰石復合物及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA與納米層狀羥基磷灰石復合物及其制備方法和應用，具體涉及一種DNA/層狀羥基磷灰石納米基因藥物載體材料的制備。
背景技術(shù)：
介導基因轉(zhuǎn)移的載體可分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體的潛在誘發(fā)突變和致癌的危險限制了其在基因治療中的應用。非病毒載體具有相對低毒、無免疫原性和致瘤性、DNA運載量大等優(yōu)點。本發(fā)明的目的是建立一個非病毒載體的基因傳遞系統(tǒng)。DNA插層層狀無機載體材料在近年來得到了廣泛的研究。目前出現(xiàn)的DNA/蒙脫土、 DNA/層狀雙羥基化合物、DNA/頁硅酸鹽等DNA插層復合材料成功地對DNA進行了存儲和釋放，并且可以有效地保護DNA不受DNA酶的分解，同時對DNA的熱穩(wěn)定性也有一定的增強作用。然而，無論是蒙脫土還是層狀雙羥基化合物，它們的生物相容性都有待于進一步的研究。羥基磷灰石是性能優(yōu)良的生物相容性材料，在生物醫(yī)學領(lǐng)域有很大的應用前景。目前，國內(nèi)外對羥基磷灰石作為基因載體方面進行了一定的研究，用于DNA載體的有羥基磷灰石和羥基磷灰石在酸性條件下的分解產(chǎn)物磷酸鈣。磷酸鈣納米顆粒在經(jīng)不同濃度的氯化鈣等試劑修飾后，能與質(zhì)粒DNA有效結(jié)合形成復合體，該復合體能吸附在細胞膜上，然后進入細胞內(nèi)，增加進入細胞內(nèi)DNA量，提高基因轉(zhuǎn)染的效率。但是傳統(tǒng)制備方法得出的普通結(jié)構(gòu)的羥基磷灰石，不能形成對DNA的大量存儲和有效保護。層狀的羥基磷灰石在基因載體方面的應用一直是一項空白。將納米層狀羥基磷灰石和DNA運用插層技術(shù)組裝在一起，有望使DNA/羥基磷灰石納米插層復合物成為一種新型的非病毒基因傳遞系統(tǒng)，在未來基因工程的實驗研究和基因治療的臨床實踐以及疾病康復方面發(fā)揮重要作用。本發(fā)明首次采用溶液插層方法制備的DNA/層狀羥基磷灰石復合物具有較大的層狀存貯空間和優(yōu)良的生物相容性，同時具有更高的酸度敏感性，可實現(xiàn)對基因的有效存儲、保護和釋放。對于基因工程和基因藥物治療具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種DNA與納米層狀羥基磷灰石復合物及其制備方法和應用。將DNA插層進入層狀納米羥基磷灰石內(nèi)部，實現(xiàn)DNA的有效存貯、保護和釋放，可以達到基因藥物可控釋放和治療的目的。
本發(fā)明提供的DNA與納米層狀羥基磷灰石復合物是以鮭魚精DNA和層狀羥基磷灰石為原料，按照DNA和羥基磷灰石的質(zhì)量比1: 5 100進行配料，其制備方法包括如下步驟
將層狀羥基磷灰石的懸浮液與DNA透明溶液混合后在恒溫搖床中進行振蕩，靜置吸附后將反應產(chǎn)物清洗并離心，干燥。所得復合物層間距介于3.3nm至4.8nm之間。本發(fā)明提供的DNA/層狀羥基磷灰石復合物的制備方法包括如下步驟
1) 將5 100份的層狀輕基磷灰石粉體加水溶解，超聲得到分散均勻的懸浮液。間歇超聲2 4次，每次0.5min，超聲功率100 W，超聲頻率40KHz。
2) 用焦碳酸二乙酯(DEPC)緩沖液配置質(zhì)量濃度為1 mg/ml的鮭魚精DNA溶液，將1份DNA溶液加入到步驟l)的懸濁液中，震蕩，超聲分散，然后加入滅菌高純水定容，得到混合液。超聲條件間歇超聲l-3次，每次0.5min，超聲功率100 W，超聲頻率40 KHz 。
3) 將混合液放入25 r恒溫搖床，轉(zhuǎn)速150rpm，每振蕩0.3 h，平衡吸附1 h，間歇操作此過程，累計振蕩6次后靜置吸附24h。
4) 反應產(chǎn)物水洗，然后超速離心，去除未插層的游離DNA，產(chǎn)物室溫干燥。本發(fā)明提供的DNA/層狀羥基磷灰石復合物用于基因藥物載體。
顯著性效果本發(fā)明提供的DNA/層狀羥基磷灰石復合物具有插層結(jié)構(gòu)。復合物層間距介于3.3 nm至4.8 nm之間。實現(xiàn)了超螺旋結(jié)構(gòu)DNA的存儲，保護和釋放。本發(fā)明提供的復合物制備方法相對容易，成本低。制備的復合物可有效保護DNA不受DNA酶的分解，并且在較低的酸性條件下可以進行釋放。對于羥基磷灰石在基因藥物載體中的應用，尤其是在多基因藥物治療和蛋白質(zhì)/基因復合藥物治療方面具有重要意義。


圖1是X射線小角度衍射圖。
圖2是不同pH下釋放DNA電泳照片。
具體實施方式
實施例
將50 mg層間距為3.1 nm的層狀羥基磷灰石粉體加入錐形瓶中(制備方法見CN101058416)，加少量滅菌的高純水。間歇超聲3次，每次0.5 min，超聲功率100 W，超聲頻率40KHz，最終得到分散均勻的羥基磷灰石懸浮液。用100mL焦碳酸二乙酯溶液溶解固態(tài)鮭魚精DNA (市售)，配制成濃度為1 mg/mL的溶液。將1 mg DNA溶液逐滴加入錐形瓶中，振蕩并超聲，超聲條件間歇超聲2次，每次0.5min，超聲功率100W，超聲頻率40KHz。最后定容至20mL。將錐形瓶放入恒溫搖床振蕩，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度25°C，每搖動0.3h，平衡吸附lh，重復操作6次。將得到的產(chǎn)物清洗并超速離心，離心速率12000rpm，室溫干燥。進行XRD測試和電泳測試，圖1是X射線小角度衍射圖譜，圖2是電泳測試照片。測試結(jié)果小角度范圍內(nèi)羥基磷灰石衍射峰左移，對應的層間距為4.8 nm。復合物(100)晶面間距比復合前的純羥基磷灰石(3.1nm)擴大了 1.7 nm。表明DNA分子已經(jīng)進入羥基磷灰石的層間，同時還說明復合物仍然保留有層狀的有序結(jié)構(gòu)。電泳照片結(jié)果表明DNA在pH低于4時候開始釋放，并且在pH = 2時達到釋放最大值。
權(quán)利要求
1、一種DNA與納米層狀羥基磷灰石復合物，其特征在于它是以鮭魚精DNA和層狀羥基磷灰石為原料，按照DNA和羥基磷灰石的質(zhì)量比1∶5～100進行配料，其制備方法包括如下步驟將層狀羥基磷灰石的懸浮液與DNA溶液在搖動下反應，反應產(chǎn)物水洗，常溫干燥；
2、 按權(quán)利要求1所述的DNA/層狀羥基磷灰石復合物，其特征在于所述的DNA/層狀羥基磷灰石復合物具有插層狀結(jié)構(gòu)，層間距為3.3 4.8nm。
3、 按權(quán)利要求1所述的DNA/層狀羥基磷灰石復合物的制備方法，其特征在于它是包括如下步驟1) 將5 100份的層狀羥基磷灰石粉體加水溶解，超聲得到分散均勻的懸浮液；2) 用焦碳酸二乙酯(DEPC)緩沖液配置質(zhì)量濃度為1 mg/ml的鮭魚精DNA溶液，將1份DNA溶液加入到步驟l)的懸濁液中，震蕩，超聲分散，然后加入滅菌高純水定容，得到混合液；3) 將混合液放入25 。C恒溫搖床，轉(zhuǎn)速150rpm，每振蕩0.3 h，平衡吸附1 h，間歇操作此過程，累計振蕩6次后靜置吸附24h;4) 反應產(chǎn)物水洗，然后超速離心，去除未插層的游離DNA，產(chǎn)物室溫干燥。
4、 按照權(quán)利要求3所述的DNA/納米層狀羥基磷灰石復合物的制備方法，其特征在于步驟l)所述的超聲條件間歇超聲2 4次，每次0.5 min，超聲功率100 W，超聲頻率40 KHz。
5、 按照權(quán)利要求3所述的DNA/納米層狀羥基磷灰石復合物的制備方法，其特征在于步驟2)所述的超聲條件間歇超聲1 3次，每次0.5min，超聲功率100 W，超聲頻率40 KHz 。
6、 權(quán)利要求1所述的DNA與納米層狀羥基磷灰石復合物的應用，其特征在于該材料用于基因藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA與納米層狀羥基磷灰石復合物及其制備方法，它是以層狀羥基磷灰石和鮭魚精DNA為原料，按照DNA與層狀羥基磷灰石的質(zhì)量比1∶5～100進行配料，其制備方法是將層狀羥基磷灰石的懸浮液與DNA溶液于37℃下間歇搖動反應5～7次，常溫下干燥；本發(fā)明提供的復合物具有插層型結(jié)構(gòu)，層間距為3.3～4.8nm，實現(xiàn)了超螺旋結(jié)構(gòu)DNA的存儲，保護和釋放。本發(fā)明提供的復合物制備方法相對容易，成本低。對于羥基磷灰石在多基因藥物治療和蛋白質(zhì)/基因復合藥物治療方面的應用具有重要意義。
文檔編號A61K47/48GK101648023SQ20091007024
公開日2010年2月17日 申請日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者萬怡灶, 芳 何, 孟憲光, 左桂福, 王潔華 申請人:天津大學