專利名稱：核桃青皮總單寧的制備及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以核桃青皮為原料制備核桃青皮總單寧的 方法及用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病，在我國(guó)城市人口中，腫瘤是第一位死因，占 全部死亡率的1/4，腫瘤亦是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的一大難題。在惡性腫瘤的三大療法中，藥物治療占 有重要的地位，發(fā)展速度也最快，合成的化學(xué)類抑腫瘤藥物絕大多數(shù)是l天然抗癌活性成分 為先導(dǎo)化合物，抗癌藥物的開發(fā)，包括計(jì)算機(jī)模擬和仿生設(shè)計(jì)都是以天然抗癌活性成分為基 礎(chǔ)的。為了應(yīng)對(duì)癌癥給人類健康所造成的巨大威脅，世界各國(guó)惡性腫瘤藥物開發(fā)科學(xué)工作者 們尤為重視植物中具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物。因此，從各種植物中篩選安全、高效、低毒 的天然抗腫瘤活性成分單體或組分(分子群)成為近年來國(guó)內(nèi)外科學(xué)家研究的重點(diǎn)課題。
胡桃屬(J"g/"朋)植物為胡桃科(Juglandaceae)落葉喬木，其果實(shí)一般統(tǒng)稱核桃(或胡 桃)。核桃青皮為核桃未成熟時(shí)包圍在核桃外部的一層厚厚的綠皮，隨著核桃逐漸成熟青果皮 會(huì)逐漸變黑，最后自然脫落。核桃青皮的藥用歷史悠久，據(jù)《本草綱目》等祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)專 著及當(dāng)代國(guó)內(nèi)外植物圖鑒記載，胡桃屬青皮辛、苦、澀、微寒，廣泛以其入藥用以抑制多種 腫瘤生長(zhǎng)、治療白血病、清熱、解毒、止痢、明目、消炎等，在德國(guó)和法國(guó)民間核桃青皮作 為止痛藥、抗腫瘤藥物等。到目前為止，對(duì)核桃青皮抗腫瘤活性考察雖有零星報(bào)道，但對(duì)核 桃青皮總單寧抗腫瘤活性成分的研究與開發(fā)尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便、工藝規(guī)范、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)率高的 核桃青皮總單寧制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供核桃青皮總單寧在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
本發(fā)明提出的核桃青皮總單寧的制備方法，包括如下步驟-
(1) 以干燥、粉碎的核桃青皮為原料，按質(zhì)量比為h 1 1: 30加入體積百分濃度為1% 100%的乙醇水溶液，常溫或加熱提取，或利用常壓回流提取裝置提取，或微波或超聲
波輔助提取1 5次，每次10min 96h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1% 60%， 得粗提物；
(2) 加入粗提物質(zhì)量1 10倍的水，攪拌，加入粗提物質(zhì)量1 10倍的正己烷萃取1 10 次，分離，向正己烷萃取剩余相加入粗提物質(zhì)量1 10倍的二氯甲垸萃取1 10次， 分離，向二氯甲垸萃取剩余相加入粗提物質(zhì)量1 10倍的乙酸乙酯萃取1 10次，分 離，得到乙酸乙酯萃取相和最后的水相；(3)將乙酸乙酯萃取相減壓濃縮為原體積的10 80%，冷卻、離心、分離純化得到淺黃色 沉淀即為核桃青皮總單寧。 優(yōu)選的是提取用乙醇水溶液的體積百分濃度為95%。 提取的沃?jǐn)?shù)最好為3次。
用本發(fā)明制備的核桃青皮總單寧的含量為70% 90%。核桃青皮總單寧含量為各類丹寧 含量總和，其測(cè)定參照文獻(xiàn)(MakkarH. RS, "fl/.， Bioresource Technology, 1993， 45(1): 69 71)。經(jīng)后續(xù)HPLC分離純化和MS、 &及13C-NMR等現(xiàn)代波譜技術(shù)對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)解 析、化合物理化性質(zhì)等的檢測(cè)，本發(fā)明所制備的核桃青皮總單寧中含有大量的沒食子酸(gallic acid)、鞣花酸(ellagic acid)、 1,2,6-三沒食子酰葡萄糖(lAG-tri-O-galloyl-ZJ-D-glucopyranoside), 1,3,6-三沒食子酰葡萄糖(1,3，6-tri-0-galloyl-y -D-gluc叩yranoside)、 1,2,4,6-四沒食子酰葡萄糖 (1,2,4,6-tetra墨0-galloyl-,D-glucopyranoside ) 、1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖 (1,2,3,4,6-f'enta-0-galloyl-y5-D-glucopyranoside ) 、 2,3-<9-4,4',5,5'，6,6'-HHDP-(a/y9)-D-葡萄糖 (2,3-0陽4，4',5，5',6,6'-HHDP-(a/灼-D-glucopyranoside)和長(zhǎng)梗馬鈴素(pedunculagin)等單寧類 化合物。
用本發(fā)明制備的核桃青皮總單寧顏色淺、純度高，制備方法具有得率高、生產(chǎn)成本低、 工藝簡(jiǎn)單規(guī)范的特點(diǎn)。
核桃青皮總單寧在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
以MTT法檢測(cè)抗腫瘤活性，結(jié)果顯示核桃青皮總單寧及對(duì)照組柔紅霉素對(duì)急性淋巴母系 胞白血病T(Moh-4細(xì)胞)細(xì)胞系半數(shù)抑制生長(zhǎng)濃度IC5o值相近，表明核桃青皮總單寧對(duì)Molt-4 細(xì)胞株生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，可用于制備抗腫瘤藥物。


圖l為核桃青皮總單寧的制備流程圖。
具體實(shí)施例方式
參考下列實(shí)施例將更容易、更全面地理解本發(fā)明，給出實(shí)施例是為了闡明本發(fā)明，而不 是以任何方式限制本發(fā)明。
本發(fā)明是從胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Jwg/ara)任何一種核桃樹的核桃青皮中制備 總單寧。
實(shí)施例1漾濞泡核桃樹核桃青皮總單寧的制備
(1) 以3.0kg漾濞泡核桃樹C/wg/fl"; Dode，又名三臺(tái)泡核桃、鐵核桃、深刻 紋泡核桃、茶泡核桃等)核桃青皮為原料，干燥、粉碎后，按質(zhì)量比為l: 4加入95%的乙 醇溶液，以常壓回流提取裝置提取3次，每次72h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的5%，得 粗提取物；
(2) 加入粗提物質(zhì)量3倍的水，攪拌，加入粗提取物質(zhì)量3倍的正己烷萃取，萃取4次， 分離，向正己烷萃取剩余相中加入粗提取物質(zhì)量3倍的二氯甲烷萃取，萃取3次，分離，向二氯甲烷萃取剩余相加入粗提取物質(zhì)量3倍的乙酸乙酯，萃取5次，分離乙酸乙酯萃取相和 最后的水相—將乙酸乙酯萃取相減壓濃縮為原體積的20%，得濃縮的乙酸乙酯萃取相；
(3)將乙酸乙酯萃取相減壓濃縮為原體積的20%，冷卻、.離心、分離純化得到淺黃色沉 淀即為的核桃青皮總單寧。
實(shí)施例2野核桃樹核桃青皮總單寧的制備
(1) 以干燥、粉碎的4.0kg野核桃樹(Ag/a似car/w;w7他Dode，別名巴核桃、山核桃 等)核桃青皮為原料，每次用10kg80。/。乙醇水溶液超聲波提取2次，每次lh，過濾，濾液減 壓濃縮至原體積的2%，得粗提物；
(2) 加入粗提物質(zhì)量2倍的水，攪拌，加入粗提取物質(zhì)量2倍的正己烷萃取，萃取4次， 分離，向正己垸萃取剩余相中加入粗提取物質(zhì)量2倍的二氯甲烷萃取，萃取4次，分離，向 二氯甲垸萃取剩余相加入粗提取物質(zhì)量2倍的乙酸乙酯，萃取4次，分離乙酸乙酯萃取相和 最后的水相；
(3) 將乙酸乙酯萃取相減壓濃縮至原體積的30%，冷卻、離心、分離純化得到淺黃色沉 淀即為的核桃青皮總單寧。
實(shí)施例3核桃楸樹核桃青皮總單寧的制備
(1) 以5.0kg干燥、粉碎的核桃楸樹(7wg/ara waTOfe^n'ca Maxim，又名胡桃楸等)核 桃青皮為原料，按質(zhì)量比為l: 20加入體積百分濃度為70%的乙醇水溶液，加熱35 40。C提 取5次，每次24h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的10%，得粗提物；
(2) 加入粗提物質(zhì)量4倍的水，攪拌，加入粗提取物質(zhì)量6倍的正己烷萃取，萃取2次， 分離，向正己烷萃取剩余相中加入粗提取物質(zhì)量6倍的二氯甲烷萃取，萃取2次，分離，向 二氯甲垸萃取剩余相加入粗提取物質(zhì)量6倍的乙酸乙酯，萃取2次，分離乙酸乙酯萃取相和 最后的水相；
(3) 將乙酸乙酯萃取相減壓濃縮至原體積的35%，冷卻、離心、分離純化得到淺黃色沉 淀即為的核桃青皮總單寧。
實(shí)施例4普通核桃樹核桃青皮總單寧的制備
(1) 以3.5kg干燥、粉碎的普通核桃樹C/Mgtow Linn，又名核桃、中國(guó)核桃、胡 桃等)的核桃青皮為原料，按質(zhì)量比為l: 2加入體積百分濃度為60%的乙醇水溶液，常溫提 取3次，每次96h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的6%，得粗提物；
(2) 加入粗提物質(zhì)量4倍的水，攪拌，加入粗提取物質(zhì)量4倍的正己烷萃取，萃取2次， 分離，向正己垸萃取剩余相中加入粗提取物質(zhì)量4倍的二氯甲烷萃取，萃取3次，分離，向 二氯甲垸萃取剩余相加入粗提取物質(zhì)量4倍的乙酸乙酯，萃取5次，分離乙酸乙酯萃取相和 最后的水相口
(3) 將乙酸乙酯萃取相減壓濃縮至原體積的25%，冷卻、離心、分離純化得到淺黃色沉 淀即為的核桃青皮總單寧。
5實(shí)施例5核輛青皮總單寧對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
(1) 供試藥物的配制取實(shí)施例1所得核桃青皮總單寧經(jīng)高壓滅菌，以乙醇溶解為
80mg/ml后作為供試藥，實(shí)驗(yàn)前以培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。以柔紅霉素為對(duì)照組藥品，以生 理鹽水稀釋至50pg/ml，實(shí)驗(yàn)前以培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。
(2) 腫瘤細(xì)胞株的選用與培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞選用急性淋巴母細(xì)胞白血病Molt-4細(xì)胞。培 養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)，另添加適量的HEPES及抗菌素(100 pg/ml的鏈霉素和100U/ml的青霉素)，37'C培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng) 至活力良好，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)將細(xì)胞株調(diào)整細(xì)胞濃度為5xl()S個(gè)細(xì)胞/ml備用。
(3) 以MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性的測(cè)定參照文獻(xiàn)(Mosmann T, Journal of Immunological Methods, 1983， 65: 55 63)。具體是，取Molt-4細(xì)胞，以Hank's液洗3次，以 培養(yǎng)液稀釋，接種于96孔板(5><104個(gè)細(xì)胞吼/100^1)，加入10pl不同濃度的核桃青皮總單 寧或柔紅霉素或同體積培養(yǎng)液，藥物設(shè)8個(gè)濃度，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，置于37'C、 5%的(:02 條件下培養(yǎng)44h后每孔再加入10^1 MTT，繼而再培養(yǎng)4h，最后加入0.4N鹽酸異丙醇100pl 終止反應(yīng)?；靹蚝笥诓ㄩL(zhǎng)595nm下測(cè)定光密度值(OD),以公式1(:5()= (l-OD *鄉(xiāng)/OD對(duì)照組) xl00計(jì)算而得其抑制率(ICs()，半數(shù)抑制生長(zhǎng)濃度)。
(4) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明實(shí)施例1所制備核桃青皮總單寧對(duì)急性淋巴母系胞白血病Molt-4 細(xì)胞半數(shù)抑制生長(zhǎng)濃度ICso為23.8pg/ml，而對(duì)照組柔紅霉素對(duì)Molt-4細(xì)胞的半數(shù)抑制生長(zhǎng) 濃度IC5o為17.2pg/ml。此結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的核桃青皮總單寧對(duì)抑制Molt-4細(xì)胞生 長(zhǎng)具有良好的作用。
權(quán)利要求
1.一種核桃青皮總單寧的制備方法，其特征按順序包括如下步驟(1)以干燥、粉碎的核桃青皮為原料，按質(zhì)量比為1∶1～1∶30加入體積百分濃度為1％～100％的乙醇水溶液，常溫或加熱提取，或利用常壓回流提取裝置提取，或微波或超聲波輔助提取1～5次，每次10min～96h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1％～60％，得粗提物；(2)加入粗提物質(zhì)量1～10倍的水，攪拌，加入粗提物質(zhì)量1～10倍的正己烷萃取1～10次，分離，向正己烷萃取剩余相加入粗提物質(zhì)量1～10倍的二氯甲烷萃取1～10次，分離，向二氯甲烷萃取剩余相加入粗提物質(zhì)量1～10倍的乙酸乙酯萃取1～10次，分離，得到乙酸乙酯萃取相和最后的水相；(3)將乙酸乙酯萃取相減壓濃縮為原體積的10～80％，冷卻、離心、分離純化得到淺黃色沉淀即為核桃青皮總單寧。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的核桃青皮為胡桃科胡桃屬中任何一種核桃樹 的核桃青皮。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述提取用溶液為乙醇水溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述提取用乙醇水溶液的體積百分濃度為1% 100%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述提取的方法包括常溫提取、加熱提取、利用常 壓回流提取裝置提取、微波輔助提取及超聲波輔助提取。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法制備的核桃青皮總單寧在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核桃青皮總單寧的制備方法及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。它以核桃青皮為原料，經(jīng)提取、萃取、沉淀、分離純化而得到核桃青皮總單寧。以本發(fā)明制備的核桃青皮總單寧顏色淺、純度高，制備方法具有得率高、生產(chǎn)成本低、工藝簡(jiǎn)單規(guī)范的特點(diǎn)。本發(fā)明所制備的核桃青皮總單寧對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)A61K36/52GK101618066SQ200910070038
公開日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月4日
發(fā)明者忠 劉, 劉鵬濤, 司傳領(lǐng), 惠嵐峰, 朱振元 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)