專利名稱:一種用于血友病b基因治療的腺病毒載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種腺病毒載體,尤其是一種可以環(huán)化后整合入宿主基因組的用于治 療血友病B的腺病毒載體及其用途。
背景技術(shù):
血友病B是X性染色體連鎖的遺傳性出血性疾病,其病因為凝血因子IX(FIX)基 因缺陷所致,主要臨床表現(xiàn)為反復的自發(fā)性軟組織及大關(guān)節(jié)出血,反復的關(guān)節(jié)出血可導致 退行性血友病關(guān)節(jié)病,嚴重的可以致畸致殘,血友病B患者出血的嚴重程度與循環(huán)中FIX的 水平相關(guān)。目前預防性因子替代療法已經(jīng)大大降低了出血發(fā)生的頻率以及血友病性關(guān)節(jié)疾 病的發(fā)生,并提高了血友病患者的生存期和生活質(zhì)量,但是患者仍存在致命性出血和慢性 關(guān)節(jié)損傷的風險。此外純化FIX價格昂貴,在發(fā)展中國家絕大多數(shù)患者不可能實施終生的 預防性治療。盡管重組FIX因子可以使患者免于輸注血漿濃縮FIX導致的傳染性疾病,但 大多數(shù)發(fā)展中國家的患者仍使用血漿來源的FIX,仍然有感染傳染性疾病的風險。然而血友病B本身的特點為基因治療提供了非常有利的條件①其臨床表現(xiàn)完全 是因單一特異的基因產(chǎn)物FIX缺乏造成的,F(xiàn)IX以微量在血漿中循環(huán);②FIX基因編碼序列 相對較短(約1. 5kb),這使其容易包裝并易于載體轉(zhuǎn)染到靶細胞;③FIX半衰期相對較長 (大約20小時);④功能性的FIX表達不需要特定的組織器官;⑤最重要的是,血漿FIX水 平不需要嚴格的調(diào)控,其血漿水平的輕度升高(生理水平的5%)即可顯著改善患者的出 血癥狀。所以,基因治療作為血友病B的治療手段前景十分看好。目前血友病B的基因治 療主要使用病毒或非病毒載體把hFIX (human FIX)基因轉(zhuǎn)染到靶細胞。病毒載體包括腺病 毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。腺病毒載體是在基因治療、基因免疫等方面應用開發(fā)得較早 的一種基因載體,在美國近三分之一的基因治療臨床試驗中采用腺病毒載體。腺病毒載體 的容量大,安全性高,在體外穩(wěn)定,易于制備與純化,既可感染分裂細胞,又可感染非分裂細 胞并以較高水平表達外源基因。腺病毒載體的不足之處在不能整合到宿主染色體上,所以 不能持續(xù)表達所需產(chǎn)物,表達時間短暫,需重復給予載體制劑治療,但這樣又能刺激免疫反 應,使反復治療的效果會逐漸降低。腺相關(guān)病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建基因轉(zhuǎn)移載體的優(yōu)點是安全穩(wěn) 定,感染宿主細胞廣泛并能特異整合于人的第19號染色體長臂末端,減少了插入突變的可 能性,但是它難以大量生產(chǎn),復制需要輔助病毒,并且包裝外源基因的能力有限,小于5kb, 因此腺相關(guān)病毒的利用受到一定限制。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能使外源基因完全整合到宿主細胞 染色體上,但也有明顯的不足,主要表現(xiàn)在以下幾個方面1)不能感染非分裂的細胞;2)可 能產(chǎn)生具有復制能力的病毒;3)由于是隨機整合,可能會引起“插入誘變”,誘導腫瘤的發(fā) 生。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對單純腺病毒的短效性,逆轉(zhuǎn)錄病毒的不安全 性,腺相關(guān)病毒的包裝復雜性,提供一種定點整合入宿主基因組的安全的用于血友病B基因治療的腺病毒載體及其用途。為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于血友病B基因治療 的腺病毒載體,該載體能同時表達hFIX與紅色熒光蛋白;在hFIX與紅色熒光蛋白串聯(lián)基因 表達框兩側(cè)各有一個方向相同的Cre整合酶作用位點Ioxp位點,在表達框內(nèi)部有位點特異 性整合酶PhiC31的作用位點attB。在其中一個Loxp位點與目的基因啟動子之間存在一個attB位點,使其能在 Phic31整合酶存在的情況被整合到宿主基因組中。所述目的基因表達框5,端的Ioxp與attB相鄰,形成Ioxpattb片段。能表達紅色熒光蛋白,能作為腺病毒包裝時的示蹤蛋白,并且與傳統(tǒng)綠色熒光蛋 白的腺病毒載體相區(qū)分,當兩種腺病毒共同作用與宿主細胞能進行區(qū)分與示蹤。能表達人凝血因子FIX。所述的腺病毒載體或其體外包裝的腺病毒顆粒在治療血友病B藥物中的應用。本發(fā)明的有益效果得到由紅色熒光蛋白標記的DNA可以環(huán)化的重組腺病毒載 體,并為該載體進一步經(jīng)由attb序列整合入宿主基因組中發(fā)揮持久治療血友病B打下基 石出。
圖1載體A中的Ioxp序列。圖 2 載體 C 經(jīng) BamHI 和 BstXI 雙酶切鑒定(1 :DL2000Marker ;2 載體 C BamHI+BstXI)。圖3載體E中Ioxpattb片段測序圖。圖4載體Bgl II和SacI凝膠電泳分析(1 :DL2000marker ;2載體B Bglll+BamHI)。圖 5 含有 loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed-PA-loxp 的穿梭質(zhì)粒載體 E 經(jīng) Sal I 與 Not I 雙酶切鑒定(1 載體 E Sal I+Not I 2 λ HindIIImarker)。圖6穿梭質(zhì)粒載體E中各主要部分的PCR鑒定(1 :DL2000marker ;2 =DsRed產(chǎn)物; 3 =PA-CMV 產(chǎn)物;4 :hFIX 產(chǎn)物)。圖7穿梭質(zhì)粒載體E的構(gòu)建示意圖。圖8pAd-attb-hFIX_DsRed(Ioxp)的凝膠電泳分析(1、2 兩個克隆的Pac I酶切 產(chǎn)物;3 λ HindIII marker)。圖 9pAd-attb-hFIX_DsRed (Ioxp)中主要組分的 PCR 鑒定(1 :DsRed 產(chǎn)物;2 PA-CMV 產(chǎn)物;3 :hFIX 產(chǎn)物;4 :DL2000marker)。圖 10pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)體外轉(zhuǎn)染 293A 后 24h,用 trizol 一步法 提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄,用PCR的方法對hFIX的基因表達進行鑒定(1 以水代替模板陰性 對照;2 轉(zhuǎn)染 pAdtrack 的 293A ;3 轉(zhuǎn)染 pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)的 293A ;4 以 pAd-attb-hFIX-DsRed(Ioxp)質(zhì)粒為模板的陽性對照;5 :DL2000marker)。
具體實施例方式本發(fā)明用于血友病B基因治療的腺病毒載體,該載體能同時表達hFIX與紅色熒光 蛋白;在hFIX與紅色熒光蛋白串聯(lián)基因表達框兩側(cè)各有一個方向相同的Cre整合酶作用位點Ioxp位點,在表達框內(nèi)部有位點特異性整合酶PhiC31的作用位點attB。在其中一個Loxp位點與目的基因啟動子之間存在一個attB位點,使其能在 Phic31整合酶存在的情況被整合到宿主基因組中。所述目的基因表達框5,端的Ioxp與attB相鄰,形成Ioxpattb片段。能表達紅色熒光蛋白,能作為腺病毒包裝時的示蹤蛋白,并且與傳統(tǒng)綠色熒光蛋 白的腺病毒載體相區(qū)分,當兩種腺病毒共同作用與宿主細胞能進行區(qū)分與示蹤。能表達人凝血因子FIX。所述的腺病毒載體或其體外包裝的腺病毒顆粒在治療血友病B藥物中的應用。本發(fā)明通過一系列的載體構(gòu)建過程,提供一種由紅色熒光蛋白為標記物,表達人 凝血因子IX的腺病毒載體,表達框兩側(cè)存在可以被重組酶Cre環(huán)化的兩個方向相同的Ioxp 位點,內(nèi)部加入一個可以被位點特異性整合酶phiC31識別的attB位點。(1)用重疊PCR的方法,從pIRES2-EGFP載體中擴增出加A尾信號PA,在其3’端引 入一個Ioxp序列,并插入載體pShuttle中,酶切位點為KpnI和NotI,其中PA是加polyA 尾的信號,形成載體A ;(2)從h FIX-pIRES2-EGFP中擴增出啟動子CMV,插入該載體原啟動子與h FIX編 碼序列之間的Bgl II與Sac I位點,CMV是最常用的基因啟動子,形成載體B; (3)改造pIRES2-EGFP載體,用PA-CMV替代IRES2序列,酶切位點為BamHI和 BstXI,新載體命名為載體C;(4)從pDsRed2-Cl中克隆出紅色熒光蛋白編碼序列,替換載體A中的綠色熒光蛋 白編碼序列,酶切位點為NotI,構(gòu)成載體D ;(5)以載體A為模板,利用重疊PCR的方法,擴增出Loxp序列,并在其后面加入 attb 序列,形成 Ioxpattb 片段 ATA ACT TCG TAT AGC ATA CATTAT ACG AAG TTA TGG TGC CAG GGC GTG CCC TTG GGC TCC CCG GGC GCG插入到載體D 的 AseI 與 Bgl II 位點,形成載 體E ;(6)載體B經(jīng)由Bgl II與BamH雙酶切,切下其中的CMV-hFIX片段,連入載體E中 的Bgl II與BamH兩酶切位點之間,新載體命名為載體F ;(7)載體F 經(jīng)由 Sal I 和 Not I 雙酶切,切下 loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed, 連入載體A的相應酶切位點中,最終構(gòu)成載體G,該載體成為一個有紅色熒光蛋白標記的, 可以表達hFIX的腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體,此二蛋白表達框兩端由方向相同的Ioxp環(huán) 繞,其中還包含attb位點;(8)將載體G與骨架載體共轉(zhuǎn)染至BJ5183細菌內(nèi),通過細菌內(nèi)同源重組得到重組 載體。(9)該重組腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染293A后,在熒光顯微鏡下可見表達紅色熒光蛋白 的細胞,用hFIX的特異檢測引物,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法可以檢測出hFIX的表達。下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明一、一個Ioxp位點的引入Loxp 是一個 34bp 的序列,為 ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。我們利用 重疊PCR的方法,將該序列引入加A尾信號的3’端,形成PA-Ioxp片段,插入腺病毒穿梭質(zhì) 粒pShuttle中,得到載體A。具體方法如下
1、利用重疊PCR的方法擴增出PA-Ioxp片段。引物序列為PAloxp 1 =ATT gCg gCC gCg ACT CTA gAT CAT AAT C, PAloxp2 :TAA TgT ATg CTA TACgAA gTT ATT TAA gAT ACA TTg ATg AgT Τ, PAloxp3 :CAC ggT ACC ATA ACTTCg TAT AAT gTA TgC TAT ACg AAg TT0 劃線部分分別為NotI和KpnI的酶切位點。反應條件以載體PIRES2-EGFP為模板,以上述 PAloxpl和ΡΑ1οχρ2為引物,進行第一次PCR反應,擴增出PA序列。采用IOOyL體系,具體
如下IOXPCR Buffer (含 Mg2+L 5mM) 10 μ L4 X dNTP (1 OmM/mL)8 μ LPAloxpl4μ LΡΑ1οχρ24 μ L模板4 μ LPyrobest DNA 聚合酶0· 6 μ L_滅菌去離子水補足到100 μ L反應條件為94°C變性 5minute ;94°C變性 30seconds,60°C退火 30seconds, 72°C延 伸Iminute ;72°C延伸7minute,共25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用Takara的小片段DNA回收試劑 盒回收后,用此回收產(chǎn)物作為模板,用PAloxpl和ΡΑ1οχρ3引物再次擴增,方法同上,得到的 PCR產(chǎn)物再次膠回收即為PAloxp片段。2、將片段PAloxp插入pShuttle,形成載體A。pShuttle載體為本室保存。將 PShuttle載體及上述PAloxp片段分別用NotI和KpnI雙酶切,分別膠回收后用Takara T4 連接酶進行連接反應,連接反應按試劑盒要求進行。取連接產(chǎn)物5ul,轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制 備的大腸桿菌(DH5 α)感受態(tài),將感受態(tài)細菌涂布于含有卡那霉素的固體LB平板上。12小 時后挑取單菌落并送測序公司測序鑒定。測序結(jié)果及酶切鑒定(見圖1)均證實,34bp的 Ioxp及PA序列被成功的引入了 pShuttle載體。二、含Ioxpattb序列載體的構(gòu)建1、可獨立表達紅色熒光蛋白的載體的構(gòu)建首先,利用PCR的方法,以 pAdtrack-CMV (本室保存)為模板,將PAPCMV序列克隆到載體pIRES2_EGFP中,替換其中的 IRES2片段。引物分別為PAPCMV1 =ATA rrATCC Tgg AgT TCg TgA CCg CC gCCg g,PAPCMV2 ATA £^_Ig^JI^JggCCggTAgCgCTAgCggATCTg,劃線部分分別為 BamHI 和 BstXI 的酶切位 點。將回收后的PCR產(chǎn)物及pIRES2-EGFP載體分別用BamHI和BstXI雙酶切,分別膠回收 后用Takara T4連接酶進行連接反應,連接反應按試劑盒要求進行。取連接產(chǎn)物5ul,轉(zhuǎn)化 以氯化鈣方法制備的大腸桿菌(DH5ci)感受態(tài),將感受態(tài)細菌涂布于含有卡那霉素的固體 LB平板上。12小時后挑取單菌落并送測序公司測序鑒定。測序結(jié)果及酶切鑒定(見圖2) 均證實載體構(gòu)建成功,如前所述,此載體命名為載體C。然后,將該載體中綠色熒光蛋白編 碼部分替換為紅色熒光蛋白編碼序列。克隆引物分別為DsRedl =CgC CAC CATggC CTC CTC CgA gAA C,DsRed2 =ATA rCr rCC rCC TAC Agg AAC Agg TggTgg Cgg,下劃線部分為 NotI 的酶切位點,模板為pDsRed2-Cl (本室保存)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后經(jīng)NotI單酶切,回收后 備用。載體C先經(jīng)BstXI單酶切,回收后用Takara公司的T4DNA聚合酶按說明書要求將粘 末端削平,在經(jīng)NotI但酶切,回收后與上述處理的DsRed片段進行連接。取連接產(chǎn)物5ul,轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制備的大腸桿菌(DH5ci)感受態(tài),將感受態(tài)細菌涂布于含有卡那霉素的 固體LB平板上。12小時后挑取單菌落并送測序公司測序鑒定。測序結(jié)果證實載體D構(gòu)建 成功。2、Ioxpattb的合成并插入載體利用重疊PCR的方法合成Ioxpattb片段。引物 序列為 loxpattbl =CgC ATT AAT gTC gAC gTC CAA ACT CAT CAATgT ATC Τ, loxpattb2 Mg ggC ACg CCC Tgg CAC CAT AAC TTC gTA TAATgT ATg C, loxpattb3 :ACA AgA TCT CgC gCC Cgg ggA gCC CAA ggg CACgCC CTg gCA CC0 劃線部分分別為 Asel,Sail 和 BglII 的 酶切位點。反應條件以載體A為模板,以上述loxpattbl和loXpattb2為引物,進行第 一次PCR反應,擴增出Ioxp及部分attb序列。反應條件為94°C變性5minute ;94°C變性 30seconds,60°C退火 30seconds,72°C延伸 Iminute ;72°C延伸 7minute,共 25 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物用Takara的小片段DNA回收試劑盒回收后,用此回收產(chǎn)物作為模板,用loxpattbl和 loxpattb3引物再次擴增,方法同上,得到的PCR產(chǎn)物再次膠回收即為Ioxpattb片段ATA ACTTCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA TGG TGC CAG GGC GTG CCC TTG GGC TCC CCG GGCGCG0載體D與Ioxpattb分別用AseI與Bgl II雙酶切,分別膠回收后用TakaraT4連 接酶進行連接反應。取連接產(chǎn)物5ul,轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制備的大腸桿菌(DH5ci)感受態(tài), 將感受態(tài)細菌涂布于含有卡那霉素的固體LB平板上。12小時后挑取單菌落并送測序公司 測序鑒定。測序結(jié)果(見圖3)證實,Ioxpattb片段成功插入載體D,并替換多克隆位點前 的CMV啟動子形成載體E。三、穿梭腺病毒載體的構(gòu)建1、CMV驅(qū)動的hFIX編碼序列的引入。為了將CMV驅(qū)動的hFIX編碼序列加入載體 E的Bgl II和BamHI兩酶切位點之間,我們先將帶有Bgl II酶切位點的CMV啟動子序列插 到 hFIX-pIRES2-EGFP (本室構(gòu)建)hFIX 之前??寺?CMV 的引物為 CMVl =ACg ArA TCT CgA CTC gAg TAg TTA TTA ATA gTA ATCAAT TAC g, CMV2 :ACC rAr CTC ggA TCT gAC ggT TCA CTA AAC CAg C,劃線部分為Bgl II和SacI酶切位點。擴增片段與載體hFIX_pIRES2_EGFP 分別用Bgl II和SacI雙酶切,純化后連接。取連接產(chǎn)物5ul,轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制備的大 腸桿菌(DH5 α)感受態(tài),將感受態(tài)細菌涂布于含有卡那霉素的固體LB平板上。12小時后挑 取單菌落用上述兩種酶切鑒定(見圖4),載體B構(gòu)建成功。載體B經(jīng)Bgl II及BamHI雙酶 切,切下CMV-hFIX片段,與載體E相應酶切后的載體片段連接,轉(zhuǎn)化,篩選,挑取單克隆進行 酶切鑒定,證明載體F構(gòu)建成功。2、載體F與上述插入PA-Ioxp的腺病毒穿梭載體A分別用Sal I與NotI雙酶切, 將載體F中的loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed切下,連入載體A片段中,連接,轉(zhuǎn)化,篩 選,挑取單克隆,提取質(zhì)粒用Sal I與Not I雙酶切鑒定及PCR鑒定(見圖5及圖6)證實 載體G既為目的穿梭質(zhì)粒,構(gòu)建成功,示意圖見圖7,可下一步重組構(gòu)建腺病毒載體。四、重組腺病毒載體的構(gòu)建1、載體G質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶線性化載體G2 μ gPmeIIUIOXNEB buffer4 5μ L100 X BSA0. 5 μ L
_補足去離子水至總體積50 μ L,37°C水浴4小時,95度水浴10分鐘,Takara膠回 收試劑盒純化回收。2、線性化質(zhì)粒的去磷酸化線性化的載體GIUg10XCIAP buffer 5μ LCTAPIU_補足去離子水至總體積50 μ L,37°C水浴4小時,65度水浴30分鐘滅活CIAP,博大
泰克小量膠回收試劑盒濃縮回收。3、BJ5183 pAdEasier_l氯化鈣法感受態(tài)細胞的制備E. coli BJ5183甘油菌復蘇,常規(guī)氯化鈣方法制備BJ5183感受態(tài)細胞。取IyL pAdEasier-Ι質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細胞,鋪鏈霉素/氨芐青霉素雙抗性LB平板(濃度均 為50g/mL),置37°C孵箱培養(yǎng)。12_16h后,挑取數(shù)個克隆,接種于鏈霉素/氨芐青霉素雙抗 性LB培養(yǎng)基,37°C振蕩過夜。次日晨收菌,將含有pAdEasier-Ι質(zhì)粒的BJ5183菌按照常規(guī) 氯化鈣的方法制備BJ5183pAdEasier-l感受態(tài)細胞。4、細菌內(nèi)同源重組及鑒定以回收的CIAP處理的線性化載體G質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)氯化鈣方法制備的 BJ5183pAdEasier-l感受態(tài)細胞,鋪卡那霉素抗性的LB平板,37°C孵箱倒置培養(yǎng)14 16小 時。挑選數(shù)個體積最小的卡那霉素抗性菌落,接種于3mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培 養(yǎng)基內(nèi),37 °C中速振蕩培養(yǎng)過夜。用博大泰克質(zhì)粒抽提試劑盒小量抽提質(zhì)粒DNA,0. 8 %瓊脂 糖凝膠電泳根據(jù)質(zhì)粒大小初步鑒定。選取近40Kb大小的質(zhì)粒,用PCR及PacI酶切的方法 鑒定重組子。PacI酶切反應條件如下候選質(zhì)粒1 μ gPacIIU10XNEB buffer 15 μ L100 X BSA0. 5 μ L_補足去離子水至總體積50μ L,37°C水浴4小時,0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切 結(jié)果。正確的重組子命名為pAd-attb-hFIX-DsRed(Ioxp)(見圖8)。此外還用PCR的方法 對其中的DsRed, PA-CMV, hFIX進行了鑒定(見圖9)。四、pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)載體在體外表達紅色熒光蛋白及phFIX將構(gòu)建好的pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)及陰性對照載體pAdtrack-CMV采用脂 質(zhì)體Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)方法分別轉(zhuǎn)染293A細胞系,24小時后,在熒 光顯微鏡下觀察,可見表達紅色熒光蛋白的細胞;分別收集pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp) 轉(zhuǎn)染的細胞及對照細胞,以Iml Trizol (Invitrogen公司)裂解細胞后,通過氯仿,異丙醇 抽提得到RNA,經(jīng)過紫外分光光度計檢測RNA的純度,取2ugRNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,hFIX的特異檢測引物進行PCR檢測。PCR產(chǎn)物
8進行瓊脂糖凝膠電泳,可見pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)轉(zhuǎn)然的細胞有hFIX的表達(見圖 10)。本發(fā)明中的腺病毒載體除其自身的優(yōu)點外,能夠整合到宿主基因組,且安全性比 逆轉(zhuǎn)錄載體高,兼有上述三種載體的優(yōu)點,又能克服它們的不足。Loxp是重組酶Cre的識別位點。如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上,且方向 相同,Cre重組酶能將兩個LoxP位點間的序列以環(huán)化的形式切出。attB原是細菌基因組中 的附著點。鏈霉菌cpC31噬菌體整合酶((pC31-int)是一種位點特異性重組酶,該酶能識別 噬菌體附著位點(attp)和宿主基因組上的attB,介導二者同源序列之間的位點特異性重 組。在人或小鼠細胞中表達的cpC31-int能夠識別基因組中的假attp位點(pseudo-attp) 和外源載體中的attB位點,將環(huán)形的帶有目的片段的載體位點特異性的整合到基因組中。 cpC31位點特異性整合酶系統(tǒng)在完成有效的基因轉(zhuǎn)移過程中安全性高,由于是定點整合而 非隨機整合,引起畸形、癌變的機率幾乎為零,而且pseudo-attP位點周圍不存在功能基 因,重組不會引起新的變異,也不影響外源基因的表達。綜上所述,本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中,相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可 以在本發(fā)明的技術(shù)指導思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例,但這種實施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
9
權(quán)利要求
一種用于血友病B基因治療的腺病毒載體,其特征在于,該載體能同時表達hFIX與紅色熒光蛋白;在hFIX與紅色熒光蛋白串聯(lián)基因表達框兩側(cè)各有一個方向相同的Cre整合酶作用位點loxp位點,在表達框內(nèi)部有位點特異性整合酶PhiC31的作用位點attB。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于血友病B基因治療的腺病毒載體,其特征在于,在其中一 個Loxp位點與目的基因啟動子之間存在一個attB位點,使其能在Phic31整合酶存在的情 況被整合到宿主基因組中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于血友病B基因治療的腺病毒載體,其特征在于,所述目的 基因表達框5,端的Ioxp與attB相鄰,形成Ioxpattb片段。
4.根據(jù)權(quán)利1所述的用于血友病B基因治療的腺病毒載體,其特征在于,能表達紅色熒 光蛋白,能作為腺病毒包裝時的示蹤蛋白,并且與傳統(tǒng)綠色熒光蛋白的腺病毒載體相區(qū)分, 當兩種腺病毒共同作用與宿主細胞能進行區(qū)分與示蹤。
5.根據(jù)權(quán)利1所述的腺病毒載體,其特征在于,能表達人凝血因子FIX。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4、5中任一項所述的腺病毒載體或其體外包裝的腺病毒顆粒在治 療血友病B藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于血友病B基因治療的腺病毒載體及其用途,該載體能同時表達hFIX與紅色熒光蛋白;在hFIX與紅色熒光蛋白串聯(lián)基因表達框兩側(cè)各有一個方向相同的Cre整合酶作用位點loxp位點,在表達框內(nèi)部有位點特異性整合酶PhiC31的作用位點attB。本發(fā)明得到由紅色熒光蛋白標記的DNA可以環(huán)化的重組腺病毒載體,并為該載體進一步經(jīng)由attb序列整合入宿主基因組中發(fā)揮持久治療血友病B打下基礎(chǔ)。所述的腺病毒載體或其體外包裝的腺病毒顆粒在治療血友病B藥物中的應用。
文檔編號A61P7/04GK101935674SQ20091006951
公開日2011年1月5日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者張磊, 杜偉廷, 楊仁池, 薛峰, 顧東生 申請人:中國醫(yī)學科學院血液學研究所