一種多肽及包含該多肽的核酸藥物納米粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多肽及包含該多肽的核酸藥物納米粒。所述多肽包含帶正電荷的第一片段和具有靶向功能的第二片段。利用該段多肽作為核酸藥物傳遞載體，其第一片段通過靜電作用與聚負電荷的核酸結(jié)合，形成復(fù)合物，第二片段則與肝癌細胞表面的受體結(jié)合，將核酸通過被動靶向及主動靶向而濃集于肝癌組織，大大提高了核酸藥物的靶向性，減少核酸藥物的使用劑量；利用本發(fā)明方法制備的多肽-核酸納米粒穩(wěn)定性好，用藥安全性高，尺寸為20-300納米，制備過程簡單可控，容易規(guī)?；糯笊a(chǎn)。
【專利說明】一種多肽及包含該多肽的核酸藥物納米粒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種核酸藥物制劑，具體涉及一種多肽及包含該多肽的核酸藥物納米粒。
【背景技術(shù)】
[0002]肝癌是世界上最常見、惡性度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第6位,致死率第3位。中國肝癌發(fā)病例數(shù)占全球55%，已成為致死率第2位的惡性腫瘤，每年有超過30萬例肝癌患者死亡。治療癌癥的一種方法是利用RNA干擾引起的基因沉默。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是1998年被發(fā)現(xiàn)并命名的一種抑制同源基因表達的現(xiàn)象。它通過小核酸分子與內(nèi)源性mRNA形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA_induced silencingcomplex, RISC),并迅速降解祀向mRNA,從而高效、特異地抑制目標基因的表達。大量的體外研究都已經(jīng)證實了靶向癌基因的siRNA等小核酸分子可以有效抑制腫瘤細胞的生長與侵襲。與目前的一些靶向藥物相比，它能實現(xiàn)單一特異性的精確抑制目的蛋白信號通路。
[0003]然而，RNA干擾技術(shù)遲遲未進入臨床腫瘤治療，主要原因是:(I)要實現(xiàn)RNA干擾技術(shù)中所使用的材料如 siRNA、microRNA、short hairpin RNA、duplex RNA 等進入 RNA干擾機制，首先必須讓其進入細胞內(nèi)，但RNA是帶高負電荷的親水性分子，而且溶脂性極差，無法穿透細胞膜或被細胞內(nèi)吞，在體外研究中可以采用物理或化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑的方法(如Iipofectamine)而使RNA進入細胞,但體內(nèi)時很難實現(xiàn)；(2)RNA穩(wěn)定性差,在血衆(zhòng)中的半衰期僅為幾分鐘，同時由于具有免疫原性，其進入機體后會被免疫系統(tǒng)識別并迅速清除；(3)RNA缺乏靶向性， 即使進入體內(nèi)后也不能靶向性地進入特定組織(如腫瘤細胞)內(nèi)。
[0004]如果能將siRNA等小核酸分子完整穩(wěn)定地運輸?shù)桨屑毎琑NAi技術(shù)有望進入臨床治療階段。常用的基因傳遞載體主要分為病毒類和非病毒類。與病毒類載體相比，非病毒載體生物安全性較高，而且通過材料的合理設(shè)計與合成能夠使載體具有較好的靶向能力與核酸藥物的釋放能力，因而近幾年得到了足夠的重視。常見的非病毒基因藥物的傳遞載體往往為帶有正電的陽離子化合物，包括聚陽離子、正電磷脂、殼聚糖、白蛋白、樹枝狀大分子以及多肽等，它們通過帶正電的基團中和RNA上的負電磷酸基團，從而將核酸壓縮保護成復(fù)合物顆粒，使得核酸藥物能夠順利通過各種生物障礙，而完成基因傳遞。由于腫瘤部位的血管大量增生，與正常組織相比，具有如下特點:腫瘤血管的壁間隙較大、淋巴回流缺失，具有納米尺寸(一般為<400nm)的材料對腫瘤血管具有比較高的通透性及滯留性(稱為EPR效應(yīng))。因此設(shè)計更穩(wěn)定、尺寸大小合適的載體體系是體內(nèi)RNAi取得較好效果的先決條件。
[0005]多肽在作為基因載體上具有很多合成高分子不具備的優(yōu)勢:多肽有20種性質(zhì)各異的氨基酸可以組成性質(zhì)豐富的一級序列；通過設(shè)計可以拿到beta折疊或者alpha螺旋等二級結(jié)構(gòu)；通過固相合成可以拿到純度高、分布單一、結(jié)構(gòu)明確的分子；可以很方便的改性或者連入生物可識別功能的靶向序列提高專一性。以多肽為原料的藥物具有生產(chǎn)成本低、在體內(nèi)可降解為氨基酸并被重復(fù)利用、生物相容性較高等優(yōu)勢而成為現(xiàn)代藥物開發(fā)領(lǐng)域的熱點。同時，一些多肽能夠與某些腫瘤細胞表面的受體相互作用，作為抗體的替代產(chǎn)品，能夠克服抗體生產(chǎn)成本高，分子量大等劣勢，在腫瘤靶向藥物載體使用中近些年廣受關(guān)注，已成為最新的下一代靶向藥物。此外，多肽中某些富含精氨酸(Arg)或者賴氨酸(Lys)的序列由于帶較多正電荷，因此能夠與帶負電的核酸分子通過靜電相互作用形成復(fù)合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種用作核酸藥物傳遞載體的多肽，利用該多肽能夠通過簡單混合的方式與核酸形成不同N/P比例、具有納米粒徑、穩(wěn)定的復(fù)合物，用以進行核酸體外和體內(nèi)的傳遞和運送。
[0007]—種多肽，包含帶正電荷的第一片段和具有祀向功能的第二片段。
[0008]利用該段多肽作為核酸藥物傳遞載體，其第一片段通過靜電作用與聚負電荷的核酸結(jié)合，形成復(fù)合物，第二片段則與肝癌細胞表面的受體結(jié)合，將核酸傳遞至肝癌細胞中，從而達到腫瘤治療的目的。
[0009]作為優(yōu)選，所述第一片段含有5~100個氨基酸殘基；更優(yōu)選為7~12個氨基酸殘基；最優(yōu)選為9個氨基酸殘基。由于肽鏈較短，因此生產(chǎn)成本較低。氨基酸殘基數(shù)目可視其傳遞的多核苷酸分子的大小而定。
[0010]優(yōu)選地，所述第一片段由帶正電荷的氨基酸縮合而成，所述帶正電荷的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。優(yōu)選地，所述帶正電荷的氨基酸為D型氨基酸，更優(yōu)選為D型精氨酸。D型氨基酸與核酸的親和力比 L型氨基酸更好，保證與核酸形成的納米復(fù)合物具有更高的穩(wěn)定性，利于體內(nèi)輸送。
[0011]本發(fā)明中，所述第二片段靶向肝癌細胞。作為優(yōu)選，所述第二片段的氨基酸序列為SFSIIHTPILP。
[0012]作為優(yōu)選，所述多肽的氨基酸序列(命名為SP94-dR)如下所示:
[0013]SFSIIHTPILPLGGGGRRRRRRRRR (R 為 D 型 Arg) (SEQ ID N0.1)，第一片段由 9 個 D 型精氨酸構(gòu)成，第二片段與第一片段之間通過4個甘氨酸殘基連接起來。
[0014]本發(fā)明還提供了所述多肽在作為核酸藥物載體中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明還提供了一種核酸藥物納米粒，包含具有治療作用的核酸和所述多肽，所述多肽中的第一片段通過靜電作用與所述核酸凝聚，形成復(fù)合體。
[0016]本發(fā)明中，所述核酸藥物納米粒的粒徑為20~300納米，對腫瘤血管具有比較高的通透性及滯留性。
[0017]所述核酸可以是RNA沉默劑，如siRNA、miRNA、反義寡核苷酸和核糖核酸酶，也可以是長鏈的DNA或RNA。作為優(yōu)選,所述核酸為siRNA或者miRNA。作為進一步優(yōu)選,所述RNA沉默劑為靶向Foxo3a基因的siRNA。
[0018]本發(fā)明中，所述siRNA包括:
[0019]正義鏈為:5’-GCACAGAGUUGGAUGAAGUTT-3’ ；
[0020]反義鏈為:5’-ACUUCAUCCAACUCUGUGCTT-3’。
[0021]FoXo3a基因是肝癌細胞中的高表達基因，本發(fā)明針對該基因設(shè)計特異沉默的siRNA,該小干擾RNA能夠高效地下調(diào)Foxo3a基因的表達。
[0022]本發(fā)明還提供了一種所述核酸藥物納米粒的制備方法，包括將如權(quán)利要求1~5任一所述的嵌段多肽與核酸藥物以摩爾比5:1~100:1混合，靜置10~25min。[0023]作為優(yōu)選，將多肽與核酸以摩爾比10:1~20:1混合，靜置15~20min?；旌虾?，多肽與核酸通過靜電相互作用形成具有納米粒徑的、穩(wěn)定的多肽-核酸納米粒，即所述核酸藥物納米粒。
[0024]利用SEQ ID N0.1所示的多肽與所述小干擾RNA以20:1摩爾比混合，制備獲得的核酸藥物納米粒，DLS測定顯示其平均粒徑約為190nm，多分散指數(shù)為0.137，可見該核酸藥物納米粒的粒徑分布較窄，納米粒的大小較為均一。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0026](I)本發(fā)明的多肽作為一種核酸藥物的傳遞載體，使用寡精氨酸作為其第一片段與聚負電荷的核酸結(jié)合，形成多肽-核酸納米粒，降低了載體對細胞的毒性。該載體跟細胞混合培養(yǎng)48小時無明顯毒性。
[0027](2)在納米粒表面的多肽的第二片段則能夠與肝癌細胞表面的受體結(jié)合，將核酸通過主動靶向而濃集于肝癌組織，大大提高了核酸藥物的靶向性，減少核酸藥物的使用劑量。
[0028](3)利用本發(fā)明方法制備的多肽-核酸納米粒穩(wěn)定性好，用藥安全性高，尺寸為20-300納米，制備過程簡單可控，容易規(guī)模化放大生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為多肽SP94_dR與SiRNA復(fù)合的瓊脂糖電泳分析結(jié)果，其中nakedsiRNA表示未與多肽SP94-dR結(jié)合的siRNA ；Heparin表示肝素；
[0030]圖2為SP94_dR/siR`NA納米粒的透射電鏡分析結(jié)果；
[0031]圖3為SP94-dR/siRNA納米粒的DLS粒徑測定結(jié)果，其中，橫坐標Size (nm)表示粒徑(nm),縱坐標intensity表示強度；
[0032]圖4為Western blot檢測SP94_dR/siF0X納米粒對肝癌細胞Huh7中Foxo3a蛋白表達的干擾結(jié)果；
[0033]圖5為Western blot檢測SP94_dR/siF0X納米粒對肺癌細胞H1299中Foxo3a蛋白表達的干擾結(jié)果；
[0034]圖6為注射SP94_dR/Cy5.5-0DN納米粒后小鼠臟器解剖后的離體紅外成像結(jié)果圖，其中，heart表示心臟，liver表示肝臟，spleen表示脾臟，Iung表示肺，kidneys表示腎，liver tumor表示肝癌組織，high表示(突光強度)高，low表示(突光強度)低。
【具體實施方式】
[0035]實施例1多肽-核酸納米粒的制備
[0036]設(shè)計并固相合成如下序列的多肽:
[0037]SFSIIHTPILPLGGGGRRRRRRRRR(R 為 D 型精氨酸，以下簡稱 SP94-dR)；
[0038]以肝癌細胞高表達的Foxo3a為靶向基因設(shè)計小干擾RNA(以下簡稱siFOX)，siFOX的正義鏈為:5’ -GCACAGAGUUGGAUGAAGUTT-3’ ；反義鏈為:5’ -ACUUCAUCCAACUCUGUGCTT-3’ ；
[0039]使siFOX與SP94_dR在DEPC水中以不同摩爾比(1:1-1:20)混合后，室溫靜置15min，使用2%的瓊脂糖電泳分析兩者的復(fù)合程度。結(jié)果顯示兩者的摩爾比為1:20時，siRNA的條帶消失，說明siRNA與該多肽形成了復(fù)合物(圖1)。而該復(fù)合物在添加具有更高負電荷的肝素后又重新出現(xiàn)。
[0040]當(dāng)摩爾比為1:20 (反應(yīng)完成后不需要分離，可以直接使用)獲得的多肽-核酸納米粒的平均粒徑約為190nm，多分散指數(shù)為0.137，透射電鏡及DLS粒徑測定結(jié)果分別如圖2與圖3所示。
[0041]實施例2:納米粒對肝癌細胞Huh7中目標基因Foxo3a的干擾
[0042](I)將實施例1制備的SP94_dR/siF0X納米粒添加到生長有Huh7細胞的Opt1-MEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中SP94-dR/siF0X納米粒的終濃度為12.5-100nM ；
[0043](2)將培養(yǎng)皿置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后置換成新鮮的不含有SP94-dR/siF0X納米粒的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時；
[0044](3)回收 Huh7 細胞，用 RIPA 裂解液裂解 30min，利用 Western blot 檢測 SP94_dR/siFOX納米粒對Foxo3a蛋白表達的干擾結(jié)果,檢測結(jié)果如圖4所示。
[0045]結(jié)果顯示:SP94-dR/siF0X納米粒能夠把siFOX靶向到肝癌細胞并且高效地下調(diào)目標基因Foxo3a的表達水平。
[0046]實施例3:納米粒對肺癌細胞H1299中目標基因Foxo3a的干擾
[0047](I)將實施例1制備的SP94-dR/siF0X納米粒添加到生長有Hl299細胞的Opt1-MEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中SP94-dR/siF0X納米粒的終濃度為12.5_200nM ；
[0048](2)將培養(yǎng)皿置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后置換成新鮮的不含有SP94-dR/siF0X納米粒的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時；
`[0049](3)回收H1299 細胞，用 RIPA裂解液裂解 30min，利用 Western blot 檢測 SP94_dR/siFOX納米粒對Foxo3a蛋白表達的干擾結(jié)果,檢測結(jié)果如圖5所示。
[0050]結(jié)果顯示:SP94-dR/siF0X納米粒不能下調(diào)肺癌H1299細胞中的目標基因Foxo3a的表達，說明該納米粒具有對肝癌細胞的選擇性。
[0051]實施例4:SP94-dR/核酸納米粒的動物實驗
[0052]為了更好地評價攜帶核酸的多肽納米粒對體內(nèi)腫瘤的靶向性能，本實施例用原位肝癌97H移植瘤模型來論證。
[0053]將Cy5.5標記的寡核苷酸(簡稱Cy5.5-0DN,其中寡核苷酸的堿基序列為:5’ -TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3’)與SP94-dR多肽以摩爾比1:10混合，采用與實施例1相同的方法復(fù)合生成納米粒，將該納米粒制成Cy5.5-0DN濃度為50 u g/mL的溶液，取0.2mL該溶液對小鼠進行尾靜脈注射，24小時后進行臟器解剖后的離體紅外成像。成像結(jié)果如圖6所
/Jn o
[0054]實驗結(jié)果顯示:該納米粒具有優(yōu)秀的腫瘤靶向性，與其他臟器相比，Cy5.5-0DN主要集中在腫瘤部位。
【權(quán)利要求】
1.一種多肽，其特征在于，包含帶正電荷的第一片段和具有靶向功能的第二片段。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一片段含有5~100個氨基酸殘基。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第二片段靶向肝癌細胞。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一片段由帶正電荷的氨基酸縮合而成，所述帶正電荷的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，所述帶正電荷的氨基酸為D型氨基酸。
6.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQID N0.1所/Jn ο
7.如權(quán)利要求1~6任一所述的多肽在作為核酸藥物載體中的應(yīng)用。
8.—種核酸藥物納米粒，其特征在于，包含具有治療作用的核酸和如權(quán)利要求1~6任一所述的多肽，所述多肽中的第一片段通過靜電作用與所述核酸凝聚，形成復(fù)合體。
9.如權(quán)利要求8所述的核酸藥物納米粒，其特征在于，所述核酸為RNA沉默劑。
10.如權(quán)利要求 8所述的核酸藥物納米粒,其特征在于,所述納米粒的粒徑為20~300納米。
【文檔編號】A61P1/16GK103804473SQ201410031237
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】徐驍, 王杭祥, 陳偉, 魏緒勇, 謝海洋, 周琳, 鄭樹森 申請人:浙江大學(xué)