用于將gdnf和bdnf遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于將GDNF和BDNF遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的融合蛋白，其包括充當(dāng)穿過血腦屏障的載體的肽載體如angiopep-2，連接于膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、或相關(guān)分子，如它們的類似物或片段。本發(fā)明的化合物可以用來治療其中期望增加神經(jīng)元存活或生長(zhǎng)的任何疾病，例如神經(jīng)變性疾病如帕金森病或肌萎縮側(cè)索硬化。能夠利用所述化合物進(jìn)行治療的其他疾病包括精神分裂癥和抑郁癥。
【專利說明】用于將GDNF和BDNF遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的融合蛋白
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年6月11日的題為“用于將⑶NF和BDNF遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的融合蛋白”的中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01080031759.6的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種包括肽載體和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)或腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的軛合物(結(jié)合物或共軛物，conjugate)，及其用途。
【背景技術(shù)】
[0003]與神經(jīng)元損失或損傷相關(guān)的疾病是嚴(yán)重病癥并且在世界范圍內(nèi)影響數(shù)百萬人。盡管療法如GDNF在治療神經(jīng)變性病如帕金森病中具有前景，但是在本發(fā)明之前，這樣的療法至腦的遞送由于活性劑不能穿過(跨越或越過，cross)血腦屏障而是復(fù)雜的。事實(shí)上，涉及用于帕金森病的GDNF療法的先前臨床試驗(yàn)要求使用將藥劑直接注入腦中，并且用于治療肌萎縮側(cè)索硬化的BDNF試驗(yàn)涉及藥劑的胸內(nèi)注射。這些方法是繁瑣且困難的。
[0004]由于對(duì)于其中增加神經(jīng)元存活或生長(zhǎng)是有益的各種各樣的疾病的治療性治療存在需要，所以期望具有穿過血腦屏障的能力的基于⑶NF和BDNF的治療劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]現(xiàn)在本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了這樣的化合物，其包括軛合至⑶NF、BDNF、或相關(guān)分子的肽載體(peptide vector)。這些化合物可以例舉包括⑶NF或BDNF序列和Angiopep-2序列的融合蛋白。在某些實(shí)施方式中，這些化合物能夠穿過血腦屏障，并因此可以用作治療具有神經(jīng)變性疾病或神經(jīng)元受損的對(duì)象(個(gè)體，subject)的治療劑。
[0006]因此，在第一方面 ，本發(fā)明的特征在于一種包括下式的化合物
[0007]A-X-B
[0008]其中A是肽載體；B是與以下基本上相同(具有統(tǒng)一性的，identical)的多肽:(i)GDNF、其具有至少一種GDNF活性的片段、或GDNF類似物(例如本文中描述的任一種)；或
(ii)BDNF、其具有至少一種BDNF活性的片段、或BDNF類似物(例如本文中描述的任一種)；以及X是結(jié)合A與B的連接物(接頭，linker)(例如本文中描述的任一種)。該化合物可以能夠(例如有效地)穿過血腦屏障。該化合物可以包括⑶NF的成熟形式(例如亞型I的氨基酸118-211)或BDNF的成熟形式(例如亞型A的氨基酸129-247)。⑶NF片段可以包括或可以是亞型I的氨基酸78-211。該化合物可以進(jìn)一步包括標(biāo)簽(tag)如His標(biāo)簽，或切割位點(diǎn)如凝血酶切割位點(diǎn)。在某些是實(shí)施方式中，該化合物具有圖2或圖14所示的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，X是肽鍵或X是至少一個(gè)氨基酸，其中A和B各自通過肽鍵共價(jià)地鍵接于X。在某些實(shí)施方式中，連接物是柔性連接物(例如(GGGGS)n，其中η為1、2或3)、剛性連接物(例如PAPAP和(PT)nP，其中η為2、3、4、5、6或7)，或者α -螺旋連接物(例如A(EAAAK)ηΑ，其中η為1、2、3、4或5)。肽載體可以存在于⑶NF、BDNF或相關(guān)分子的N-或C-端。本發(fā)明的特征還在于一種編碼該化合物的核酸分子，其中X是肽鍵、氨基酸或肽連接物。該核酸可以是載體的一部分，并且該核酸可以可操作地(operably)連接于啟動(dòng)子。本發(fā)明的特征還在于一種通過在細(xì)胞中表達(dá)由所述載體編碼的多肽，并純化該多肽而制備一種化合物的方法。本發(fā)明的特征還在于一種通過在固體支撐物(固體載體，solid support)上合成所述化合物而制備該化合物的方法。
[0009]在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種治療(例如預(yù)防地)具有神經(jīng)變性病或神經(jīng)元受損或損傷的對(duì)象(例如人)的方法，通過給予該對(duì)象有效量的本發(fā)明的化合物。神經(jīng)變性病可以選自由多聚谷氨酰胺序列延長(zhǎng)病(多聚谷氨酰胺擴(kuò)張紊亂，polyglutamineexpansion disorder)、脆性X染色體綜合征、脆性XE精神發(fā)育遲緩、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥(Friedreich’ sataxia)、營(yíng)養(yǎng)不良性肌強(qiáng)直(myotonic dystrophy)、8型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxia type8)和12型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、亞歷山大病(Alexander disease)、阿耳拍病(Alper，s disease)、阿爾茨海默病(Alzheimer’ sdisease)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telangiectasia)、Batten 病(Batten disease, SVSB 四氏病(SpieImeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease))、卡納萬病(Canavan disease)、Cockayne綜合征(Cockayne syndrome)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(Corticobasal degeneration)、克雅二氏病(Ceutzfeldt-Jakob disease)、缺血性中風(fēng)(ischemia stroke)> 克拉伯病(Krabbedisease)、Lewy體癡呆(Lewy body dementia)、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮(multiple systematrophy)> 帕金森病、佩-梅二氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、匹克病(Pick，sdisease)、原發(fā)性側(cè)索硬化(primary lateral sclerosis)、植燒酸忙積癥(Refsum，sdisease)、Sandhoff 病(Sandhoff disease)、謝耳德病(Schilder，s disease)、脊髓損傷(spinal cord injury)、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy)、SRO 三氏病(Steele-Richardson-Olszewski disease)、以及脊髓瘦(Tabes dorsalis)組成的組。多聚谷氨酰胺復(fù)發(fā)病(polyglutamine repeat disease)可以是亨廷頓氏病(HD)、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮(dentatorubropallidoluysian atrophy)、肯尼迪病(Kennedy，sdisease)(也稱為脊髓延髓肌萎縮(spinobulbar muscular atrophy)),或選自由I型、2型、3型(馬-約病(Machado-Josep`h disease))、6型、7型、和17型組成的組中的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxia)。神經(jīng)元損傷可以由缺血性中風(fēng)、出血性中風(fēng)(hemorrhagic stroke)、或脊髓受損引起。能夠利用本發(fā)明的化合物治療的其他疾病包括抑郁癥和精神分裂癥(schizophrenia)。
[0010]在以上這些方面的特定實(shí)施方式中，A是Angiop印-2 (SEQ ID N0:97)，X是肽鍵，而B是h⑶NF78_211，其中A通過X結(jié)合于B的N-端；A是Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X是肽鍵，而B是h⑶NF78_211,其中A通過X連接于B的C-端；A是反向Angiopep-2 (reversedAngiopep-2)(SEQ ID NO: 117)，X是肽鍵，而B是h⑶NF78_211，其中A通過X連接于B的N-端；A 是 Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X 是(GGGGS)2，而 B 是 h⑶NF78_211，其中 A 通過 X 連接于 B的N-端汸是么叩化口印-2 (SEQID N0:97)，X是PAPAP，而B是h⑶NF78_211，其中A通過X連接于 B 的 N-端；或 A 是 Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X 是 A(EAAAK)2A，而 B 是 h⑶NF78-211，其中A通過X連接于B的N-端。
[0011]在以上方面的任一個(gè)中，肽載體可以是與表1列出的序列中的任一個(gè)基本相同的多肽、或其片段。在某些實(shí)施方式中，肽載體具有Angiop印-1 (SEQ ID N0:67)、Angiopep-2 (SEQ ID N0:97)、Angiopep-3 (SEQ ID NO: 107)、Angiopep_4a (SEQ IDNO: 108)、Angiopep_4b (SEQ ID NO: 109)、Angiopep-5 (SEQ ID NO: 110)、Angiopep-6(SEQ ID NO: 111)、Angiop印-7 (SEQ ID NO: 112)、或反向 Angiop印-2 (SEQ ID NO: 117)的序列。本發(fā)明的肽載體或化合物可以被有效地輸送到特定細(xì)胞型(例如，肝、肺、腎、脾和肌肉中的任一種、兩種、二種、四種或五種)，或可以有效地穿過哺乳動(dòng)物BBB (例如Angiopep-1、-2、-3、-4a> -4b> -5、以及-6)。在另一實(shí)施方式中,肽載體或化合物能夠進(jìn)入特定細(xì)胞型(例如，肝、肺、腎、脾和肌肉中的任一種、兩種、三種、四種或五種)，但不會(huì)有效地穿過BBB (例如包括Angiop印-7的軛合物)。肽載體可以為任意長(zhǎng)度，例如至少6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200、或 500 個(gè)氨基酸，或者是這些數(shù)值之間的任意范圍。在某些實(shí)施方式中，肽載體的長(zhǎng)度為10~50個(gè)氨基酸。多肽可以通過重組遺傳技術(shù)或化學(xué)合成生產(chǎn)。
[0012]表1:示例性肽載體
【權(quán)利要求】
1.一種包含下式的化合物:
A-X-B 其中，A包括與選自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向Angiop印_2(SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQ ID NO:67)、cys_Angiopep-2 (SEQ ID NO: 113)和 Angiopep-2-cys (SEQID NO: 114)組成的組中的序列至少70%相同的氨基酸序列；B是與以下基本相同的多肽: ⑶NF、其具有至少一種⑶NF活性的片段、或⑶NF類似物； 以及 X是將A結(jié)合于B的連接物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述化合物能夠穿過血腦屏障。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述B包括GDNF的成熟形式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述序列同一性為至少90%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，A包括選自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向 Angiopep-2 (SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQ ID NO:67)、cys-Angiopep-2 (SEQID NO: 113)和 Angiopep-2-cys (SEQ ID NO: 114)組成的組中的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中，A由選自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向 Angiopep-2 (SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQID NO:67)、cys-Angiopep-2 (SEQ IDNO: 113)和Angiopep·-2-cys (SEQ ID NO: 114)組成的組中的氨基酸序列構(gòu)成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，X是肽鍵。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，X是至少一個(gè)氨基酸；并且A和B各自通過肽鍵共價(jià)鍵接于X。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其中，X選自由以下構(gòu)成的組:(GGGGS)n，其中η為1、2 或 3 ;PAPAP ; (PT)pP，其中 ρ 為 2、3、4、5、6 或 7 ;以及 A (EAAAK) qA，其中 q 為 1、2、3、4 或 5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ ID N0:97);X是肽鍵;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiopep-2(SEQ ID N0:97);X是肽鍵;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的C-端。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是反向Angiop印-2(SEQ ID N0:117);X是肽鍵；以及B是h⑶NF78_211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ ID N0:97);X是(GGGGS) 2 ;以及B是h⑶NF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQID NO:97);X是PAPAP ;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ IDN0:97);X是A (EAAAK) 2A ;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
16.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)所述的化合物的核酸分子。
17.一種載體，包括根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸分子，其中，所述核酸可操作地連接于啟動(dòng)子。
18.一種制備根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的化合物的方法，所述方法包括在細(xì)胞中表達(dá)由根據(jù)權(quán)利要求17所述的載體編碼的多肽，以及純化所述多肽。
19.一種制備根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的化合物的方法，所述方法包括在固體載體上合成所述化合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療具有神經(jīng)變性疾病的對(duì)象的藥物中的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中，所述神經(jīng)變性疾病選自由以下組成的組:多聚谷氨酰胺序列延長(zhǎng)病、脆性X染色體綜合征、脆性XE精神發(fā)育遲緩、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥、營(yíng)養(yǎng)不良性肌強(qiáng)直、8型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、和12型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、亞歷山大病、阿耳珀病、阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、Batten病(SVSB四氏病)、卡納萬病、Cockayne綜合征、皮質(zhì)基底節(jié)變性、克雅二氏病、缺血性中風(fēng)、克拉伯病、Lewy體癡呆、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮、帕金森病、佩-梅二氏病、匹克病、原發(fā)性側(cè)索硬化、植烷酸貯積癥、SandhofT病、謝耳德病、脊髓損傷、脊髓性肌萎縮、SRO三氏病以及脊髓癆。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中，所述多聚谷氨酰胺復(fù)發(fā)病是亨廷頓氏病(HD)、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮、肯尼迪病(也稱為脊髓延髓肌萎縮)，或選自由I型、2型、3型(馬-約病)、6型、7型和17型組成的組中的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中，所述對(duì)象是人。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療具有神經(jīng)元損傷的對(duì)象的藥物中的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，其中，所述神經(jīng)元損傷是由缺血性中風(fēng)、出血性中風(fēng)或脊髓受損引起的。
26.根據(jù)權(quán)利要求24 所述的用途，其中，所述對(duì)象是人。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療具有抑郁癥的對(duì)象的藥物中的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途，其中，所述對(duì)象是人。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療具有精神分裂癥的對(duì)象的藥物中的用途。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的用途，其中，所述對(duì)象是人。
【文檔編號(hào)】A61P25/18GK103819564SQ201410030902
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2009年6月11日
【發(fā)明者】米歇爾·德默勒, 多米尼克·波依溫, 讓-保羅·卡斯泰恩 申請(qǐng)人:安吉奧開米公司