本發(fā)明屬于仿生學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于牙周組織缺損修復(fù)的仿生層狀支架及其制備方法。

背景技術(shù)：

牙周炎所造成的牙周附著喪失和牙槽骨缺損,可能導(dǎo)致牙齒最終喪失，該病在我國有較高的發(fā)病率，現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的口腔疾病之一。

目前臨床上牙周病的治療原則主要是通過控制口腔內(nèi)菌斑及微生物、清除牙石、改善口腔微環(huán)境等方法來消除牙周致病因素和控制炎癥。具體方法包括以機(jī)械的潔刮治和根面平整為核心的牙周基礎(chǔ)治療，配合藥物治療、新技術(shù)新材料的應(yīng)用等。這些治療方法能在一定程度上控制牙周炎的發(fā)展，但不能解決已經(jīng)發(fā)生的牙周附著喪失的重建和牙槽骨缺損修復(fù)等問題。

牙周炎治療的目的不僅在于控制炎癥，更在于使已破壞的牙周組織再生以形成新附著，實現(xiàn)牙槽骨和牙骨質(zhì)以及錨定在二者之間的牙周膜結(jié)構(gòu)及其功能的重建。隨著組織工程學(xué)的快速發(fā)展，一些組織工程技術(shù)與方法已被證明在牙周組織再生方面具有明確的臨床應(yīng)用前景。引導(dǎo)組織再生術(shù)是目前牙周組織再生的主要方法之一,其主要利用膜性材料引導(dǎo)牙周組織的修復(fù)。有的研究者通過在膜性材料加入不同生長因子、釉基質(zhì)衍生物等力圖提高修復(fù)效果，雖然一定程度上加速了牙周組織再生，但再生組織通常僅局限在牙周缺損的底部，而且很大程度上受缺損形式和剩余組織量的影響。因此，這種方法獲得的遠(yuǎn)期臨床修復(fù)效果仍不理想。利用各類鈣磷系列骨水泥雖能在一定程度上可修復(fù)牙周組織缺損，但面臨著牙根尖周填充區(qū)域內(nèi)成骨性差或長期不成骨等問題。Kumar等利用I型膠原制備屏障膜對牙周骨內(nèi)缺損進(jìn)行修復(fù)，實驗結(jié)果表明使用該類膠原屏障膜與根面刮治清創(chuàng)術(shù)的修復(fù)效果沒有顯著差異。Shalumon等將納米羥基磷灰石、聚己內(nèi)酯-殼聚糖和納米生物活性玻璃復(fù)合物通過靜電紡絲技術(shù)制備成納米纖維仿生支架用于模擬骨細(xì)胞外基質(zhì)，取得了一定的修復(fù)效果。但成骨均勻性差和新生纖維組織缺乏等問題尚未解決。

雖然組織工程學(xué)為牙周組織再生提供了新思路和方法，但目前的常用方法均難達(dá)到理想的牙周組織再生。近來Bottino等設(shè)計了具有梯度結(jié)構(gòu)的層狀PLGA/膠原蛋白/納米羥基磷灰石的生物膜性材料用于牙周組織缺損修復(fù)，證實該型支架內(nèi)部有更多的纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞附著，支架相容性和降解性能有所改善，但PLGA降解產(chǎn)物為酸性，長期造成組織局部慢性炎癥，此外，該膜性材料也無法完全產(chǎn)生牙周組織的三層結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明設(shè)計一種可調(diào)控仿生層狀支架及其制備方法，以修復(fù)牙周組織缺損，重建牙齒的生理功能。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種用于牙周組織缺損修復(fù)的仿生層狀支架，包括牙骨質(zhì)層、牙槽骨層和位于牙骨質(zhì)層、牙槽骨層之間的牙周膜層；所述牙骨質(zhì)層與牙周膜層之間、牙周膜層與牙槽骨層之間分別通過粘合劑粘結(jié)；所述牙骨質(zhì)層材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I；所述牙周膜層材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/Col-I/CS；所述牙槽骨層材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I；其中CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I中40wt％和60wt％指nHA在CH-PCL/nHA中含量。

作為優(yōu)選項：所述牙骨質(zhì)層和牙周膜層的厚度為0.2-0.3mm；所述牙骨質(zhì)層、牙周膜層和牙槽骨層總厚度為1.2-1.8mm。

作為優(yōu)選項：所述牙骨質(zhì)層、牙周膜層、牙槽骨層的一端通過粘合劑粘結(jié)；所述粘合劑為醫(yī)用纖維蛋白膠。

本發(fā)明還提供用于牙周組織缺損修復(fù)的仿生層狀支架的制備方法，步驟如下：

一、CH-PCL共聚物的合成：將脫乙酰度為100％的殼聚糖與3倍量的鄰苯二甲酸酐在干燥的二甲基甲酰胺中加熱到130℃，常規(guī)實驗條件下反應(yīng)5-7小時，混合物變?yōu)榍辶恋狞S色液體；此時得到中間產(chǎn)物A(鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?,接下來將產(chǎn)物A與己內(nèi)酯按1：0.9的比例在N₂保護(hù)，100℃的條件下不斷攪拌，反應(yīng)20個小時，此時得到中間產(chǎn)物B(鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?g-聚已內(nèi)酯)；將中間產(chǎn)物B置于索氏抽提器中用丙酮萃取24小時以去除反應(yīng)中的同聚物；最后將1g萃取的B產(chǎn)物溶于20ml的二甲基甲酰胺中，100℃，N₂保護(hù)條件下孵育2小時，冷卻至室溫并使其自然沉淀，收集沉淀物并用雙蒸水及乙醇漂洗凈，干燥得到CH-PCL；

二、殼聚糖-聚已內(nèi)酯/納米羥基磷灰石(CH-PCL/nHA)復(fù)合物的制備：

(1)將步驟一所得的CH-PCL取a克(a>0)溶于體積分?jǐn)?shù)為0.5-1.0％乙酸溶液制備2％(w/v)的CH-PCL溶液；

(2)另分別制備0.2M的Ca(NO₃)₂·4H₂O溶液和0.2M(NH₄)₂HPO₄溶液，備用；

(3)將兩體積的Ca(NO₃)₂·4H₂O溶液加入到一體積的CH-PCL溶液中，高速攪拌2h，得到混合液1；其后將一體積的(NH₄)₂HPO₄加入到混合液1中并加入體積濃度為25％的NH₃·H₂O使其pH值為11，得到混合液2；將混合液2中分別加入2/3a克和3/2a克的nHA，在室溫下連續(xù)攪拌24h后在室溫條件下陳化24h，減壓過濾，棄去濾液，所獲得產(chǎn)物于60℃條件下干燥24h，分別得到粉末狀CH-PCL/nHA(40wt％)和CH-PCL/nHA(60wt％)；

三、仿生膜制備：

(1)CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I復(fù)合膜制備；

A、以0.5-1.0％的乙酸為溶劑，制備0.5-1.0wt％的CH-PCL/nHA(40wt％)溶液，備用；

B、以0.2％的乙酸為溶劑，制備0.2-0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將CH-PCL/nHA(40wt％)溶液與Col-I溶液按體積比為7：3的比例混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO₃溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.025-0.1％的京尼平溶液中交聯(lián)2-10h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.2-0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得到CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I復(fù)合膜；

(2)CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜制備

A、將步驟一所得PCL含量小于40wt％的CH-PCL溶于0.5-1.0％乙酸溶液制備0.5-1.0wt％的的CH-PCL溶液，備用；

B、以0.2％的乙酸為溶劑制備0.2-0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將CS溶于雙蒸水制備0.1-0.3wt％的CS溶液，備用；

D、將CH-PCL溶液與Col-I溶液按體積比為7：3的比例混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO₃溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.025-0.1％的京尼平溶液中交聯(lián)2-10h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.2-0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜；該復(fù)合膜的最終厚度控制在0.2-0.3mm；

(3)CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜制備

A、以0.5-1.0％的乙酸為溶劑，制備0.5-1.0wt％的CH-PCL/nHA(60wt％)溶液，備用；

B、以0.2％的乙酸為溶劑，制備0.2-0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將CH-PCL/nHA(60wt％)溶液與Col-I溶液按體積比為7：3的比例混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO₃溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.025-0.1％的京尼平溶液中交聯(lián)2-10h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.2-0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜；該復(fù)合膜的最終厚度控制在0.9-1.1mm；

四、加載生長因子；

(1)、將PDGF溶于PBS中制備成濃度在0.1-1.0μg/mL的溶液，備用；

(2)、分別將上步制備的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜浸入PDGF溶液中達(dá)到飽和溶脹后放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成薄膜后于-70℃凍干，然后在環(huán)氧乙烷氣體氛圍下滅菌、備用；

所述除濕后CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜的厚度為0.2-0.3mm，CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜的厚度為0.9-1.1mm；

五、仿生層狀支架組裝

(1)、將體外預(yù)培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞分別加載到已消毒的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I三種復(fù)合膜中，分別在標(biāo)準(zhǔn)條件下體外培養(yǎng)7天，備用；

(2)、將醫(yī)用纖維蛋白膠涂加到三種已加載細(xì)胞的膜的一端，將三種膜在無菌條件下按CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I順序疊合，按壓涂膠部位，即得到仿生層狀支架。

作為優(yōu)選項：所述步驟五(2)中醫(yī)用纖維蛋白膠途加長度為2-3mm。

由于正常牙骨質(zhì)厚度平均約0.15-0.20mm,牙周膜厚度約為0.15-0.38mm，因此，我們設(shè)計制備的層狀仿生支架的牙骨質(zhì)層及牙周膜層各厚度約為0.2-0.3mm,支架(三層)總厚度約1.5mm；由于支架厚度薄，在植入過程中及植入后都需要承受一定的張力和壓力，因此，支架的力學(xué)性質(zhì)變得尤為重要；另外，支架在體內(nèi)的降解速率需要與新生組織的生長速率相匹配，支架的降解性質(zhì)也成為影響修復(fù)效果的關(guān)鍵因素；我們首先按文合成一類殼聚糖-聚已內(nèi)酯共聚物(chitosan-polycaprolactone,CH-PCL)，其中聚已內(nèi)酯(PCL)側(cè)鏈取代度及鏈長可調(diào)；通過改變PCL側(cè)鏈長及PCL在CH-PCL中的含量來控制該共聚物的力學(xué)、膨脹、降解和親疏水性；將優(yōu)化獲得的可利用水性溶劑加工的CH-PCL作為主要材料用于制備仿生層狀支架；該仿生支架具有層狀結(jié)構(gòu)并具有一定的孔度。

本發(fā)明的有意技術(shù)效果為：按牙周組織的三層生理結(jié)構(gòu)制作仿生支架，在各支架層加載修復(fù)用的牙周膜細(xì)胞，組裝成整體后在一端2－3mm處壓實。此類型支架植入牙周缺損處后，牙周膜細(xì)胞會在各相應(yīng)層中產(chǎn)生對應(yīng)于牙周的三層組織(牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨)，而支架材料會逐漸吸收，最終被產(chǎn)生的新生牙周組織替代，支架壓實端則可以阻止生長較快的上皮組織進(jìn)入支架中，確保牙周膜細(xì)胞完成牙周修復(fù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明植入示意圖。

具體實施方式

實施例1

一、CH-PCL共聚物的合成：將6g脫乙酰度為100％的殼聚糖與18g的鄰苯二甲酸酐在干燥的二甲基甲酰胺中加熱到130℃，常規(guī)實驗條件下反應(yīng)5-7小時，混合物變?yōu)榍辶恋狞S色液體；此時得到中間產(chǎn)物A(鄰苯二甲酰化殼聚糖),接下來將上述含A的混合物與21g的己內(nèi)酯在N₂保護(hù)，100℃的條件下不斷攪拌，反應(yīng)20個小時，此時得到中間產(chǎn)物B(鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?g-聚已內(nèi)酯)接下來將反應(yīng)物置于索氏抽提器中用丙酮萃取24小時以去除反應(yīng)中的同聚物；最后取30g萃取的B產(chǎn)物溶于600ml的二甲基甲酰胺中，100℃，N₂保護(hù)條件下孵育2小時，冷卻至室溫并使其自然沉淀，收集沉淀物并用雙蒸水及乙醇漂洗凈，干燥得到CH-PCL；

四、殼聚糖-聚已內(nèi)酯/納米羥基磷灰石(CH-PCL/nHA)復(fù)合物的制備：

(1)將步驟一所得的CH-PCL取6克溶于300ml體積分?jǐn)?shù)為1.0％乙酸溶液制備2％(w/v)的CH-PCL溶液；

(3)另分別制備0.2M的Ca(NO₃)₂·4H₂O溶液和0.2M(NH₄)₂HPO₄溶液，備用；

(3)將200ml的Ca(NO₃)₂·4H₂O溶液加入到100ml的CH-PCL溶液中，高速攪拌2h，得到混合液1；其后將100ml的(NH₄)₂HPO₄加入到混合液1中并加入180ml體積濃度為25％的NH₃·H₂O使其pH值為11，得到混合液2；將混合液2中分別加入4克和9克的nHA，在室溫下連續(xù)攪拌24h后在室溫條件下陳化24h，減壓過濾，棄去濾液，所獲得產(chǎn)物于60℃條件下干燥24h，分別得到粉末狀CH-PCL/nHA(40wt％)和CH-PCL/nHA(60wt％)；

五、仿生膜制備：

(2)CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I復(fù)合膜制備；

C、取上述制備好的CH-PCL/nHA(40wt％)粉未1g，加以100ml的1.0％的乙酸為溶劑，制備1.0wt％的CH-PCL/nHA(40wt％)溶液，備用；

D、以0.2％的乙酸為溶劑，制備0.2-0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將CH-PCL/nHA(40wt％)溶液100ml與Col-I 43ml溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO₃溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.085％的京尼平溶液中交聯(lián)6.5h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得到CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I復(fù)合膜；

(2)CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜制備

A、將步驟一所得PCL含量小于40wt％的CH-PCL 5g溶于495g 1.0％乙酸溶液制備1.0wt％的的CH-PCL溶液，備用；

B、用2L 0.2％的乙酸為溶劑加入10g Col-I粉質(zhì)0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將0.6g CS溶于200ml雙蒸水制備0.3wt％的CS溶液，備用；

D、取70ml CH-PCL溶液與30ml Col-I溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO₃溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.1％的京尼平溶液中交聯(lián)4.2h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.2-0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜；該復(fù)合膜的最終厚度控制在0.2-0.3mm；

(3)CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜制備

C、取0.5-1.0％的乙酸200ml，加入2.04g的CH-PCL/nHA(60wt％)制備成0.5-1.0wt％的溶液，備用；

D、用2L的0.2％的乙酸為溶劑，加入10g Col-I粉質(zhì)，制備0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將70ml CH-PCL/nHA(60wt％)溶液與30ml Col-I溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO₃溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.06％的京尼平溶液中交聯(lián)7.4h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜；該復(fù)合膜的最終厚度控制在0.9-1.1mm；

四、加載生長因子；

(1)、將0.1mg的PDGF溶于100ml的PBS中制備成濃度在0.1-1.0μg/mL的溶液，備用；

(2)、分別將上步制備的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜浸入PDGF溶液中達(dá)到飽和溶脹后放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成薄膜后于-70℃凍干，然后在環(huán)氧乙烷氣體氛圍下滅菌、備用；

所述除濕后CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜的厚度為0.2-0.3mm，CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜的厚度為0.9-1.1mm；

五、仿生層狀支架組裝

(1)、將體外預(yù)培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞分別加載到已消毒的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I三種復(fù)合膜中，分別在標(biāo)準(zhǔn)條件下體外培養(yǎng)7天，備用；

(2)、將醫(yī)用纖維蛋白膠涂加到三種已加載細(xì)胞的膜的一端，將三種膜在無菌條件下按CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I順序疊合，按壓涂膠部位，即得到仿生層狀支架。

所述步驟五(2)中醫(yī)用纖維蛋白膠途加長度為2-3mm。

圖1中牙骨質(zhì)層1材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I；牙周膜層2材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/Col-I/CS；牙槽骨層3材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I。

實施例2

一、CH-PCL共聚物的合成：將20g脫乙酰度為100％的殼聚糖與60g的鄰苯二甲酸酐在干燥的二甲基甲酰胺中加熱到130℃，常規(guī)實驗條件下反應(yīng)5-7小時，混合物變?yōu)榍辶恋狞S色液體；此時得到中間產(chǎn)物A(鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?,接下來將上述含A的混合物與72g的己內(nèi)酯在N2保護(hù)，100C的條件下不斷攪拌，反應(yīng)20個小時，此時得到中間產(chǎn)物B(鄰苯二甲酰化殼聚糖-g-聚已內(nèi)酯)接下來將反應(yīng)物置于索氏抽提器中用丙酮萃取24小時以去除反應(yīng)中的同聚物；最后取42g萃取的B產(chǎn)物溶于840ml的二甲基甲酰胺中，100℃，N2保護(hù)條件下孵育2小時，冷卻至室溫并使其自然沉淀，收集沉淀物并用雙蒸水及乙醇漂洗凈，干燥得到CH-PCL；

二、殼聚糖-聚已內(nèi)酯/納米羥基磷灰石(CH-PCL/nHA)復(fù)合物的制備：

(1)將步驟一所得的CH-PCL取20克溶于1000ml體積分?jǐn)?shù)為1.0％乙酸溶液制備2％(w/v)的CH-PCL溶液；

(2)另分別制備0.2M的Ca(NO3)2·4H2O溶液和0.2M(NH4)2HPO4溶液，備用；

(3)將400ml的Ca(NO3)2·4H2O溶液加入到200ml的CH-PCL溶液中，高速攪拌2h，得到混合液1；其后將200ml的(NH4)2HPO4加入到混合液1中并加入360ml體積濃度為25％的NH3·H2O使其pH值為11，得到混合液2；將混合液2中分別加入13.3克和30克的nHA，在室溫下連續(xù)攪拌24h后在室溫條件下陳化24h，減壓過濾，棄去濾液，所獲得產(chǎn)物于60℃條件下干燥24h，分別得到粉末狀CH-PCL/nHA(40wt％)和CH-PCL/nHA(60wt％)；

三、仿生膜制備：

(1)CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I復(fù)合膜制備；

A、取上述制備好的CH-PCL/nHA(40wt％)粉未5g，加以1000ml的0.5％的乙酸為溶劑，制備1.0wt％的CH-PCL/nHA(40wt％)溶液，備用；

B、以0.2％的乙酸為溶劑，制0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將CH-PCL/nHA(40wt％)溶液500ml與Col-I 214ml溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO₃溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.068％的京尼平溶液中交聯(lián)5.3h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.2-0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得到CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I復(fù)合膜；

(2)CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜制備

A、將步驟一所得PCL含量小于40wt％的CH-PCL 20g溶于3960g 0.5％乙酸溶液制備1.0wt％的的CH-PCL溶液，備用；

B、用3L 0.2％的乙酸為溶劑加入15g Col-I粉質(zhì)0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將6g CS溶于2000ml雙蒸水制備0.3wt％的CS溶液，備用；

D、取100ml CH-PCL溶液與42.9ml Col-I溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO3溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.09％的京尼平溶液中交聯(lián)3.2h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.2-0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜；該復(fù)合膜的最終厚度控制在0.2-0.3mm；

(3)CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜制備

A、取1.0％的乙酸320ml，加入3.26g的CH-PCL/nHA(60wt％)制備成1.0wt％的溶液，備用；

B、用2.8L的0.2％的乙酸為溶劑，加入14g Col-I粉質(zhì)，制備0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將200ml CH-PCL/nHA(60wt％)溶液與85.7ml Col-I溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO₃溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.0875％的京尼平溶液中交聯(lián)6.4h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.2-0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜；該復(fù)合膜的最終厚度控制在0.9-1.1mm；

四、加載生長因子；

(1)、將0.3mg的PDGF溶于300ml的PBS中制備成濃度在0.1g/mL的溶液，備用；

(2)、分別將上步制備的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜浸入PDGF溶液中達(dá)到飽和溶脹后放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成薄膜后于-70℃凍干，然后在環(huán)氧乙烷氣體氛圍下滅菌、備用；

所述除濕后CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜的厚度為0.2-0.3mm，CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜的厚度為0.9-1.1mm；

五、仿生層狀支架組裝

(1)、將體外預(yù)培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞分別加載到已消毒的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I三種復(fù)合膜中，分別在標(biāo)準(zhǔn)條件下體外培養(yǎng)7天，備用；

(2)、將醫(yī)用纖維蛋白膠涂加到三種已加載細(xì)胞的膜的一端，將三種膜在無菌條件下按CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I順序疊合，按壓涂膠部位，即得到仿生層狀支架。

所述步驟五(2)中醫(yī)用纖維蛋白膠途加長度為2-3mm。

圖1中牙骨質(zhì)層1材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I；牙周膜層2材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/Col-I/CS；牙槽骨層3材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I。

實施例3

一、CH-PCL共聚物的合成：將14g脫乙酰度為100％的殼聚糖與42g的鄰苯二甲酸酐在干燥的二甲基甲酰胺中加熱到130℃，常規(guī)實驗條件下反應(yīng)5-7小時，混合物變?yōu)榍辶恋狞S色液體；此時得到中間產(chǎn)物A(鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?,接下來將上述含A的混合物與21g的己內(nèi)酯在N2保護(hù)，100℃的條件下不斷攪拌，反應(yīng)20個小時，此時得到中間產(chǎn)物B(鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?g-聚已內(nèi)酯)接下來將反應(yīng)物置于索氏抽提器中用丙酮萃取24小時以去除反應(yīng)中的同聚物；最后取36g萃取的B產(chǎn)物溶于720ml的二甲基甲酰胺中，100℃，N2保護(hù)條件下孵育2小時，冷卻至室溫并使其自然沉淀，收集沉淀物并用雙蒸水及乙醇漂洗凈，干燥得到CH-PCL；

二、殼聚糖-聚已內(nèi)酯/納米羥基磷灰石(CH-PCL/nHA)復(fù)合物的制備：

(1)將步驟一所得的CH-PCL取15克溶于750ml體積分?jǐn)?shù)為1.0％乙酸溶液制備2％(w/v)的CH-PCL溶液；

(2)另分別制備0.2M的Ca(NO3)2·4H2O溶液和0.2M(NH4)2HPO4溶液，備用；

(3)將300ml的Ca(NO3)2·4H2O溶液加入到150ml的CH-PCL溶液中，高速攪拌2h，得到混合液1；其后將150ml的(NH4)2HPO4加入到混合液1中并加入270ml體積濃度為25％的NH3·H2O使其pH值為11，得到混合液2；將混合液2中分別加入10克和22.5克的nHA，在室溫下連續(xù)攪拌24h后在室溫條件下陳化24h，減壓過濾，棄去濾液，所獲得產(chǎn)物于60℃條件下干燥24h，分別得到粉末狀CH-PCL/nHA(40wt％)和CH-PCL/nHA(60wt％)；

三、仿生膜制備：

(1)CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I復(fù)合膜制備；

A、取上述制備好的CH-PCL/nHA(40wt％)粉未8g，加以800ml的1.0％的乙酸為溶劑，制備1.0wt％的CH-PCL/nHA(40wt％)溶液，備用；

B、以0.2％的乙酸為溶劑，制備0.2-0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將CH-PCL/nHA(40wt％)溶液180ml與Col-I 77ml溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO3溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.025％的京尼平溶液中交聯(lián)9h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得到CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I復(fù)合膜；

(2)CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜制備

A、將步驟一所得PCL含量小于40wt％的CH-PCL 16g溶于1584g 1.0％乙酸溶液制備1.0wt％的的CH-PCL溶液，備用；

B、用2.4L 0.2％的乙酸為溶劑加入12g Col-I粉質(zhì)0.2wt％的Col-I溶液，備用；

C、將2.1g CS溶于700ml雙蒸水制備0.3wt％的CS溶液，備用；

D、取160ml CH-PCL溶液與68ml Col-I溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70℃條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO3溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.075％的京尼平溶液中交聯(lián)8h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜；該復(fù)合膜的最終厚度控制在0.2-0.3mm；

(3)CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜制備

A、取1.0％的乙酸300ml，加入3.06g的CH-PCL/nHA(60wt％)制備成1.0wt％的溶液，備用；

B、用2.3L的0.2％的乙酸為溶劑，加入11.5g Col-I粉質(zhì)，制備0.5wt％的Col-I溶液，備用；

C、將120ml CH-PCL/nHA(60wt％)溶液與51.4ml Col-I溶液混合均勻，利用旋涂方法制備成厚度約0.6mm的薄膜，然后將該薄膜在室溫條件下于氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度0.3-0.4mm的薄膜后于-70C條件下凍干，得到初膜；將初膜在2wt％的NaHCO3溶液中處理5h,用雙蒸水洗至中性后在室溫條件下在0.05％的京尼平溶液中交聯(lián)7h；然后再用雙蒸水清洗除去交聯(lián)劑后再放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成厚度約0.2-0.3mm的薄膜后于-70℃凍干，即得CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜；該復(fù)合膜的最終厚度控制在0.9-1.1mm；

四、加載生長因子；

(1)、將0.1mg的PDGF溶于100ml的PBS中制備成濃度在0.1g/mL的溶液，備用；

(2)、分別將上步制備的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜浸入PDGF溶液中達(dá)到飽和溶脹后放入氣體內(nèi)循環(huán)式蒸發(fā)器中慢速除濕形成薄膜后于-70℃凍干，然后在環(huán)氧乙烷氣體氛圍下滅菌、備用；

所述除濕后CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS復(fù)合膜的厚度為0.2-0.3mm，CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I復(fù)合膜的厚度為0.9-1.1mm；

五、仿生層狀支架組裝

(1)、將體外預(yù)培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞分別加載到已消毒的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I三種復(fù)合膜中，分別在標(biāo)準(zhǔn)條件下體外培養(yǎng)7天，備用；

(2)、將醫(yī)用纖維蛋白膠涂加到三種已加載細(xì)胞的膜的一端，將三種膜在無菌條件下按CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I、CH-PCL/Col-I/CS和CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I順序疊合，按壓涂膠部位，即得到仿生層狀支架。

所述步驟五(2)中醫(yī)用纖維蛋白膠途加長度為2-3mm。

圖1中牙骨質(zhì)層1材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/nHA(40wt％)/Col-I；牙周膜層2材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/Col-I/CS；牙槽骨層3材料為加載有牙周膜細(xì)胞的CH-PCL/nHA(60wt％)/Col-I。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本說明書未詳細(xì)闡述的部分均屬于現(xiàn)有技術(shù)。

應(yīng)當(dāng)理解的是，上述針對較佳實施例的描述較為詳細(xì)，并不能因此而認(rèn)為是對本發(fā)明專利保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可以做出替換或變形，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明的請求保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。