本發(fā)明涉及獸藥領(lǐng)域，具體涉及的是一種口蹄疫疫苗稀釋液及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Aftosa)，俗名“口瘡”、“辟癀”，是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。口蹄疫主要侵害偶蹄獸，偶見于人和其他動物，其臨診特征為口腔粘膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大政治、經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病之首。
隨著我國畜牧業(yè)規(guī)?；B(yǎng)殖的快速發(fā)展，口蹄疫疫病的防疫成為畜牧業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。目前，口蹄疫疫病的防控主要措施之一為接種疫苗。因此，高質(zhì)量疫苗的供應(yīng)和精準(zhǔn)的接種液量是保證口蹄疫疫病能夠得到有效防控的關(guān)鍵因素，也是我國畜牧業(yè)能夠得以健康發(fā)展的保障。
目前，口蹄疫疫苗的生產(chǎn)工藝為：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)病毒→滅活→純化、濃縮→乳化→分裝。其中，國內(nèi)口蹄疫疫苗生產(chǎn)的乳化工藝中，普遍采用的乳化方法是將佐劑無菌過濾到佐劑專用缸或在佐劑專用缸內(nèi)經(jīng)高壓滅菌，制備成油相；然后將抗原液按工藝要求制備成水相，最后將含有抗原的水相和油相乳化成乳狀液(劑型一般為W/O/W)，即疫苗。
現(xiàn)有常規(guī)方法乳化的疫苗中抗原加量固定，采用常規(guī)稀釋液(如生理鹽水、葡萄糖等)會造成疫苗分層而無法對此類W/O/W劑型疫苗進(jìn)行稀釋。公開號為CN1413732A的專利申請中公開了一種由氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、葡萄糖、磷酸鹽等組成的稀釋劑，該稀釋劑是用來稀釋抗原，而非疫苗，用此稀釋劑稀釋疫苗也會造成疫苗分層而無法使用。因此，由于沒有合適的稀釋劑，在疫苗接種時(shí)只能按照既定注射液量注射，對高濃度疫苗來說，接種微小液量時(shí)由于誤差較大，無法保證其準(zhǔn)確性，也無法采用常規(guī)稀釋的方法進(jìn)行稀釋，對疫苗的精準(zhǔn)接種和疫苗的配制不利。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，第一方面，提供一種口蹄疫疫苗稀釋液，其原料包括磷酸鹽緩沖液和油相；優(yōu)選的，其是由磷酸鹽緩沖液和油相乳化而成的水包油包水(W/O/W)狀的乳化液。
所述磷酸鹽緩沖液包含以下成分：
所述油相為206佐劑。
其制備包括：將除菌后的磷酸鹽緩沖液(30±1℃)緩慢加入除菌后的油相(30±1℃)中，所述磷酸鹽緩沖液與油相的體積比為(30-50)：(50-70)(優(yōu)選46:54)，在乳化攪拌頻率為35-40Hz下進(jìn)行乳化，30min后，將乳化攪拌頻率調(diào)整為3-5Hz，迅速降溫至15℃以下，即得到口蹄疫疫苗稀釋液。
本發(fā)明的第二個(gè)方面在于提供制備上述口蹄疫疫苗稀釋液的方法，配制磷酸鹽緩沖液，除菌后作為稀釋液水相；將油相除菌，作為稀釋液油相；將稀釋液水相與稀釋液油相乳化，得到水包油包水(W/O/W)狀的口蹄疫疫苗稀釋液。
包括以下步驟：
1)將以下成分溶解于水后，配制得到pH＝8.0的磷酸鹽緩沖液,
2)將步驟1)得到的磷酸鹽緩沖液經(jīng)0.2μm濾器除菌，作為稀釋液水相，然后保持溫度在30±1℃；
3)將油相經(jīng)0.2μm濾器除菌，作為稀釋液油相，然后保持溫度在30±1℃；
4)將步驟2)的稀釋液水相緩慢加入到步驟3)的稀釋液油相中，在35-40Hz的乳化攪拌頻率下進(jìn)行乳化，30min后，將乳化攪拌頻率調(diào)整為3-5Hz，迅速降溫至15℃以下，即得到口蹄疫疫苗稀釋液；稀釋液水相和稀釋液油相的體積比為(30-50)/(50-70)，優(yōu)選46:54。
本發(fā)明的第三個(gè)方面在于提供一種稀釋的口蹄疫疫苗，包含口蹄疫疫苗原液和上述口蹄疫疫苗稀釋液或上述方法制備得到的口蹄疫疫苗稀釋液。
所述口蹄疫疫苗原液的制備為：將滅活口蹄疫抗原依次經(jīng)過物理純化、超濾(UF)、化學(xué)純化制得，濃縮倍數(shù)在500-1000倍之間，得到高純度、高濃度的抗原，作為疫苗水相；將206佐劑作為疫苗油相；保持疫苗水相和疫苗油相的溫度為30±1℃，將疫苗水相緩慢加入疫苗油相中，35-40Hz的乳化攪拌頻率下進(jìn)行乳化，乳化30min后，將乳化攪拌頻率調(diào)至3-5Hz，迅速降溫至15℃以下，即得的口蹄疫疫苗原液。
本發(fā)明的第四個(gè)方面在于提供制備上述稀釋的口蹄疫疫苗的方法，將口蹄疫疫苗原液和上述口蹄疫疫苗稀釋液或上述方法制備得到的口蹄疫疫苗稀釋液混合均勻即可。
本發(fā)明的第五個(gè)方面在于提供上述口蹄疫疫苗稀釋液在稀釋口蹄疫疫苗原液中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的口蹄疫疫苗稀釋液，用來稀釋口蹄疫疫苗，不僅可以實(shí)現(xiàn)精確接種；還可以克服現(xiàn)有檢驗(yàn)過程中無法準(zhǔn)確得到實(shí)際效力數(shù)據(jù)的不足。這是因?yàn)?010版《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定口蹄疫抗原檢測的方法為將備檢疫苗分為1頭份、1/3頭份、1/9頭份三個(gè)劑量組，每一劑量組分別接種于試驗(yàn)動物進(jìn)行效力檢驗(yàn)(PD50)，實(shí)際能夠檢測出的效力上限為15.59個(gè)PD50，然而有的疫苗的效力可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于15.59，卻因超出量程上限而不能被檢測出來。用本發(fā)明的稀釋液可以將疫苗稀釋成不同倍數(shù)后再進(jìn)行效力檢驗(yàn)，得到的效力再乘稀釋倍數(shù)就能夠準(zhǔn)確得到疫苗的實(shí)際效力數(shù)據(jù)。
隨著疫苗濃縮技術(shù)的發(fā)展，配合本發(fā)明的口蹄疫疫苗稀釋液，可使高濃縮疫苗的應(yīng)用更廣泛，這樣每一包裝量的免疫頭份數(shù)量增加，疫苗的存儲量就減少，可降低儲存成本。例如：現(xiàn)有每瓶100ml的疫苗只含有100頭份的抗原量，只能接種100頭動物；而100ml濃縮疫苗可含有500頭份的抗原量，使用時(shí)與本發(fā)明的口蹄疫疫苗稀釋液使用，可接種500頭動物，即同樣包裝量的疫苗，接種頭份數(shù)量將增大，有利于農(nóng)場、免疫站等的大規(guī)模接種。此外，有了本發(fā)明的口蹄疫疫苗稀釋液，疫苗可被濃縮，在后續(xù)的乳化工藝中可減小乳化罐的體積，這樣乳化時(shí)的攪拌和溫度更加均一，從而可以提高乳化效果，同時(shí)節(jié)約了乳化成本。
具體實(shí)施方式
目前口蹄疫疫苗中的抗原濃度可以提高1000倍以上，雖然抗原純化濃縮水平在不斷提高，但是由于沒有適合于口蹄疫疫苗的稀釋液，口蹄疫疫苗的濃度只能是可直接用于接種的濃度。如果直接使用高濃度抗原制備的疫苗，操作過程中容器內(nèi)的殘留或取液器械上的沾染都會使實(shí)際注射量與理論值偏差較大，無法保證接種量的準(zhǔn)確性。如果研發(fā)出一種適用于口蹄疫疫苗的稀釋液，在使用前用稀釋液將高濃度抗原的疫苗稀釋，再進(jìn)行接種，一方面能夠保證接種量的精確，提高檢驗(yàn)的精度；另一方面高濃度抗原的疫苗儲存量將大大減少，緩解疫苗的儲存、運(yùn)輸壓力。因此，一種口蹄疫疫苗稀釋液的研發(fā)是非常有必要及非常具有前瞻性的。
本發(fā)明提出了一種用來稀釋口蹄疫疫苗的稀釋液，及稀釋液的制備方法；進(jìn)一步地，用稀釋液稀釋口蹄疫疫苗，得到稀釋的口蹄疫疫苗。
首先，口蹄疫疫苗稀釋液為乳化的磷酸鹽緩沖液(PBS)(劑型為W/O/W)，其制備包括以下步驟：
1)按照如下配方將各物質(zhì)溶解于水后，配制得到磷酸鹽緩沖液,配方如下：
所用試劑均為分析純，可商購得到。
2)用0.2μm濾器將磷酸鹽緩沖液除菌后加入到水相罐中，作為稀釋液水相，并將稀釋液水相的溫度保持在30±1℃；
3)將206佐劑(206佐劑購自于賽彼科(上海)特殊化學(xué)用品有限公司)用0.2μm濾器除菌后加入到乳化罐中，作為稀釋液油相，同樣將稀釋液油相的溫度保持在30±1℃；
4)將水相罐中的稀釋液水相緩慢加入到乳化罐中的稀釋液油相中，稀釋液水相：稀釋液油相(體積比)為(30-50)/(50-70)，優(yōu)選46:54，乳化攪拌頻率設(shè)置為35-40Hz進(jìn)行乳化，乳化30min后，將攪拌頻率調(diào)整為3-5Hz，用乙二醇迅速降溫(降溫的速度越快越好)至15℃以下，即得到口蹄疫疫苗稀釋液，進(jìn)行分裝。
口蹄疫疫苗購自金宇保靈生物藥品有限公司，具體的制備方法包括以下步驟：通過將滅活抗原依次經(jīng)過物理純化、超濾(UF)、化學(xué)純化的純化濃縮工藝制得，濃縮倍數(shù)在500-1000倍之間，得到濃縮后的抗原，作為疫苗水相，206佐劑作為疫苗油相；將疫苗水相和疫苗油相的溫度分別調(diào)節(jié)至30±1℃，將疫苗水相緩慢加入疫苗油相中，攪拌頻率設(shè)置為35-40Hz進(jìn)行乳化，乳化30min后，將攪拌頻率調(diào)整為3-5Hz，緩慢降溫至15℃以下，最后分裝，即得高純度、高濃度的口蹄疫疫苗。
制備稀釋的口蹄疫疫苗時(shí)，按照疫苗的有效保護(hù)液量以及擬接種動物數(shù)量來計(jì)算所需的高純度、高濃度疫苗的數(shù)量，然后依據(jù)接種液量計(jì)算疫苗的稀釋倍數(shù)，按照比例將口蹄疫疫苗稀釋液和口蹄疫疫苗混合均勻，即得到稀釋的口蹄疫疫苗，可直接進(jìn)行接種。
以下結(jié)合具體實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實(shí)施例絕非對本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例中使用的手段，如無特別說明，均使用本領(lǐng)域常規(guī)的手段。實(shí)施例中用到的口蹄疫疫苗(O/MYA98/BY/2010株+asial/JSL/ZK/06株+Re-A/WH/10株)，批號：S163501，購自金宇保靈生物藥品有限公司。乳化罐和水相罐購自長春富士特流體設(shè)備有限公司。
一、口蹄疫疫苗稀釋液的制備
按照上述方法制備得到一系列本發(fā)明的口蹄疫疫苗稀釋液，其制備過程中的各參數(shù)見表1。
表1制備1L實(shí)施例1-9口蹄疫疫苗稀釋液的參數(shù)
二、高純度、高濃度口蹄疫疫苗
由金宇保靈生物藥品有限公司，批號為S163501、S163502、S163503，抗原為O/MYA98/BY/2010株+asial/JSL/ZK/06株+Re-A/WH/10株。
三、高濃度口蹄疫疫苗的稀釋
無菌條件下取稀釋液與口蹄疫疫苗混合均勻，對高純度、高濃度口蹄疫疫苗進(jìn)行相應(yīng)倍數(shù)的稀釋。
實(shí)驗(yàn)例、口蹄疫疫苗稀釋液中磷酸鹽緩沖液的篩選
用實(shí)施例1-9得到的口蹄疫疫苗稀釋液將口蹄疫疫苗稀釋5倍后，檢測稀釋后的口蹄疫疫苗的物理性狀(如劑型、外觀、黏度、顆粒度)，并采用傳統(tǒng)破乳工藝破乳，檢測水相樣146S。比較例1-3為按本發(fā)明制備口蹄疫稀釋液的方法得到的稀釋液，僅是稀釋液水相或稀釋液油相的成分與本發(fā)明所列實(shí)施例不同；比較例1稀釋液水相為磷酸鹽緩沖液，其配方為：10g/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、0.3g/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)、8.1g/L氯化鈉(NaCl)，稀釋液水相和稀釋液油相的體積比為46:54；比較例2稀釋液水相也為磷酸鹽緩沖液，其配方與CN1413732A中公開的相同，為：8.0g/L氯化鈉(NaCl)、0.125g/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、0.4g/L氯化鉀(KCl)、0.06g/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)、0.2g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、1.0g/L葡萄糖、0.14g/L氯化鈣(CaCl2)，稀釋液水相和稀釋液油相的體積比為46:54；比較例3稀釋液油相的配方為：0.9L/L白油、0.04L/L吐溫(TWEEN)和0.06L/L司班(SPAN)組成的混合物(即按體積百分含量，含有90％的白油、4％的吐溫和6％的司班)，稀釋液水相的配方與實(shí)施例5相同，稀釋液水相和稀釋液油相的體積比為46:54。以實(shí)施例5為例，檢測結(jié)果見表2。
表2稀釋5倍后的口蹄疫疫苗的物理性狀及146S含量
通過表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用比較例1和比較例2的稀釋液稀釋得到的疫苗146S回收率低，146S是口蹄疫疫苗中的有效抗原成分，146S回收率低表示稀釋液對疫苗中有效成分的保護(hù)性不好，降解或失活多，可見比較例1和2的稀釋液不適合用于疫苗的稀釋。用比較例3的稀釋液稀釋得到的疫苗一方面黏度較高不利于動物接種，另一方面疫苗顆粒度不呈正態(tài)分布，劑型穩(wěn)定性差，因此比較例3也不適用于疫苗稀釋。而用本發(fā)明的稀釋液稀釋得到的疫苗不僅粘度合適、顆粒度呈正態(tài)分布、劑型穩(wěn)定性好，而且對疫苗中的有效抗原成分146S回收率高，說明本發(fā)明的稀釋液對疫苗中的有效成分保護(hù)性好，降解或失活的抗原少，適用于疫苗的稀釋。
通過比較三種疫苗稀釋液稀釋后的疫苗的質(zhì)量，結(jié)合成本費(fèi)用綜合分析，本發(fā)明的口蹄疫疫苗稀釋液用來稀釋口蹄疫疫苗更適合。
其它實(shí)施例也有相似實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不再一一贅述。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。