本發(fā)明涉及生物化學和醫(yī)藥領域，具體地，涉及蛋白功能抑制劑dapt在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術：
：垂體腺瘤治療方式主要包括藥物治療、手術治療、放射性治療，目前的治療主要以手術為主，相當一部分患者手術效果不佳，術后常出現(xiàn)殘留及復發(fā)，是目前神經(jīng)外科難以突破的一個問題。藥物治療是解決這一難題的有效途徑。生長抑素類似物和多巴胺受體激動劑被用于控制一部分高分泌gh型和prl型腺瘤患者，sstr2表達水平的高低與藥物敏感性呈正相關。但是臨床上仍存在大量手術切除殘留、術后復發(fā)、對藥物耐藥的病人，治療方法不當和過度治療并存，使其治療效率低，致殘率高，總體復發(fā)率超過30％。目前仍缺乏針對性的、有效的藥物治療手段。因此有必要開發(fā)能夠影響垂體腺瘤分化、增殖、凋亡和侵襲過程的方法和藥品，從而為提高垂體腺瘤的治療及預后效果提供有效途徑。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供蛋白功能抑制劑dapt在制備治療垂體腺瘤的藥物中的用途。本發(fā)明的第二個目的是提供蛋白功能抑制劑dapt的功能片段、衍生物及其鹽或溶劑化物在制備治療垂體腺瘤的藥物中的用途。其中，dapt是指cas登錄號208255-80-5的化合物，中文名：(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨?；?l-2-苯基甘氨酸叔丁酯；分子式：c23h26f2n2o4； 是一種γ-分泌酶(γ-secretase)抑制劑，能夠間接抑制γ-分泌酶底物notch的活性，進而影響細胞信號傳導和細胞分化過程。其中，所述dapt的衍生物為dapt的鹵代、磺化、硝化、羥化、烷氧化或酯化產(chǎn)物。dapt衍生物可成鹽或溶劑化物，其中所述的鹽包括鈉鹽、鉀鹽等，所述的溶劑化物是指水合物、乙醇化物等。所述衍生物可以用于至少部分的抑制垂體腺瘤的分化、增殖和侵襲。本領域技術人員可以預見，dapt的衍生物和功能化片段具備與dapt相同的核心結構。因此，其功能片段、衍生物及其鹽或溶劑化物在制備治療或預防垂體腺瘤的藥物中同樣具備理想的應用效果。本發(fā)明所述的垂體腺瘤涵蓋了已知多種垂體腺瘤，包括功能性垂體腺瘤和/或非功能性垂體腺瘤，其中，所述功能性垂體腺瘤包括gh型垂體腺瘤、prl型垂體腺瘤、acth型垂體腺瘤和tsh型垂體腺瘤中的至少一種；所述非功能性垂體腺瘤包括空細胞腺瘤、大嗜酸粒細胞瘤、促性腺激素腺瘤、靜止的促皮質(zhì)激素腺瘤和糖蛋白分泌腺瘤中的至少一種。除活性成分外，本發(fā)明所述的藥物還包括藥學上可接受的至少一種賦形劑。所述的賦形劑為本領域技術人員所理解，包括但并不局限于崩解劑、潤滑劑、分散劑等，本領域技術人員可依據(jù)制劑的實際需求加以選擇，本發(fā)明對此不作特別限定。本發(fā)明所述的藥物，可經(jīng)由常規(guī)方法制備成藥學上各種常見劑型，如片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、混懸劑、口服溶液、粉針或注射劑等。給藥方式可選口服、舌下、靜脈、皮下、透皮或局部給藥等，以單位給藥形式給予動物或人。本發(fā)明所述的藥物合適的單位給藥形式包括口服劑型(例如片劑、膠囊、丸劑、散劑、顆粒劑、口服溶液或懸浮液)、舌下或口含給藥劑型、靜 脈，皮下，透皮或肌內(nèi)給藥劑型(例如注射液、粉針等)。此外，所述藥物可以是普通制劑、緩釋制劑、速釋制劑及控釋制劑。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的藥物為口服劑型、靜脈給藥劑型或肌內(nèi)給藥劑型。本發(fā)明同時為含有dapt、dapt的功能片段、dapt衍生物及其鹽或溶劑化物的藥物制劑提供理想的實施方式，具體而言，當制備片劑或膠囊形式的固體藥物組合物時，在活性成分中可加入的賦形劑，包括稀釋劑，如乳糖、糊精、淀粉、預膠化淀粉、蔗糖、甘露醇、微晶纖維素等；黏合劑，如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羥丙甲纖維素等；崩解劑，如羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧基甲基纖維素、低取代羥丙纖維素、羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮等；潤滑劑，如二氧化硅、硬脂酸鎂、硬脂酸鹽、玉米淀粉、滑石粉等，矯味劑，如甘露醇、阿斯巴甜、糖精鈉和甜菊苷等，此外，還可加入表面活性劑，如十二烷基磺酸鈉、磺基丁二酸二辛酯鈉、蔗糖酯和泊洛沙姆等。當制備丸劑形式的藥物組合物時，在活性成分中可加入的賦形劑，包括稀釋劑與吸收劑，如乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、可可脂等；黏合劑，如阿拉伯膠、黃芪膠、明膠、蜂蜜等；崩解劑，如甲基纖維素、乙基纖維素、干燥淀粉、瓊脂粉、海藻酸鹽等?？诜芤夯驊腋∫嚎杉尤氲馁x形，包括甜味劑，如糖精鈉、蔗糖、甜蜜素、阿斯巴甜和甜菊苷等；助懸劑，如聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、羥丙基甲基纖維素等；防腐劑，如尼泊金類、苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等。顆粒劑可加入的賦形劑，包括填充劑、黏合劑、著色劑及矯味劑等。注射用制劑，如注射液、乳劑、凍干粉針劑等，可以使用本領域常用的各種稀釋劑，如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氧化異硬脂醇等，助溶劑，緩沖劑或ph調(diào)節(jié)劑等。另外，為了制備等滲注射液，可加入氯化鈉、葡萄糖或甘油等。本發(fā)明所述的片劑可以是純片劑，還可將片 劑進一步制成包衣片，例如薄膜衣、糖衣等。通過制備聚合物基質(zhì)或在膜包衣中使用特定的聚合物，可將片劑制成速釋、緩釋或控釋劑型。膠囊劑可以是軟膠囊或硬膠囊，不帶膜或帶膜，以便具有速釋、緩釋或控釋性能。在本發(fā)明的藥物組合物中，dapt通常以劑量單位配制。每劑量單位含有5至10毫克dapt，每日給予1次或多次。特定情況下也可以采用較高或較低劑量，每個患者的適用劑量由醫(yī)生根據(jù)給藥模式，該患者的年齡、體重和反應來最終決定。所述藥物可以與已經(jīng)可用的治療手段(例如化學治療、外科手術治療或放療)聯(lián)用。除了在所概述的任意方法中使用藥物以外，本發(fā)明的藥物可用作其他療法的添加劑。應該清楚本發(fā)明的治療可以與任何其他已知的治療方法聯(lián)用。通過上述技術方案，dapt能明顯抑制垂體腺瘤細胞和移植瘤的生長。在原代生長激素腺瘤腫瘤細胞和gh3細胞中應用不同劑量的dapt，能夠明顯抑制原代垂體腺瘤細胞和gh3細胞的增殖。特別是在5-20ng/ml的處理劑量下，能夠獲得最佳的抑制增殖效果。transwell實驗也顯示dapt在2-20ng/ml劑量下能夠抑制腫瘤細胞的侵襲能力。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。具體實施方式以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。以下實施例中dapt為geneoperation(us)的商品化產(chǎn)品，貨號為in01001-0005mg。實施例11.1標本來源標本取自垂體腺瘤患者手術切除的腫瘤組織。術前根據(jù)臨床表現(xiàn)，血清激素水平和影像學檢查做出初步診斷，再根據(jù)術中所見及術后病理學和免疫組織化學染色確診，為具有侵襲力的gh型垂體腺瘤、tsh型腺瘤、prl型腺瘤、無功能腺瘤各10例。1.2主要試劑胰酶，dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，二甲基亞砜，多聚賴氨酸均為市售產(chǎn)品。1.3細胞培養(yǎng)手術切除的垂體腺瘤組織在無菌操作下放入無血清dmem培養(yǎng)液中，超凈臺內(nèi)無菌pbs沖洗2-3次，去除結締組織，壞死組織及血塊，將標本用眼科剪剪碎成1mm3大小組織壞，加胰蛋白酶吹打分散，待細胞分散良好以后，加入dmem培養(yǎng)液(內(nèi)含10％胎牛血清)終止消化，經(jīng)100目細胞濾器過濾后，1000r/min離心10min，棄上清液，加入dmem培養(yǎng)液使細胞重懸分散，鏡檢計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×106/ml。用臺盼藍染色計數(shù)細胞活性。接種于預先包被了多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待原代垂體腺瘤細胞達到80％-90％融合時，用胰蛋白酶消化收集細胞，用dmem培養(yǎng)液重懸傳代。1.4觀測指標：1.4.1形態(tài)學及細胞增殖速度觀察設置6個不同劑量的處理組，在dmem培養(yǎng)液中分別添加終濃度0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，對照組添加等體積的dmso，進行細胞培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下每天觀察一次培養(yǎng)細胞的形態(tài)特點，記錄不同處理組下垂體腺瘤細胞貼壁的時間及長滿單層的時間，結果如表1所示。表11.4.2流式細胞儀檢測細胞凋亡設置6個不同劑量的處理組，在dmem培養(yǎng)液中分別添加終濃度為0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，對照組添加等體積的dmso，進行細胞培養(yǎng)。取培養(yǎng)時間同為3周的原代垂體腺瘤細胞傳代培養(yǎng)3d后將其收獲，并制成單細胞懸液，經(jīng)1000r/m(r＝15cm)離心5min，棄上清，細胞直接懸浮于pi低滲液中，fcm對細胞dna進行分析，pi-dna復合物發(fā)出的熒光經(jīng)fcm計量分析，細胞凋亡用小于2倍體峰的細胞百分數(shù)表示。結果如表2所示。表21.4.3mts法檢測細胞增殖設置6個不同劑量的處理組，在dmem培養(yǎng)液中分別添加終濃度為0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，對照組添加等體積的dmso，培養(yǎng)原代垂體腺瘤細胞和gh3細胞到對數(shù)生長期，取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加dmem培養(yǎng)液(加10％小牛血清)在37℃5％co2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。每孔加20μlmts/pms混合液，繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時顯色。檢測前搖晃培養(yǎng)板10秒鐘，混勻顏色在酶聯(lián)檢測儀上，波長570nm處檢測各孔的光吸收值(od)。用樣品稀釋度對od值(od570)繪制曲線。統(tǒng)計細胞增殖情況如表3所示。表31.4.4腫瘤細胞侵襲能力檢測按照chemicon公司的ecm550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300μl預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15-30min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。制備細胞懸液：制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12-24h，進一步去除血清的影響。消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用pbs洗1－2遍，用含bsa的無血清培養(yǎng)基重懸。加入不同劑量的dapt并調(diào)整細胞密度至1-10×105。接種細胞：取細胞懸液200μl加入transwell小室；24孔板下室加入500μl含fbs或趨化因子的培養(yǎng)基。培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)24h。mtt法進行結果計數(shù)：用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞；24孔板中 加入500μl含0.5mg/mlmtt的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃4h后取出。24孔板中加入500μldmso，將小室置于其中，使膜浸沒在dmso中，振蕩10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上測od值(od570)，處理數(shù)據(jù)結果如表4所示。表4處理組(ng/ml)0.51510201000原代垂體腺瘤細胞0.3790.3340.2960.2230.1780.1420.457gh3細胞0.3910.3450.2770.2070.1650.1340.672以上結果表明在原代生長激素腺瘤腫瘤細胞和gh3細胞中應用不同劑量的dapt，能夠明顯抑制原代腫瘤細胞和gh3細胞的增殖。特別是在5-20ng/ml的處理劑量下，能夠獲得最佳的抑制增殖效果。transwell實驗顯示dapt能夠抑制腫瘤細胞的侵襲能力。1.4.5裸鼠移植瘤實驗spf級balb/c-nu小鼠(品種)，雌性，5-7周齡，體重(18±2)g(購北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：scxk(京)2012-0001)經(jīng)前肢腋下皮下接種鼠源垂體生長激素腺瘤gh3細胞(購自中國醫(yī)學科學院基礎研究所細胞中心)，待瘤長至約120mm3從中篩選出體重及瘤體均勻的荷瘤鼠30只，備用。將荷瘤鼠30只隨機均勻分為3組，每組10只，每組分別經(jīng)尾靜脈施用不同劑量dapt，每日分1次給藥，每次給藥劑量分別為1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg。給藥15天后處死動物，剝?nèi)×鼋M織計算抑瘤率tvi，結果如表5所示。tvi％＝(空白組當天腫瘤體積-給藥組當天腫瘤體積)/(空白組當天腫瘤體積)×100％。表5每次給藥劑量(mg/kg)給藥15天后抑瘤率(％)110.71528.971049.81以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。當前第1頁12