本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，特別涉及一種長春堿類衍生物在制備抑制腫瘤轉移藥物中的應用。

背景技術：

腫瘤轉移是惡性腫瘤的重要特征，也是引起大多數惡性腫瘤患者死亡的首要原因。因此，抑制腫瘤轉移對挽救惡性腫瘤患者的生命具有至關重要的臨床意義，已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的策略之一。

腫瘤細胞從原發(fā)病灶向遠端組織的轉移包括以下幾種方式：(1)直接蔓延到鄰近部位，侵蝕原發(fā)器官；(2)癌細胞隨淋巴結引流，由近及遠轉移至各級淋巴結，發(fā)生遠端轉移；(3)癌細胞直接進入血管，隨血流轉移至遠端組織，如肺、骨和腦等組織，形成繼發(fā)性腫瘤病灶。一方面，腫瘤細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)在腫瘤轉移中扮演著重要的角色，可增強腫瘤細胞的運動、遷移和侵襲能力，從而促進腫瘤的轉移(prieto-garcia.e,etal.medoncol.2017,34(7):122.)。另一方面，腫瘤血管也為腫瘤細胞的轉移提供必要的運輸通道。因此，靶向腫瘤細胞抑制癌細胞emt和靶向腫瘤血管是兩個重要的抑制腫瘤轉移的治療策略。

目前，靶向腫瘤細胞emt的抑制劑主要集中在tgf-β通路，如競爭性結合tgf-βri激酶atp位點的抑制劑sd-093和ly-580276(subramanian.g,etal.cancerres.2004,64(15):5200-11.)；tgf-β/alk5特異性抑制劑ew-7203(parkcy,etal.cancersci.2011,102(10):1889-96.)，ew-719(parkcy,etal.eurjcancer.2011,47(17):2642-53.)和ew-7197(jinch,etal.jmedchem.2014,57(10):4213-38.)等。然而，這些抑制劑僅停留在臨床試驗階段，臨床上尚缺乏有效的emt抑制劑類藥物上市。

靶向腫瘤血管的治療藥物主要包括兩大類(mckeagemj,etal.cancer2010,116(8):1859-71.)。一類是血管新生抑制劑(angiogenicinhibitors,ais)，主要為vegf單克隆抗體貝伐單抗(bevacizumab)和vegfr2酪氨酸激酶抑制劑apatinib，vandetanib等。ais主要抑制腫瘤血管的新生過程，雖然可促進腫瘤血管正?；?，減少腫瘤轉移，但它們對腫瘤已形成的血管無顯著影響，因而僅能減緩腫瘤的進展，不能有效殺傷已形成的腫瘤，且對中晚期腫瘤的療效較差。因此，ais的臨床應用范圍受到明顯的限制，患者的受益程度較小。另一類是腫瘤血管破壞劑(vasculardisruptingagents,vdas)，可選擇性損傷腫瘤中心區(qū)域已形成的血管，誘導腫瘤中心大面積壞死，從而發(fā)揮良好的抗腫瘤效果。然而，腫瘤邊緣區(qū)域的血管成熟度較高(周細胞覆蓋率相對較高)，該部分血管對vdas不敏感，因此，vdas治療后在腫瘤邊緣區(qū)域殘留明顯的生存圈(tozergm,etal.natrevcancer.2005,5(6):423-35.；tozergm,etal.cancerres.2008,68(7):2301-11.；nguyenl,etal.bmccancer2012,12:522.)。殘留的腫瘤生存圈，一方面由于缺氧等因素導致腫瘤細胞emt增強(fifist,etal.cancermed.2013,2(5):595-610.)，增加了治療后腫瘤發(fā)生轉移的風險；另一方面，生存圈也是vdas治療停藥后迅速復發(fā)的重要原因。綜上所述，尋找可同時抑制腫瘤細胞emt和破壞腫瘤血管，克服腫瘤生存圈的藥物具有十分重要的治療意義。

從夾竹桃科植物長春花中分離得到的長春堿類化合物如長春堿、長春新堿及其衍生物長春瑞濱和長春氟寧等，它們都屬于雙吲哚生物堿。藥理作用研究表明，長春堿及其衍生物屬于細胞毒性藥物，主要抑制微管蛋白的聚合，妨礙紡錘體微管的形成，使細胞核分裂被阻滯于中期。長春堿及其衍生物具有廣譜的抗腫瘤活性，臨床上主要用于治療何杰金氏病、絨毛膜上皮癌，對急性白血病、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、頭頸部癌、口咽部癌、單核細胞白血病均有一定療效(wilsonl,etal.annnyacadsci.1975,253:213-31.)。近年來，angelovacca等人研究發(fā)現，非毒劑量下長春堿可在細胞水平顯著抑制血管的新生(vaccaa,etal.blood1999,94(12):4143-55.)；giannoulaklement等人研究表明，持續(xù)給予低劑量的長春堿可抑制腫瘤血管的新生(klementg,etal.jclininvest.2000,105(8):r15-24.)；jamesmoore等人證實長春新堿能夠抑制腫瘤新生血管的生長(moorej,etal.jpediatrsurg.2001,36(8):1273-6.)；另一方面，annakruczynskia等人研究發(fā)現，長春氟寧可抑制腫瘤血管生成，同時破壞已生成的腫瘤血管，對實驗性惡性腫瘤轉移也有顯著的抑制作用(kruczynskia,etal.eurjcancer.2006,42(16):2821-32.)。與許多臨床使用的化療藥物一樣，長春堿類藥物在疾病治療過程中也出現許多嚴重的副作用，例如骨髓抑制、肌痛、惡性嘔吐等不良反應(bonneterrej,etal.annoncol.2001,12(12):1683-91.18.；spillerm,etal.pediatrbloodcancer.2005,45(3):344-6.)，極大限制了其在臨床上的應用。降低該類藥物毒副作用的有效途徑之一是對藥物進行結構修飾，使之成為前體藥物，利用病灶組織與正常組織之間分子生物學上的差異，選擇性作用于病灶靶細胞的基因、酶、信號傳導因子等，從而達到靶向治療的目的。近年來大量研究表明，成纖維細胞激活蛋白酶(fibroblast-activationproteinalpha,fapα)特異性表達于傷愈組織和90％以上的腫瘤組織激活的成纖維細胞與周細胞表面(ramirez-montagutt,etal.oncogene2004,23(32):5435-46.)。

研究表明，長春堿類化合物經肼解及加二肽衍生化形成fapα酶激活式前藥后，在體內外均有良好的抗腫瘤、血管新生抑制和血管破壞活性，如申請中國發(fā)明專利(cn201310138241.8；cn201310738860.0)和pct專利(pct/cn2014/000192)。但是長春堿類衍生物在抑制腫瘤轉移方面的應用和研究尚未見報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種長春堿類衍生物在制備抑制腫瘤轉移藥物中的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：一種長春堿類衍生物在制備抑制腫瘤轉移藥物中的應用，所述的長春堿類衍生物包括長春堿類二肽及其生理上可接受的鹽。

所述的長春堿類二肽為肼解長春堿類化合物與n-芐氧羰基二肽縮合得到的化合物(即長春堿類二肽為長春堿類化合物與水合肼反應形成的肼解長春堿類化合物，再與n-芐氧羰基二肽縮合所得的化合物)；優(yōu)選為長春堿加二肽(bx-ccj)、長春瑞濱加二肽(bx-ccrb)、長春氟寧加二肽(bx-ccfn)和長春新堿加二肽(bx-ccxj)中的一種或以上，其結構式如式ii～v所示：

其中，z-gp表示芐氧羰基甘氨酰脯氨?；?。

所述的長春堿類衍生物的合成路線如下：

所述的肼解長春堿類化合物為長春堿類化合物與水合肼反應得到的化合物；優(yōu)選為肼解長春堿(jj-ccj)、肼解長春瑞濱(jj-ccrb)、肼解長春氟寧(jj-ccfn)或肼解長春新堿(jj-ccxj)。

所述的長春堿類化合物優(yōu)選為長春堿(ccj)、長春瑞濱(ccrb)、長春氟寧(ccfn)或長春新堿(ccxj)。

所述的n-芐氧羰基二肽優(yōu)選為n-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸(z-gp-oh)；所述的n-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸的結構式如式i所示：

所述腫瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌、大腸癌、肝癌、鼻咽癌、腦癌、骨癌等惡性腫瘤；優(yōu)選為乳腺癌。

所述的腫瘤轉移包括腫瘤轉移的各個階段，包括腫瘤轉移早期、中期和晚期。

本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及效果：本發(fā)明肼解長春堿類化合物、長春堿類二肽及其生理上可接受的鹽，在體外可顯著抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移和水平運動能力，在體內顯著抑制腫瘤的遠端轉移，其藥效優(yōu)于長春堿類化合物，可應用于中晚期惡性腫瘤病人伴隨遠端轉移病人的治療。

附圖說明

圖1是長春堿類衍生物對tgf-β1誘導的人乳腺癌細胞mda-mb-231侵襲能力的抑制作用對比圖(***p<0.001vs空白對照組，^###p<0.001vstgf-β1組，^#p<0.01vstgf-β1組)。

圖2是長春堿類衍生物對tgf-β1誘導的人乳腺癌細胞mda-mb-231遷移能力的抑制作用對比圖(***p<0.001vs空白對照組,^###p<0.001vstgf-β1組，^#p<0.01vstgf-β1組)。

圖3是長春堿類衍生物對tgf-β1誘導的人乳腺癌細胞mda-mb-231水平運動能力的抑制作用對比圖(***p<0.001vs空白對照組，^###p<0.001vstgf-β1組，^#p<0.01vstgf-β1組)。

圖4是長春堿類衍生物對tgf-β1誘導的人乳腺癌細胞mda-mb-231上皮間質轉化相關蛋白表達的影響結果圖(***p<0.001vs空白對照組,^###p<0.001vstgf-β1組，^#p<0.01vstgf-β1組)；其中，圖a為上皮細胞鈣粘蛋白、圖b為n-鈣粘蛋白，圖c為波形蛋白。

圖5是長春堿類衍生物對mda-mb-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤肺轉移的抑制作用對比圖(n＝8,mean±sem,^###p<0.001vs空白對照組；^#p<0.01vs空白對照組)；其中，圖a為h&e染色檢測裸鼠肺組織轉移灶數目，圖b為h&e染色檢測裸鼠肺組織轉移灶面積，圖c為利用免疫組化的方法對給藥前后小鼠肺組織上皮標志物(上皮細胞鈣粘蛋白)和間質標志物(n-鈣粘蛋白、纖粘蛋白)的檢測結果，圖d為采用免疫印跡的方法檢測長春堿類衍生物作用前后小鼠腫瘤組織中上皮標志物(上皮細胞鈣粘蛋白)和間質標志物(n-鈣粘蛋白、波形蛋白)的變化。

圖6是長春堿類衍生物對裸鼠乳腺癌mda-mb-231肺轉移的抑制作用對比圖(n＝8,mean±sem,^###p<0.001vs空白對照組；^#p<0.01vs空白對照組)；其中，圖a為h&e染色檢測裸鼠肺組織轉移灶數目；圖b為h&e染色檢測裸鼠肺組織轉移灶面積；圖c為利用免疫組化的方法對給藥前后小鼠肺組織上皮標志物(上皮細胞鈣粘蛋白)和間質標志物(n-鈣粘蛋白、纖粘蛋白)的檢測結果，圖d為采用免疫印跡的方法檢測長春堿類衍生物對小鼠肺組織中上皮標志物(上皮細胞鈣粘蛋白)和間質標志物(n-鈣粘蛋白、波形蛋白)的作用。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

本發(fā)明實施例中涉及的長春堿類化合物依次為長春堿(ccj)、長春瑞濱(ccrb)、長春氟寧(ccfn)和長春新堿(ccxj)，它們經肼解后所得的肼解長春堿類化合物；肼解長春堿類化合物為：肼解長春堿(jj-ccj)、肼解長春瑞濱(jj-ccrb)、肼解長春氟寧(jj-ccfn)和肼解長春新堿(jj-ccxj)；

本發(fā)明實施例中涉及的長春堿類二肽為為長春堿類化合物與水合肼反應形成的肼解長春堿類化合物，再與n-芐氧羰基二肽(n-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸(z-gp-oh))縮合所得的化合物；長春堿類二肽為長春堿二肽(bx-ccj)、長春瑞濱二肽(bx-ccrb)、長春氟寧二肽(bx-ccfn)及長春新堿二肽(bx-ccxj)；

所述化合物的結構及命名如下所示：

實施例1長春堿類衍生物對tgf-β1誘導的人乳腺癌細胞mda-mb-231侵襲能力的抑制作用

實驗方法：將處于對數生長期的人乳腺癌細胞mda-mb-231細胞(購買于americantypeculturecollection，atcc)消化，離心，計數，以2×10⁴/ml分別接種于鋪有matrigel基質膠(bd公司)的transwell小室，重懸細胞于無血清培養(yǎng)基中。每孔100μl，設置空白對照組、tgf-β1組(tgf-β12ng/ml)組和加藥組，加藥組為bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj(6.25nm)與tgf-β1(2ng/ml)共同處理，下室加入700μl含10％新生牛血清的1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時后，吸去培養(yǎng)液，用pbs緩沖液清洗一次，4％多聚甲醛室溫固定30分鐘，用吉姆薩染料著色30分鐘，用棉棒將小室上層膜上的細胞擦去，pbs清洗一次，顯微鏡觀察并計算細胞數目。

實驗結果：與空白對照組相比，tgf-β1組顯著增加了人乳腺癌細胞mda-mb-231的侵襲作用；與因子組對比，長春堿類衍生物明顯抑制了人乳腺癌細胞mda-mb-231的侵襲作用，其藥效優(yōu)于長春堿類化合物(見圖1)。

實施例2長春堿類衍生物對tgf-β1誘導的人乳腺癌細胞mda-mb-231遷移能力的抑制作用

實驗方法：取對數生長期的mda-mb-231細胞，pbs清洗離心，重懸細胞于無血清培養(yǎng)基中。將2×10⁴個/ml的細胞接種于transwell小室，每孔100μl，設置空白對照組、tgf-β1(tgf-β12ng/ml)組和加藥組，加藥組為bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj(6.25nm)與tgf-β1(2ng/ml)共同處理，下室加入700μl含10％新生牛血清的1640培養(yǎng)液。置37℃、含5％co2的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，用pbs清洗一次，4％多聚甲醛室溫固定30分鐘，用吉姆薩染料著色30分鐘，用棉棒將小室上層膜上的細胞擦去，pbs清洗一次，顯微鏡觀察并計算細胞數目。

實驗結果：與空白對照組相比，tgf-β1組顯著增加了人乳腺癌細胞mda-mb-231的遷移作用；與因子組對比，長春堿類衍生物明顯抑制了人乳腺癌細胞mda-mb-231的遷移作用，其藥效優(yōu)于長春堿類化合物(見圖2)。

實施例3長春堿類衍生物對tgf-β1誘導的人乳腺癌細胞mda-mb-231水平運動能力的抑制作用

實驗方法：取對數生長期的mda-mb-231細胞，pbs清洗，消化。將5×10⁵個/ml的細胞接種于六孔板，待細胞密度達90％時，用無血清培養(yǎng)基饑餓8h，10μl移液器劃十字交叉痕，pbs沖洗，拍照，設置空白對照組、tgf-β1(tgf-β12ng/ml)組和加藥組，加藥組為bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj(6.25nm)與tgf-β1(2ng/ml)共同處理，8h后相同視野拍照。結果使用imageplus5軟件統(tǒng)計，求平均值，并計算遷移的細胞數目。

實驗結果：與空白對照組相比，tgf-β1組顯著增加了人乳腺癌細胞mda-mb-231的水平運動能力；與tgf-β1組對比，長春堿類衍生物明顯抑制了人乳腺癌細胞mda-mb-231的水平運動能力，其藥效優(yōu)于長春堿類化合物(見圖3)。

實施例4長春堿類衍生物對tgf-β1誘導的人乳腺癌細胞mda-mb-231上皮間質轉化相關蛋白表達的影響

實驗方法：取對數生長期的mda-mb-231細胞，設置空白對照組、tgf-β1(tgf-β12ng/ml)組和加藥組，加藥組用bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj(6.25nm)處理48小時后，tgf-β1組和加藥組同時加入tgf-β1(2ng/ml)，作用1小時。用ripa裂解液裂解細胞蛋白；進行bca蛋白定量；取40～50μg蛋白樣品進行sds-page凝膠電泳，根據分子量大小的不同對蛋白進行分離；將膠上的蛋白條帶轉移到pvdf膜上；將蛋白條帶置于5％的牛血清白蛋白(bsa)中進行封閉；孵育一抗(購買于cellsignalingtechnology，cst)：按照體積比1:1000稀釋上皮細胞鈣粘蛋白，波形蛋白，n-鈣粘蛋白，4℃孵育過夜；孵育二抗(購買于cellsignalingtechnology，cst)；用ecl顯色液a和b顯出蛋白條帶，并用quantityone軟件進行灰度分析。

實驗結果：與空白對照組相比，tgf-β1組上皮細胞鈣粘蛋白表達下降；n-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達升高。與tgf-β1組相比，給藥組上皮細胞鈣粘蛋白的表達增高；n-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達下降；表明長春堿類衍生物作用后，可顯著抑制tgf-β1誘導的上皮標志物上皮細胞鈣粘蛋白表達降低，同時抑制間質標志物n-鈣粘蛋白和波形蛋白表達升高，長春堿類衍生物抑制上皮間質轉化相關蛋白的作用優(yōu)于長春堿類化合物(見圖4)。

實施例5長春堿類衍生物對mda-mb-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤肺轉移的抑制作用

實驗方法：將處于對數生長期的mda-mb-231細胞消化，用預冷pbs稀釋的matrigel基質膠(體積比1:1稀釋)重懸，調整細胞密度為1×10⁷個/ml后，按0.15ml/只接種于6周齡雌性balb/cnu/nu裸鼠(購買于廣東省醫(yī)學實驗動物中心)左側乳腺脂肪墊內。待瘤塊長至100mm³～200mm³大小，將裸鼠隨機分為9組，每組10只，分別為生理鹽水，bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj組，尾靜脈注射給藥，給藥劑量為2μmol/kg。隔天給藥1次，連續(xù)給藥10次后結束實驗，裸鼠經心臟采血后，剝取腫瘤組織和肺組織。裸鼠肺組織采用蘇木精-伊紅染色，分析轉移灶的大小和數目。肺組織用abc法免疫組化染色。以上皮細胞鈣粘蛋白作為上皮細胞標志性蛋白，n-鈣粘蛋白和纖粘蛋白作為間質細胞標志物，分析它們在空白對照組和給藥組小鼠肺組織的表達情況。裸鼠腫瘤組織取一半勻漿、裂解組織蛋白，用westernblotting的方法分別檢測裸鼠腫瘤組織中上皮細胞鈣粘蛋白，n-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達情況。

實驗結果：長春堿類衍生物顯著抑制了裸鼠乳腺癌上皮間質轉化作用，進而抑制了裸鼠mda-mb-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤的肺轉移；其藥效優(yōu)于長春堿類化合物(見圖5)。

實施例6長春堿類衍生物對裸鼠mda-mb-231乳腺癌轉移的抑制作用

實驗方法：將處于對數生長期的mda-mb-231細胞消化，重懸于無血清的dmem空白培養(yǎng)基內，調整細胞密度為1×10⁷個/ml后，按0.1ml/只尾靜脈注射到6周齡雌性balb/cnu/nu裸鼠。兩周后，將裸鼠隨機分為9組，每組10只，分別為生理鹽水，bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj組，給藥劑量為2μmol/kg。隔天尾靜脈給藥1次，連續(xù)給藥10次后結束實驗，裸鼠經心臟采血后，剝取肺組織，裸鼠肺組織采用蘇木精-伊紅染色，分析轉移灶的大小和數目。用abc法免疫組化染色。以上皮細胞鈣粘蛋白作為上皮細胞標志性蛋白，n-鈣粘蛋白和纖粘蛋白作為間質細胞標志物，分析它們在空白對照組和給藥組小鼠肺組織的表達情況。取一半裸鼠肺組織勻漿、裂解組織蛋白，用westernblotting的方法檢測裸鼠肺組織中上皮細胞鈣粘蛋白，n-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達情況(見圖6)。

實驗結果：長春堿類衍生物顯著抑制了裸鼠乳腺癌上皮間質轉化作用，進而抑制了裸鼠乳腺癌mda-mb-231的肺轉移，其藥效優(yōu)于長春堿類化合物。

上述實驗結果揭示了本發(fā)明所述長春堿類衍生物在體內外可顯著地抑制乳腺癌的轉移，可應用于乳腺癌轉移早期和晚期的治療。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。