本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檸檬苦素在制備治療和/或預(yù)防抗腫瘤轉(zhuǎn)移和/或抗內(nèi)皮血管新生藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的疾病之一，自20世紀70年代以來，我國惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率一直呈上升趨勢，到目前為止尚無徹底治療的辦法。因此，尋求有效預(yù)防及治療腫瘤的方法和藥物一直是國內(nèi)外的研究熱點。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性生物學(xué)行為的特征性表現(xiàn)，也是導(dǎo)致臨床上大多數(shù)惡性腫瘤治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，抗腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤綜合治療的重點。

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康。乳腺癌高居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位。在中國，乳腺癌發(fā)病率為11.6/10萬人口，其發(fā)病率相對較高。而對于乳腺癌的治療，近些年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了多種對抗乳腺癌的小分子藥物靶點，包括一些常規(guī)藥物治療無效的乳腺癌新靶標，進而促進了多種相應(yīng)小分子藥物的研發(fā)及其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的消化道惡腫瘤，尤其是在發(fā)展中國家，其死亡率位居癌癥相關(guān)死亡的第三位，在我國其發(fā)病率及死亡率尤為突出。據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增胃癌病例高達數(shù)百萬，其中我國占42％左右；全球每年因為胃癌死亡的人數(shù)約為80萬，中國占35％。常規(guī)的胃癌治療手段包括手術(shù)、化療、放療、生物免疫治療等。手術(shù)治療仍是根治胃癌的最好選擇，但并不是所有的胃癌患者都可以進行手術(shù)，而且術(shù)后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差；化療和放療對胃癌的輔助治療具有重要意義，但其副作用大，容易破壞患者的免疫系統(tǒng)；生物免疫治療如腫瘤疫苗，多數(shù)還處于研發(fā)或臨床試驗階段，治療效果還未知。近年來，分子靶向治療成為腫瘤治療領(lǐng)域的一個新熱點，它符合胃癌異質(zhì)性明顯、生物學(xué)行為復(fù)雜等特點。分子靶向治療通過特異性靶向或調(diào)節(jié)腫瘤細胞上異常表達的標志性分子，阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細胞的生長、侵襲或轉(zhuǎn)移，其和放療等傳統(tǒng)治療手段相比具有特異性強、選擇性高等優(yōu)點。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多階段復(fù)雜的過程，基本過程包括：1)原發(fā)瘤的增殖，并發(fā)展為侵襲性腫瘤；2)腫瘤新生血管的生長；3)腫瘤細胞侵襲基底膜；4)浸入淋巴系統(tǒng)或血液循環(huán)系統(tǒng)并隨之在體內(nèi)轉(zhuǎn)移；5)在循環(huán)系統(tǒng)中存活的癌細胞，形成瘤栓并轉(zhuǎn)運到遠隔靶器官；6)滯留于靶器官微小血管中；7)傳出血管并形成微小轉(zhuǎn)移灶；8)腫瘤血管形成，轉(zhuǎn)移癌灶增殖。每一個階段都受到不同因素的影響和調(diào)控，涉及到多種黏附分子、基質(zhì)蛋白酶、細胞因子以 及相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制和相關(guān)的基因改變。

目前臨床上尚無治療腫瘤的有效方法，化療藥物對腫瘤雖有一定的療效，但毒副作用較大；中成藥的療效作用緩慢且均不理想，因此開發(fā)多途徑、多靶點的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物是具有重大醫(yī)學(xué)價值的策略之一。

檸檬苦素(limonin)具有抗癌、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒等多種藥理活性。柑橘檸檬苦素類似物能夠抑制結(jié)腸癌、肺癌、口腔癌、胃癌和乳腺癌的生長。zhanga等發(fā)現(xiàn)在動物實驗和人體細胞檸檬苦素具有顯著的抗炎作用。satomishimizu等發(fā)現(xiàn)檸檬苦素呈劑量依賴性顯著抑制人結(jié)腸癌細胞系caco-2轉(zhuǎn)錄活動中的t細胞因子/淋巴細胞增強因子。rahmana發(fā)現(xiàn)檸檬苦素是通過表達凋亡相關(guān)蛋白促進細胞凋亡相關(guān)蛋白發(fā)揮其抗癌潛力。langeswarank發(fā)現(xiàn)檸檬苦素是一種對人類肝癌hepg2細胞有效的抗增殖劑；主要通過穩(wěn)定wnt信號通路誘導(dǎo)hepg2細胞凋亡。chidambaramurthykn發(fā)現(xiàn)食用姜黃素和檸檬苦素類似物對結(jié)腸癌患者可能會提供更多的保護。kimj發(fā)現(xiàn)柑橘類檸檬苦素類似物可能通過caspase-7相關(guān)的通路預(yù)防er-乳腺癌(mcf-7)。somasundarams發(fā)現(xiàn)檸檬苦素對乳腺癌化療患者可能是有益。

現(xiàn)有技術(shù)中并未見有關(guān)檸檬苦素在治療和/或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和/或內(nèi)皮血管新生藥物中的用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對腫瘤轉(zhuǎn)移在臨床上治療效果不理想的現(xiàn)狀，本發(fā)明首次提供了檸檬苦素制備治療和/或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和/或血管新生的新用途。

本發(fā)明提出了檸檬苦素在制備治療和/或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。

其中，所述檸檬苦素是一種含呋喃環(huán)高度氧化的四環(huán)三萜類化合物，主要存在于蕓香科和楝科植物中；分子式為c26h30o8，分子量是470.53，熔點是298℃，分子結(jié)構(gòu)如下式(1)所示：

所述治療和/或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移包括抑制腫瘤細胞遷移。

所述治療和/或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移包括抑制腫瘤細胞腹腔轉(zhuǎn)移。

所述治療和/或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移包括抑制腫瘤大小。

所述治療和/或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移包括減少腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。

本發(fā)明還提出了檸檬苦素在制備治療和/或預(yù)防腫瘤內(nèi)皮血管新生藥物中的應(yīng)用，所述檸檬苦素結(jié)構(gòu)如式(1)所示：

所述治療和/或預(yù)防腫瘤內(nèi)皮血管新生包括降低內(nèi)皮細胞的活性。

所述治療和/或預(yù)防腫瘤內(nèi)皮血管新生包括抑制內(nèi)皮細胞遷移與侵襲的能力。

所述治療和/或預(yù)防腫瘤內(nèi)皮血管新生包括抑制內(nèi)皮細胞小管的生成。

所述治療和/或預(yù)防腫瘤內(nèi)皮血管新生包括減少體內(nèi)基質(zhì)膠血管的生成。

所述腫瘤內(nèi)皮細胞為人臍靜脈內(nèi)皮細胞。

所述人臍靜脈內(nèi)皮細胞為huvec。

所述腫瘤包括頭頸癌、甲狀腺癌、食管癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、皮膚癌、骨癌、宮頸癌、腸癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、腎癌、皮膚癌、口腔癌或惡性淋巴瘤。優(yōu)選地，所述腫瘤為乳腺癌或胃癌；其中，所述乳腺癌(或乳腺癌細胞)為mda-mb-231或mcf-7；所述胃癌(或胃癌細胞)為bgc-823、sgc-7901、ags或mgc-803。

所述檸檬苦素用于降低腫瘤細胞和/或腫瘤內(nèi)皮細胞的stat3磷酸化水平。

所述stat3磷酸化水平由vegfr2介導(dǎo)。

所述檸檬苦素呈濃度依賴性降低腫瘤細胞和/或內(nèi)皮細胞的stat3磷酸化水平。

所述應(yīng)用的對象可以為人、其他哺乳動物如小鼠等，其中小鼠可以為c57bl/a裸小鼠。

本發(fā)明還提出了檸檬苦素在制備抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的活性、遷移、侵襲、成管的藥物中的應(yīng)用。

所述檸檬苦素還可以和其藥學(xué)上可接受的鹽形成藥物組合物。

所述藥物或藥物組合物被配制成可注射流體、氣霧劑、乳膏、凝膠劑、片劑、丸劑、膠囊劑、糖漿劑或透皮貼劑。

所述藥物或藥物組合物被用于口服給藥、皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、舌下給藥、直腸給藥、經(jīng)皮給藥或噴霧吸入。優(yōu)選地，所述藥物被用于腹腔注射或靜脈注射；用于小鼠時，可采用尾靜脈注射。

所述藥物單獨使用或與其他藥物聯(lián)合使用。

所述檸檬苦素為天然的或合成的。

stat(signaltransducerandactivatoroftranscription信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子)蛋白最初被發(fā)現(xiàn)是作為細胞因子信號傳導(dǎo)的調(diào)控者，在細胞內(nèi)起著重要的信號傳遞作用，負責(zé)將細胞外的信號傳遞到細胞核，并通過誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄表達生物刺激的效應(yīng)作用。stat3在stat家族的7個成員中研究較為廣泛。stat3是一個在多種腫瘤細胞中持續(xù)激活的致癌基因。stat3在細胞質(zhì)內(nèi)被磷酸化后形成二聚體，然后入核，與靶基因結(jié)合，從而調(diào)控細胞的增殖、分化、以及凋亡。stat3調(diào)控mmp-2和mmp-1的表達，可直接與mmp-2的啟動子結(jié)合來上調(diào)mmp-2的表達，mmp-2和mmp-1蛋白又可以調(diào)節(jié)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，因此，stat3在腫瘤細胞浸潤過程中起著重要的作用，抑制stat3的活性可以減少腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。在高遷細胞中，阻礙活化的stat3可以抑制腫瘤細胞的浸潤、生長和轉(zhuǎn)移。另外，在皮膚鱗狀癌細胞中，過表達磷酸化stat3促進腫瘤細胞的浸潤和腫瘤轉(zhuǎn)移。stat3調(diào)控muc1基因的表達，而muc1可以調(diào)控腫瘤浸潤?？傊?，stat3可以通過多種機制來調(diào)控腫瘤浸潤。首次發(fā)現(xiàn)stat3與血管新生相關(guān)是在雞胚尿囊膜模型中粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子可以誘導(dǎo)的血管新生。研究證明stat3可以促進vegf的表達和腫瘤轉(zhuǎn)移。大多數(shù)持續(xù)表達stat3的腫瘤細胞都會表達vegf。因而，降低stat3的活性就可以抑制vegf的表達和腫瘤血管新生。

很多細胞因子、生長因子、致癌蛋白，如egf、pdgf、vegf、bfgf、il-6、src和ras等都可以激活stat3，這就說明stat3信號通路參與了腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。一系列的研究證明持續(xù)表達stat3的細胞都可以轉(zhuǎn)移，而且轉(zhuǎn)移能力與stat3的表達相關(guān)。

本發(fā)明的有益效果在于：提供了檸檬苦素(limonin)新的用途。公開了檸檬苦素的抗腫瘤轉(zhuǎn)移和/或內(nèi)皮血管新生的作用；檸檬苦素可有效抑制乳腺癌細胞和/或胃癌細胞的遷移能 力；檸檬苦素可抑制c57bl/a裸小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移，明顯減少轉(zhuǎn)移灶數(shù)量；檸檬苦素具有抑制血管內(nèi)皮細胞活性、遷移、侵襲和小管生成；檸檬苦素可抑制基質(zhì)凝膠血管新生；并顯著降低腫瘤細胞和/或內(nèi)皮細胞stat3磷酸化水平。以上發(fā)現(xiàn)說明檸檬苦素具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移和/或抗腫瘤血管新生的活性，為腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供了一種新的方法。

附圖說明

圖1為檸檬苦素對乳腺癌和胃癌細胞的增殖的作用。

圖2為檸檬苦素抑制乳腺癌和胃癌細胞的遷移，其中，圖2a為顯微鏡拍照圖，圖2b為細胞遷移數(shù)量統(tǒng)計圖。

圖3為檸檬苦素抑制小鼠體內(nèi)胃癌bgc-823細胞腹腔轉(zhuǎn)移。

圖4為檸檬苦素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(huvec)的活力。

圖5為檸檬苦素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(huvec)的遷移。

圖6為檸檬苦素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(huvec)的侵襲。

圖7為檸檬苦素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(huvec)的成管。

圖8為檸檬苦素抑制小鼠基質(zhì)凝膠新生血管的形成。

圖9為檸檬苦素降低腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞stat3蛋白的磷酸化水平。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施本發(fā)明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1檸檬苦素抑制乳腺癌細胞、胃癌細胞增殖的實驗

細胞增殖實驗采用mts檢測。細胞接種于96孔板中培養(yǎng)，4500-5000個/孔。待細胞貼壁后，棄去上清培養(yǎng)液，用pbs清洗2遍，將檸檬苦素按以下濃度0、180、260、340、420、500μmol/l加入孔中，100μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)60～72h后加入20μlcelltiteraqueous細胞增殖檢測試劑，孵育1-3小時，用酶標儀測定490nm下的od值。

細胞活力(％)＝(odsample–odblank)/(odcontrol–odblank)×100％。

其中，所述乳腺癌的細胞為mda-mb-231或mcf-7；所述胃癌的細胞為bgc-823、sgc-7901、ags或mgc-803。

結(jié)果：如圖1示，檸檬苦素對乳腺癌和胃癌細胞的增殖抑制作用不明顯。統(tǒng)計結(jié)果顯示，檸檬苦素的濃度為500μmol/l時，多種乳腺癌和胃癌細胞活力為67.0％～92.5％不等。

結(jié)論：檸檬苦素對乳腺癌和胃癌細胞增殖抑制作用不明顯。

實施例2檸檬苦素抑制乳腺癌和胃癌細胞的遷移

采用細胞劃痕法，本法借鑒體外細胞致傷愈合實驗?zāi)Ｐ停瑴y定腫瘤細胞在細胞外劃痕部位上的運動特性。腫瘤細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待細胞生長率達到90％后，沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕，pbs清洗后，將1ml含檸檬苦素的dmem/1640培養(yǎng)基加入孔中，檸檬苦素濃度分別為0、40、60μmol/l，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后拍照。按照如下公式計算抑制率：

細胞遷移抑制率(％)＝(平均遷移距離control-平均遷移距離sample)/平均遷移距離×100％。

其中，所述乳腺癌的細胞為mda-mb-231或mcf-7；所述胃癌的細胞為bgc-823、sgc-7901、ags或mgc-803。

結(jié)果：如圖2示，其中，圖2a為顯微鏡拍照圖，圖2b為細胞遷移數(shù)量統(tǒng)計圖。

檸檬苦素能顯著抑制腫瘤細胞遷移且呈劑量依賴性。統(tǒng)計結(jié)果顯示，60μmol/l濃度檸檬苦素給藥24h后，細胞遷移抑制率可達47～77％，40μmol/l濃度檸檬苦素給藥24h后，mda-mb-231、mcf-7、sgc-7901、bgc-823、ags、mgc-803的抑制率分別為49％、45％、40％、36％、32％、62％。

結(jié)論：檸檬苦素顯著抑制乳腺癌和胃癌腫瘤細胞的遷移。

實施例3檸檬苦素抑制小鼠體內(nèi)胃癌bgc-823細胞腹腔轉(zhuǎn)移

采用實驗性胃癌腹腔轉(zhuǎn)移模型。balb/ca(nu/nu)裸鼠(雌雄各半，20±2g)隨機分為空白對照組、檸檬苦素低劑量組(12.5mg/kg)和檸檬苦素高劑量組(25mg/kg)。空白對照組給1×pbs，給藥方式為腹腔注射，給藥體積為50μl。提前給藥7天后，將人胃癌細胞株bgc-823(低分化腺癌細胞株，濃度為1×10⁷個/ml)腹腔注射balb/ca(nu/nu)裸鼠，0.2ml/只，即每只小鼠腹腔注射bgc-823腫瘤細胞2×10⁶個，連續(xù)給藥28天。造膜后，每7天隨機處死2只/組小鼠，小心取出肺、腸、腹膜，避免鑷子觸及臟器表面損傷組織，顯微鏡下計算表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。

結(jié)果：如圖3所示，小鼠隨機分組后每組隨機取2只解剖拍照，之后每組每7天隨機解剖2只，拍照得到0天、7天、14天、21天的結(jié)果圖，從結(jié)果中看出，檸檬苦素加藥組可顯著減少腫瘤的大小和轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，隨著檸檬苦素劑量的增加，腫瘤大小和轉(zhuǎn)移灶數(shù)量逐漸減少，其中25mg/kg檸檬苦素可顯著減少小鼠體內(nèi)腫瘤的大小和轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。

結(jié)論：檸檬苦素具有抗胃癌bgc-823腫瘤細胞腹腔轉(zhuǎn)移的作用。

實施例4檸檬苦素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖實驗

細胞增殖實驗采用mts檢測。huvecs細胞接種于0.1％明膠包被的96孔板中培養(yǎng)，5000個/孔。待細胞貼壁后，棄去上清培養(yǎng)液，用pbs清洗2遍，加入含不同藥物濃度(0、 0、120、160、200、240μmol/l)及50ng/mlvegf165的培養(yǎng)基，100μl/孔，于5％co2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h，加入20μlcelltiteraqueous細胞增殖檢測試劑，孵育1-3小時，用酶標儀測定490nm下的od值。

細胞活力(％)＝(odsample–odblank)/(odvegf165control–odblank)×100％。結(jié)果：如圖4示，加入vegf后可顯著促進huvec的生長，但同時加入檸檬苦素后，增殖明顯減少，其中240μmol/l的檸檬苦素可顯著濃度依賴地抑制內(nèi)皮細胞存活，抑制率為57％。

結(jié)論：檸檬苦素抑制vegf刺激條件下的內(nèi)皮細胞生長。

實施例5檸檬苦素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外劃痕遷移實驗

huvecs細胞接種于0.1％明膠包被的6孔板中培養(yǎng)，待細胞生長率達到90％后，沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕，pbs清洗后，加入含不同藥物濃度(0、0、40、60μmol/l)及50ng/mlvegf165的培養(yǎng)基，于5％co2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)7-9h，直至vegf165組劃線兩側(cè)的細胞遷移至劃線區(qū)域中央。

結(jié)果：如圖5示，內(nèi)皮細胞會在vegf的誘導(dǎo)下自發(fā)向空襲區(qū)域遷移，40μmol/l的檸檬苦素就能明顯地抑制細胞的遷移，且抑制率達到73％，抑制效果明顯。

結(jié)論：檸檬苦素顯著抑制vegf刺激條件下人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(huvecs)的遷移。

實施例6檸檬苦素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外侵襲實驗

采用transwell小室法。主要材料是transwell小室(millopore)，transwell小室是一類可插入細胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)皿，底層有孔徑為0.1–12.0μm的聚碳酸酯膜(polycarbonatepetmembrane)，在生長因子vegf的誘導(dǎo)下細胞可以透過膜的一側(cè)粘附于含有高濃度生長因子的另一側(cè)。此實驗可以檢測藥物對內(nèi)皮細胞有侵襲能力的影響。

本實驗采用8μm孔徑小室，分別用100μl0.1％明膠包被transwell小室和培養(yǎng)板，37℃放置1h。將huvecs細胞消化，用無血清的ecm培養(yǎng)基重懸后，取100μl含100,000個細胞的培養(yǎng)基與藥物(檸檬苦素濃度分別為0、0、40、60μmol/l)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，將細胞轉(zhuǎn)入transwell小室里，放入含500μl及50ng/mlvegf165的ecm正常培養(yǎng)基的24孔板里。24h后，從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)板，棄去孔中培養(yǎng)液，用濕潤的棉簽輕輕擦去上室明膠及未遷移的細胞，4％多聚甲醛溶液固定20min，0.1％結(jié)晶紫染色30min，最后用pbs溶液洗去多余的結(jié)晶紫染料。在倒置顯微鏡下觀察拍照。

結(jié)果：如圖6示，內(nèi)皮細胞在vegf的刺激誘導(dǎo)下向鋪有matrigel小室的下方侵襲，但加藥后這種遷移在檸檬苦素濃度為40μmol/l時明顯減少，并且有濃度依賴性，在40μmol/l時，檸檬苦素對內(nèi)皮細胞侵襲的抑制率為56％，檸檬苦素顯著抑制了內(nèi)皮細胞的侵襲。

結(jié)論：檸檬苦素顯著抑制vegf刺激條件下內(nèi)皮細胞的侵襲。

實施例7檸檬苦素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞成管實驗

內(nèi)皮細胞可以在基質(zhì)膠matrigel上融合形成微管，利用內(nèi)皮細胞的這種特性來研究藥物對血管形成的影響。matrigel是從ehs(engelbreth-holm-swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜抽提物。在室溫下，此matrigel可聚合成一種具有生物活性的基質(zhì)材料，其作用與哺乳動物細胞基底膜類似，對于細胞的粘附和分化有效應(yīng)作用。本試驗先將100μl/孔matrigel均勻鋪到24孔板中，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中放置30分鐘待其凝固。每孔加入500μl含huvecs細胞(8×10⁴個/孔)和不同藥物濃度(0、40、60μmol/l)及50ng/mlvegf165的ecm正常培養(yǎng)基。置于37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-10h，空白對照組可以形成明顯的管狀。固定后在顯微鏡下觀察微管形成情況，計算微管形成數(shù)量并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

結(jié)果：如圖7示，在vegf的誘導(dǎo)下內(nèi)皮細胞會遷移、分化并形成小管分支狀形態(tài)結(jié)構(gòu)，但加藥后這種管狀結(jié)構(gòu)的長度和數(shù)目明顯減少，在40μmol/l時，檸檬苦素對內(nèi)皮細胞成管抑制率為61％。

結(jié)論：檸檬苦素顯著抑制人內(nèi)皮細胞小管狀結(jié)構(gòu)的形成。

實施例8檸檬苦素抑制小鼠基質(zhì)凝膠血管新生

將0.5mlmatrigel和不同劑量的藥物溶液冰上混合均勻。將6周齡雄性小鼠隨機分為3組，對照組(pbs)，vegf刺激組，vegf刺激并加藥組。把老鼠麻醉后，在進腹中線注射混好的matrigel。7天后，取出基質(zhì)凝膠球，拍照后，固定包埋，免疫組化分析。

結(jié)果：如圖8示，含vegf組內(nèi)的凝膠呈鮮紅色，里面布滿了血管。同時含有vegf和檸檬苦素的凝膠，呈淡黃色，里面有少量的血管。并且隨著檸檬苦素濃度的提高，基質(zhì)膠的顏色變淡。

結(jié)論：檸檬苦素顯著抑制小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠中血管新生。

實施例9檸檬苦素降低腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞stat3磷酸化水平

細胞按試驗需要處理后，pbs清洗細胞，去pbs，加入ripa緩沖液，加入pmsf等各種蛋白酶抑制劑，移入離心管冰上孵育30min，每隔5min震蕩一次放回冰上。4℃約12,000rpm離心15min，采用bca法(microbca^tmproteinassaykit)定量各組蛋白濃度。校正各組蛋白濃度后，5×sds-loading稀釋并混勻，100℃煮10min，冰上冷卻，離心。按照westernblot基本步驟操作，負于特定蛋白單克隆抗體，ecl化學(xué)發(fā)光，顯影定影于x光片。

結(jié)果：如圖9示，檸檬苦素不僅能夠呈濃度依賴性降低bgc-823腫瘤細胞stat3磷酸化水平(圖9a1)，也呈濃度依賴性降低vegf誘導(dǎo)下的huvecs內(nèi)皮細胞stat3磷酸化水平(圖9a2)，與對照組相比，隨著檸檬苦素濃度的增加，ptyr⁷⁰⁵-stat3的表達量逐漸降低，而總蛋白stat3和內(nèi)參β-actin的表達量不變。

結(jié)論：檸檬苦素呈濃度依賴性的降低腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞stat3磷酸化水平。

本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。