本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，尤其涉及靜電紡絲膜及其制備方法與在制備生物補(bǔ)片中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
羊膜作為一種異體來源的生物敷料目前已被廣泛的應(yīng)用于眼科、皮膚科修復(fù)、抗瘢痕化等外科常見的疾病。其中，羊膜眼科的應(yīng)用主要包括：一、眼表疾病的化學(xué)燒傷、熱燒傷引起的眼表疾病；二、感染性及非感染性角膜潰瘍的治療；三、原發(fā)性或復(fù)發(fā)性翼狀胬肉；四、其他結(jié)膜疾病某些眼部或全身系統(tǒng)性疾病所致的結(jié)膜囊狹窄；五、青光眼手術(shù)聯(lián)合羊膜植入鞏膜瓣下有效的抑制鞏膜增生。羊膜在皮膚修復(fù)中的應(yīng)用主要包括：組織工程皮膚在修復(fù)皮膚燒傷、潰瘍等疾病中具有其不可取代的地位。還可以減少瘢痕形成，減輕疼痛，使創(chuàng)面滲出液減少。羊膜作為生物輔料廣泛的應(yīng)用，但是羊膜的來源有限并且羊膜處理、保存程序繁瑣，同時(shí)羊膜可能引起人體免疫排斥反應(yīng)。所以目前迫切需要開發(fā)新產(chǎn)品用于替代羊膜于臨床上的應(yīng)用。
靜電紡絲技術(shù)(electrostaticspinning，es)是一種簡單易行的新型組織工程多孔支架制備方法，靜電紡絲材料具有獨(dú)特的微觀結(jié)構(gòu)和適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能，為生物組織工程支架、緩釋材料等的研發(fā)提供理想的平臺(tái)。靜電紡絲技術(shù)創(chuàng)建的時(shí)間較早，但直到20世紀(jì)90年代，靜電紡絲才被廣泛的研究，利用靜電將聚合物拉成的細(xì)絲“紡織成布”。目前人們利靜電紡絲技術(shù)成功的合成了人造皮膚、人造血管等生物材料，利用plla，殼聚糖，膠原，plga等生物材料制備外傷輔料止血、皮膚再生、定向藥物緩釋等功能的醫(yī)用產(chǎn)品。以靜電紡絲技術(shù)制備生物補(bǔ)片，可以克服羊膜來源有限、保存不易的困難。但目前的靜電紡絲膜的對(duì)組織修復(fù)的效果不能夠令人滿意。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供靜電紡絲膜及其制備方法與在制備生物補(bǔ)片中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的靜電紡絲膜具有良好的抗炎、抑 菌作用，將其作為生物補(bǔ)片能夠?yàn)榧?xì)胞生長的提供支架，從而促進(jìn)組織的修復(fù)。
本發(fā)明提供的靜電紡絲膜，由以下原料制得；所述原料包括：殼聚糖、明膠和細(xì)胞外基質(zhì)。
通過調(diào)節(jié)靜紡絲膜中殼聚糖與明膠的比例可以調(diào)節(jié)殼聚糖靜電紡膜與體內(nèi)的降解時(shí)間，根據(jù)應(yīng)用的不同要求制備具有不同降解時(shí)間點(diǎn)的可聚糖靜電紡絲溶液。在本發(fā)明中，殼聚糖與明膠的質(zhì)量比為(3～5)：(1～5)。
細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrixc,ecm)，是由動(dòng)物細(xì)胞合成并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。創(chuàng)面愈合過程中，由遷移增生的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)起到重要作用，它可以為細(xì)胞提供移動(dòng)的網(wǎng)絡(luò)和向?qū)?，把?xì)胞粘附在一起，對(duì)組織的愈合起到骨架作用，并且影響各種生長因子生物活性及其調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明將細(xì)胞外基質(zhì)添加入靜電紡絲膜中，使其存在于靜電紡絲膜的立體結(jié)構(gòu)中，所得靜電紡絲膜作為敷料能夠具有保濕抑菌，促進(jìn)傷口愈合的作用。
本發(fā)明添加的細(xì)胞外基質(zhì)選自纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白或硫酸乙酰肝素蛋白。
在本發(fā)明中，細(xì)胞外基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％～1％。
為了避免靜電紡絲膜使用時(shí)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，在其中添加抗排斥藥物。
添加的抗排斥藥物選自硫唑嘌呤、強(qiáng)的松或環(huán)磷酰胺。
在本發(fā)明中，抗排斥藥物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2‰～2‰。
在本發(fā)明中，抗排斥藥物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1‰。
在一些實(shí)施例中，靜電紡絲膜由殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)制得。
其中，殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)的質(zhì)量比為10:2:1。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)為纖維粘連蛋白。
在一些實(shí)施例中，靜電紡絲膜由殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)和抗排斥藥物制得。
其中，殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、抗排斥藥物的質(zhì)量比為10:2:1:0.01。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)為纖維粘連蛋白和層黏連蛋白；抗排斥藥物為強(qiáng)的松。
在另一些實(shí)施例中，殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、抗排斥藥物的質(zhì)量比 為10:4:1:0.01。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)為iv型膠原蛋白；抗排斥藥物為硫唑嘌呤。
在另一些實(shí)施例中，殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、抗排斥藥物的質(zhì)量比為10:5:1:0.01。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)為硫酸乙酰肝素蛋白；抗排斥藥物為環(huán)磷酰胺。
本發(fā)明利用靜電紡絲技術(shù)將殼聚糖和明膠制成靜電紡絲膜，并且加入細(xì)胞外基質(zhì)和抗排斥的藥物，增加了所得靜電紡絲膜的生物學(xué)功能。本發(fā)明利用的為天然生物多糖為原料不僅來源廣泛，避免了應(yīng)用倫理性問題，同時(shí)降低生物污染、病毒傳播、免疫排斥反應(yīng)等。
本發(fā)明提供的靜電紡絲膜可以僅經(jīng)過紡絲工藝制得(本發(fā)明稱為靜電紡絲膜)，也可于紡絲工藝后經(jīng)過交聯(lián)步驟(本發(fā)明稱為交聯(lián)靜電紡絲膜)，形成網(wǎng)格狀空間結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與羊膜的結(jié)構(gòu)相似。
本發(fā)明提供的靜電紡絲膜的制備方法，以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物為溶液，將殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)溶解，制得靜電紡絲溶液后經(jīng)紡絲制得靜電紡絲膜。
在一些實(shí)施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的體積比為7:3～9:1。
作為優(yōu)選，氟乙酸和二氯甲烷的體積比為9:1。
在一些實(shí)施例中，靜電紡絲溶液中：殼聚糖的濃度為50g/l；明膠的濃度為10g/l～25g/l；細(xì)胞外基質(zhì)的濃度為5g/l。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，溶液中還溶解抗排斥藥物。
所述靜電紡絲液中抗排斥藥物的濃度為0.05g/l。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負(fù)電極之間距離為7～12cm；正負(fù)電壓差為20～35kv。
作為優(yōu)選，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負(fù)電極之間距離為7cm；正負(fù)電壓差為30kv。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，紡絲設(shè)備接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為100～120轉(zhuǎn)/min。
作為優(yōu)選，紡絲設(shè)備接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為120轉(zhuǎn)/min。
殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2～0.5mm/s。
作為優(yōu)選，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2mm/s。
紡絲空間溫度為70～90℃，濕度為40rh。
作為優(yōu)選，紡絲空間溫度為80℃。
連續(xù)紡絲120～180min。作為優(yōu)選，連續(xù)紡絲150min。
以本發(fā)明提供的制備方法制得的靜電紡絲膜。
以本發(fā)明提供的制備方法制得的靜電紡絲膜在制備敷料中的應(yīng)用。
殼聚糖、明膠和細(xì)胞外基質(zhì)的混合物以三氟乙酸和二氯甲烷溶解后，經(jīng)過紡絲形成了膜狀結(jié)構(gòu)，將其用貼附傷口表面，能夠形成一層粘稠的殼聚糖薄膜，具有保濕抑菌的作用。與經(jīng)過交聯(lián)的靜電紡絲膜相比，不經(jīng)交聯(lián)的靜電紡絲膜遇水能夠溶解，空間結(jié)構(gòu)消失，但是能夠更好的附著于傷口表面。
本發(fā)明提供的靜電紡絲膜的另一種制備方法需要經(jīng)過交聯(lián)。具體為：
交聯(lián)靜電紡絲膜的制備方法，以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物為溶液，將殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)，制得靜電紡絲溶液后，經(jīng)紡絲、交聯(lián)制得交聯(lián)靜電紡絲膜。
在一些實(shí)施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的體積比為7:3～9:1。
作為優(yōu)選，氟乙酸和二氯甲烷的體積比為9:1。
在一些實(shí)施例中，靜電紡絲溶液中：殼聚糖的濃度為50g/l；明膠的濃度為10g/l～25g/l；細(xì)胞外基質(zhì)的濃度為5g/l。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，溶液中還溶解抗排斥藥物。
所述靜電紡絲液中抗排斥藥物的濃度為0.05g/l。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負(fù)電極之間距離為7～12cm；正負(fù)電壓差為20～35kv。
作為優(yōu)選，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負(fù)電極之間距離為7cm；正負(fù)電壓差為30kv。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，紡絲設(shè)備接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為100～120轉(zhuǎn)/min。
作為優(yōu)選，紡絲設(shè)備接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為120轉(zhuǎn)/min。
殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2～0.5mm/s。
作為優(yōu)選，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2mm/s。
紡絲空間溫度為70～90℃，濕度為40rh。
作為優(yōu)選，紡絲空間溫度為80℃。
連續(xù)紡絲120～180min。作為優(yōu)選，連續(xù)紡絲150min。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，交聯(lián)的交聯(lián)劑為戊二醛；交聯(lián)時(shí)間為1～3h。
交聯(lián)具體為，將經(jīng)紡絲的靜電紡絲膜與交聯(lián)體系置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發(fā)蒸汽進(jìn)行交聯(lián)。在一些實(shí)施例中，交聯(lián)體系中包括水和交聯(lián)劑，其中交聯(lián)劑的體積分?jǐn)?shù)為10～25％。
經(jīng)交聯(lián)的，還經(jīng)過干燥的步驟，干燥的條件為真空干燥，溫度為70～90℃，時(shí)間為2～3h。
在經(jīng)過干燥的步驟后，還經(jīng)過堿處理，以進(jìn)一步的穩(wěn)定靜電紡絲膜的空間結(jié)構(gòu)。具體為，以氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡經(jīng)交聯(lián)和干燥的交聯(lián)靜電紡絲膜。所述氫氧化鈉的乙醇溶液中，氫氧化鈉的濃度為0.5mol/l，浸泡的時(shí)間為1～3h。
在經(jīng)過堿處理后，將交聯(lián)靜電紡絲膜以蒸餾水清洗后，干燥。所述干燥的溫度為70～100℃，干燥的條件為真空干燥。
以本發(fā)明提供的制備方法制得的交聯(lián)靜電紡絲膜。
以本發(fā)明提供的制備方法制得的交聯(lián)靜電紡絲膜在制備生物補(bǔ)片中的應(yīng)用。
殼聚糖、明膠和細(xì)胞外基質(zhì)的混合物以三氟乙酸和二氯甲烷溶解后，經(jīng)過紡絲形成了網(wǎng)格狀的立體結(jié)構(gòu)，經(jīng)過交聯(lián)和堿處理后，該結(jié)構(gòu)更加的穩(wěn)固，紡絲粗細(xì)均勻，空間結(jié)構(gòu)完整與羊膜的結(jié)構(gòu)類似。經(jīng)檢測，經(jīng)交聯(lián)的靜電紡絲膜厚度為0.1mm～0.5mm，應(yīng)力值為1.07n～2.2n。該靜電紡絲膜的空間結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞附著在靜電紡絲膜上，從而為細(xì)胞的生長提供了與體內(nèi)更加相似的環(huán)境，將其制成生物補(bǔ)片，能夠促進(jìn)傷口的愈合，并且能夠起到良好的抗菌作用。因而，本發(fā)明提供了一種生物補(bǔ)片，由經(jīng)交聯(lián)的靜電紡絲膜和生長因子制得。
本發(fā)明提供的生物補(bǔ)片由以下原料制得，所述原料包括殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)和生長因子。
在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞外基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5％；所述生長因子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1‰。
生長因子是指具有刺激細(xì)胞生長活性的細(xì)胞因子。是一類通過與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與其他細(xì)胞功能等多效應(yīng)的多肽類物質(zhì)。本發(fā)明利用靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進(jìn)行縮合反應(yīng)，將生長因子修飾在靜電紡絲膜的表面。本發(fā)明制得的生物補(bǔ)丁具有網(wǎng)格狀的 空間結(jié)構(gòu)，紡絲粗細(xì)均勻。其內(nèi)部含有細(xì)胞外基質(zhì)成分，表面修飾有生長因子，因此，其能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長。根據(jù)不同患者的需求，可將不同的生長因子修飾在靜電紡絲膜的表面。也可以根據(jù)不同患者的需求，在生物補(bǔ)片表面接種不同種類的干細(xì)胞，然后將其用于受損組織的修復(fù)；或者直接利用靜電紡膜對(duì)受損組織進(jìn)行修復(fù)。因此，本發(fā)明提供的生物補(bǔ)片可用于眼科、皮膚科、隔膜修復(fù)。能夠用于治療胬肉、眼表損傷、抗增殖、皮膚損傷、臟器損傷，或進(jìn)行牙齒修復(fù)。
本發(fā)明提供的生物補(bǔ)片中還包括抗排斥藥物，所述抗排斥藥物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2‰。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，生長因子選自成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、人肝細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子或血管內(nèi)皮生長因子。
在一些實(shí)施例中，生物補(bǔ)片由殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)和生長因子制得。
其中，殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子的質(zhì)量比為10:2:1:0.01。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)為纖維粘連蛋白。
其中，生長因子為成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子。
其中，成纖維細(xì)胞生長因子和表皮細(xì)胞生長因子的質(zhì)量比為1：1。
實(shí)驗(yàn)表明，此實(shí)施例制得靜電紡絲膜的降解時(shí)間為25天。
在一些實(shí)施例中，靜電紡絲膜由殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子和抗排斥藥物制得。
其中，殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子和抗排斥藥物的質(zhì)量比為10:4:1:0.01。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)為纖維粘連蛋白和層黏連蛋白；抗排斥藥物為強(qiáng)的松。生長因子為成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子。
其中，成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子的質(zhì)量比為1：1。
實(shí)驗(yàn)表明，此實(shí)施例制得靜電紡絲膜的降解時(shí)間為23天。
在另一些實(shí)施例中，殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子和抗排斥藥物的質(zhì)量比為10:5:1：0.01：0.01。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)為iv型膠原蛋白；抗排斥藥物為硫唑嘌呤；生長因子 為表皮生長因子和胰島素樣生長因子。
其中，表皮生長因子和胰島素樣生長因子的質(zhì)量比為1：1。
實(shí)驗(yàn)表明，此實(shí)施例制得靜電紡絲膜的降解時(shí)間為21天。
在另一些實(shí)施例中，殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子和抗排斥藥物的質(zhì)量比為10:5:1：0.01：0.01。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)為硫酸乙酰肝素蛋白；抗排斥藥物為環(huán)磷酰胺；生長因子為表皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子。
其中，表皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子的質(zhì)量比為1：1。
實(shí)驗(yàn)表明，此實(shí)施例制得靜電紡絲膜的降解時(shí)間為21天。
本發(fā)明提供的生物補(bǔ)片是在靜電紡絲膜上修飾生長因子制得，所述靜電紡絲膜可參照本發(fā)明提供的方法制備，也可于市場購得本發(fā)明制備的靜電紡絲膜。
本發(fā)明提供的生物補(bǔ)片的制備方法，包括：
步驟1：以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物為溶液，將殼聚糖、明膠和細(xì)胞外基質(zhì)溶解，制得靜電紡絲溶液后，經(jīng)紡絲、交聯(lián)制得交聯(lián)靜電紡絲膜；
步驟2：在所述交聯(lián)靜電紡絲膜表面修飾生長因子反應(yīng)，制得生物補(bǔ)片。
步驟2具體為，將靜電紡絲膜活化后，在dmap和nhs存在條件下，與生長因子反應(yīng)，制得生物補(bǔ)片。
在一些實(shí)施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的體積比為7:3～9:1。
作為優(yōu)選，氟乙酸和二氯甲烷的體積比為9:1。
在一些實(shí)施例中，靜電紡絲溶液中：殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％；明膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5％；細(xì)胞外基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，溶液中還溶解抗排斥藥物。
所述靜電紡絲液中抗排斥藥物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2‰。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負(fù)電極之間距離為7～12cm；正負(fù)電壓差為20～35kv。
作為優(yōu)選，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負(fù)電極之間距離為7cm；正負(fù)電壓差為30kv。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，紡絲設(shè)備接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為100～120轉(zhuǎn)/min。
作為優(yōu)選，紡絲設(shè)備接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為120轉(zhuǎn)/min。
殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2～0.5mm/s。
作為優(yōu)選，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2mm/s。
紡絲空間溫度為70～90℃，濕度為40rh。
作為優(yōu)選，紡絲空間溫度為80℃。
連續(xù)紡絲120～180min。作為優(yōu)選，連續(xù)紡絲150min。
在一些實(shí)施例中，活化的時(shí)間為12～24h；與生長因子反應(yīng)的溫度為0～4℃，反應(yīng)時(shí)間為20～30h。
在一些實(shí)施例中，活化為將靜電紡絲膜以pbs緩沖液浸泡。
作為優(yōu)選，活化的時(shí)間為24h；與生長因子反應(yīng)的溫度為4℃，反應(yīng)時(shí)間為24h。
作為優(yōu)選，dmap與nhs的質(zhì)量比1:1。
在一些實(shí)施例中，靜電紡絲膜與生長因子的質(zhì)量比為(3～4)：0.01。
作為優(yōu)選，靜電紡絲膜與生長因子的質(zhì)量比為3：0.01。
與生長因子反應(yīng)后，生物補(bǔ)片還經(jīng)過凍干和滅菌。
作為優(yōu)選，滅菌采用環(huán)氧乙烷熏蒸。
實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的生物補(bǔ)片能夠具有良好的抑菌效果，且可以作為細(xì)胞支架用于傷口的修復(fù)，或作為生物海綿吸附干細(xì)胞懸液進(jìn)行傷口的修復(fù)。
因此，本發(fā)明提供的生物補(bǔ)片在傷口的修復(fù)中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了靜電紡絲膜及其制備的生物補(bǔ)片。本發(fā)明提供的靜電紡絲膜由殼聚糖、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)制得，其中還可包括抗排斥藥物。其可直接由紡絲制得，或經(jīng)紡絲、交聯(lián)后制得。在靜電紡絲膜表面修飾生長因子，制得生物補(bǔ)丁。本發(fā)明提供的靜電紡絲膜具有網(wǎng)格狀的空間結(jié)構(gòu)，紡絲粗細(xì)均勻，與羊膜結(jié)構(gòu)相似。且其表面修飾生長因子后，其能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長，有利于細(xì)胞的吸附且能夠?yàn)榧?xì)胞生長提供更加適宜的環(huán)境，從而達(dá)到更好的修復(fù)作用，能夠用于皮膚、眼表等部位，具有良好的抗菌、消炎效果。
附圖說明
圖1-a示實(shí)施例5制得的靜電紡絲膜的電鏡圖；
圖1-b示生物羊膜的靜電紡絲膜的電鏡圖；
圖2示紅外圖譜；其中，線1示殼聚糖的紅外光譜；線2示明膠的紅外光譜；線3示實(shí)施例5制得靜電紡絲膜的紅外光譜；線4示實(shí)施例9制得的生物補(bǔ)片的紅外光譜；
圖3-a示光鏡下實(shí)施例9制得的生物補(bǔ)片，25×；
圖3-b示市售殼聚糖靜電紡絲膜與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的效果，25×；
圖3-c示生物羊膜與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的效果，25×；
圖3-d示實(shí)施例5制得的靜電紡絲膜與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的效果，25×；
圖3-e示實(shí)施例9制得的生物補(bǔ)片與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的效果，25×；
圖4-a示a組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4天后球結(jié)膜病理檢測，40×；
圖4-b示a組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×；
圖4-c示a組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×；
圖4-d示a組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×；
圖4-e示b組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4天后球結(jié)膜病理檢測，40×；
圖4-f示b組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×；
圖4-g示b組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×；
圖4-h示b組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×；
圖4-i示c組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4天后球結(jié)膜病理檢測，40×；
圖4-j示c組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×；
圖4-k示c組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×；
圖4-l示c組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28天后球結(jié)膜組織病理檢測，40×。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了靜電紡絲膜及其制備方法與在制備生物補(bǔ)片中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
本發(fā)明采用的試劑、試材、儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
實(shí)施例1
殼聚糖10g、明膠2g、纖維粘連蛋白1g，溶解于0.2l三氟乙酸與二氯甲烷(體積比為9:1)溶液中；充分?jǐn)嚢杌旌先芙?，待完全溶解后加?.01g的硫唑嘌呤溶解待用。
采用kh-1103型靜電紡絲設(shè)備對(duì)殼聚糖靜電紡絲溶液進(jìn)行紡絲。殼聚糖靜電紡絲溶液裝填于注射器中，注射器前端的針頭直徑為0.7mm，將殼聚糖注射器的針頭連接靜電紡絲機(jī)正電極，滾筒狀接收器靜電紡絲機(jī)負(fù)電極，調(diào)節(jié)靜電紡絲機(jī)正負(fù)電極之間的距離為7cm，正負(fù)電壓差子在30kv，接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為120轉(zhuǎn)/min，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2mm/s，紡絲空間溫度為80℃，濕度為40rh。連續(xù)紡絲150min，制得靜電紡絲膜5g。
實(shí)施例2
殼聚糖10g、明膠4g、纖維粘連蛋白0.5g、層黏連蛋白0.5g、溶解于0.2l三氟乙酸與二氯甲烷(體積比為7:3)溶液中；充分?jǐn)嚢杌旌先芙?，待完全溶解后加入?qiáng)的松0.01g，溶解待用。
采用kh-1103型靜電紡絲設(shè)備對(duì)殼聚糖靜電紡絲溶液進(jìn)行紡絲。殼聚糖靜電紡絲溶液裝填于注射器中，注射器前端的針頭直徑為0.7mm，將殼聚糖注射器的針頭連接靜電紡絲機(jī)正電極，滾筒狀接收器靜電紡絲機(jī)負(fù)電極，調(diào)節(jié)靜電紡絲機(jī)正負(fù)電極之間的距離為10cm，正負(fù)電壓差子在20kv，接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為100轉(zhuǎn)/min，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.3mm/s，紡絲空間溫度為70℃，濕度為40rh。連續(xù)紡絲120min，制得靜電紡絲膜5.5g。
實(shí)施例3
殼聚糖10g、明膠5g、iv型膠原蛋白1g溶解于0.2l三氟乙酸與二氯甲烷(體積比為4:1)溶液中；充分?jǐn)嚢杌旌先芙?，待完全溶解后加入硫唑嘌?.01g，溶解待用。
采用kh-1103型靜電紡絲設(shè)備對(duì)殼聚糖靜電紡絲溶液進(jìn)行紡絲。殼聚糖 靜電紡絲溶液裝填于注射器中，注射器前端的針頭直徑為0.7mm，將殼聚糖注射器的針頭連接靜電紡絲機(jī)正電極，滾筒狀接收器靜電紡絲機(jī)負(fù)電極，調(diào)節(jié)靜電紡絲機(jī)正負(fù)電極之間的距離為12cm，正負(fù)電壓差子在35kv，接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為110轉(zhuǎn)/min，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.5mm/s，紡絲空間溫度為90℃，濕度為40rh。連續(xù)紡絲180min，制得靜電紡絲膜5.4g。
實(shí)施例4
殼聚糖10g、明膠5g、乙酰肝素蛋白1g溶解于0.2l三氟乙酸與二氯甲烷(體積比為9:1)溶液中；充分?jǐn)嚢杌旌先芙猓耆芙夂蠹尤氕h(huán)磷酰胺0.01g，溶解待用。
采用kh-1103型靜電紡絲設(shè)備對(duì)殼聚糖靜電紡絲溶液進(jìn)行紡絲。殼聚糖靜電紡絲溶液裝填于注射器中，注射器前端的針頭直徑為0.7mm，將殼聚糖注射器的針頭連接靜電紡絲機(jī)正電極，滾筒狀接收器靜電紡絲機(jī)負(fù)電極，調(diào)節(jié)靜電紡絲機(jī)正負(fù)電極之間的距離為8cm，正負(fù)電壓差子在25kv，接收器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為120轉(zhuǎn)/min，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.4mm/s，紡絲空間溫度為85℃，濕度為40rh。連續(xù)紡絲160min，制得靜電紡絲膜5.2g。
實(shí)施例5
將實(shí)施例1制得的靜電紡絲膜2g與0.025l戊二醛水溶液(體積分?jǐn)?shù)25％)置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發(fā)蒸汽進(jìn)行殼聚糖靜電紡絲膜的交聯(lián)1h。
90℃真空條件下干燥2h。
0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇溶液浸泡殼聚糖靜電紡絲膜1h，進(jìn)一步保持靜電紡絲膜的空間結(jié)構(gòu)。
蒸餾水反復(fù)清洗去掉多余的氫氧化鈉等物質(zhì)，100℃真空干燥，制得交聯(lián)靜電紡絲膜。
實(shí)施例6
將實(shí)施例2制得的靜電紡絲膜2g與0.025l戊二醛水溶液(體積分?jǐn)?shù)10％)置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發(fā)蒸汽進(jìn)行殼聚糖靜 電紡絲膜的交聯(lián)3h。
70℃真空條件下干燥3h。
0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇溶液浸泡殼聚糖靜電紡絲膜3h，進(jìn)一步保持靜電紡絲膜的空間結(jié)構(gòu)。
蒸餾水反復(fù)清洗去掉多余的氫氧化鈉等物質(zhì)，70℃真空干燥，制得交聯(lián)靜電紡絲膜。
實(shí)施例7
將實(shí)施例3制得的靜電紡絲膜2g與0.025l戊二醛水溶液(體積分?jǐn)?shù)15％)置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發(fā)蒸汽進(jìn)行殼聚糖靜電紡絲膜的交聯(lián)2h。
80℃真空條件下干燥2.5h。
0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇溶液浸泡殼聚糖靜電紡絲膜2h，進(jìn)一步保持靜電紡絲膜的空間結(jié)構(gòu)。
蒸餾水反復(fù)清洗去掉多余的氫氧化鈉等物質(zhì)，80℃真空干燥，制得交聯(lián)靜電紡絲膜。
實(shí)施例8
將實(shí)施例4制得的靜電紡絲膜2g與0.025l戊二醛水溶液(體積分?jǐn)?shù)20％)置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發(fā)蒸汽進(jìn)行殼聚糖靜電紡絲膜的交聯(lián)3h。
80℃真空條件下干燥3h。
0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇溶液浸泡殼聚糖靜電紡絲膜2h，進(jìn)一步保持靜電紡絲膜的空間結(jié)構(gòu)。
蒸餾水反復(fù)清洗去掉多余的氫氧化鈉等物質(zhì)，100℃真空干燥，制得交聯(lián)靜電紡絲膜。
實(shí)施例9
將實(shí)施例5制得的交聯(lián)靜電紡絲膜1.5g，浸泡于pbs溶液中(ph值7.4)24h，使其表面的氨基充分活化。加入4-二甲氨基吡啶(dmap)0.12g與 n-羥基丁二酰亞胺(nhs)0.12g。充分溶解后加入成纖維細(xì)胞生長因子0.005g、表皮生長因子0.005g。利用殼聚糖靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進(jìn)行縮合反應(yīng)，4℃反應(yīng)24h，將生長因子修飾在靜電紡絲膜表面后，冷凍干燥、進(jìn)行環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌，制得生物補(bǔ)片。
實(shí)施例10
將實(shí)施例6制得的交聯(lián)靜電紡絲膜2g，浸泡于pbs溶液中(ph值7.4)12h，使其表面的氨基充分活化。同時(shí)加入4-二甲氨基吡啶(dmap)0.15g與n-羥基丁二酰亞胺(nhs)0.15g。充分溶解后加入成纖維細(xì)胞生長因子0.007g、血管內(nèi)皮生長因子0.007g。利用殼聚糖靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進(jìn)行縮合反應(yīng)，2℃反應(yīng)20h，將生長因子修飾在靜電紡絲膜表面后，冷凍干燥、進(jìn)行環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌，制得生物補(bǔ)片。
實(shí)施例11
將實(shí)施例7制得的交聯(lián)靜電紡絲膜1g，浸泡于pbs溶液中(ph值7.4)20h，使其表面的氨基充分活化。同時(shí)加入4-二甲氨基吡啶(dmap)0.1g與n-羥基丁二酰亞胺(nhs)0.1g。充分溶解后加入表皮生長因子0.003g、胰島素樣生長因子0.003g。利用殼聚糖靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進(jìn)行縮合反應(yīng)，0℃反應(yīng)30h，將生長因子修飾在靜電紡絲膜表面后，冷凍干燥、進(jìn)行環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌，制得生物補(bǔ)片。
實(shí)施例12
將實(shí)施例8制得的交聯(lián)靜電紡絲膜1g，浸泡于pbs溶液中(ph值7.4)18h，使其表面的氨基充分活化。同時(shí)加入4-二甲氨基吡啶(dmap)0.1g與n-羥基丁二酰亞胺(nhs)0.1g。充分溶解后加入表皮生長因子0.003g、血管內(nèi)皮生長因子0.003g。利用殼聚糖靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進(jìn)行縮合反應(yīng)4℃反應(yīng)24h，將生長因子修飾在靜電紡絲膜表面后，冷凍干燥、進(jìn)行環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌，制得生物補(bǔ)片。
實(shí)施例13
掃描電鏡的檢測：
取實(shí)施例1～12制得的靜電紡絲膜樣品，表面噴金、固定，以鎢燈絲掃描電子顯微鏡(s-3800，日立公司)觀察靜電紡絲膜纖維表面形貌。其中，對(duì)實(shí)施例5制得的靜電紡絲膜的電鏡圖如圖1-a所示，其他實(shí)施例制得的靜電紡絲膜的空間結(jié)構(gòu)與此相似?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例制得的靜電紡絲膜具有空間立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與生物羊膜空間結(jié)構(gòu)(圖1-b)相似，紡絲直徑均勻(0.1～0.5μm)納米纖維。
實(shí)施例14
紅外圖譜檢測：
對(duì)實(shí)施例5～8制得的交聯(lián)靜電紡絲膜和實(shí)施例9～12制得的生物補(bǔ)片進(jìn)行紅外圖譜檢測。其中，對(duì)實(shí)施例5制得靜電紡絲膜和實(shí)施例9制得的生物補(bǔ)片的紅外圖譜如圖2紅外圖譜所示，其中，線1示殼聚糖的紅外光譜，線2示明膠的紅外光譜，線3示實(shí)施例5制得靜電紡絲膜的紅外光譜(實(shí)施例6～8制得的靜電紡絲膜的紅外光譜與此相似)；線4示實(shí)施例9制得的生物補(bǔ)片的紅外光譜(實(shí)施例10～12制得的靜電紡絲膜的紅外光譜與此相似)。如線4，細(xì)胞因子與殼聚糖上的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)形成酰胺鍵。
檢測結(jié)果表明，殼聚糖在3413cm-1、2875cm-1、1655cm-1、1376cm-1、1049cm-1等處具有明顯的吸收峰。3400cm-1、2862cm-1為殼聚糖環(huán)上的碳?xì)滏I、羥基的吸收峰，本研究用的殼聚糖的脫乙酰度為95％左右，在紅外圖譜上可以觀察到酰胺鍵的吸收峰在1646cm-1、1382cm-1處,1049cm-1處的吸收峰為糖環(huán)上的碳氧鍵吸收峰。
本發(fā)明制得的生物補(bǔ)片在3413cm-1、2875cm-1、1648cm-1、1378cm-1、1070cm-1處具有明顯的吸收峰。保持與殼聚糖明膠的基礎(chǔ)吸收峰，并且酰胺鍵的吸收峰變得扁平，峰面積較大，可以斷定生物因子與殼聚糖進(jìn)行的縮合反應(yīng)形成酰胺鍵。
實(shí)施例15
瓊脂擴(kuò)散抑菌實(shí)驗(yàn)，以實(shí)施例5制得的靜電紡絲膜與生物羊膜(直徑5mm)探討生物膜膜片對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑制作用。結(jié)果如表1 所示：
注：--示未見抑菌效果
結(jié)果顯示，本發(fā)明實(shí)施例制得的生物補(bǔ)片或靜電紡絲膜皆具有良好的抑菌效果。
實(shí)施例16
靜電紡絲膜干細(xì)胞培養(yǎng)：
實(shí)施例5～12制得的靜電紡絲膜，實(shí)驗(yàn)以市售殼聚糖靜電紡絲膜為對(duì)照。分別將膜平鋪于6cm培養(yǎng)皿底部，加入2ml無血清dmed培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48h，接種間充質(zhì)干細(xì)胞前2h去掉浸泡培養(yǎng)基。間充質(zhì)干細(xì)胞制備成4×108l-1的細(xì)胞懸液，2ml的細(xì)胞懸液緩慢滴加于培養(yǎng)皿靜電紡絲膜的表面，孵育2h的后添加3ml10％小牛血清的dmem培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換10％小牛血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)10天，每天對(duì)靜電紡絲陪細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖3所示：光鏡下，實(shí)施例9制得的生物補(bǔ)片具有網(wǎng)格狀的空間結(jié)構(gòu)，紡絲粗細(xì)均勻(圖3-a)，市售殼聚糖靜電紡絲膜上生長的干細(xì)胞數(shù)量較少(圖3-b)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)為7×105個(gè)/cm2，生物羊膜上細(xì)胞附著數(shù)量豐富，生長狀態(tài)良好(圖3-c)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)為8.3×105個(gè)/cm2；實(shí)施例5制得的靜電紡絲膜上細(xì)胞數(shù)量較豐富，生長狀態(tài)良好(圖3-d)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)為9.8×105個(gè)/cm2；實(shí) 施例9制得的生物補(bǔ)片上細(xì)胞數(shù)量豐富(圖3-e)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)為9×105個(gè)/cm2，且生長狀態(tài)良好，與生物羊膜效果相當(dāng)。
實(shí)施例17
選擇健康無眼病新西蘭白兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重2.5～3kg，30只，雌雄不限，由中國北方眼科疾病動(dòng)物平臺(tái)(遼寧何氏醫(yī)學(xué)院)提供，右眼選為實(shí)驗(yàn)眼，以0.2ml/kg的劑量肌肉注射速眠新ⅱ進(jìn)行麻醉，鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，碘伏沖洗結(jié)膜囊，手術(shù)切除外直肌與上直肌間約1/4項(xiàng)限4mm×5mm鞏膜緣組織，其前界達(dá)到角膜透明區(qū)內(nèi)0.5-1mm，后界達(dá)到角鞏膜溝后1.0～1.5mm，深0.2～0.4mm，棉簽蘸取0.5mol/l的氫氧化鈉溶液(1ml)處理角膜緣透明區(qū)域，制備球結(jié)膜損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
a組模型動(dòng)物空白組；常規(guī)手術(shù)方法切除4mm×5mm鞏膜緣組織，縫合四角結(jié)膜與淺鞏膜固定球結(jié)膜損傷處，作為傷口的標(biāo)記；
b組凍干羊膜治療組；實(shí)驗(yàn)方法與a組相同，術(shù)中凍干羊膜5mm×6mm平鋪于傷口處，膜四周墊付于結(jié)膜下，縫合四角結(jié)膜、生物羊膜與淺層鞏膜固定凍干羊膜(生物羊膜由上善醫(yī)療器械有限公司提供)；
c組本發(fā)明生物補(bǔ)片治療組。實(shí)驗(yàn)方法與a組相同，術(shù)中采用實(shí)施例9制備的生物補(bǔ)片5mm×6mm平鋪于手術(shù)傷口處，膜的四周墊付于結(jié)膜下，四角縫合結(jié)膜、靜電紡絲膜與淺層鞏膜固定靜電紡絲膜。
如圖4所示，術(shù)后4、8、14、28天分別取材進(jìn)行常規(guī)病理檢測：a組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以觀察到球結(jié)膜術(shù)后，球結(jié)膜于眼球后部緩慢向角膜方向生長，28天后角膜緣附近生有大量的瘢痕組織(he，×40)(圖4-a～圖4-b)；b組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以觀察到球結(jié)膜術(shù)后，球結(jié)膜修復(fù)快速，球結(jié)膜上皮生長不完整，修復(fù)速度較單純手術(shù)恢復(fù)的快，同時(shí)瘢痕化較輕(he，×40)(圖4-e～圖4-h)；c組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以觀察到球結(jié)膜術(shù)后，球結(jié)膜修復(fù)迅速，大量的組織沿著生物補(bǔ)片生長，28天后球結(jié)表面較為光潔，很大程度上促進(jìn)球結(jié)膜的修復(fù)，抗瘢痕化作用強(qiáng)(he，×40)(圖4-i～圖4-l)。
說明：本發(fā)明制備的生物補(bǔ)片具有支撐組織生長的能力，促進(jìn)球結(jié)膜術(shù)后快速修復(fù)，為修復(fù)提供良好的細(xì)胞支架，修復(fù)組織較平整，瘢痕化增殖較少，為球結(jié)膜的修復(fù)提供一種良好的組織敷料。
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。