本發(fā)明涉及由基于核酸的分子構(gòu)成的生物藥物和治療劑領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及利用rna干擾(rnai)來(lái)調(diào)節(jié)人gst-π的表達(dá)的化合物和組合物及其用途。序列表本申請(qǐng)包括于2015年12月20日創(chuàng)建的命名為nd5123385wo_sl.txt的作為ascii文件以電子方式提交的序列表，其大小為100,000字節(jié)，該序列表通過(guò)引用整體并入本文。發(fā)明背景已經(jīng)發(fā)現(xiàn)各種人類癌組織與突變的kras基因的出現(xiàn)相關(guān)。在一些情況下，所述組織也呈現(xiàn)出升高水平的谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶pi(gst-π)表達(dá)。(miyanishi等，gastroenterology，2001，第121卷：865-874，摘要)。例如，在各種胃腸道惡性腫瘤患者中觀察到升高的血清gst-π水平。(niitsu等，cancer，1989，第63卷，no.2，第317-323頁(yè)，摘要)gst-π是通過(guò)催化疏水性和親電子化合物與還原型谷胱甘肽的綴合而在解毒中起作用的酶的gst家族的成員。使用sirna可以在體外減少gst-π表達(dá)。(niitsu等，us2014/0315975a1)。然而，現(xiàn)有sirna劑存在許多缺點(diǎn)，例如活性不足、脫靶效應(yīng)(offtargeteffects)、缺乏血清穩(wěn)定性以及缺乏體內(nèi)功效或效力。迫切需要用于調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)的基因的表達(dá)的組合物和方法。特別地，基于gst-π表達(dá)抑制的治療劑將需要高功效和穩(wěn)定的sirna序列和結(jié)構(gòu)，其可降低脫靶效應(yīng)。人們需要用于調(diào)節(jié)gst-π表達(dá)的sirna序列、化合物和結(jié)構(gòu)，其具有治療疾病(例如，惡性腫瘤)的用途。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及使用rna干擾來(lái)調(diào)節(jié)人gst-π表達(dá)的化合物、組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于對(duì)gst-π進(jìn)行rna干擾基因沉默的分子。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)、分子和組合物可用于預(yù)防或治療與gst-π相關(guān)的疾病或改善與gst-π相關(guān)的病癥或障礙(包括惡性腫瘤)的癥狀的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案包括以下內(nèi)容：一種核酸分子，其用于抑制gst-π的表達(dá)，所述核酸分子包含有義鏈和反義鏈，其中所述的鏈形成雙鏈體區(qū)域。所述核酸分子可以是用于抑制gst-π表達(dá)的sirna分子，并且可含有經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，用于抑制gst-π表達(dá)的核酸sirna分子可包括2'-脫氧核苷酸、2'-o-烷基取代的核苷酸、2'-脫氧-2'-氟取代的核苷酸或其任意組合。在某些實(shí)施方案中，2'-脫氧核苷酸可以在sirna分子的種子區(qū)域。在某些方面，用于抑制gst-π表達(dá)的sirna分子可在反義鏈的多個(gè)位置處具有脫氧核苷酸。本發(fā)明的核酸分子可以以小于300pm的ic50有利地抑制gst-πmrna的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，單次施用所述分子后，所述核酸分子可在體內(nèi)抑制至少25％的gst-πmrna表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子可具有脫靶活性降低、或降低至少50倍或至少100倍的乘客鏈。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了藥物組合物，其包含sirna分子和可藥用運(yùn)載體。在一些實(shí)施方案中，所述運(yùn)載體可以是脂質(zhì)分子或脂質(zhì)體。本發(fā)明包括包含核酸分子的載體或細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過(guò)向有需要的受試者施用含sirna的組合物用于治療與gst-π表達(dá)相關(guān)的疾病的方法，其中所述疾病是惡性腫瘤、癌癥、由表達(dá)突變的kras的細(xì)胞引起的癌癥、肉瘤或癌。附圖簡(jiǎn)述圖1：圖1示出通過(guò)本發(fā)明的靶向gst-π的sirna而實(shí)現(xiàn)的體內(nèi)原位肺癌腫瘤的顯著減小。將gst-πsirna以2mg/kg的劑量在脂質(zhì)體制劑中施用于呈現(xiàn)a549原位肺癌腫瘤的無(wú)胸腺裸鼠。在尸檢時(shí)對(duì)治療組和介質(zhì)對(duì)照組測(cè)量最終原發(fā)腫瘤重量。在這項(xiàng)為期6周的研究中，gst-πsirna對(duì)肺癌腫瘤的抑制示出顯著效力。如圖1所示，43天后，與對(duì)照相比，gst-πsirna示出明顯有利的腫瘤抑制，最終原發(fā)腫瘤平均重量顯著降低2.8倍。圖2：圖2示出gst-πsirna在體內(nèi)的腫瘤抑制效力。以0.75mg/kg相對(duì)低劑量的sirna使用利用a549細(xì)胞的癌異種移植模型。gst-πsirna在幾天內(nèi)示出有利的腫瘤抑制。36天后，與對(duì)照相比，gst-πsirna示出明顯有利的腫瘤抑制，最終腫瘤平均體積顯著降低約2倍。圖3：圖3示出在圖2的終點(diǎn)處gst-πsirna的體內(nèi)腫瘤抑制效力。gst-πsirna示出有利的腫瘤抑制作用，平均腫瘤重量降低超過(guò)2倍。圖4：圖4示出本發(fā)明的gst-πsirna通過(guò)體外凋亡大幅增加了癌細(xì)胞死亡。gst-πsirna引起puma的上調(diào)，puma是細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物，其與細(xì)胞活力損失相關(guān)。在圖4中，puma的表達(dá)在轉(zhuǎn)染gst-πsirna后的2至6天大幅增加。圖5：圖5示出本發(fā)明的gst-πsirna為體內(nèi)a549異種移植腫瘤提供了敲低效力。在具有靶向gst-π的sirna的無(wú)胸腺裸鼠(nu/nu)雌性小鼠(charlesriver)中觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低。如圖5所示，以4mg/kg劑量，注射后24小時(shí)檢測(cè)到gst-πmrna顯著降低約40％。圖6：圖6示出本發(fā)明的gst-πsirna在體內(nèi)抑制胰腺癌異種移植腫瘤。當(dāng)在脂質(zhì)體制劑中施用于6至8周齡的無(wú)胸腺裸鼠的胰腺癌異種移植腫瘤時(shí)，gst-πsirna提供了體內(nèi)基因沉默功效。如圖6所示，以0.375mg/kg至3mg/kg的劑量范圍的靶向gst-π的sirna獲得了劑量響應(yīng)。gst-πsirna在施用后數(shù)天內(nèi)示出有利的腫瘤抑制，腫瘤體積在終點(diǎn)時(shí)降低約2倍。圖7：圖7示出本發(fā)明的gst-πsirna表現(xiàn)出增加的血清穩(wěn)定性。如圖7所示，gst-πsirna的有義鏈(圖7，上)和反義鏈(圖7，下)兩者的血清半衰期(t1/2)為約100分鐘。圖8：圖8示出本發(fā)明的gst-πsirna在血漿中的制劑表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性。圖8示出在pbs中的50％人血清中的gst-πsirna的脂質(zhì)體制劑的孵育，以及在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)剩余的sirna。如圖8所示，gst-πsirna制劑的血漿半衰期(t1/2)明顯長(zhǎng)于100小時(shí)。圖9：圖9示出gst-πsirna的引導(dǎo)鏈的體外敲低。如圖9所示，與沒(méi)有顯示效果的具有加擾序列的對(duì)照相比，gst-πsirna的引導(dǎo)鏈敲低近似指數(shù)。圖10：圖10示出圖9的gst-πsirna的乘客鏈的體外敲低。如圖10所示，gst-πsirna的乘客鏈脫靶敲低大幅降低，基本無(wú)效果。圖11：圖11示出幾種高活性gst-πsirna的引導(dǎo)鏈的體外敲低。如圖11所示，gst-πsirna的引導(dǎo)鏈敲低活性大致呈指數(shù)。圖12：圖12示出圖11的gst-πsirna的乘客鏈的體外敲低。如圖12所示，gst-πsirna的乘客鏈脫靶敲低活性大幅降低至低于約500pm。圖13：圖13示出高活性gst-πsirna的引導(dǎo)鏈的體外敲低。如圖13所示，gst-πsirna的引導(dǎo)鏈敲低活性近似指數(shù)。圖14：圖14示出圖13的gst-πsirna的乘客鏈的體外敲低。如圖14所示，gst-πsirna的乘客鏈脫靶敲低活性大幅降低。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)gst-π表達(dá)的基于核酸的治療劑的化合物、組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在rna干擾中有活性的分子，以及能沉默gst-π表達(dá)的結(jié)構(gòu)和組合物。本公開(kāi)的結(jié)構(gòu)和組合物可用于預(yù)防或治療各種疾病例如惡性腫瘤。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于遞送和攝取本發(fā)明的一種或更多種治療性rnai分子的組合物及其使用方法。本發(fā)明的基于rna的組合物可用于預(yù)防或治療惡性腫瘤例如癌癥的方法。本發(fā)明的治療性組合物包括在rna干擾中有活性的核酸分子。治療性核酸分子可以靶向用于基因沉默的gstp1(gst-π)。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可以作為小干擾rna(sirna)起作用并且可以調(diào)節(jié)或沉默gst-π基因表達(dá)的一系列分子。本發(fā)明的sirna可用于預(yù)防或治療惡性腫瘤。本發(fā)明的一些實(shí)施方案還提供了用于將本發(fā)明的sirna遞送至需要預(yù)防或治療惡性腫瘤的受試者的介質(zhì)、制劑或脂質(zhì)納米顆粒制劑。本發(fā)明還涉及向哺乳動(dòng)物施用sirna作為治療劑的方法。通過(guò)向有需要的受試者施用化合物或組合物，本發(fā)明的治療性分子和組合物可用于針對(duì)預(yù)防或治療gst-π相關(guān)疾病的rna干擾。本發(fā)明的方法可以利用本發(fā)明化合物來(lái)預(yù)防或治療惡性腫瘤。在一些方面，所述惡性腫瘤可以呈現(xiàn)為各種疾病，例如高度表達(dá)gst-π的癌癥、由表達(dá)突變的kras的細(xì)胞引起的癌癥、肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和癌。在某些方面，本發(fā)明的方法可在任何器官或組織利用用于預(yù)防或治療惡性腫瘤的本發(fā)明的化合物，包括例如腦腫瘤、頭頸癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、十二指腸癌、結(jié)腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、白血病、惡性淋巴瘤、上皮性惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性分子的組合可用于沉默或抑制gst-π基因表達(dá)。本發(fā)明提供了一系列rnai分子，其中每個(gè)分子具有多核苷酸有義鏈和多核苷酸反義鏈；所述分子的每條鏈長(zhǎng)度為15至30個(gè)核苷酸；反義鏈的15至30個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)域與編碼gst-π的mrna的序列互補(bǔ)；并且所述有義鏈的至少一部分與所述反義鏈的至少一部分互補(bǔ)，并且所述分子具有長(zhǎng)度為15至30個(gè)核苷酸的雙鏈體區(qū)域。本發(fā)明的rnai分子可具有與編碼gst-π的mrna的序列互補(bǔ)的反義鏈的15至30個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)域，所述連續(xù)區(qū)域位于分子的雙鏈體區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，rnai分子可具有與編碼gst-π的mrna的序列互補(bǔ)的反義鏈的15至30個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)域。本發(fā)明的一些實(shí)施方案可進(jìn)一步提供用于在有需要的哺乳動(dòng)物中預(yù)防、治療或改善惡性腫瘤的一種或更多種癥狀、或降低發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)、或延遲惡性腫瘤的發(fā)作的方法。gst-π和rnai分子示例性靶人谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶pi(人gst-π)mrna的核酸序列公開(kāi)于genbank登錄號(hào)nm_000852.3(hgstpl)，并且長(zhǎng)度為986個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，已被報(bào)道的序列可能因時(shí)間而有所變化，因此，相應(yīng)地，本文所述核酸分子中需要進(jìn)行的任何變化也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施方案可以提供使用小核酸分子進(jìn)行g(shù)st-π表達(dá)的基因沉默的組合物和方法。核酸分子的實(shí)例包括在rna干擾(rnai分子)、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微rna(mirna)和短發(fā)夾rna(shrna)分子以及dna指導(dǎo)的rna(ddrna)、piwi相互作用rna(pirna)和重復(fù)相關(guān)sirna(rasirna)中有活性的分子。這樣的分子能夠介導(dǎo)針對(duì)gst-π基因表達(dá)的rna干擾。本文公開(kāi)的組合物和方法還可用于治療受試者中的各種惡性腫瘤。本發(fā)明的核酸分子和方法可用于下調(diào)編碼gst-π的基因的表達(dá)。本發(fā)明的組合物和方法可以包括一個(gè)或更多個(gè)核酸分子，其可以獨(dú)立地或組合地對(duì)gst-π蛋白和/或編碼gst-π蛋白的基因、編碼與gst-π相關(guān)的疾病、病癥或障礙(例如惡性腫瘤)的維持和/或發(fā)生相關(guān)的gst-π的基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)加以調(diào)節(jié)或調(diào)控。參考gst-π的示例性序列描述本發(fā)明的組合物和方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方案涉及任何相關(guān)的gst-π基因、序列或變體，例如同源基因和轉(zhuǎn)錄變體，以及多態(tài)性，包括與任何gst-π基因相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(snp)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可提供下調(diào)gst-π基因(例如，人gst-π)表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(sirna)分子。本發(fā)明的rnai分子可以靶向gst-π和任何同源序列，例如使用互補(bǔ)序列或通過(guò)并入非典型(canonical)堿基對(duì)例如錯(cuò)配和/或擺動(dòng)(wobble)堿基對(duì)(其可提供額外的靶序列)。在鑒定錯(cuò)配的情況下，可以使用非典型堿基對(duì)，例如錯(cuò)配和/或擺動(dòng)堿基來(lái)產(chǎn)生靶向多于一個(gè)基因序列的核酸分子。例如，非典型堿基對(duì)(例如uu和cc堿基對(duì))可用于產(chǎn)生能夠靶向共享序列同源性的不同gst-π靶標(biāo)的序列的核酸分子。因此，rnai分子可以靶向同源基因之間保守的核苷酸序列，單個(gè)rnai分子可用于抑制多于一個(gè)基因的表達(dá)。在一些方面，本發(fā)明的組合物和方法包括對(duì)gst-πmrna有活性的rnai分子，其中rnai分子包括與編碼gst-π序列的任何mrna互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的rnai分子可具有針對(duì)gst-πrna的活性，其中rnai分子包括與具有變體gst-π編碼序列的rna互補(bǔ)的序列，例如本領(lǐng)域已知的與惡性腫瘤相關(guān)的突變體gst-π基因。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的rnai分子可以包括可與gst-π基因的核苷酸序列相互作用并介導(dǎo)gst-π基因表達(dá)沉默的核苷酸序列。用于抑制gst-π表達(dá)的核酸分子可具有有義鏈和反義鏈，其中所述鏈形成雙鏈體區(qū)域。核酸分子可以在雙鏈體區(qū)域中具有一個(gè)或更多個(gè)核苷酸，所述一個(gè)或更多個(gè)核苷酸經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾，包括本領(lǐng)域已知的這樣的修飾。sirna的懸掛中的任何核苷酸也都可以是經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾的。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸是2'-脫氧核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸可包括2'-o-烷基取代的核苷酸、2'-脫氧-2'-氟取代的核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、鎖定的核苷酸或其任意組合。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)可以在多個(gè)位置具有含有脫氧核苷酸的反義鏈，所述多個(gè)位置是以下之一：位于所述反義鏈的5'端的第4、6和8位中的每一個(gè)；位于所述反義鏈的5’端的第3、5和7位中的每一個(gè)；位于所述反義鏈的5’端的第1、3、5和7位中的每一個(gè)；位于所述反義鏈的5’端的第3至8位中的每一個(gè)；或者位于所述反義鏈的5’端的第5至8位中的每一個(gè)。這些結(jié)構(gòu)中的任何一個(gè)均可以與雙鏈區(qū)域中的一個(gè)或更多個(gè)2'-脫氧-2'-氟取代的核苷酸組合。本發(fā)明的核酸分子可以抑制gst-πmrna的表達(dá)，其有利的ic50小于約300pm、或小于約200pm、或小于約100pm或小于約50pm。此外，單次施用后，核酸分子可以在體內(nèi)抑制至少25％的gst-πmrna表達(dá)水平。本發(fā)明涉及藥物組合物，所述藥物組合物可以含有與可藥用運(yùn)載體組合的如本文所述的一種或更多種sirna?？梢允褂萌魏魏线m的運(yùn)載體，包括本領(lǐng)域已知的運(yùn)載體，以及脂質(zhì)分子、納米顆?；蛑|(zhì)體，其均可以包封sirna分子。本發(fā)明公開(kāi)了用于治療可能與gst-π表達(dá)相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用含有一種或更多種sirna的組合物。待治療的疾病可以包括惡性腫瘤、癌癥、由表達(dá)突變的kras的細(xì)胞引起的癌癥、肉瘤和癌等。靶向gst-πmrna的本發(fā)明的rnai分子的實(shí)例示于表1。表1：gst-π的rnai分子序列表1的說(shuō)明：大寫的a、g、c和u分別指ribo-a、ribo-g、ribo-c和ribo-u。小寫字母a、u、g、c、t分別指2'-脫氧-a、2'-脫氧-u、2'-脫氧-g、2'-脫氧-c和脫氧胸苷。本發(fā)明靶向gst-πmrna的rnai分子的實(shí)例示于表2中。表2gst-π的rnai分子序列表2的說(shuō)明：大寫的a、g、c和u分別指ribo-a、ribo-g、ribo-c和ribo-u。小寫字母a、u、g、c、t分別指2'-脫氧-a、2'-脫氧-u、2'-脫氧-g、2'-脫氧-c和脫氧胸苷(dt＝t＝t)。下劃線是指2’-ome取代的，例如u。小寫字母f是指2’-脫氧-2’-氟取代，例如fu是2’-脫氧-2’-氟-u。n是a、c、g、u、u、a、c、g、u、t或經(jīng)修飾、反向的或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸。字母“s”表示硫代磷酸酯鍵。本發(fā)明靶向gst-πmrna的rnai分子的實(shí)例示于表3中。表3：gst-π的rnai分子序列表3的說(shuō)明：大寫的a、g、c和u分別指ribo-a、ribo-g、ribo-c和ribo-u。小寫字母a、u、g、c、t分別指2'-脫氧-a、2'-脫氧-u、2'-脫氧-g、2'-脫氧-c和脫氧胸苷(dt＝t＝t)。下劃線是指2’-ome取代的，例如u。小寫字母f是指2’-脫氧-2’-氟取代，例如fu是2’-脫氧-2’-氟-u。n是a、c、g、u、u、a、c、g、u、t或經(jīng)修飾、反向的或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸。本發(fā)明靶向gst-πmrna的rnai分子的實(shí)例示于表4中。表4：gst-π的rnai分子序列表4的說(shuō)明：大寫的a、g、c和u分別指ribo-a、ribo-g、ribo-c和ribo-u。小寫字母a、u、g、c、t分別指2'-脫氧-a、2'-脫氧-u、2'-脫氧-g、2'-脫氧-c和脫氧胸苷(dt＝t＝t)。下劃線是指2’-ome取代的，例如u。小寫字母f是指2’-脫氧-2’-氟取代，例如fu是2’-脫氧-2’-氟-u。n是a、c、g、u、u、a、c、g、u、t或經(jīng)修飾、反向的或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸。本發(fā)明靶向gst-πmrna的rnai分子的實(shí)例示于表5中。表5：gst-π的rnai分子序列表5的說(shuō)明：大寫的a、g、c和u分別指ribo-a、ribo-g、ribo-c和ribo-u。小寫字母a、u、g、c、t分別指2'-脫氧-a、2'-脫氧-u、2'-脫氧-g、2'-脫氧-c和脫氧胸苷(dt＝t＝t)。下劃線是指2’-ome取代的，例如u。小寫字母f是指2’-脫氧-2’-氟取代，例如fu是2’-脫氧-2’-氟-u。n是a、c、g、u、u、a、c、g、u、t或經(jīng)修飾、反向的或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸。本發(fā)明靶向gst-πmrna的rnai分子的實(shí)例示于表6中。表6：gst-π的rnai分子序列表6的說(shuō)明：大寫的a、g、c和u分別指ribo-a、ribo-g、ribo-c和ribo-u。小寫字母a、u、g、c、t分別指2'-脫氧-a、2'-脫氧-u、2'-脫氧-g、2'-脫氧-c和脫氧胸苷(dt＝t＝t)。下劃線是指2’-ome取代的，例如u。小寫字母f是指2’-脫氧-2’-氟取代，例如fu是2’-脫氧-2’-氟-u。n是a、c、g、u、u、a、c、g、u、t或經(jīng)修飾、反向的或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一系列核酸分子，其中a)該分子具有多核苷酸有義鏈和多核苷酸反義鏈；b)分子的每條鏈長(zhǎng)度為15至30個(gè)核苷酸；c)反義鏈的15至30個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)域與編碼gst-π的mrna序列互補(bǔ)；和d)有義鏈的至少一部分與反義鏈的至少一部分互補(bǔ)，并且該分子具有長(zhǎng)度為15至30個(gè)核苷酸的雙鏈體區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，核酸分子可具有與編碼gst-π的mrna的序列互補(bǔ)并且位于分子的雙鏈體區(qū)域中的、反義鏈的15至30個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)域。在另一些實(shí)施方案中，核酸分子可具有與編碼gst-π的mrna的序列互補(bǔ)的、反義鏈的15至30個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子的每條鏈的長(zhǎng)度可以為18至22個(gè)核苷酸。所述核酸分子的雙鏈體區(qū)域的長(zhǎng)度可以為19個(gè)核苷酸。在一些替代形式中，所述核酸分子可具有以單鏈連接并形成在一端通過(guò)環(huán)連接的雙鏈體區(qū)域的多核苷酸有義鏈和多核苷酸反義鏈。本發(fā)明的核酸分子的一些實(shí)施方案可具有平末端。在某些實(shí)施方案中，核酸分子可具有一個(gè)或更多個(gè)3'懸掛。本發(fā)明提供了作為有基因沉默活性的rnai分子的一系列核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以是有基因沉默活性的dsrna、sirna、微rna或shrna以及dna指導(dǎo)的rna(ddrna)、piwi相互作用rna(pirna)和重復(fù)相關(guān)的sirna(rasirna)。所述核酸分子可對(duì)抑制gst-π表達(dá)有活性。本發(fā)明的一些實(shí)施方案還提供了具有小于100pm的針對(duì)gst-π敲低的ic50的核酸分子。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案提供了具有小于50pm的針對(duì)gst-π敲低的ic50的核酸分子。本發(fā)明還涵蓋含有一種或更多種本發(fā)明的核酸分子和可藥用運(yùn)載體的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述運(yùn)載體可以是脂質(zhì)分子或脂質(zhì)體。本發(fā)明的化合物和組合物可用于通過(guò)向有需要的受試者施用化合物或組合物來(lái)預(yù)防或治療gst-π相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明的方法可利用本發(fā)明化合物來(lái)預(yù)防或治療惡性腫瘤。惡性腫瘤可以呈現(xiàn)為各種疾病，例如與gst-π表達(dá)相關(guān)的癌癥、由表達(dá)突變的kras引起的癌癥、肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、癌、腦腫瘤、頭頸癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌癥、肛門癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、白血病、惡性淋巴瘤、上皮性惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna本發(fā)明的實(shí)施方案包括經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾以提供治療用途的增強(qiáng)特性的sirna分子，例如針對(duì)基因沉默提高的活性和功效。本發(fā)明提供了經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾的sirna分子，其可具有提高的血清穩(wěn)定性以及降低的脫靶效應(yīng)，而不會(huì)損失sirna分子的基因調(diào)節(jié)和基因沉默活性和功效。在一些方面，本發(fā)明提供了多種組合的具有修飾或化學(xué)修飾的sirna，其增強(qiáng)sirna的穩(wěn)定性和效力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的sirna分子可具有降低至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少50倍或至少100倍的乘客鏈脫靶活性。本文所用術(shù)語(yǔ)經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾是指在sirna的天然核苷酸或核酸結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)中所作的改變，其包括具有一個(gè)或更多個(gè)核苷酸類似物、改變的核苷酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸、非天然核苷酸及其組合的sirna。在一些實(shí)施方案中，sirna中經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾的結(jié)構(gòu)的數(shù)目可以包括sirna分子的所有結(jié)構(gòu)組分和/或所有核苷酸。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有核苷酸糖基修飾、核苷酸核堿基修飾、核酸主鏈或鍵修飾、在sirna鏈末端的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的結(jié)構(gòu)修飾及其組合的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括在糖的2'碳上具有取代基修飾的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括在鏈的5'端、3'端或兩端具有修飾的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有在鏈之間產(chǎn)生互補(bǔ)錯(cuò)配的修飾的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有5'-丙胺末端、5'-磷酸化末端、3'-嘌呤霉素末端或3'-生物素末端基團(tuán)的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有2'-氟取代的核糖核苷酸、2'-ome取代的核糖核苷酸、2'-脫氧核糖核苷酸、2'-氨基取代的核糖核苷酸、2'-硫代取代核糖核苷酸的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有一個(gè)或更多個(gè)5-精氨酸、5-鹵代胞苷、5-甲基胞苷、核糖胸苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、4-硫代嘌呤或5-氨基烯酰尿苷的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有一個(gè)或更多個(gè)硫代磷酸酯基團(tuán)的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有一個(gè)或更多個(gè)2'-氟取代的核糖核苷酸、2'-氟尿嘧啶、2'-氟胞苷、2'-脫氧核糖核苷酸、2'-脫氧腺苷或2'-脫氧鳥(niǎo)苷的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有一個(gè)或更多個(gè)硫代磷酸酯鍵的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有一個(gè)或更多個(gè)亞烷基二醇鍵、氧基-烷硫基鍵或氧羰氧基鍵的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有一個(gè)或更多個(gè)脫氧無(wú)堿基基團(tuán)、肌苷、n3-甲基-脲、n6,n6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核糖核苷和利巴韋林的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有一個(gè)或更多個(gè)3'或5'反向末端基團(tuán)的sirna。經(jīng)修飾和經(jīng)化學(xué)修飾的sirna的實(shí)例包括具有一個(gè)或更多個(gè)5-(2-氨基)丙基脲、5-溴嘌呤、腺苷、8-溴鳥(niǎo)苷、7-脫氮腺苷或n6-甲基腺苷的sirna。調(diào)節(jié)gst-π和治療惡性腫瘤的方法本發(fā)明的實(shí)施方案可提供可用于下調(diào)或抑制gst-π和/或gst-π蛋白表達(dá)的rnai分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的rnai分子可用于下調(diào)或抑制由可能與諸如惡性腫瘤的疾病或病癥相關(guān)的gst-π單元型多態(tài)性引起的gst-π和/或gst-π蛋白的表達(dá)?？梢允褂胓st-π蛋白或mrna水平的監(jiān)測(cè)來(lái)表征基因沉默，并確定本發(fā)明的化合物和組合物的效力。本公開(kāi)的rnai分子可以單獨(dú)使用或與其他sirna組合用于調(diào)節(jié)一種或更多種基因的表達(dá)。本公開(kāi)的rnai分子可以單獨(dú)使用，或組合使用，或與其它已知用于預(yù)防或治療與gst-π相關(guān)的疾病、或改善與gst-π相關(guān)的病癥或障礙(包括惡性腫瘤)的癥狀的藥物聯(lián)用。本發(fā)明的rnai分子可用于以序列特異性方式調(diào)節(jié)或抑制gst-π的表達(dá)。本公開(kāi)的rnai分子可以包括引導(dǎo)鏈，對(duì)其而言，一系列連續(xù)核苷酸與gst-πmrna至少部分互補(bǔ)。在某些方面，可以使用本發(fā)明的rnai分子通過(guò)rna干擾治療惡性腫瘤。可以在合適的基于細(xì)胞的模型以及離體或體內(nèi)動(dòng)物模型中表征惡性腫瘤的治療。可以通過(guò)測(cè)定受影響組織的細(xì)胞中g(shù)st-πmrna的水平和/或gst-π蛋白的水平來(lái)表征惡性腫瘤的治療。可以通過(guò)對(duì)受影響的器官或組織的非侵襲性醫(yī)學(xué)掃描來(lái)表征惡性腫瘤的治療。本發(fā)明的一些實(shí)施方案可包括用于預(yù)防、治療或改善有此需要的受試者中g(shù)st-π相關(guān)疾病或病癥的癥狀的方法。在一些實(shí)施方案中，用于預(yù)防、治療或改善受試者惡性腫瘤癥狀的方法可包括向受試者施用本發(fā)明的rnai分子以調(diào)節(jié)受試者或生物體中g(shù)st-π基因的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)使細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的rnai分子接觸來(lái)下調(diào)細(xì)胞或生物體中g(shù)st-π基因的表達(dá)的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案包括根據(jù)上述實(shí)例經(jīng)修飾或經(jīng)化學(xué)修飾的表1-6的sirna分子。rna干擾rna干擾(rnai)是指由短干擾rna(sirna)介導(dǎo)的動(dòng)物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。參見(jiàn)例如zamore等,cell,2000,第101卷,第25-33頁(yè)；fire等,nature,1998,第391卷,第806811頁(yè)；sharp,genes&development,1999,第13卷,第139-141頁(yè)。細(xì)胞中的rnai應(yīng)答可以通過(guò)雙鏈rna(dsrna)來(lái)觸發(fā)，雖然該機(jī)制尚未完全理解。細(xì)胞中的某些dsrna可以經(jīng)歷dicer酶、核糖核酸酶iii酶的作用。參見(jiàn)例如zamore等，cell，2000，第101卷，第25-33頁(yè)；hammond等，nature，2000，第404卷，第293-296頁(yè)。dicer可以將dsrna加工成dsrna的較短片段，其為sirna。通常，sirna的長(zhǎng)度可以為約21至約23個(gè)核苷酸，并且包括長(zhǎng)度為約19個(gè)核苷酸的堿基對(duì)雙鏈體區(qū)域。rnai涉及被稱為rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)的核酸內(nèi)切酶復(fù)合物。sirna具有進(jìn)入risc復(fù)合物并介導(dǎo)對(duì)具有與sirna雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈rna靶標(biāo)加以切割的反義鏈或引導(dǎo)鏈。sirna的另一條鏈?zhǔn)浅丝玩?passengerstrand)。靶標(biāo)rna的切割發(fā)生在與sirna雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域的中部。參見(jiàn)例如elbashir等，genes&development，2001，第15卷，第188-200頁(yè)。本文所用術(shù)語(yǔ)“有義鏈”是指與sirna分子的相應(yīng)反義鏈的至少一部分部分或完全互補(bǔ)的sirna分子的核苷酸序列。sirna分子的有義鏈可以包括與靶核酸序列具有同源性的核酸序列。本文所用術(shù)語(yǔ)“反義鏈”是指與靶核酸序列的至少一部分部分或完全互補(bǔ)的sirna分子的核苷酸序列。sirna分子的反義鏈可以包括與sirna分子的相應(yīng)有義鏈的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。rnai分子可以通過(guò)以序列特異性方式介導(dǎo)rna干擾來(lái)下調(diào)或敲低基因表達(dá)。參見(jiàn)例如zamore等,cell,2000,第101卷，第25-33頁(yè)；elbashir等,nature,2001,第411卷,第494-498頁(yè)；kreutzer等,wo2000/044895；zernicka-goetz等,wo2001/36646；fire等,wo1999/032619；plaetinck等,wo2000/01846；mello等,wo2001/029058。本文所用術(shù)語(yǔ)“抑制”、“下調(diào)”或“減少”相對(duì)于基因表達(dá)意為基因的表達(dá)或編碼一種或更多種蛋白質(zhì)的mrna分子的水平或一種或更多種編碼的蛋白質(zhì)的活性降低到低于不存在本發(fā)明的rnai分子或sirna的情況下觀察到的活性。例如，從不存在本發(fā)明的rnai分子或sirna的情況下觀察到的，表達(dá)水平、mrna水平或編碼的蛋白質(zhì)活性水平可以降低至少1％、或至少10％、或至少20％、或至少50％、或至少90％或更多。rnai分子也可用于敲低病毒基因表達(dá)，由此影響病毒復(fù)制。rnai分子可以由分離的多核苷酸鏈構(gòu)成：有義鏈或乘客鏈，以及反義鏈或引導(dǎo)鏈。引導(dǎo)鏈和乘客鏈至少部分互補(bǔ)。引導(dǎo)鏈和乘客鏈可形成具有約15至約49個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，sirna的雙鏈體區(qū)域可具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個(gè)堿基對(duì)。在某些實(shí)施方案中，rnai分子可以在risc復(fù)合物中是活性的，其具有具risc活性的雙鏈體區(qū)域的長(zhǎng)度。在另外一些實(shí)施方案中，rnai分子可以作為dicer底物起作用，轉(zhuǎn)化為可在risc復(fù)合物中有活性的rnai分子。在一些方面，rnai分子可以在長(zhǎng)分子的相對(duì)端具有互補(bǔ)的引導(dǎo)序列部分和乘客序列部分，使得分子可以與互補(bǔ)序列部分形成雙鏈體區(qū)域，并且鏈在核苷酸或非核苷酸接頭的雙鏈體區(qū)域的一端連接。例如，發(fā)夾布置、或莖和環(huán)布置。與鏈的接頭的相互作用可以是共價(jià)鍵或非共價(jià)相互作用。本公開(kāi)的rnai分子可以包括將核酸的有義區(qū)連接到核酸的反義區(qū)的核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸接頭。核苷酸接頭可以是長(zhǎng)度≥2個(gè)核苷酸的接頭，例如長(zhǎng)度為約3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸。核苷酸接頭可以是核酸適體。本文所用的“適體”或“核酸適體”是指特異性結(jié)合靶分子的核酸分子，其中所述核酸分子具有包含靶分子在其天然環(huán)境中識(shí)別的序列的序列?；蛘撸m體可以是結(jié)合不天然地結(jié)合核酸靶分子的核酸分子。例如，適體可用于結(jié)合蛋白質(zhì)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而防止天然配體與蛋白質(zhì)的相互作用。參見(jiàn)例如，gold等，annurevbiochem，1995，第64卷，第763-797頁(yè)；brody等，j.biotechnol.，2000，第74卷，第5-13頁(yè)；hermann等.，science，2000，第287卷，第820-825頁(yè)。非核苷酸接頭的實(shí)例包括脫堿基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)、聚烴或其它聚合物，例如聚乙二醇，例如具有2至100個(gè)乙二醇單元的聚乙二醇。一些實(shí)例描述于seela等，nucleicacidsresearch，1987，第15卷，第3113-3129頁(yè)；cload等，j.am.chem.soc.，1991，第113卷，第6324-6326頁(yè)；jaeschke等，tetrahedronlett.，1993，第34卷，第301頁(yè)；arnold等，wo1989/002439；usman等，wo1995/006731；dudycz等，wo1995/011910和ferentz等，j.am.chem.soc.,1991，第113卷，第4000-4002頁(yè)。rnai分子可具有來(lái)自雙鏈體區(qū)域的一個(gè)或更多個(gè)懸掛。作為非堿基配對(duì)的單鏈區(qū)域的懸掛長(zhǎng)度可以為1至8個(gè)核苷酸，或更長(zhǎng)。懸掛可以是3'端懸掛，其中鏈的3'端具有1至8個(gè)核苷酸的單鏈區(qū)域。懸掛可以是5'端懸掛，其中鏈的5'-端具有1至8個(gè)核苷酸的單鏈區(qū)域。rnai分子的懸掛可具有相同的長(zhǎng)度，或可以是不同的長(zhǎng)度。rnai分子可具有一個(gè)或更多個(gè)平末端，其中雙鏈體區(qū)域末端沒(méi)有懸掛，并且該鏈與雙鏈體區(qū)域的末端堿基配對(duì)。本公開(kāi)的rnai分子可具有一個(gè)或更多個(gè)平末端，或者可具有一個(gè)或更多個(gè)懸掛，或者可具有平末端和懸掛的組合。rnai分子的鏈的5'端可以是平末端，或者可以是懸掛。rnai分子的鏈的3'端可以是平末端，或者可以是懸掛。rnai分子的鏈的5'端可以是平末端，而3'端為懸掛。rnai分子的鏈的3'端可以是平末端，而5'-端是懸掛。在一些實(shí)施方案中，rnai分子的兩端都是平末端。在另一些實(shí)施方案中，rnai分子的兩端具有懸掛。在5'和3'端的懸掛可具有不同的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，rnai分子可具有平末端，其中反義鏈的5'端和有義鏈的3'端不具有任何懸掛的核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，rnai分子可具有平末端，其中反義鏈的3'端和有義鏈的5'端不具有任何懸掛的核苷酸。rnai分子在雙鏈體區(qū)域的堿基配對(duì)中可能具有錯(cuò)配。rnai分子懸掛的任何核苷酸均可以是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。一個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸可以在5'端，其中rnai分子的另一條鏈的3'端可能不具有懸掛，或者可能不具有脫氧核糖核苷酸懸掛。一個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸可以在3'端，其中rnai分子的另一條鏈的5'-端可能不具有懸掛，或可能不具有脫氧核糖核苷酸懸掛。在一些實(shí)施方案中，rnai分子的一個(gè)或更多個(gè)或全部懸掛核苷酸可以是2'-脫氧核糖核苷酸。dicer底物rnai分子在一些方面，rnai分子可具有適合作為dicer底物的長(zhǎng)度，其可被加工成產(chǎn)生risc活性rnai分子。參見(jiàn)例如rossi等，us2005/0244858。作為dicer底物的雙鏈rna(dsrna)可具有足以使得其由dicer加工成產(chǎn)生活性rnai分子的長(zhǎng)度，并且還可以包括以下特性中的一個(gè)或更多個(gè)：(i)dicer底物dsrna可以是不對(duì)稱的，例如，在反義鏈上具有3'懸掛，和(ii)dicer底物dsrna可以在有義鏈上具有經(jīng)修飾的3'端以引導(dǎo)dicer結(jié)合的取向和dsrna加工成活性rnai分子。在某些實(shí)施方案中，dicer底物dsrna中最長(zhǎng)鏈的長(zhǎng)度可以為24至30個(gè)核苷酸。dicer底物dsrna可以是對(duì)稱的或不對(duì)稱的。在一些實(shí)施方案中，dicer底物dsrna可具有22至28個(gè)核苷酸的有義鏈和24至30個(gè)核苷酸的反義鏈。在某些實(shí)施方案中，dicer底物dsrna可在反義鏈的3'端具有懸掛。在另一些實(shí)施方案中，dicer底物dsrna可具有長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸的有義鏈和長(zhǎng)度為27個(gè)核苷酸的反義鏈，具有2堿基3'懸掛。懸掛的長(zhǎng)度可以為1、2或3個(gè)核苷酸。有義鏈也可具有5'磷酸根。不對(duì)稱的dicer底物dsrna可以在有義鏈的3'端具有兩個(gè)脫氧核糖核苷酸來(lái)代替兩個(gè)核糖核苷酸。dicer底物dsrna的有義鏈的長(zhǎng)度可以為約22至約30、或約22至約28、或約24至約30、或約25至約30、或約26至約30、或約26和29、或約27至約28個(gè)核苷酸。dicer底物dsrna的有義鏈的長(zhǎng)度可以為22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，dicer底物dsrna可具有長(zhǎng)度為至少約25個(gè)核苷酸且長(zhǎng)度不超過(guò)約30個(gè)核苷酸的有義鏈和反義鏈。在某些實(shí)施方案中，dicer底物dsrna可具有長(zhǎng)度為26至29個(gè)核苷酸的有義鏈和反義鏈。在某些實(shí)施方案中，dicer底物dsrna可具有長(zhǎng)度為27個(gè)核苷酸的有義鏈和反義鏈。dicer底物dsrna的有義鏈和反義鏈可以與平末端長(zhǎng)度相同，或者與懸掛長(zhǎng)度不同，或者可具有平末端和懸掛。dicer底物dsrna可具有長(zhǎng)度為19、20、21、22、23、24、25、26或27個(gè)核苷酸的雙鏈體區(qū)域。dicer底物dsrna的反義鏈可具有在生物條件下，例如在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與有義鏈的至少一部分序列退火的任何序列。具有有義鏈和反義鏈的dicer底物可以通過(guò)第三結(jié)構(gòu)(例如接頭基團(tuán)或接頭寡核苷酸)連接。接頭連接dsrna的兩條鏈，例如使得在退火時(shí)形成發(fā)夾。dicer底物的有義鏈和反義鏈通常是互補(bǔ)的，但在堿基配對(duì)中可具有錯(cuò)配。在一些實(shí)施方案中，dicer底物dsrna可以是不對(duì)稱的，使得有義鏈具有22至28個(gè)核苷酸，反義鏈具有24至30個(gè)核苷酸。dicer底物dsrna的一條鏈(特別是反義鏈)的區(qū)域可具有至少19個(gè)核苷酸的序列長(zhǎng)度，其中這些核苷酸位于鄰近于反義鏈3'端的21個(gè)核苷酸的區(qū)域并且與從靶基因產(chǎn)生的rna的核苷酸序列充分互補(bǔ)。dicer底物dsrna的反義鏈可以在5'端具有1至9個(gè)核糖核苷酸，得到22至28個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。當(dāng)反義鏈具有21個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度時(shí)，可以在3'端加入1至7個(gè)核糖核苷酸或2至5個(gè)核糖核苷酸或4個(gè)核糖核苷酸。加入的核糖核苷酸可具有任何序列。dicer底物dsrna的有義鏈可具有24至30個(gè)核苷酸。有義鏈可以與反義鏈基本上互補(bǔ)，以在生物條件下與反義鏈退火。rnai分子的使用方法本發(fā)明的核酸分子和rnai分子可通過(guò)直接施用分子或與運(yùn)載體或稀釋劑組合的分子遞送至細(xì)胞或組織。本發(fā)明的核酸分子和rnai分子可以通過(guò)直接施用分子與運(yùn)載體或稀釋劑或輔助、促使或促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞的任何其它遞送介質(zhì)來(lái)遞送或施用于細(xì)胞、組織、器官或受試者，所述其它遞送介質(zhì)例如病毒序列、病毒物質(zhì)或者脂質(zhì)或脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明的核酸分子和rnai分子可與陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合，包裝在脂質(zhì)體內(nèi)，或以其它方式遞送至靶細(xì)胞或組織。核酸或核酸復(fù)合物可以通過(guò)直接皮膚施用、透皮施用或注射離體或體內(nèi)局部施用于相關(guān)組織。遞送系統(tǒng)可包括例如水性和非水性凝膠、乳膏、乳劑、微乳劑、脂質(zhì)體、軟膏、水性和非水性溶液、洗劑、氣溶膠、烴基和粉末，并且可以含有賦形劑例如增溶劑和滲透促進(jìn)劑。本公開(kāi)的組合物和方法可包括以允許核酸分子表達(dá)的方式包含編碼本發(fā)明的至少一種rnai分子的核酸序列的表達(dá)載體。本發(fā)明的核酸分子和rnai分子可以從插入dna或rna載體的轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)。重組載體可以是dna質(zhì)?；虿《据d體。可以使用提供核酸分子的瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。例如，載體可以包含編碼雙鏈體的rnai分子的兩條鏈或者自身互補(bǔ)因此形成rnai分子的單個(gè)核酸分子的序列。表達(dá)載體可以包括編碼兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子的核酸序列。核酸分子可以在細(xì)胞內(nèi)從真核啟動(dòng)子表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到任何核酸均可在真核細(xì)胞中從適當(dāng)?shù)膁na/rna載體表達(dá)。在一些方面，病毒構(gòu)建體可用于將表達(dá)構(gòu)建體引入細(xì)胞，用于由表達(dá)構(gòu)建體編碼的dsrna構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。脂質(zhì)制劑可以通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射或口服或通過(guò)吸入或本領(lǐng)域已知的其它方法施用于動(dòng)物。用于施用寡核苷酸的可藥用制劑是已知的并且可以使用。用于體外敲低的實(shí)施例方案在轉(zhuǎn)染前一天，用100μl含有10％fbs的dmem(hyclonecat.#sh30243.01)將細(xì)胞以2×103個(gè)細(xì)胞/孔于96孔板中鋪板，并在空氣中含有5％co2的加濕氣氛的37℃孵育箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為90μl含有2％fbs的opti-memi還原血清培養(yǎng)基(lifetechnologiescat.#31985-070)。在室溫下將0.2μllipofectaminernaimax(lifetechnologiescat.#13778-100)與4.8μlopti-memi混合5分鐘。接下來(lái)，將1μlsirna與4μlopti-memi混合，并與lf2000溶液混合，然后輕輕混勻，不進(jìn)行渦旋。在室溫下等待5分鐘。再在室溫下孵育混合物10分鐘，以形成rna-rnaimax復(fù)合物。將10μlrna-rnaimax復(fù)合物加入到孔中，用手輕輕搖板。將細(xì)胞在空氣中含有5％co2的加濕氣氛的37℃孵育箱中孵育2小時(shí)。將培養(yǎng)基更換為含有2％fbs的新鮮-memi還原血清培養(yǎng)基(lifetechnologiescat.#31985-070)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用冰冷的pbs洗滌細(xì)胞一次。在室溫下用50μlcell-to-ct裂解緩沖液(lifetechnologiescat.#4391851c)裂解細(xì)胞5至30分鐘。加入5μl終止液，室溫孵育2分鐘。立即用taqman通過(guò)rt-qpcr測(cè)量mrna水平?；蛘?，可以在-80℃冷凍樣品并在其后進(jìn)行測(cè)定。用于血清穩(wěn)定性的實(shí)施例方案在37℃用10％人血清孵育0.2mg/mlsirna。在某些時(shí)間點(diǎn)(0、5、15和30分鐘)，等分為200μl樣品并用200μl萃取溶劑(氯仿:苯酚:異戊醇＝24:25:1)萃取。在室溫下渦旋樣品并以13,000rpm離心10分鐘，然后轉(zhuǎn)移上層溶液并用0.45μm濾器過(guò)濾。將濾出物轉(zhuǎn)移到300μlhplc注射瓶中。對(duì)于lcms，流動(dòng)相為mpa:100mmhfip+7mmtea在水中，mpb:50％乙醇+50％乙腈。柱：watersacquityost2.1×50mm，1.7μm。實(shí)施例實(shí)施例1.發(fā)現(xiàn)靶向gst-π的本發(fā)明的sirna在體外有基因沉默活性。發(fā)現(xiàn)gst-πsirna對(duì)于基因敲低的劑量依賴性活性顯示出低于約250皮摩爾(pm)的ic50并且低至1pm。在a549細(xì)胞系中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染以測(cè)定sirna敲低效力。如表7所示，用表1的sirna觀察gst-πmrna的劑量依賴性敲低。表7：a549細(xì)胞系中g(shù)st-πmrna的劑量依賴性敲低sirna結(jié)構(gòu)ic50(pm)a9(seqidno:25和90)24b2(seqidno:52和117)121b3(seqidno:53和118)235b4(seqidno:54和119)229b13(seqidno:50和115)17bu2(seqidno:61和126)31如表7所示，表1的gst-πsirna的活性在17至235pm范圍內(nèi)，其適用于許多用途，包括作為待體內(nèi)使用的藥劑。實(shí)施例2：具有位于sirna的反義鏈的種子區(qū)域中的脫氧核苷酸的本發(fā)明的gst-πsirna的結(jié)構(gòu)在體外提供出人意料有利地提高的基因敲低活性。在a549細(xì)胞系中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以測(cè)定基于結(jié)構(gòu)bu2'(seqidno：131和157)的gst-πsirna的敲低效力。用基于結(jié)構(gòu)bu2'的gst-πsirna觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低，如表8所示。表8：對(duì)于基于結(jié)構(gòu)bu2’的gst-πsirna，a549細(xì)胞系中g(shù)st-πmrna的劑量依賴性敲低如表8所示，與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，基于在反義鏈的種子區(qū)域中具有三個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)bu2'的gst-πsirna的活性驚人地、出人意料地提高了多達(dá)6倍。這些數(shù)據(jù)示出與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，具有位于反義鏈的種子區(qū)域的第3、5和7位或4、6和8位的3個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)的gst-πsirna出乎意料地提高了基因敲低活性。在表8中示出的在反義鏈的種子區(qū)域中具有3個(gè)脫氧核苷酸的gst-πsirna活性為5至8pm，其例外地適于許多用途，包括作為待體內(nèi)使用的藥劑。實(shí)施例3：具有位于sirna的反義鏈的種子區(qū)域中的脫氧核苷酸的本發(fā)明的gst-πsirna的結(jié)構(gòu)在體外提供出人意料地有利提高的基因敲低活性。在a549細(xì)胞系中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以測(cè)定基于結(jié)構(gòu)a9'(seqidno：183和195)的gst-πsirna的敲低效力。用基于結(jié)構(gòu)a9'的gst-πsirna觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低，如表9所示。表9：對(duì)于基于結(jié)構(gòu)a9’的gst-πsirna，a549細(xì)胞系中g(shù)st-πmrna的劑量依賴性敲低如表9所示，與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，基于在反義鏈的種子區(qū)域中具有3至6個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)a9'的gst-πsirna的活性出乎意料地提高了多達(dá)24倍。這些數(shù)據(jù)示出與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，具有位于反義鏈的種子區(qū)域的第4、6和8位或第1、3、5和7位、或第3至8位或第5至8位或第3、5和7位的3至6個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)的gst-πsirna出乎意料地提供提高基因敲低活性。在表9中示出的在反義鏈的種子區(qū)域中具有3至6個(gè)脫氧核苷酸的gst-πsirna活性為1至15pm，其例外地適于許多用途，包括作為待體內(nèi)使用的藥劑。實(shí)施例4：具有位于sirna的反義鏈的種子區(qū)域中的脫氧核苷酸的本發(fā)明的gst-πsirna的結(jié)構(gòu)在體外提供出人意料地有利提高的基因敲低活性。在a549細(xì)胞系中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以測(cè)定基于結(jié)構(gòu)b13'(seqidno：207和222)的gst-πsirna的敲低效力。用基于結(jié)構(gòu)b13'的gst-πsirna觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低，如表10所示。表10：對(duì)于基于結(jié)構(gòu)b13’的gst-πsirna，a549細(xì)胞系中g(shù)st-πmrna的劑量依賴性敲低如表10所示，與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，基于在反義鏈的種子區(qū)域中具有3個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)b13'的gst-πsirna的活性出乎意料地提高。這些數(shù)據(jù)示出與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，具有位于反義鏈的種子區(qū)域的第4、6和8位的3個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)的gst-πsirna出乎意料地提高了基因敲低活性。在表10中示出的在反義鏈的種子區(qū)域中具有3個(gè)脫氧核苷酸的gst-πsirna的活性為11pm，其例外地適于許多用途，包括作為待體內(nèi)使用的藥劑。實(shí)施例5：具有位于sirna的反義鏈的種子區(qū)域中的脫氧核苷酸的本發(fā)明的gst-πsirna的結(jié)構(gòu)在體外提供出人意料地有利提高的基因敲低活性。在a549細(xì)胞系中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以測(cè)定基于結(jié)構(gòu)b4'(seqidno：261和273)的gst-πsirna的敲低效力。用基于結(jié)構(gòu)b4'的gst-πsirna觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低，如表11所示。表11：對(duì)于基于結(jié)構(gòu)b4’的gst-πsirna，a549細(xì)胞系中g(shù)st-πmrna的劑量依賴性敲低如表11所示，與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，基于在反義鏈的種子區(qū)域中具有6個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)b4'的gst-πsirna的活性驚人地、出人意料地提高了超過(guò)2倍。這些數(shù)據(jù)示出與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，具有位于反義鏈的種子區(qū)域的第3至8位的6個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)的gst-πsirna提供出人意料地提高的基因敲低活性。在表11中示出的在反義鏈的種子區(qū)域中具有6個(gè)脫氧核苷酸的gst-πsirna活性為113pm，其例外地適于許多用途，包括作為待體內(nèi)使用的藥劑。實(shí)施例6：具有位于sirna的反義鏈的種子區(qū)域中的脫氧核苷酸的本發(fā)明的gst-πsirna的結(jié)構(gòu)在體外提供出人意料地有利提高的基因敲低活性。在a549細(xì)胞系中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以測(cè)定基于結(jié)構(gòu)b2'(seqidno：237和249)的gst-πsirna的敲低效力。用基于結(jié)構(gòu)b2'的gst-πsirna觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低，如表12所示。表12：對(duì)于基于結(jié)構(gòu)b2’的gst-πsirna，a549細(xì)胞系中g(shù)st-πmrna的劑量依賴性敲低如表12所示，與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，基于在反義鏈的種子區(qū)域中具有3至4個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)b2'的gst-πsirna的活性驚人地提高了高達(dá)4倍。這些數(shù)據(jù)示出與雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，具有位于反義鏈的種子區(qū)域的第5至8位或第1、3、5和7位或第3、5和7位的3至4個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)的gst-πsirna提供出人意料地提高的基因敲低活性。在表12中示出的在反義鏈的種子區(qū)域中具有3至4個(gè)脫氧核苷酸的gst-πsirna的活性為30至100pm，其例外地適于許多用途，包括作為待體內(nèi)使用的藥劑。實(shí)施例7：含有一個(gè)或更多個(gè)2’-脫氧-2’-氟取代的核苷酸的gst-πsirna的結(jié)構(gòu)在體外提供出人意料地提高的基因敲低活性。在a549細(xì)胞系中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以測(cè)定基于結(jié)構(gòu)bu2'(seqidno：131和157)的gst-πsirna的敲低效力。用基于結(jié)構(gòu)bu2'的gst-πsirna觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低，如表13所示。表13：對(duì)于基于結(jié)構(gòu)bu2’的gst-πsirna，a549細(xì)胞系中g(shù)st-πmrna的劑量依賴性敲低如表13所示，與沒(méi)有2’-f脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，基于具有一個(gè)或更多個(gè)2’-f脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)bu2'的gst-πsirna的活性驚人地提高了高達(dá)10倍。這些數(shù)據(jù)示出與沒(méi)有2’-f脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，具有一個(gè)或更多個(gè)2’-f脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)的gst-πsirna提供出人意料地提高的基因敲低活性。在表13中示出的具有一個(gè)或更多個(gè)2’-f脫氧核苷酸的gst-πsirna的活性為3至13pm，其例外地適于許多用途，包括作為待體內(nèi)使用的藥劑。實(shí)施例8：含有一個(gè)或更多個(gè)2’-脫氧-2’-氟取代的核苷酸的gst-πsirna的結(jié)構(gòu)在體外提供出人意料地提高的基因敲低活性。在a549細(xì)胞系中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以測(cè)定基于結(jié)構(gòu)b13'(seqidno：207和222)的gst-πsirna的敲低效力。用基于結(jié)構(gòu)b13'的gst-πsirna觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低，如表14所示。表14：對(duì)于基于結(jié)構(gòu)b13’的gst-πsirna，a549細(xì)胞系中g(shù)st-πmrna的劑量依賴性敲低如表14所示，與沒(méi)有2’-f脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，基于具有位于非懸掛位置的3個(gè)2’-f脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)b13'的gst-πsirna的活性驚人地提高了約3倍。這些數(shù)據(jù)示出與沒(méi)有2’-f脫氧核苷酸的gst-πsirna相比，具有一個(gè)或更多個(gè)2’-f脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)的gst-πsirna提供出人意料地提高的基因敲低活性。在表14中示出的具有一個(gè)或更多個(gè)2’-f脫氧核苷酸的gst-πsirna的活性按皮摩爾計(jì)為6pm，其例外地適于許多用途，包括作為待體內(nèi)使用的藥劑。實(shí)施例9：原位a549肺癌小鼠模型。本發(fā)明的gst-πsirna可以在體內(nèi)顯示原位肺癌腫瘤的顯著減少。在該實(shí)施例中，當(dāng)向無(wú)胸腺裸鼠的原位肺癌腫瘤中以脂質(zhì)體制劑施用時(shí)，gst-πsirna在體內(nèi)提供基因敲低功效。通常，原位腫瘤模型可以顯示出與藥物效力和功效的直接臨床相關(guān)性，以及改進(jìn)的預(yù)測(cè)能力。在原位腫瘤模型中，將腫瘤細(xì)胞直接植入與細(xì)胞所起源器官相同種類的器官中。通過(guò)比較用于治療組和介質(zhì)對(duì)照組的尸檢時(shí)測(cè)量的最終原發(fā)腫瘤重量來(lái)評(píng)價(jià)sirna制劑對(duì)人肺癌a549的抗腫瘤效力。圖1示出基于結(jié)構(gòu)bu2(seqidno：61和126)的gst-πsirna的體內(nèi)原位肺癌腫瘤抑制。以2mg/kg靶向gst-π的sirna的相對(duì)低劑量使用原位a549肺癌小鼠模型。在這個(gè)為期六周的研究中，gst-πsirna示出顯著且出乎意料地有利的肺腫瘤抑制效力。如圖1所示，43天后，gst-πsirna示出顯著有利的腫瘤抑制效力，與對(duì)照相比，最終腫瘤平均重量顯著降低2.8倍。對(duì)于該研究，使用5至6周齡的雄性ncrnu/nu小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間保持在hepa過(guò)濾的環(huán)境中。sirna制劑在使用前儲(chǔ)存在4℃，并在注射入小鼠前10分鐘溫?zé)嶂潦覝?。?duì)于該a549人肺癌原位模型，在外科原位植入(soi)當(dāng)天，從攜帶a549腫瘤異種移植物的動(dòng)物的皮下部位獲取所存腫瘤(stocktumor)，并置于rpmi-1640培養(yǎng)基中。去除壞死組織，將活組織切成1.5至2mm3片。用異氟醚吸入麻醉動(dòng)物，手術(shù)區(qū)用碘和酒精滅菌。使用一對(duì)手術(shù)剪刀在小鼠的左胸壁中制造約1.5cm長(zhǎng)的橫切口。在第三肋與第四肋之間進(jìn)行肋間切口，暴露左肺。將一個(gè)a549腫瘤片段用8-0手術(shù)縫合線(尼龍)移植到肺表面。用6-0手術(shù)縫合線(絲)將胸壁封閉。使用具有25g×11/2針的3cc注射器通過(guò)胸內(nèi)穿刺再次對(duì)肺充氣，以抽出胸腔中的剩余空氣。用6-0手術(shù)絲縫合封閉胸壁。在hepa過(guò)濾層流罩下，用7倍放大顯微鏡進(jìn)行上述操作的所有程序。腫瘤植入后3天，將模型荷瘤小鼠隨機(jī)分組，每組10只。對(duì)于感興趣的組，10只小鼠的治療在腫瘤植入后三天開(kāi)始。對(duì)于感興趣的組，制劑是一種脂質(zhì)體組合物(可離子化的脂質(zhì)：膽固醇：dope：dopc：dppe-peg-2k：dspe-peg-2k)。脂質(zhì)體包封gst-πsirna。對(duì)于研究終點(diǎn)，治療開(kāi)始后第42天處死實(shí)驗(yàn)小鼠。切除原發(fā)腫瘤并在電子天平上稱重以進(jìn)行后續(xù)分析。為了估計(jì)化合物毒性，將治療組和對(duì)照組中的小鼠的平均體重在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間保持在正常范圍內(nèi)。在小鼠中沒(méi)有觀察到其他毒性癥狀。實(shí)施例10：本發(fā)明的gst-πsirna在體內(nèi)表現(xiàn)出癌異種移植腫瘤的顯著減少。當(dāng)向癌異種移植腫瘤以脂質(zhì)體制劑施用時(shí)，gst-πsirna在體內(nèi)提供基因敲低功效。圖2示出gst-πsirna(seqidno：156和182)的腫瘤抑制效力。以0.75mg/kg靶向gst-π的sirna的較低劑量使用癌異種移植模型。gst-πsirna在施用后幾天內(nèi)示出顯著且意想不到地有利的腫瘤抑制效力。36天后，gst-πsirna示出顯著有利的腫瘤抑制效力，與對(duì)照相比，腫瘤體積降低了2倍。如圖3所示，gst-πsirna在終點(diǎn)當(dāng)天顯示出顯著且意想不到地有利的腫瘤抑制效力。特別地，腫瘤重量降低了超過(guò)2倍。在兩次注射具有組成(可離子化脂質(zhì)：膽固醇：dope：dopc：dppe-peg-2k)(25:30:20:20:5)的脂質(zhì)體制劑(第1天和第15天)中施用gst-πsirna。對(duì)于癌異種移植模型，從atcc獲得a549細(xì)胞系。將細(xì)胞保持在補(bǔ)充有10％胎牛血清和100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中。細(xì)胞在接種之前分裂48小時(shí)，使得細(xì)胞在收獲時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用胰蛋白酶-edta輕度胰蛋白酶消化細(xì)胞并從組織培養(yǎng)物中收獲。在臺(tái)盼藍(lán)存在下，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)并測(cè)定活細(xì)胞數(shù)(僅計(jì)數(shù)活細(xì)胞)。將細(xì)胞在沒(méi)有血清的培養(yǎng)基中重懸至5×107個(gè)/ml的濃度。然后將細(xì)胞懸浮液與冰融化的bd基質(zhì)膠以1:1的比例充分混合用于注射。小鼠是charlesriverlaboratoryincymicnude(nu/nu)雌性小鼠，免疫受損，6至8周齡，每組7至8只小鼠。對(duì)于腫瘤模型制備，使用25g針頭和注射器，每只小鼠一只接種物將每只小鼠右側(cè)腹部皮下接種0.1ml2.5×106個(gè)a549細(xì)胞的接種物。小鼠的接種未麻醉。對(duì)于腫瘤體積測(cè)量和隨機(jī)化，測(cè)量腫瘤大小至最接近的0.1mm。使用以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積＝長(zhǎng)×寬度2/2。一旦建立的腫瘤達(dá)到約120至175mm3，平均腫瘤體積為約150mm3，將小鼠分配到各種介質(zhì)對(duì)照組和治療組中，使得治療組中的平均腫瘤體積在介質(zhì)對(duì)照組平均腫瘤體積的10％以內(nèi)，理想情況下，腫瘤體積的cv％小于25％。同一天，根據(jù)給藥方案施用試驗(yàn)制品和對(duì)照介質(zhì)。在第1周監(jiān)測(cè)腫瘤體積3次，其余數(shù)周為2次，包括研究終止日。對(duì)于劑量施用，在給藥日，將試驗(yàn)制品從-80℃冷凍器中取出并在冰上解凍。在施加于注射器之前，將含有制劑的瓶子用手翻轉(zhuǎn)數(shù)次。所有試驗(yàn)制品均通過(guò)iv以0.75mg/kg，q2w×2，10ml/kg給藥。對(duì)于體重，將小鼠稱重至最接近的0.1g。對(duì)于首次給藥，在給藥后7天內(nèi)，每日監(jiān)測(cè)并記錄體重。其余數(shù)周每周監(jiān)測(cè)并記錄體重兩次，包括研究終止日。對(duì)于腫瘤采集，在第一次給藥后第28天，測(cè)量腫瘤體積，并解剖腫瘤以進(jìn)行體重測(cè)量，存儲(chǔ)用于pd生物標(biāo)志物研究。記錄腫瘤重量。實(shí)施例11：證實(shí)了本發(fā)明的gst-πsirna通過(guò)體外癌細(xì)胞凋亡增加的癌細(xì)胞死亡。gst-πsirna提供了gst-π敲低，其導(dǎo)致puma上調(diào)，puma是細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物，與細(xì)胞活力損失相關(guān)。種子區(qū)域中含有脫氧核苷酸的組合－2'-f取代的脫氧核苷酸和2'-ome取代的核糖核苷酸－的gst-πsirnaseqidno：156和182提供了意想不到的增加的癌細(xì)胞凋亡。如圖4所示測(cè)量puma對(duì)于gst-πsirnaseqidno：156和182的表達(dá)水平。在圖4中，puma的表達(dá)在轉(zhuǎn)染gst-πsirna后的2至4天大幅增加。這些數(shù)據(jù)表明，種子區(qū)域中含有脫氧核苷酸的組合－2'-f取代的脫氧核苷酸和2'-ome取代的核糖核苷酸－的gst-πsirna的結(jié)構(gòu)提供了意想不到的增加的癌細(xì)胞凋亡。puma生物標(biāo)志物的方案如下。在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以2×103個(gè)細(xì)胞/孔布板在96孔板中，每孔具有含有10％fbs的100μldmem(hyclonecat.#sh30243.01)，并在空氣中含有5％co2加濕氣氛的37℃孵育箱中培養(yǎng)。次日，在轉(zhuǎn)染之前，用含有2％fbs的90μl的opti-memi還原血清培養(yǎng)基(lifetechnologiescat.#31985-070)更換培養(yǎng)基。然后，將0.2μl的lipofectaminernaimax(lifetechnologiescat.#13778-100)與4.8μl的opti-memi在室溫下混合5分鐘。將1μl的gst-πsirna(儲(chǔ)備濃度1μm)與4μl的opti-memi混合，并與rnaimax溶液混合，然后輕輕混合。將混合物在室溫下孵育10分鐘，以形成rna-rnaimax復(fù)合物。每孔加入10μlrna-rnaimax復(fù)合物，至sirna的終濃度為10nm。將細(xì)胞孵育2小時(shí)，將培養(yǎng)基更換為含有2％fbs的新鮮的opti-memi還原血清培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后1、2、3、4和6天，用冰冷的pbs洗滌細(xì)胞一次，然后在室溫下用50μl細(xì)胞至ct裂解緩沖液(lifetechnologiescat.#4391851c)裂解5至30分鐘。加入5μl終止液，并在室溫下孵育2分鐘。使用taqman通過(guò)qpcr測(cè)量puma(bbc3，cat#hs00248075，lifetechnologies)mrna水平。實(shí)施例12：本發(fā)明的gst-πsirna可以在體內(nèi)顯示癌異種移植腫瘤的顯著減少。當(dāng)以脂質(zhì)體制劑施用于癌異種移植腫瘤時(shí)，gst-πsirna可以在體內(nèi)提供基因敲低功效。圖5示出gst-πsirna(seqidno：61和126)的腫瘤抑制效力。用靶向gst-π的sirna在體內(nèi)觀察到gst-πmrna的劑量依賴性敲低。使用靶向gst-π的sirna的癌異種移植模型。gst-πsirna在施用后幾天內(nèi)示出顯著且意想不到地有利的腫瘤抑制效力。如圖5所示，使用gst-πsirna治療在注射脂質(zhì)制劑后4天導(dǎo)致gst-πmrna表達(dá)顯著降低。在4mg/kg的較高劑量下，注射后24小時(shí)檢測(cè)到約40％的顯著降低。gst-πsirna以單次注射10ml/kg具有組成(可離子化脂質(zhì):膽固醇:dope:dopc:dppe-peg-2k)(25:30:20:20:5)的脂質(zhì)體制劑)施用。對(duì)于癌異種移植模型，從atcc獲得a549細(xì)胞系。將細(xì)胞保持在補(bǔ)充有10％胎牛血清和100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的rpmi-1640中。細(xì)胞在接種之前分裂48小時(shí)，使得細(xì)胞在收獲時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用胰蛋白酶-edta輕度胰蛋白酶消化細(xì)胞并從組織培養(yǎng)物中收獲。在臺(tái)盼藍(lán)存在下，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)并測(cè)定活細(xì)胞數(shù)(僅計(jì)數(shù)活細(xì)胞)。將細(xì)胞在沒(méi)有血清的rpmi培養(yǎng)基中重懸至4×107個(gè)/ml的濃度。然后將細(xì)胞懸浮液與冰融化的bd基質(zhì)膠以1:1的比例充分混合用于注射。小鼠是charlesriverlaboratoryincymicnude(nu/nu)雌性小鼠，免疫受損，6至8周齡，每組3只小鼠。對(duì)于腫瘤模型制備，使用25g針頭和注射器，每只小鼠一只接種物將每只小鼠右側(cè)腹部皮下接種0.1ml2.5×106個(gè)a549細(xì)胞的接種物。小鼠的接種未麻醉。對(duì)于腫瘤體積測(cè)量和隨機(jī)化，測(cè)量腫瘤大小至最接近的0.1mm。使用以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積＝長(zhǎng)×寬度2/2。腫瘤體積每周監(jiān)測(cè)兩次。一旦建立的腫瘤達(dá)到約350至600mm3，將小鼠分配到具有不同時(shí)間點(diǎn)的組中。當(dāng)天，根據(jù)給藥方案施用試驗(yàn)制品。對(duì)于劑量施用，在建立的腫瘤達(dá)到約350至600mm3那天，將試驗(yàn)制品從4℃冰箱中取出。在施加于注射器之前，將含有制劑的瓶子用手翻轉(zhuǎn)數(shù)次以得到均勻溶液。對(duì)于體重，將小鼠稱重至最接近的0.1g。每周監(jiān)測(cè)并記錄體重兩次，其余數(shù)周，包括研究終止日。對(duì)于腫瘤采集，在第一次給藥后第0、24、48、72、96(任選的)和168小時(shí)通過(guò)過(guò)量co2處死動(dòng)物并切除腫瘤。首先將腫瘤濕稱重，然后分成三份用于kd、分布和生物標(biāo)志物分析。將樣品在液氮中快速冷凍并在-80℃儲(chǔ)存待處理。實(shí)施例13：本發(fā)明的gst-πsirna在體內(nèi)抑制胰腺癌異種移植腫瘤。當(dāng)以脂質(zhì)體制劑施用于胰腺癌異種移植腫瘤時(shí)，gst-πsirna在體內(nèi)提供基因敲低功效。在該異種移植模型中，將每只小鼠右側(cè)皮下接種0.1ml2.5×106個(gè)panc-1細(xì)胞的接種物。使用charlesriver6至8周齡的無(wú)胸腺裸鼠。將腫瘤大小測(cè)量至最接近的0.1mm。一旦建立的腫瘤達(dá)到約150至250mm3(平均腫瘤體積為約200mm3)，將小鼠分配到各種介質(zhì)對(duì)照組和治療組中，使得治療組中的平均腫瘤體積在介質(zhì)對(duì)照組平均腫瘤體積的10％以內(nèi)。同一天，根據(jù)給藥方案施用試驗(yàn)制品和對(duì)照介質(zhì)。在第1周監(jiān)測(cè)腫瘤體積3次，其余數(shù)周為2次，包括研究終止日。圖6示出gst-πsirna(seqidno：61和126)的腫瘤抑制效力。如圖6所示，用靶向gst-π的sirna的0.375mg/kg至3mg/kg的劑量獲得了劑量響應(yīng)。gst-πsirna在施用后幾天內(nèi)示出顯著且意想不到地有利的腫瘤抑制效力。因此，gst-πsirna在終點(diǎn)顯示出顯著且意想不到地有利的腫瘤抑制效力gst-πsirna以具有組成(可離子化脂質(zhì):膽固醇:dope:dopc:dppe-peg-2k)(25:30:20:20:5)的脂質(zhì)體制劑施用。實(shí)施例14：本發(fā)明的gst-πsirna表現(xiàn)出提高的血清穩(wěn)定性。圖7示出在人血清中孵育并通過(guò)fipls/lcms在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)剩余的sirna。如圖7所示，gst-πsirna(seqidno：61和126)的有義鏈(圖7，上)和反義鏈(圖7下，底部)兩者的血清中的半衰期(t1/2)為約100分鐘。實(shí)施例15：本發(fā)明的gst-πsirna在血漿中的制劑表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性。圖8示出在血漿中孵育制劑和在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)剩余的sirna。如圖8所示，gst-πsirna(seqidno：61和126)制劑的血漿中的半衰期(t1/2)顯著長(zhǎng)于100小時(shí)。在具有組成(電離脂質(zhì)：膽固醇：dope：dopc：dppe-peg-2k)(25:30:20:20:5)的脂質(zhì)體制劑中制備gst-πsirna。脂質(zhì)體納米粒子的z-平均粒徑為40.0nm，sirna封裝91％。將制劑在pbs中的50％人血清中孵育40分鐘、1.5小時(shí)、3小時(shí)、24小時(shí)和96小時(shí)。通過(guò)基于elisa的測(cè)定法測(cè)定gst-πsirna的量。實(shí)施例16：本發(fā)明的gst-πsirna表現(xiàn)出乘客鏈減少的脫靶效應(yīng)。對(duì)于gst-πsirna(seqidno：156和182)，圖9示出與沒(méi)有顯示效果的具有加擾序列的對(duì)照相比，引導(dǎo)鏈的體外敲低近似指數(shù)。在5pm下測(cè)量該sirna的ic50。圖10示出同一gst-πsirna的乘客鏈的體外敲低。如圖10所示，gst-πsirna的乘客鏈脫靶敲低大幅減少了超過(guò)100倍。對(duì)于gst-πsirna(seqidno：187和199)、(seqidno：189和201)和(seqidno：190和202)，圖11示出引導(dǎo)鏈的體外敲低近似為指數(shù)。分別在6、7和5pm測(cè)量這些sirna的ic50。如圖12所示，這些gst-πsirna的乘客鏈的體外敲低顯著降低了至少10倍。所有這些gst-πsirna在雙鏈體區(qū)域的種子區(qū)域中具有脫氧核苷酸，在雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有其他修飾。對(duì)于gst-πsirna(seqidno：217和232)，圖13示出該高活性gst-πsirna的引導(dǎo)鏈的體外敲低近似指數(shù)。在11pm下測(cè)量該sirna的ic50。如圖14所示，該gst-πsirna的乘客鏈的體外敲低顯著降低了超過(guò)100倍。該gst-πsirna在雙鏈體區(qū)域的種子區(qū)域中具有脫氧核苷酸，在雙鏈體區(qū)域中沒(méi)有其他修飾。使用編碼海腎熒光素酶基因的表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒psicheck-2測(cè)定脫靶效應(yīng)。(dual-luciferasereporterassaysystem，promega，cat#：e1960)。sirna濃度通常為50pm。方案：第1天，以5至7.5×103/100μl/孔接種hela細(xì)胞。第2天，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞融合約80％。第3天，收獲細(xì)胞用于熒光素酶活性測(cè)量。根據(jù)制造商的方案，使用promega的熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)(e4550)測(cè)量熒光素酶活性。psicheck-2載體能夠監(jiān)測(cè)與海腎螢光素酶的報(bào)告基因融合的靶基因的表達(dá)變化。將sirna構(gòu)建體克隆到多重克隆區(qū)，并將該載體與sirna共轉(zhuǎn)染入hela細(xì)胞。如果特異性sirna與靶mrna結(jié)合并啟動(dòng)rnai過(guò)程，則融合的renilla螢光素酶：構(gòu)建體mrna將被切割并隨后降解，從而降低海腎螢光素酶信號(hào)。例如，具有bu2'結(jié)構(gòu)的sirna的質(zhì)粒插入物如下：psicheck-2(f)質(zhì)粒插入物：seqidno.：285ctcgaggggcaactgaagccttttgagaccctgctgtcccaggcggccgcpsicheck-2(r)質(zhì)粒插入物：seqidno：：286ctcgagctgggacagcagggtctcaaaaggcttcagttgcccgcggccgc實(shí)施例17：本發(fā)明的gst-πsirna顯示出有利地降低的mirna樣脫靶效應(yīng)，其是種子依賴性非目標(biāo)脫靶基因沉默。對(duì)于gst-πsirna(seqidno：156和182)、(seqidno：187和199)、(seqidno：189和201)、(seqidno：190和202)和(seqidno：217和232)，發(fā)現(xiàn)模擬mirna的脫靶活性基本上可以忽略不計(jì)。這些gst-πsirna的種子依賴性非目標(biāo)脫靶基因沉默與引導(dǎo)鏈的靶向活性相比降低至少10倍至100倍。為了測(cè)試與mirna相關(guān)的脫靶效應(yīng)，將與整個(gè)含種子區(qū)域互補(bǔ)的種子匹配的靶序列的一至四個(gè)重復(fù)(位于反義鏈的5′端的第1至8位，而不是其余非種子區(qū)域，第9至21位)引入相應(yīng)于熒光素酶mrna的3’utr的區(qū)域中，以確定種子依賴性非目標(biāo)脫靶效應(yīng)的效率。使用質(zhì)粒插入物來(lái)模擬具有種子區(qū)域的完全匹配和非種子區(qū)域的錯(cuò)配(凸起)的mirna。例如，具有bu2’結(jié)構(gòu)的sirna的質(zhì)粒插入物如下：psicheck-2(fmil)質(zhì)粒插入物：seqidno.：287ctcgaggggcaactctacgcaaaacagaccctgctgtcccaggcggccgcpsicheck-2(fmi2)質(zhì)粒插入物：seqidno.：288ctcgaggggcaactctacgcaaaacagaccctgctctacgcaaaacagaccctgctgtcccaggcggccgcpsicheck-2(fmi3)質(zhì)粒插入物：seqidno.：289ctcgaggggcaactctacgcaaaacagaccctgctctacgcaaaacagaccctgctctacgcaaaacagaccctgctgtcccaggcggccgcpsicheck-2(fmi4)質(zhì)粒插入物：seqidno：290ctcgaggggcaactctacgcaaaacagaccctgctctacgcaaaacagaccctgctctacgcaaaacagaccctgctctacgcaaaacagaccctgctgtcccaggcggccgc本文描述的實(shí)施方案不是限制性的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地理解，可以不進(jìn)行過(guò)度實(shí)驗(yàn)而測(cè)試本文所述修飾的特定組合以鑒定具有改進(jìn)的rnai活性的核酸分子。出于所有目的，本文特別提及的所有出版物、專利和文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所述特定方法、方案、材料和試劑，因?yàn)樗鼈兛赡茏兓＿€應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，而無(wú)意于限制本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的是，在不背離本說(shuō)明書的范圍和總之的情況下，可以對(duì)本文所公開(kāi)的描述進(jìn)行各種替換和修改，并且這些實(shí)施方案在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。必須指出，本文和所附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指稱，上下文另有明確說(shuō)明除外。同樣地，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”(或“一種”)、“一個(gè)或更多個(gè)(一種或更多種)”和“至少一個(gè)/種”在本文可以互換使用。另外要注意，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”、“含有”、“含”和“具有”可以互換使用，并且應(yīng)該被廣義、無(wú)限制地解釋。除非本文另有說(shuō)明，否則本文中對(duì)數(shù)值范圍的記載僅僅意在作為對(duì)單獨(dú)提到落入該范圍的每個(gè)單獨(dú)的值的速記法，每個(gè)單獨(dú)的值均被并入說(shuō)明書中，如同它們被單獨(dú)記載于本文中一樣。對(duì)于馬庫(kù)什組，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，該描述包括個(gè)體成員以及馬庫(kù)什組成員的亞組。即使沒(méi)有進(jìn)一步的闡述，認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員亦可基于上述描述最大程度地利用本發(fā)明。因此，所附的具體實(shí)施方案應(yīng)被解釋為僅是說(shuō)明性的，而不是以任何方式限制本公開(kāi)的其余部分。本說(shuō)明書中公開(kāi)的所有特征可以以任何組合而聯(lián)用。本說(shuō)明書中公開(kāi)的每個(gè)特征可以由服務(wù)于相同、等同或相似目的的替代特征來(lái)代替。當(dāng)前第1頁(yè)12