pct提交相關(guān)申請的交叉引用的格式

背景

該申請要求2014年10月3日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/059,466的優(yōu)先權(quán)。該申請的內(nèi)容以其全部通過引用被并入本文。

封入生物活性劑的無生命但完整的細菌囊泡已用于治療目的。在例如國際專利申請w02003/033519中，本發(fā)明人描述含有治療性核酸分子的細菌衍生完整微細胞的制備及用途。通過w02005/079854，本發(fā)明人也表明，小分子藥物(無論親水性或疏水性)可封裝至微細胞中，所述微細胞在被靶哺乳動物細胞攝取時可將藥物釋放至靶細胞的細胞質(zhì)中。同樣地，美國專利第8,591,862號列出本發(fā)明人且表明封裝有治療劑的完整殺死的細菌細胞的制備及用途。

根據(jù)定義，殺死的細菌細胞為無生命的，微細胞亦如此。任一種類型的完整細菌囊泡均不能復(fù)制或主動侵入宿主細胞。

本發(fā)明人已報導(dǎo)，殺死的細菌細胞及微細胞(盡管其尺寸相對較大)在與細胞接觸時可被靶哺乳動物細胞攝取，且隨后在晚期內(nèi)體/溶酶體中降解，將其藥物有效負載釋放至靶細胞中。當殺死的細菌細胞或微細胞附著至靶向哺乳動物細胞的配體時，攝取改良。w02005/056749中說明性描述的此類配體為雙特異性抗體，其具有(i)對微細胞表面結(jié)構(gòu)具有特異性的第一臂及(ii)對非吞噬性哺乳動物細胞表面受體具有特異性的第二臂。

本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，在靜脈內(nèi)施用到帶有腫瘤的哺乳動物宿主后，微細胞通過與包括某些腦瘤的多種實體腫瘤相關(guān)的滲漏脈管快速外滲(w02013/088250)，且微細胞在腫瘤微環(huán)境中積聚。微細胞被限制于腫瘤微環(huán)境中且不會穿透至正常組織中被認為歸因于直徑約400nm±50nm的微細胞不能從包圍正常(非腫瘤)組織的正常脈管逸出。

另外，本發(fā)明人描述用于將藥物有效負載裝載至此類細菌囊泡中的方法。例如，核酸在濃度梯度下與囊泡一起溫育時可被封裝至完整無生命細菌囊泡中，在此期間，核酸沿梯度向下移動至囊泡中。參見例如美國專利第8,669,101號?？蛇x地，可將編碼核酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至活細菌中且復(fù)制或轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生核酸。隨后可殺死封裝核酸的活細菌，得到如上文所描述的殺死的細菌細胞，或其可產(chǎn)生自身裝載有核酸的完整微細胞。參見例如w02003/033519。

不同于核酸，小分子藥物典型地無法由質(zhì)粒產(chǎn)生。然而，如所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可直接將此類藥物裝載至囊泡中。他們的裝載小分子藥物的方法被闡明在macdiarmid等人，cancercell11：431-45(2007)所報導(dǎo)的實驗中。

對于2007公開內(nèi)容中報導(dǎo)的實驗，用1至2毫升(ml)磷酸緩沖鹽水(“pbs緩沖液”)中所含有的微細胞實現(xiàn)藥物裝載，所述緩沖液具有以下組成：137mmnacl、2.7mmkc1、10mmna2po4、2mmkh2po4(調(diào)節(jié)至ph7.4)。參見p.gerhardt等人，manualofmethodsforgeneralbacteriology，第2版，americansocietyformicrobiology(washington，d.c.)，1981。在此1ml至2ml規(guī)模(下文，“小規(guī)?！?上，與給定藥物共同溫育微細胞之后進行自微細胞移除過量藥物的工作。此工作需要離心，從而將封裝藥物的微細胞形成球粒(pellet)，且隨后丟棄認為任何過量藥物存在于其中的上清液。隨后使微細胞再懸浮于新鮮pbs(同樣1至2ml)中，且對于給定制劑，重復(fù)離心及上清液丟棄步驟五次至六次。在本公開中，此常規(guī)方法稱為“小規(guī)模方案”，其需要共同溫育(裝載)步驟及通過再懸浮、離心及上清液丟棄的洗滌的多個步驟，均在1至2ml規(guī)模上進行。

作為執(zhí)行小規(guī)模方案的后續(xù)，macdiarmid等人提取與微細胞相關(guān)的藥物，參見第433頁上及以下的最后一個完整句子，之后使用hplc分析來測定藥物濃度。對于若干抗癌藥物，macdiarmid等人報導(dǎo)就例如多柔比星的“每個微細胞約1000萬個......分子......”而言，小規(guī)模方法的所估計的裝載效率。同上，第435頁的第一個完整句子。

發(fā)明概述

通過進一步研究，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，當與初始不含有給定熒光化合物的無生命完整細菌囊泡一起溫育時，熒光化合物可出人意料地比其他類似但非熒光化合物更迅速地沿所得濃度梯度向下移動(高外部至低內(nèi)部)至囊泡的細胞質(zhì)中，且熒光化合物也可實現(xiàn)出人意料地較高囊泡內(nèi)濃度。沿著這些線索，本發(fā)明人觀測到，例如將非熒光化合物與熒光部分連接大大提高至無生命完整細菌囊泡中的裝載、用非熒光化合物自身獲得的相對結(jié)果，然而此類修飾典型地實現(xiàn)分子量提高，其被認為將妨礙藥物裝載。

尤其就熒光化合物的裝載而言，本發(fā)明人也已確定，當在已添加有諸如堿金屬鹵化物鹽(例如氯化鉀、氯化鈉及溴化鉀)的二元離子化合物的培養(yǎng)基中實現(xiàn)熒光化合物的裝載時，效率的增強甚至更大。依照本發(fā)明，裝載培養(yǎng)基中濃度低至約200mm數(shù)量級的此類化合物的存在使熒光化合物的裝載效率提高兩倍或更多，其中裝載在僅約十五分鐘之后有效地完成。

更一般而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可除去上文所討論的小規(guī)模方案中涉及的離心，且對于熒光及非熒光化合物兩者，小規(guī)模方案自身替換為共同溫育(裝載)繼而經(jīng)由交叉流過濾的洗滌的多個步驟的方法。一般而言，參見crossflowfiltrationmethodhandbook(29-0850-76ab)，gehealthcare，訪問www.gelifesciences.com/gehcls_images/gels/related％20content/files/1392028292867/litdoc29085076_20140313045908.pdf。也參見membraneprocessesinbiotechnologyandpharmaceutics，catherinecharcosset編，elsevier(2012)及sterilefiltration：apracticalapproach，maikw.jornitz及theodoreh.meltzer編，taylor&francis(2000)。根據(jù)本發(fā)明，用可購自除其它供貨商外的sartoriusstedimsystems，gehealthcare和pallcorporation的醫(yī)藥級過濾器進行交叉流過濾?；谟晒┴浬烫峁┑氖褂谜呤謨灾械拿枋?，視過濾器的尺寸、制備規(guī)模等而定，選擇適合的過濾器在熟悉過濾領(lǐng)域的那些人的權(quán)限內(nèi)。另外，過濾器的孔徑為標準的，例如0.45μm或0.2μm，視過濾目的而定。在過濾期間所施加的壓力在各步驟間不同且根據(jù)需要進行調(diào)節(jié)。

在此情形下，當在緩沖液中洗滌封裝藥物的囊泡的規(guī)模在所采用的緩沖液體積方面提高約四與五個之間的數(shù)量級(即，相比于小規(guī)模方案的毫升規(guī)模，在升規(guī)模(下文，“大規(guī)?！?)，例如通過每次重復(fù)在約20升新鮮緩沖液中重復(fù)洗滌裝載藥物的囊泡三至五次時，發(fā)現(xiàn)涉及出人意料的優(yōu)勢。依照此方法(下文，“大規(guī)模方法”)，因此，可例如在針對給定批次的裝載藥物的囊泡的洗滌步驟中采用約100升數(shù)量級的緩沖液。

因此，本發(fā)明方法不僅使得游離內(nèi)毒素水平下降，且也使得常規(guī)小規(guī)模方案截留(trapped)于囊泡外表面上的有效負載化合物的迄今未辨識部分減少。借助于說明，小規(guī)模方案使得每個完整微細胞裝載許多多柔比星分子，上述macdiarmid等人(2007)估計為約1000萬。在本發(fā)明的大規(guī)模方法的情況下，此數(shù)值為每個微細胞約100萬個以下的分子(參見以下實施例6)。因此，小規(guī)模方案與使900萬個多柔比星分子中的一些截留至封裝微細胞外層相關(guān)，與本發(fā)明方法形成顯著對比(參見實施例14)。

因此，根據(jù)本發(fā)明方法，有效負載化合物截留至封裝囊泡外部被減到最少，且當移除濃度梯度時，裝載化合物保持在囊泡內(nèi)部。因此，本發(fā)明提供制備以每10⁹個微細胞數(shù)百納克化合物的數(shù)量級的量封入裝載化合物的完整無生命細菌囊泡的高效方法。

因此，在一個方面中，本發(fā)明提供包含封入熒光小分子藥物的完整且無生命的細菌囊泡的組合物，該熒光小分子藥物不是多柔比星、伊立替康、比山群、托泊替康、表柔比星、柔紅霉素、米托蒽醌、oregon488結(jié)合的紫杉醇或fl結(jié)合的長春堿。囊泡為完整細菌衍生的微細胞或殺死的細菌細胞。在一些實施方式中，微細胞封入小分子藥物的至少500,000個分子。優(yōu)選，小分子藥物為生物活性的。在一些實施方式中，小分子藥物的分子量為約900道爾頓或更小。在其它實施方式中，小分子藥物為細胞毒性的。示例性小分子藥物包括但不限于嗎啉基蒽環(huán)類衍生物，諸如pnu-159682。在某些實施方式中，小分子藥物為體內(nèi)活化的。

在另一方面中，本公開提供包含封入式d-l-f化合物或其鹽的完整且無生命的細菌囊泡的組合物，其中：d為小分子藥物的殘基，l為連接體，且f為熒光部分。適用于本發(fā)明的連接體的半衰期在6小時與24小時之間，或在酸性ph條件下，諸如在哺乳動物細胞的內(nèi)體中降解。下文詳述說明性小分子藥物、熒光部分及連接體及其結(jié)構(gòu)。

在又一方面中，提供包含封入化合物的細菌衍生的完整細菌囊泡的組合物，該化合物包括活性劑，通過連接體結(jié)合至能量轉(zhuǎn)移部分，其中活性劑不為oregon488結(jié)合的紫杉醇和fl結(jié)合的長春堿。在一些實施方式中，能量轉(zhuǎn)移部分為發(fā)光部分，包含共軛pi系統(tǒng)，或包含吖啶基部分、呫噸基部分或苯并咪唑基部分。

在相關(guān)方面中，本發(fā)明涉及不通過離心使多個微細胞裝載所需化合物的方法。該方法包括以下步驟：(a)在一定體積的所需化合物于緩沖液體中的溫育溶液中溫育該多個微細胞，其中體積為約100ml或更大的數(shù)量級，及隨后(b)使該多個微細胞經(jīng)多個洗滌步驟，各包括用數(shù)量級為升的一定體積的緩沖液體交叉流過濾微細胞，其中洗滌步驟中無一者采用離心微細胞。在一些實施方式中，使與待裝載在微細胞內(nèi)的所需化合物不同的二元離子化合物溶解于溫育溶液中，達到約200mm或更大數(shù)量級的濃度。優(yōu)選，步驟(b)包括三至五個洗滌步驟。在一些實施方式中，所需化合物為熒光的。在一些實施方式中，步驟(a)的溫育持續(xù)約4小時的時期。在一些實施方式中，所需化合物為生物活性的。所需化合物可為分子量為約900道爾頓或更小的小分子藥物。優(yōu)選，小分子藥物為細胞毒性的。小分子藥物可為體內(nèi)活化的。在其它實施方式中，所需化合物具有式d-l-f或為其鹽，其中d為小分子藥物的殘基，l為連接體，且f為熒光部分。優(yōu)選，連接體的半衰期在6小時與24小時之間或在哺乳動物細胞的內(nèi)體中降解。

在又一方面中，描述涉及在需要其的患者中治療癌癥。治療包括向患者施用有效量的本發(fā)明所涵蓋的組合物。在一些實施方式中，組合物包含細胞毒性化合物。

附圖簡述

圖1顯示封裝有長春堿fl的微細胞的熒光圖像。微細胞在黑色背景上發(fā)出亮紅色熒光，指示長春堿fl存在于微細胞中且不存在于外部空間中。

圖2顯示封裝有flutax-1的微細胞的熒光影像。微細胞在黑色背景上發(fā)出亮綠色熒光。因此，flutax-1被封裝至微細胞中且未保留在外部空間中。

圖3顯示來自1×10⁹個封裝flutax-1的微細胞的提取物的hplc分離的示例性層析圖。在保留時間(rt)＝4.72分鐘時發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于flutax-1的峰值。此峰面積用于通過與已知量的flutax-1的標準曲線進行比較來計算封裝至微細胞中的flutax-1的量。

圖4顯示封裝有與green-488結(jié)合的紫杉醇的微細胞的熒光影像。微細胞在黑色背景上發(fā)出亮綠色熒光顯示結(jié)合物封裝至微細胞中。

圖5顯示封裝有fcp的微細胞的熒光影像。微細胞在黑色背景上發(fā)出亮綠色熒光，指示fcp封裝至微細胞中。

圖6顯示來自裝載fcp的微細胞(1×10⁹)的提取物的hplc分離的示例性層析圖。在保留時間(rt)＝3.64分鐘時發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于fcp的峰值。此峰值的區(qū)域用于通過與已知量的fcp的標準曲線進行比較來計算封裝至微細胞中的fcp的量。

圖7顯示封裝有baclight^tmgreen的微細胞的熒光影像。微細胞在黑色背景上發(fā)出亮綠色熒光。因此，baclight^tmgreen顯示與微細胞相關(guān)且不與外部空間相關(guān)。

圖8顯示由空的及封裝baclight^tmgreen的微細胞的流式細胞術(shù)分析產(chǎn)生的直方圖。x軸表示fl-1通道中的熒光，且y軸＝計數(shù)。封裝baclight^tmgreen的微細胞呈現(xiàn)相異的群體，其相比于空的微細胞移位至右側(cè)，指示該群體的微細胞為熒光的。

圖9顯示封裝有多柔比星的微細胞的熒光影像。微細胞在黑色背景上發(fā)出亮紅色熒光，指示多柔比星存在于微細胞內(nèi)而非外部空間中。

圖10顯示來自1×10⁹個封裝多柔比星的微細胞的提取物的hplc分離的示例性層析圖。在保留時間(rt)＝5.5分鐘時發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于多柔比星的峰值。此峰值的區(qū)域用于通過與已知多柔比星量的標準曲線進行比較來計算封裝至微細胞中的多柔比星的量。

圖11顯示封裝有核酸染料syto9的微細胞的熒光影像。微細胞在黑色背景上發(fā)出亮綠色熒光，指示syto9與微細胞而非外部空間相關(guān)。

圖12顯示由空的及封裝syto9的微細胞的流式細胞術(shù)分析產(chǎn)生的直方圖。x軸表示fl-1通道中的熒光；y軸＝計數(shù)。封裝syto9的微細胞呈現(xiàn)相異的群體，其相比于空的微細胞移位至右側(cè)；因此，封裝微細胞為熒光的。

圖13顯示封裝有9-氨吖啶鹽酸鹽水合物的微細胞的熒光影像。微細胞在黑色背景上發(fā)出藍色熒光，指示9-氨吖啶鹽酸鹽水合物與微細胞而非外部空間相關(guān)。

圖14顯示來自1×10⁹個封裝紫杉醇的微細胞的提取物的hplc分離的示例性層析圖。在保留時間(rt)＝4.48分鐘時發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于紫杉醇的峰值。此峰值的區(qū)域用于通過與已知量的標準曲線進行比較來計算封裝至微細胞中的紫杉醇的量。

圖15顯示來自1×10⁹個封裝tf.pac的微細胞的提取物的hplc分離的示例性層析圖。在保留時間(rt)＝4.57分鐘時發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于tf.pac的峰值。此峰值的區(qū)域用于通過與已知tf.pac量的標準曲線進行比較來測定封裝至微細胞中的tf.pac的量。

圖16顯示在兩種不同波長處，具有不同濃度的葉酸的裝載多柔比星的溶液的熒光讀數(shù)。

圖17顯示游離多柔比星的標準曲線的產(chǎn)生。

圖18顯示熒光淬滅劑葉酸對多柔比星裝載量的影響。

圖19顯示根據(jù)uv(250nm)讀數(shù)的多柔比星裝載至微細胞中的hplc定量。

圖20顯示根據(jù)相對熒光(rf)讀數(shù)的多柔比星裝載量的hplc定量。

圖21顯示在來自各種離子鹽的解離的離子存在下裝載至微細胞中的flutax-1的過程及量。

圖22描繪針對表示將flutax-1裝載至微細胞中15分鐘的時間點，圖21中所顯示的數(shù)據(jù)。

圖23顯示共同溫育溫度對通過離子增強熒光介導(dǎo)的化合物跨膜移動至微細胞中的影響。

圖24說明人類受體酪氨酸激酶的20個亞家族及58個成員(摘錄自lemmonandschlessinger，cell141：1117-134(2010))。

詳細描述

本公開提供用于將化合物裝載至完整的細菌衍生的無生命囊泡(包括微細胞及殺死的細菌細胞的類別)中的方法，以及含有裝載此類化合物的囊泡的組合物(優(yōu)選醫(yī)藥級)。

(a)定義

除非另外定義，否則本說明書中所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解相同的含義。

為方便起見，下文提供本說明書、實施例及所附權(quán)利要求中所采用的某些術(shù)語及詞組的含義。在整個說明書中定義其它術(shù)語及詞組。

除非上下文另外明確指示，否則單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多個指示物。

如本文所使用，術(shù)語“約”將為一般本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解且將在一定程度上視使用其的上下文而變化。若使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員并不清楚的術(shù)語(給定使用該術(shù)語的上下文)，則“約”將意謂特定術(shù)語至多加或減10％。

如本文所使用，除當上下文另外需要時外，術(shù)語“包含(包括，comprise)”及該術(shù)語的變化形式，諸如“包含(包括，comprising)”、“包含(包括，comprises)”及“包含(包括，comprised)”并不意欲排除其它添加物、組分、整數(shù)或步驟。

詞組“生物活性的(biologicallyactive)”和“生物活性(biologicalactivity)”用于描述或指示(視具體情況)化合物或組合物對活的物質(zhì)的影響。因此，若材料與人類或動物體中的任何細胞組織具有相互作用或?qū)ζ溆杏绊?，例如通過與細胞中的蛋白質(zhì)、核酸或其它分子反應(yīng)，則材料為生物活性的或具有生物活性。

本文中可互換使用的“癌癥”、“贅瘤”、“腫瘤”、“惡性腫瘤”及“癌”指展現(xiàn)特征為明顯失去細胞增殖控制的異常生長表型的細胞或組織。本公開的方法及組合物尤其適用于惡性、轉(zhuǎn)移前、轉(zhuǎn)移性及非轉(zhuǎn)移性細胞。

“藥物”指在動物，尤其哺乳動物及人類中產(chǎn)生局部或全身性影響的任何生理學(xué)上或藥理學(xué)上活性的物質(zhì)。

在本說明書中可互換使用的術(shù)語“個體”、“受試者”、“宿主”及“患者”指期望診斷、治療或療法的任何哺乳動物個體。個體、受試者、宿主或患者可為人類或非人類動物。因此，適合的受試者可包括但不限于非人類靈長類動物、牛、馬、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠及小鼠。

術(shù)語“治療(treatment)”、“治療(treating)”、“治療(treat)”及其類似者指在腫瘤患者中獲得所需藥理學(xué)及/或生理作用。在完全或部分預(yù)防腫瘤生長或其癥狀方面，該作用可為預(yù)防性的，和/或在部分或完全穩(wěn)定或治愈腫瘤方面和/或針對可歸因于腫瘤的不良作用方面，該作用可為治療性的。治療涵蓋在哺乳動物，尤其人類中的腫瘤的任何治療。期望的治療效果可為腫瘤反應(yīng)，其可測量為腫瘤塊(質(zhì)量，mass)減少或抑制腫瘤塊增加?？蛇x地或另外地，期望的治療效果可為總患者存活、無進展存活、腫瘤復(fù)發(fā)時間的增加，或不良作用的減少。

“烷基”指具有1至20，或1至10，或1至6，或1至4個碳原子的單價飽和直鏈或支鏈線性烴基。烷基的實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基或辛基。c1-c4直鏈或支鏈烷基也稱為“低級烷基”。

“亞烷基”指具有1至20，或1至10，或1至6，或1至4個碳原子，或1或2個碳原子的二價飽和直鏈或支鏈線性烴基。亞烷基的實例包括-(ch2)y-，其中y為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

“環(huán)烷基”指具有3至10，或3至8個碳原子的環(huán)烴基。環(huán)烷基的實例包括例如金剛烷基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)辛基及環(huán)己烯基。“cu-v環(huán)烷基”指具有u至v個碳原子作為環(huán)成員的環(huán)烷基。

“雜環(huán)”或“雜環(huán)的”或“雜環(huán)基(heterocyclo)”或“雜環(huán)烷基”或“雜環(huán)基(heterocyclyl)”指具有總計3至18個環(huán)原子、1至14個碳原子及1至6個選自氮、硫或氧的雜原子的飽和或部分飽和環(huán)狀基團，且包括單環(huán)及多環(huán)系統(tǒng)，包括稠合、橋連及螺環(huán)系統(tǒng)。對于具有芳族和/或非芳族環(huán)的多環(huán)系統(tǒng)，當存在至少一個環(huán)雜原子且連接點在非芳族環(huán)的原子處(例如1，2，3，4-四氫喹啉-3-基、5，6，7，8-四氫喹啉-6-基及十氫喹啉-6-基)時，應(yīng)用術(shù)語“雜環(huán)的”或“雜環(huán)”或“雜環(huán)基(heterocyclo)”或“雜環(huán)烷基”或“雜環(huán)基(heterocyclyl)”。在一個實施方式中，雜環(huán)基的氮和/或硫原子(一個或多個)任選地被氧化以提供n-氧化物、亞磺?；蚧酋；糠?。更確切而言，雜環(huán)基包括但不限于四氫吡喃基、哌啶基、n-甲基哌啶-3-基、哌嗪基、n-甲基吡咯啶-3-基、3-吡咯烷基、2-吡咯烷酮酰-1-基(2-pyrrolidon-1-yl)、嗎啉基及吡咯烷基。指示碳原子數(shù)目的前綴(例如c3-c10)指雜環(huán)基部分中除雜原子數(shù)目以外的碳原子總數(shù)。

取代的烷基、亞烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)指分別具有1至5或1至3個并未實質(zhì)上干擾化合物的抗癌活性的取代基的烷基、亞烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)。烷基上取代基的實例包括-oh、-nh2、-no2、-cn、-cooh、鹵基(halo)、鹵烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、-or^a、氧代(＝o)、-o-cor^a、-cor^a、-so3h、-nhr^a、-nr^ar^b、-coor^a、-cho、-conh2、-conhr^a、-conr^ar^b、-nhcor^a、-nr^ccor^a、-nhconh2、-nhconr^ah、-nhconr^ar^b、-nr^cconh2、-nr^cconr^ah、-nr^cconr^ar^b、-c(＝nh)-nh2、-c(＝nh)-nhr^a、-c(＝nh)-nr^ar^b、-c(＝nr^c)-nh2、-c(＝nr^c)-nhr^a、-c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nh-c(＝nh)-nh2、-nh-c(＝nh)-nhr^a、-nh-c(＝nh)-nr^ar^b、-nh-c(＝nr^c)-nh2、-nh-c(＝nr^c)-nhr^a、-nh-c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nr^d-c(＝nh)-nh2、-nr^d-c(＝nh)-nhr^a、-nr^d-c(＝nh)-nr^ar^b、-nr^d-c(＝nr^c)-nh2、-nr^d-c(＝nr^c)-nhr^a、-nr^d-c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nhnh2、-nhnhr^a、-nhnr^ar^b、-so2nh2、-so2nhr^a、-so2nr^ar^b、-ch＝chr^a、-ch＝cr^ar^b、-cr^c＝cr^ar^b、-cr^c＝chr^a、-cr^c＝cr^ar^b、-ccr^a、-sh、-sr^a、-s(o)r^a、-s(o)2r^a及-co-烷基，其中r^a、r^b、r^c及r^d獨立地為烷基、鹵烷基、環(huán)烷基、苯基或芐基。在一些實施方式中，取代基(一個或多個)選自-oh、鹵基、苯基、芐基、吡啶基及c1-c8烷氧基。在一些實施方式中，取代基(一個或多個)選自-oh、鹵基及c1-c4烷氧基。亞烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基團上取代基的實例包括-oh、-nh2、-no2、-cn、-cooh、鹵基、鹵烷基、烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、氧代(＝o)、-or^a、-o-cor^a、-cor^a、-so3h、-nhr^a、-nr^ar^b、-coor^a、-cho、-conh2、-conhr^a、-conr^ar^b、-nhcor^a、-nr^ccor^a、-nhconh2、-nhconr^ah、-nhconr^ar^b、-nr^cconh2、-nr^cconr^ah、-nr^cconr^ar^b、-c(＝nh)-nh2、-c(＝nh)-nhr^a、-c(＝nh)-nr^ar^b、-c(＝nr^c)-nh2、-c(＝nr^c)-nhr^a、-c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nh-c(＝nh)-nh2、-nh-c(＝nh)-nhr^a、-nh-c(＝nh)-nr^ar^b、-nh-c(＝nr^c)-nh2、-nh-c(＝nr^c)-nhr^a、-nh-c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nr^d-c(＝nh)-nh2、-nr^d-c(＝nh)-nhr^a、-nr^d-c(＝nh)-nr^ar^b、-nr^d-c(＝nr^c)-nh2、-nr^d-c(＝nr^c)-nhr^a、-nr^d-c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nhnh2、-nhnhr^a、-nhr^ar^b、-so2nh2、-so2nhr^a、-so2nr^ar^b、-ch＝chr^a、-ch＝cr^ar^b、-cr^c＝cr^ar^b、-cr^c＝chr^a、-cr^c＝cr^ar^b、-ccr^a、-sh、-sr^a、-s(o)r^a、-s(o)2r^a及-co-烷基，其中r^a、r^b、r^c及r^d獨立地為烷基、鹵烷基、環(huán)烷基、苯基或芐基。在一些實施方式中，取代基(一個或多個)選自-oh、鹵基、c1-c4烷基、苯基、芐基、吡啶基及c1-c8烷氧基。在一些實施方式中，取代基(一個或多個)選自-oh、c1-c4烷基、鹵基及c1-c4烷氧基。

“芳基”指具有6至14個碳原子且無環(huán)雜原子且具有單個環(huán)(例如苯基)或多個縮合(稠合)環(huán)(例如萘基或蒽基)的芳族基。對于多環(huán)系統(tǒng)，包括具有不含環(huán)雜原子的芳族及非芳族環(huán)的稠合、橋連及螺環(huán)系統(tǒng)，當連接點在芳族碳原子處時，應(yīng)用術(shù)語“芳基”或“ar”。例如，5，6，7，8四氫萘-2-基為芳基，其連接點在芳族苯環(huán)的2-位置處。

“取代的芳基”指用1至8，或在一些實施方式中1至5，1至3或1至2個選自以下的取代基取代的芳基：-oh、氧代(＝o)、-nh2、-no2、-cn、-cooh、鹵基、鹵烷基、烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、-or^a、-o-cor^a、-cor^a、-cooh、-so3h、-nhr^a、-nr^ar^b、-coor^a、-cho、-conh2、-conhr^a、-conr^ar^b、-nhcor^a、-nr^ccor^a、-nhconh2、-nhconr^ah、-nhconr^ar^b、-nr^cconh2、-nr^cconr^ah、-nr^cconr^ar^b、-c(＝nh)-nh2、-c(＝nh)-nhr^a、-c(＝nh)-nr^ar^b、-c(＝nr^c)-nh2、-c(＝nr^c)-nhr^a、-c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nh-c(＝nh)-nh2、-nh-c(＝nh)-nhr^a、-nh-c(＝nh)-nr^ar^b、-nh-c(＝nr^c)-nh2、-nh-c(＝nr^c)-nhr^a、-nh-c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nr^d-c(＝nh)-nh2、-nr^d-c(＝nh)-nhr^a、-nr^d-c(＝nh)-nr^ar^b、-nr^d-c(＝nr^c)-nh2、-nr^d-c(＝nr^c)-nhr^a、-nr^d_c(＝nr^c)-nr^ar^b、-nhnh2、-nhnhr^a、-nhr^arb、-so2nh2、-so2nhr^a、-so2nr^ar^b、-ch＝chr^a、-ch＝cr^ar^b、-cr^c＝cr^ar^b、-cr^c＝chr^a、-cr^c＝cr^ar^b、-ccr^a、-sh、-sr^a、-s(o)r^a、-s(o)2r^a及-co-烷基，其中r^a、r^b、r^c及r^d獨立地為烷基、環(huán)烷基、苯基或芐基。在一些實施方式中，取代基(一個或多個)選自-oh、鹵基、c1-c4烷基、苯基、芐基、吡啶基及c1-c8烷氧基。在一些實施方式中，取代基(一個或多個)選自-oh、c1-c4烷基、鹵基及c1-c4烷氧基。

“鹵烷基”指用1至5或1至3個鹵基取代的烷基。

“烷氧基”指基團-o-烷基，其中烷基如本文所定義?！叭〈耐檠趸敝?o-(取代的烷基)。

“鹵代烷氧基”指基團-o-鹵烷基，其中鹵烷基如本文所定義。

“鹵基”指-f、-cl、-br或-i。

“雜芳基”指示具有1至14個碳原子及1至6個選自氧、氮及硫的雜原子的芳族基，且包括5至18元環(huán)或環(huán)系統(tǒng)——包括單個環(huán)(例如咪唑基)或多個環(huán)(例如苯并咪唑-2-基及苯并咪唑-6-基)。對于多環(huán)系統(tǒng)，包括具有芳族及非芳族環(huán)的稠合、橋連及螺環(huán)系統(tǒng)，若存在至少一個環(huán)雜原子且連接點在芳環(huán)的原子處(例如1，2，3，4-四氫喹啉-6-基及5，6，7，8-四氫喹啉-3-基)，則應(yīng)用術(shù)語“雜芳基”。在一個實施方式中，雜芳基的氮和/或硫環(huán)原子(一個或多個)任選地被氧化以提供n-氧化物(n→o)、亞磺?；蚧酋；糠?。在一些實施方式中，雜芳基包含總共5、6或7個環(huán)原子，且分別稱為5元、6元或7元雜芳基。雜芳基的實例包括但不限于吡啶基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、異噻唑基、三唑基、咪唑基、異唑基、吡咯基、吡唑基、噠嗪基、嘧啶基、苯并呋喃基、四氫苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并三唑基、吲哚基、異吲哚基、苯并唑基、喹啉基、四氫喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、苯并咪唑基、苯并異唑基或苯并噻吩基。

“小規(guī)模方案”指示例在macdiarmid等人(2007)中的程序，其中細菌衍生的囊泡，諸如微細胞裝載有緩沖液體(典型地pbs緩沖液)中的治療有效負載，該緩沖液體積數(shù)量級為毫升，例如1至2ml，其后裝載的微細胞經(jīng)多個洗滌步驟，涉及離心、上清液丟棄及微細胞再懸浮，同樣在毫升體積的緩沖液體中進行。

相比之下，“大規(guī)模方法”指本發(fā)明的方法，其中裝載的微細胞經(jīng)多個(例如3至5個)洗滌步驟，其中利用每步驟體積數(shù)量級為幾十升(例如約20升)的適用于細胞生物學(xué)研究的pbs緩沖液或其它緩沖液體，諸如hepes緩沖鹽水、硼酸鹽緩沖鹽水及tris緩沖鹽水，進行交叉流過濾(無離心)。另外，對于大規(guī)模方法，使微細胞裝載有治療有效負載(諸如小分子藥物)的步驟在一定體積的緩沖液體(其優(yōu)選約100毫升或更大數(shù)量級)中進行，其中緩沖液體，諸如pbs緩沖液任選地具有約200mm或更大數(shù)量級的二元離子化合物(諸如kcl)的濃度。

詞組“醫(yī)藥級”指示不具有親代細胞污染、細胞碎片、游離內(nèi)毒素及其它熱原，足以符合人類靜脈內(nèi)施用的管理要求。參見例如美國食品藥物管理局(u.s.foodanddrugadministration)的“工業(yè)熱原及內(nèi)毒素測試指南(guidanceforindustry-pyrogenandendotoxinstesting)”(2012年6月)。

“化合物的殘基”指示通過從化合物移除原子或部分，諸如氫原子、。oh或-co-ch3基團獲得的部分。因此，在一些實施方式中，化合物的殘基為通過從化合物移除氫原子獲得的部分。

“取代的雜芳基”指用1至8或在一些實施方式中1至5、或1至3、或1至2個選自針對取代的芳基所定義的取代基的取代基取代的雜芳基。

“立體異構(gòu)體”指示不同之處在于一或多個立體中心的手性的化合物(一個或多個)。立體異構(gòu)體包括對映異構(gòu)體及非對映異構(gòu)體。若本發(fā)明化合物具有一或多個不對稱中心或具有不對稱取代的雙鍵，則其可以立體異構(gòu)形式存在，且因此，可作為個別立體異構(gòu)體或混合物產(chǎn)生。除非另外指明，否則該描述意欲包括個別立體異構(gòu)體以及混合物。用于立體異構(gòu)體的立體化學(xué)測定及分離的方法是熟知的，如march′sadvancedorganicchemistry，第7版(wiley，2013)的第4章中的討論所證明。

“互變異構(gòu)體”指質(zhì)子位置不同的化合物的替代形式，諸如烯醇-酮基及亞胺-烯胺互變異構(gòu)體，或含有連接至環(huán)-nh-部分與環(huán)＝n-部分的環(huán)原子的雜芳基的互變異構(gòu)形式，諸如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑及四唑。同理，本文中提及“化合物”同樣包括其互變異構(gòu)體。

“藥學(xué)上可接受的鹽”指衍生自本領(lǐng)域中熟知的多種有機及無機反離子的藥學(xué)上可接受的鹽，且包括例如鈉、鉀、鈣、鎂、銨及四烷基銨。當分子含有堿性官能性時，有機或無機酸的酸加成鹽，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似；或用諸如以下的有機酸形成：乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥苯甲?；?苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、草酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、甲磺酸、4-甲基雙環(huán)[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸及其類似者。鹽也可當母體化合物中所存在的酸性質(zhì)子被金屬離子如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子置換；或與有機堿如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、n-甲基葡糖胺及其類似者配位時形成。藥學(xué)上可接受的鹽適用于在患者體內(nèi)施用且具有合乎需要的藥理學(xué)特性。適合的鹽進一步包括handbookofpharmaceuticalsalts：properties，selection，anduse，第2版(wiley，2011)中所描述的那些鹽。

在本說明書中“有效負載”識別或限定待裝載或已裝載至微細胞中以用于遞送至靶宿主細胞的生物活性材料。

(b)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)及其驚人本質(zhì)

如所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，熒光本身大大增加小分子化合物至完整無生命細菌囊泡中的裝載效率。例如，以下實例表明可將未經(jīng)修飾的紫杉醇封裝至微細胞中以達到每個微細胞2，115個拷貝(分子)的濃度(實施例9)，且同時紫杉醇的水可溶衍生物tf.pac可達到每個微細胞50,000個拷貝(實施例10)，均通過與微細胞一起共同溫育。相比之下，可將紫杉醇、flutax-1及fitc結(jié)合的紫杉醇(fcp)的兩種熒光衍生物均裝載至微細胞中以達到每個微細胞270,000個拷貝(實施例2)及230,000個拷貝(實施例4)的高濃度。相對于通過未經(jīng)修飾(未衍生化)的非熒光化合物達到的濃度，這些濃度分別高127倍及109倍。

預(yù)期較大分子通常將比較小分子更難裝載至囊泡中，因為據(jù)認為裝載方法需要運送通過膜通道，其中尺寸將影響移動。然而，盡管fcp(分子量：1455.6道爾頓)遠大于紫杉醇(分子量：853.9道爾頓)，但是熒光衍生物可達到比紫杉醇自身高109倍的囊泡內(nèi)濃度。出于此原因，本發(fā)明人在此方面的發(fā)現(xiàn)也是非常驚人的。

可能歸因于除其(自發(fā))熒光特性外的小尺寸優(yōu)勢，多柔比星及米托蒽醌分別達到每個微細胞約800,000個拷貝(實施例6)及759,000個拷貝(實施例12)。熒光化合物baclight^tmgreen染料(實施例5)、syto9(實施例7)及9-aahh(實施例8)也展現(xiàn)高裝載效率。

紫杉醇、紫杉醇oregon的又一個熒光結(jié)合物同樣達到如此高的濃度(實施例3)。同樣地以高效率將長春堿的熒光衍生物fl裝載至微細胞中，如實施例1所表明。利用未經(jīng)修飾的長春堿進行此類裝載是不可能的，該事實從上述macdiarmid等人(2007)的使用fl結(jié)合的長春堿以及oregon488結(jié)合的紫杉醇以通過熒光顯微鏡檢查證明用藥物裝載微細胞的公開內(nèi)容是不明顯的。參見macdiarmid等人(2007)第432頁(圖例)的圖1(e)及(f)。

本發(fā)明的另一驚人的方面為熒光化合物的高裝載效率似乎與給定化合物的親水性或疏水性無關(guān)。例如，紫杉醇為疏水性的，而tf.pac及fcp均為水溶性的，但是fcp的裝載效率又比tf.pac的裝載效率大5倍。

化合物上熒光部分的結(jié)合點似乎不影響通過本發(fā)明實現(xiàn)的裝載效率。因此，fcp及flutax-1具有相同熒光素熒光團，但對于fcp，其連接在c2’位置處，而非如flutax-1中的c7位置處。又在最終微細胞內(nèi)化合物濃度方面，兩種衍生物實現(xiàn)類似裝載效率。

此外，實施例11說明，通過葉酸淬滅多柔比星熒光以劑量依賴性方式降低多柔比星至微細胞中的裝載效率。依照本發(fā)明，此現(xiàn)象進一步突顯了熒光本身在增強化合物裝載至微細胞中方面的作用。

據(jù)本發(fā)明人所知，還沒有通過熒光因而對化學(xué)化合物的運輸或移動，尤其跨越細胞膜的移動產(chǎn)生影響的報導(dǎo)。此類影響，如本發(fā)明人所證明，可歸因于熒光化合物與跨膜通道中或沿跨膜通道排列的某些分子之間的能量轉(zhuǎn)移，其增強化合物移動通過通道。相比于非熒光化合物，熒光化合物含有例如通過電磁輻射更易于激發(fā)的電子。據(jù)認為，此類激發(fā)有助于熒光化合物與一些微細胞跨膜通道結(jié)構(gòu)(一個或多個)之間的能量轉(zhuǎn)移，使得化合物在通道中更快速移動，以及所裝載的化合物的量增加。

根據(jù)本發(fā)明的裝載方法需要濃度梯度，即，細胞外高于細胞內(nèi)的化合物濃度。然而，如所述，熒光化合物的參與導(dǎo)致裝載速率及囊泡內(nèi)濃度大于可常規(guī)地在單獨濃度梯度方面解釋的濃度。因此，當至微細胞中的裝載針對熒光化合物進行時，化合物的細胞內(nèi)濃度提高且隨后超越細胞外濃度，且化合物持續(xù)移動至微細胞中直至達到實際飽和度。培養(yǎng)基中離子的存使熒光介導(dǎo)的完整的細菌衍生的囊泡的裝載增強成為可能，如實施例13所說明，同樣地不是濃度梯度的明顯功能。

另外，未告知關(guān)于制備含有醫(yī)藥級微細胞及殺死的細菌細胞的組合物的常規(guī)思想，且確實未考慮在macdiarmid等人(2007)所說明的小規(guī)模方案的情況下發(fā)生的裝載化合物在囊泡表面上的截留。本發(fā)明人關(guān)于截留問題的發(fā)現(xiàn)揭露迄今未認識到的變量——表面截留化合物的瀝濾(參見實施例14)，其可能影響通過施用含有微細胞或殺死的細菌細胞的組合物遞送的有效負載化合物的有效劑量，根據(jù)以下部分(i)。也在實施例14中說明的本發(fā)明的大規(guī)模方法允許通過緩解或甚至消除截留問題來控制此變量。

上文所描述的這些發(fā)現(xiàn)及其它發(fā)現(xiàn)涉及完整的細菌衍生的微細胞，但其易于外推至殺死的細菌細胞。這是因為此兩種類型的無生命細菌囊泡的不同之處主要在于尺寸及存在或不存在細菌染色體。兩種區(qū)別均被認為與化合物的裝載效率無關(guān)，化合物的裝載效率主要為細菌膜的功能(兩種類型細菌囊泡共有的特征)。

在這方面，本發(fā)明人的出人意料的發(fā)現(xiàn)不僅強調(diào)在此所描述的針對將小分子化合物裝載至完整無生命細菌囊泡中的方法的驚人本質(zhì)而且也強調(diào)根據(jù)本發(fā)明使用其的相關(guān)組合物及方法的驚人本質(zhì)。

(c)將熒光化合物裝載至完整的細菌衍生的囊泡中

因此，提供包括完整無生命細菌囊泡的組合物，該囊泡封入呈現(xiàn)熒光的化合物。熒光為(a)固有的(自發(fā)熒光)或(b)非固有的，即，借助于如下文所定義的預(yù)先化學(xué)引入的能量轉(zhuǎn)移部分的熒光。

自發(fā)熒光化合物的子類別(a)原則上涵蓋如下文所定義的在曝露于某一波長的電磁輻射后固有地呈現(xiàn)熒光，但典型地不一定在視覺光譜中的任何小分子化合物。根據(jù)其方法學(xué)方面，涉及子類別(a)的本發(fā)明涵蓋借助于如上文所定義的大規(guī)模方法將任何自發(fā)熒光化合物裝載至完整的細菌衍生的囊泡(包括微細胞或殺死的細菌細胞)中。根據(jù)其組成方面，涉及子類別(a)的本發(fā)明涵蓋包含完整的細菌衍生的囊泡的組合物，所述囊泡含有自發(fā)熒光化合物，其不包括以下化合物(先前公開，而未提及或暗示目前描述的熒光對囊泡裝載的影響)中的任一或多個或所有的子類別(a)：多柔比星(激發(fā)480nm，發(fā)射580nm)；伊立替康——喜樹堿的半合成類似物，激發(fā)最大值為約360nm且發(fā)射最大值為約440nm；比山群(激發(fā)，410nm；發(fā)射，517nm)；托泊替康(激發(fā)，382nm；發(fā)射，523nm)；表柔比星(激發(fā)，474nm；發(fā)射，551nm)；柔紅霉素(激發(fā)，488nm；發(fā)射，575nm)；及米托蒽醌(激發(fā)，610及660nm；發(fā)射，684nm)。

包含在本發(fā)明的組成方面下的其余自發(fā)熒光小分子化合物的說明性實例為：達內(nèi)霉素a，天然環(huán)狀烯二炔以及達內(nèi)霉素a的熒光類似物(參見美國專利第5,281,710號，其內(nèi)容在此以引用的方式并入)；吖啶橙，激發(fā)最大值為502nm且發(fā)射最大值為525nm(綠色)；和喜樹堿，天然生物堿，激發(fā)最大值為360nm且發(fā)射最大值為440nm。同樣地，說明性實例為在國際專利申請wo1998/002446中所描述的嗎啉基蒽環(huán)類衍生物類別中的固有熒光化合物。在此類衍生物中有奈莫柔比星(nemombicin)(3′-脫氨基-3’-[2(s)-甲氧基-4-嗎啉基]多柔比星)、a/k/ammdx及其主要代謝物pnu-159682(3′-脫氨基-3″-4′-脫水-[2″(s)-甲氧基-3”(r)-羥基-4″-嗎啉基]多柔比星)，其結(jié)構(gòu)式下面示出；以及內(nèi)容在此以引用的方式并入的美國專利第8,470,984號中所描述的這四種其它此類衍生物：3′-脫氨基-3″-4’-脫水-[2″(s)-甲氧基-3”(r)-羥基-4″-嗎啉基]伊達比星；3′-脫氨基-3″-4’-脫水-[2”(s)-甲氧基-3″(r)-羥基-4”-嗎啉基]柔紅霉素；3′-脫氨基-3″-4’-脫水-[2”(s)-甲氧基-3″(r)-羥基-4″-嗎啉基-洋紅霉素(caminomycin)；及3’-脫氨基-3″-4’-脫水-[2”(s)-乙氧基-3”(r)-羥基-4”-嗎啉基]多柔比星。

依照本發(fā)明，前述衍生物中的任一者的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽也是此群組自發(fā)熒光嗎啉基蒽環(huán)類衍生物的成員。

非固有熒光化合物的子類別(b)涵蓋下文所定義的尤其包含(i)活性成分或部分及(ii)能量轉(zhuǎn)移部分的任何化合物?；钚猿煞挚蔀樗幬锘蛩幬锏幕钚圆糠郑ㄟ^衍生化反應(yīng)向其添加能量轉(zhuǎn)移部分。結(jié)果可為結(jié)合物，其中衍生化反應(yīng)的產(chǎn)物因而在具有或不具有連接體的情況下將接合的藥物或其活性部分并入至能量轉(zhuǎn)移部分；或它可為結(jié)構(gòu)類似物，其中反應(yīng)產(chǎn)物表現(xiàn)與藥物或其活性部分的結(jié)構(gòu)類似性，但不同之處在于藥物或活性部分中一個或多個原子、官能基或子結(jié)構(gòu)用結(jié)構(gòu)類似物中的其它原子、基團或子結(jié)構(gòu)置換。

根據(jù)其方法學(xué)方面，涉及子類別(b)的本發(fā)明考慮借助于大規(guī)模方法將任何非固有熒光化合物裝載至完整的細菌衍生的囊泡(包括微細胞或殺死的細菌細胞)中。根據(jù)其組成方面，涉及子類別(b)的本發(fā)明涵蓋包含完整的細菌衍生的囊泡的組合物，所述囊泡含有選自子類別(b)的非固有熒光化合物，其不包括其中成分微細胞由含有oregon488結(jié)合的紫杉醇或fl結(jié)合的長春堿的那些組成的含有微細胞的組合物。此類排除的含有微細胞的組合物由上述macdiarmid等人(2007)公開，而未提及或暗示目前描述的熒光對化合物跨膜移動至此類囊泡中的影響。

上文所提及的結(jié)構(gòu)類似物的說明性實例為多卡米星的熒光開環(huán)類似物——細胞毒性抗生素，如tietze等人，chemistry&diversity9∶2559-70(2012)所描述。通過涉及某些香豆素羧酸的反應(yīng)流程，藥物的三甲氧基吲哚部分及(二甲氨基)乙氧基吲哚部分由熒光分子(其如同置換部分，與dna相互作用)置換。同樣地，在本說明書內(nèi)的結(jié)構(gòu)類似物的示例為藥物依地福新的熒光類似物(1-o-十八烷基-2-o-甲基-rac-甘油-3-磷酸膽堿)，其如mollinedo等人，celldeath&dis.2：e158(2011)中所描述，保存藥物的促凋亡活性。也參見gajate等人，oncogene31：2627-39(2012)。

在其中采用熒光結(jié)合物的實施方式中，連接體可具有一定半衰期以使得當將化合物裝載至囊泡中時或當一定時期已過去或在其后時間范圍內(nèi)時(參見下文)，連接體降解，以釋放非固有熒光結(jié)合物的活性成分?？蛇x地，連接體基團在靶細胞內(nèi)可為不穩(wěn)定的。即，連接體可經(jīng)歷熱、ph依賴性、化學(xué)(例如水解)或酶裂解，于是在攝取后將活性成分釋放至細胞中。例如，在抗體-藥物結(jié)合物的情形下已發(fā)展此類不穩(wěn)定連接體且其易于調(diào)適用于本發(fā)明中。參見ducryandstump，bioconjugatechem.21：5-13(2010)，加上下文其它論述。

上文所提及的“能量轉(zhuǎn)移部分”為在通過適當波長電磁輻射激發(fā)后將能量轉(zhuǎn)移至附近能量受體的基團?！斑m當?shù)摹辈ㄩL為激發(fā)能量轉(zhuǎn)移部分中的電子以使得其進入能階的電磁輻射的任何波長，其中在弛豫后，電子自能量轉(zhuǎn)移部分釋放或使得電磁輻射自能量轉(zhuǎn)移部分釋放。

說明性能量轉(zhuǎn)移部分為具有共軛pi電子系統(tǒng)的基團。共軛pi系統(tǒng)包括例如多個雙鍵的配位、多個芳族基團的配位、雙鍵與芳族基團的配位、雜環(huán)芳族基團的配位及其類似物。說明性能量轉(zhuǎn)移部分為吖啶基、呫噸基、蒽基、苯并咪唑基、菲基(phenanthrenylgroup)、吡啶基、喹啉基及卟啉基(porphorinylgroup)。

與本發(fā)明一致，據(jù)認為能量轉(zhuǎn)移達到的能量受體與無生命細菌囊泡的一或多個跨膜結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。根據(jù)此觀點，當由能量轉(zhuǎn)移部分實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移時，隨后跨膜結(jié)構(gòu)(一個或多個)接收所傳遞的能量，無論通過電子或光的發(fā)射。

下文論述適用于裝載至根據(jù)本發(fā)明的完整無生命細菌囊泡中的不同類型的化合物(只要其為自發(fā)熒光或非固有熒光的)。這些化合物包括但不限于生物活性化合物的類別及化學(xué)治療化合物，尤其小分子化學(xué)治療化合物的子類別。

多種生物活性化合物并不是熒光的。本發(fā)明涉及用于提供給定化合物(其是熒光的)的修飾的(衍生的)形式的途徑，其用于將此類化合物裝載至完整無生命細菌囊泡中，且通過此類囊泡，隨后將其引入靶哺乳動物細胞中。盡管大多數(shù)分子尺寸將小于約900道爾頓，但連接熒光分子或改變藥物的結(jié)構(gòu)以增強藥物至微細胞中的裝載可能將其分子量提高至約1500道爾頓。

在一個方面中，本發(fā)明考慮將生物活性但非熒光化合物與熒光部分結(jié)合以形成具有下式的“修飾的化合物”：

d-l-f，

或其鹽，其中：

d為化合物或其活性成分，

l為連接體，和

f為熒光部分。

依照本發(fā)明，此類熒光修飾的化合物可在允許修飾的化合物進入囊泡的條件下與完整無生命細菌囊泡一起溫育。

連接體l可為在一定時期之后或在某些條件下使得化合物或活性成分d自熒光部分f釋放。例如，如上文所指出，連接體在囊泡中可具有一定半衰期以使得連接體在裝載修飾的化合物之后某時降解以在囊泡內(nèi)釋放d?？蛇x地，連接體l在囊泡內(nèi)部可以是穩(wěn)定的但在哺乳動物細胞的內(nèi)體或溶酶體中為不穩(wěn)定的。即，在被靶哺乳動物細胞攝取且曝露于內(nèi)體或溶酶體區(qū)室內(nèi)的環(huán)境后，連接體在環(huán)境因素，諸如ph或酶作用的影響下降解，以在內(nèi)體或溶酶體中釋放活性成分。此類連接體的實例提供在以下部分g中。

根據(jù)相關(guān)方面，修飾的化合物不具有未經(jīng)修飾的化合物的生物活性且在囊泡內(nèi)部保持那種“非活性”狀態(tài)。連接體在內(nèi)體或溶酶體中的降解使得活性形式或種類，即，活性成分d釋放。

更一般而言，熒光部分可在部分或完全抑制生物活性化合物的活性的位置處連接至生物活性化合物。生物活性化合物典型地具有對于生物活性而言重要的一或多個外部反應(yīng)性基團。這些反應(yīng)性基團的化學(xué)修飾或衍生化可能降低或甚至消除化合物的生物活性。此通過以下實例中所論述的某些修飾的化合物說明，其并未具有與對應(yīng)未經(jīng)修飾的化合物相關(guān)的生物活性。

在本發(fā)明技術(shù)的情況下，如下文部分(e)下所定義的小分子化合物的分子重量連續(xù)光譜上的甚至較高分子量化合物可有效地裝載至完整的細菌衍生的囊泡中。因此，修飾的化合物的分子量可為至少約1000道爾頓，或可選地至少約1100、1200、1300、1400或1500道爾頓。

在上文所描述的方法及組合物中的任一者的情形下，化合物或修飾的化合物可為疏水性的，而在另一方面中為親水性的。在又一方面中，化合物或修飾的化合物為水可溶的。

沿著類似線索，本發(fā)明在一個方面中提供包含呈微細胞和/或殺死的細菌細胞形式的完整的細菌衍生的囊泡及式d-l-f化合物或其鹽的組合物，其中d為諸如藥物的非熒光小分子化合物的殘基，l為連接體，且f為熒光部分。該組合物為有用的，尤其因為以下事實：通過未經(jīng)修飾的小分子化合物的實例促進化合物裝載至囊泡中。

根據(jù)一個方面，本說明書的細菌囊泡為完整的細菌衍生的微細胞?？紤]到本發(fā)明裝載方法的高效率，各此類囊泡(即，微細胞)可封裝有化合物的至少約100,000個拷貝。更特定而言，各微細胞可封裝有化合物的至少約200,000個拷貝，可選地至少約300,000、約400,000、約500,000、約600,000、約700,000、約800,000、約900,000或約100萬個拷貝。

在一個方面中，微細胞封入每10⁹個微細胞至少約200ng，或至少300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng或1,000ng的給定熒光化合物或熒光化合物的組合。相比之下，每10⁹個微細胞所裝載的可比非熒光化合物的量典型地為較小的數(shù)量級，即，數(shù)量級為幾十納克。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，完整無生命囊泡為殺死的細菌細胞。與上文描述一致，給定殺死的細菌細胞的容量比微細胞的容量大約3-4倍。因此，殺死的細菌細胞可封裝修飾的化合物的至少約400,000個拷貝。更特定而言，各殺死的細菌細胞可封裝有化合物的至少約800,000個拷貝，或可選地至少約1,200,000、約1,600,000、約2,000,000、約2,400,000、約2,800,000、約3,200,000、約3,600,000或約400萬個拷貝。

此類殺死的細菌細胞可每10⁹個殺死的細胞封入至少約800ng，或至少1,200ng、1,600ng、2,000ng、2,400ng、2,800ng、3,200ng、3,600ng或4,000ng的化合物。

(d)完整的細菌衍生的囊泡

詞組“完整的細菌衍生的囊泡”及“完整的無生命細菌囊泡”同義地指細菌細胞的囊泡衍生物，包括殺死的細菌細胞及細菌微細胞，其無法再生且其不能主動地啟動進入哺乳動物細胞中。在此情形下，“完整”意謂細胞包膜，即，質(zhì)膜及周圍細胞壁(其包括圍繞單層細胞壁的多個層(對于源自革蘭氏陽性細菌細胞的囊泡)或雙層外部膜(對于源自革蘭氏陰性細菌細胞的囊泡))的規(guī)則連續(xù)性及結(jié)構(gòu)完整性。參見bergey′smanualofsystematicbiology，第2版(springer，2012)。

因此，詞組“完整的殺死的細菌細胞”指示細菌、藍細菌、真細菌或古細菌的完整無生命原核細胞，其具有完整細胞包膜且含有細菌物種內(nèi)源的遺傳物質(zhì)(核酸)。同上。對于醫(yī)藥用途，將殺死的細菌細胞的組合物盡可能徹底地與免疫原性組分及其它有毒污染物分離。用于純化殺死的完整細菌細胞的方法描述于美國專利第8,591,862號中，其相關(guān)內(nèi)容在此以引用的方式并入。簡言之，可通過抗生素殺死活細菌細胞，繼而移除細胞碎片及游離內(nèi)毒素。

“微細胞”指細菌細胞的衍生物，其缺乏染色體(“無染色體”)且是由二分裂期間細胞分裂與dna分離的協(xié)調(diào)失調(diào)所產(chǎn)生。微細胞不同于其它小囊泡，諸如所謂“膜泡”(尺寸約為0.2μm或以下)，其在某些情形下自發(fā)地產(chǎn)生及釋放，但其并不歸因于特異基因重排或游離基因表達。同樣地，完整微細胞不同于細菌鬼影(ghosts)，其并不因特異基因重排或游離基因表達而產(chǎn)生。

本發(fā)明中所采用的細菌衍生的微細胞為完全完整的，如上文所討論，且因此區(qū)別于以外膜或界定膜破碎或降解、甚至移除為特征的其它無染色體形式的細菌細胞衍生物。參見美國專利第7,183,105號第111欄第54行及以下。表征本發(fā)明微細胞的完整膜允許治療有效負載在微細胞內(nèi)保留直至攝取后在腫瘤細胞內(nèi)釋放該有效負載。

根據(jù)本發(fā)明所采用的微細胞可由諸如大腸桿菌及鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞制備。原核染色體復(fù)制與正常二分裂相聯(lián)，其涉及細胞中隔(mid-cellseptum)形成。在大腸桿菌中，例如min基因(諸如mincd)的突變可移除細胞分裂期間在細胞極對隔膜形成的抑制，導(dǎo)致正常子細胞及少染色體微細胞產(chǎn)生。參見boer等人，j.bacteriol.174：63-70(1992)；raskinanddeboer，j.bacteriol.181：6419-24(1999)；huandlutkenhaus，mol.microbiol.34：82-90(1999)；和harry，mol.microbiol.40：795-803(2001)。

除min操縱子突變以外，少染色體微細胞在影響隔膜形成的一系列其它基因重排或突變后產(chǎn)生，例如在枯草桿菌中的divivb1中。參見reeveandcornett，j.virol.15：1308-16(1975)。微細胞也可在參與細胞分裂/染色體分離的蛋白質(zhì)的基因表達水平擾動后形成。例如，mine的過度表達導(dǎo)致極性分裂且微細胞產(chǎn)生。類似地，少染色體微細胞可由染色體分離缺陷產(chǎn)生，例如枯草桿菌中的smc突變(britton等人，genesdev.12∶1254-59(1998))、枯草桿菌中的spooj缺失(ireton等人，j.bacteriol.176：5320-29(1994))、大腸桿菌中的mukb突變(hiraga等人，j.bacteriol.171：1496-1505(1989))及大腸桿菌中的parc突變(stewartandd’ari，j.bacteriol.174：4513-51(1992))。此外，cafa可增強細胞分裂速率和/或抑制復(fù)制后的染色體分配(okada等人，j.bacteriol.176：917-22(1994))，導(dǎo)致鏈狀細胞及少染色體微細胞形成。

min系統(tǒng)存在于大多數(shù)細菌物種中，參見barak，frontiersinmicrobiology4：art.378(2013)，而在其它細菌，諸如新月柄桿菌(caulobactercrescentus)中，已進化出另一機制以控制分裂隔膜的放置，可操控該機制以通過不等分裂產(chǎn)生微細胞。因此，針對本發(fā)明，可由革蘭氏陽性或革蘭氏陰性來源的任何細菌細胞制備微細胞。此外，用于本發(fā)明中的微細胞應(yīng)具有完整細胞壁(即，為“完整微細胞”)，如上文所指出，且應(yīng)區(qū)別于其它小囊泡(諸如膜泡)且與其分離，其并不由特異基因重排或游離基因表達引起。

在給定實施方式中，微細胞的親本(源)細菌可為革蘭氏陽性或其可為革蘭氏陰性的，如所提及的。因此，親本細菌可選自例如以下分類群中的任何一或多者：地桿菌屬(terrabacteria)(bv1)，其包括革蘭氏陽性門(放線菌門(actinobacteria)及硬壁菌門(firmicutes))等；變形菌門(proteobacteria)(bv2)，其為所有成員均為革蘭氏陰性的一門；及類別bv4，其包括螺旋體門(spirochaetes)、鞘脂桿菌門(sphingobacteria)及浮游細菌門(planctobacteda)以及其它革蘭氏陰性細菌，諸如酸桿菌門(acidobacteria)。

因此，依照一個方面，制備殺死的細菌細胞或微細胞的細菌選自以下分類群中的一或多者：硬壁菌門(bv3)，諸如桿菌綱(bacilli)、梭菌綱(clostridia)及無壁菌門(tenericutes)/柔膜菌綱(mollicutes)；及放線菌門(bv5)，諸如放線菌目(actinomycetales)及雙歧桿菌目(bifidobacteriales)。在另一方面中，親本細菌選自以下中的任何一或多者：原細菌(eobacteria)(綠彎菌門(chloroflexi)、異常球菌-棲熱菌門(deinococcus-thermus))、藍細菌(cyanobacteria)、熱脫硫桿菌門(thermodesulfobacteria)、嗜熱菌(thermophiles)(產(chǎn)水菌門(aquificae)、熱袍菌門(thermotogae))、α、β、γ(腸桿菌科(enterobacteriaceae))、δ或ε變形菌門(proteobacteria)、螺旋體門(spirochaetes)、纖維桿菌門(fibrobacteres)、綠菌門(chlorobi)/擬桿菌門(bacteroidetes)、衣原體門(chlamydiae)/疣微菌門(verrucomicrobia)、浮霉菌門(planctomycetes)、酸桿菌門(acidobacteria)、產(chǎn)金菌門(chrysiogenetes)、脫鐵桿菌門(deferribacteres)、梭桿菌門(fusobacteria)、芽單胞菌門(gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(nitrospirae)、互養(yǎng)菌門(synergistetes)、網(wǎng)團菌門(dictyoglomi)、黏膠球形菌門芽孢桿菌目(lentisphaeraebacillales)、芽孢桿菌科(bacillaceae)、李斯特菌科(listeriaceae)、葡萄球菌科(staphylococcaceae)、乳桿菌目(lactobacillales)、腸球菌科(enterococcaceae)、乳桿菌科(lactobacillaceae)、明串珠菌科(leuconostocaceae)、鏈球菌科(streptococcaceae)、梭菌目(clostridiales)、鹽厭氧菌目(halanaerobiales)、嗜熱厭氧菌目(thermoanaerobacterales)、支原體目(mycoplasmatales)、蟲原體目(entomoplasmatales)、厭氧獎菌目(anaeroplasmatales)、無膽甾原體目(acholeplasmatales)、haloplasmatales、放線菌亞目(actinomycineae)、放線菌科(actinomycetaceae)、棒桿菌亞目(corynebacterineae)、諾卡氏菌科(nocardiaceae)、棒狀桿菌科(corynebacteriaceae)、弗蘭克氏菌亞目(frankineae)、弗蘭克氏菌科(frankiaceae)、微球菌亞目(micrococcineae)、短桿菌科(brevibacteriaceae)及雙歧桿菌科(bifidobacteriaceae)。

對于醫(yī)藥用途，本發(fā)明的組合物應(yīng)包含盡可能徹底地與免疫原性組分及其它有毒污染物分離的殺死的細菌細胞或微細胞。用于純化細菌衍生的微細胞以移除游離內(nèi)毒素及親本細菌細胞的方法描述于wo2004/113507中，其在此以全文引用的方式并入。簡言之，純化方法實現(xiàn)移除以下各者：(a)小囊泡，諸如膜泡，其尺寸通常為小于0.2μm；(b)自細胞膜釋放的游離內(nèi)毒素；及(c)親本細菌，無論活的或死的，及其碎片，其同樣為游離內(nèi)毒素的來源。此類移除可尤其利用以下執(zhí)行：0.2μm過濾器，以移除小囊泡及細胞碎片，0.45μm過濾器，以在誘導(dǎo)親本細胞形成長絲后移除親本細胞、殺死活細菌細胞的抗生素及抗游離內(nèi)毒素的抗體。

在純化程序下，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，盡管其細菌來源差異，所有完整微細胞的尺寸均為大致400nm，即，大于膜泡及其它小囊泡且仍小于親本細菌?？赏ㄟ^使用固態(tài)(諸如電子顯微鏡檢查)或通過基于液體的技術(shù)(例如動態(tài)光散射)來實現(xiàn)微細胞的尺寸測定。通過各類此技術(shù)產(chǎn)生的尺寸值可具有誤差范圍，且不同技術(shù)之間所述值可能略微不同。因此，在干燥狀態(tài)中的微細胞的尺寸可經(jīng)由電子顯微鏡檢查測量為大致400nm±50nm。另一方面，動態(tài)光散射可測量相同微細胞的尺寸為大致500nm±50nm。此外，同樣可使用動態(tài)光散射測量封裝藥物、靶向配體的微細胞為大致600nm±50nm。

實際上易于調(diào)節(jié)此尺寸值的分散，例如出于將微細胞與如上文所描述的免疫原性組分及其它有毒污染物分離的目的。即，細菌衍生的完整微細胞的特征在于通過剛性膜包圍的細胞質(zhì)，該剛性膜為微細胞提供剛性球形結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)在透射電子顯微圖中顯而易見，其中跨越微細胞，在剛性膜的外部界限之間測量微細胞直徑。此測量提供上文所提及的400nm±50nm的尺寸值。

源自革蘭氏陰性細菌的微細胞的另一結(jié)構(gòu)元素為脂多醣(lps)的o-多醣組分，其通過脂質(zhì)a錨定物嵌入在外部膜中。該組分為重復(fù)碳水化合物-殘基單元的鏈，其中每鏈多達70至100個四至五個糖的重復(fù)單元。因為這些鏈在液體環(huán)境中并不如體內(nèi)一般為剛性的，所以其可采用提供珊瑚海洋環(huán)境中的海藻的一般外觀的波狀可撓性結(jié)構(gòu)；即，所述鏈隨液體移動，同時其余部分錨定于微細胞膜上。

受o-多醣組分影響，動態(tài)光散射可為微細胞尺寸提供約500nm至約600nm的值，如上文所指出。然而，來自革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌的微細胞以同樣的方式容易地通過0.45μm過濾器，其證實了400nm±50nm的有效微細胞尺寸。本發(fā)明涵蓋上文所提及的尺寸分散且尤其通過詞組“尺寸為大致400nm”及其類似者中的限定詞“大致”表示。

關(guān)于有毒污染物，本發(fā)明的組合物可含有小于約350eu的游離內(nèi)毒素。在此方面的說明性實例為分別約250eu、約200eu、約150eu、約100eu、約90eu、約80eu、約70eu、約60eu、約50eu、約40eu、約30eu、約20eu、約15eu、約10eu、約9eu、約8eu、約7eu、約6eu、約5eu、約4eu、約3eu、約2eu、約1eu、約0.9eu、約0.8eu、約0.7eu、約0.6eu、約0.5eu、約0.4eu、約0.3eu、約0.2eu、約0.1eu、約0.05eu及約0.01eu的游離內(nèi)毒素水平。

本公開的組合物也可含有至少約10⁸個囊泡，例如至少約5×10⁸個?？蛇x地，組合物可含有數(shù)量級為10⁹或10¹⁰個囊泡，例如5×10⁹、1×10¹⁰或5×10¹⁰個囊泡。此外，在任何此數(shù)量微細胞中，本公開的組合物可含有少于約10個污染活的/親本細菌細胞，例如少于約9、8、7、6、5、4、3、2或1個活的/親本細菌細胞。

(e)小分子化合物

如所述，本發(fā)明提供用于將熒光的小分子化合物裝載至完整無生命細菌囊泡中的方法。小分子化合物可為固有熒光(自發(fā)熒光)的或其可為非固有熒光的，即，借助于將熒光部分添加至非熒光化合物中的熒光，之后將修飾的化合物裝載至完整無生命細菌囊泡中。

根據(jù)本發(fā)明，小分子化合物可為“小分子藥物”，其意謂其在施用本發(fā)明組合物時為生物活性的，或其在施用后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成生物活性形式(“活化的”)。與上述定義一致，“生物活性”指小分子藥物與細胞中的蛋白質(zhì)、核酸或其它分子反應(yīng)而導(dǎo)致細胞中的功能改變的能力。在一個方面中，改變?yōu)橹委煂W(xué)上合乎需要的。生物活性可為細胞毒性的，例如其中小分子化合物為化學(xué)治療劑，即，其為小分子“化療藥物”。因此，可互換地采用“化療藥物”、“化療劑”及“化學(xué)療法”以意謂具有殺死或破壞贅生性細胞的能力的小分子藥物。

“小分子藥物”子類別涵蓋特征在于(i)對生物過程具有作用及(ii)相比于蛋白質(zhì)或聚合大分子具有相對低分子量的化合物。小分子藥物典型地為約900道爾頓或更小，下限值為約150道爾頓，如約194道爾頓的(替莫唑胺(temozolomide))所說明，其用于治療多形性膠質(zhì)母細胞瘤及其它類型的腦癌。然而，盡管大多數(shù)分子的尺寸將小于約900道爾頓，但連接熒光分子或改變藥物的結(jié)構(gòu)以增強藥物至微細胞中的裝載可能將其分子量提高至高達約1500道爾頓。在此情形下，“約”指示合格的分子重量值易有測量精度方面的變化及數(shù)量級為若干道爾頓或幾十道爾頓的實驗誤差。因此，小分子藥物(未經(jīng)修飾、修飾的或連接至熒光分子)的分子量可為約1500道爾頓或更小，約1400道爾頓或更小，約1300道爾頓或更小，約1200道爾頓或更小，約1100道爾頓或更小，約1000道爾頓或更小，約900道爾頓或下，約800道爾頓或更小，約700道爾頓或更小，約600道爾頓或更小，約500道爾頓或更小，或約400道爾頓或更小，例如在約150至約400道爾頓范圍內(nèi)。更確切而言，小分子藥物(未經(jīng)修飾、修飾的或連接至熒光分子)的分子量可為約400道爾頓或更大，約450道爾頓或更大，約500道爾頓或更大，約550道爾頓或更大，約600道爾頓或更大，約650道爾頓或更大，約700道爾頓或更大，約750道爾頓或更大，約800道爾頓或更大，約850道爾頓或更大，約900道爾頓或更大，約950道爾頓或更大，約1000道爾頓或更大，約1050道爾頓或更大，約1100道爾頓或更大，約1150道爾頓或更大，約1200道爾頓或更大，約1250道爾頓或更大，約1300道爾頓或更大，約1350道爾頓或更大，約1400道爾頓或更大，約1450道爾頓或更大，或約1500道爾頓或更大。在另一實施方式中，封裝至微細胞中的小分子藥物(未經(jīng)修飾、修飾的或連接至熒光分子)的分子量在約400道爾頓與約1300道爾頓之間，在約400道爾頓與約1100道爾頓之間，在約400道爾頓與約1000道爾頓之間，在約450道爾頓與約900道爾頓之間，在約450道爾頓與約850道爾頓之間，在約450道爾頓與約800道爾頓之間，在約500道爾頓與約800道爾頓之間，或在約550道爾頓與約750道爾頓之間。

受制于分別根據(jù)本發(fā)明的方法學(xué)及組成方面在上面所列的限制性條件，適合的小分子化療藥物尤其包括但不限于氮芥、亞硝基脲、乙撐亞胺、烷烴磺酸鹽、四嗪、鉑化合物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗代謝物、葉酸類似物、蒽環(huán)、紫杉烷、長春花生物堿及拓撲異構(gòu)酶抑制劑。因此，用于本發(fā)明中的小分子化療藥物可尤其選自以下中的任一者：烯二炔，諸如達內(nèi)霉素a、尤尼卡拉霉素(unicalamycin)、卡奇霉素γ1及卡奇霉素θ1；米阿亞霉素(meayamicin)，其為fr901464的合成類似物；苯并環(huán)庚烯衍生物，如例如tanpure等人，bioorg.med.chem.21：8019-32(2013)所描述；奧瑞他汀(audstatins)，諸如奧瑞他汀e、單甲基奧瑞他汀e(mmae)及奧瑞他汀f(其為多拉司他汀的合成類似物)；多卡米星類，諸如多卡米星sa及cc-1065；美登素(maytansine)及其衍生物(類美登素(maytansinoids))，諸如dm1及dm4；伊立替康及其它拓撲異構(gòu)酶抑制劑，諸如托泊替康、依托泊苷、米托蒽醌及替尼泊苷；及谷田霉素(yatakemycin)，okano等人，j.am.chem.soc.128：7136-37(2006)詳述其合成。

更特定而言，此段落中詳述的特異性小分子化療藥物的任一或多者或所有為適用于根據(jù)上述部分(c)中所陳述的限制性條件的那些的說明性實例：放射菌素-d、愛克蘭、ara-c、阿那曲唑、bicnu、比卡魯胺、博萊霉素、白消安、卡培他濱卡鉑、碳鉑、卡莫司汀、ccnu、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、cpt-11、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪、更生霉素、右雷佐生、多西紫杉醇、dtic、乙撐亞胺、依托泊苷、氟尿苷、氟達拉賓、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他濱、六甲銨、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法侖、巰嘌呤、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、奧沙利鉑、紫杉醇、氨羥二磷酸二鈉、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、鏈脲菌素、sti-571、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊甙、四嗪、硫鳥嘌呤、噻替派、雷替曲塞(tomudex)、托泊替康、曲奧舒凡(treosulphan)、三甲曲沙、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱及vp-16。依照本發(fā)明，這些小分子化學(xué)治療藥物中的任一種或多種或所有可衍生有熒光團，或視具體情況可針對固有熒光采用。

如上述部分(c)中所詳述，本發(fā)明內(nèi)的組合物分別相對于固有熒光藥物(子類別(a))及非固有熒光活性劑(子類別(b))進行排除。對于子類別(a)，排除由多柔比星、伊立替康、比山群、表柔比星、托泊替康、表柔比星、柔紅霉素及米托蒽醌組成。對于子類別(b)，排除由oregon488結(jié)合的紫杉醇及fl結(jié)合的長春堿組成。

在一些實施方式中，式d-l-f中的d具有以下式d-i或d-ii

或為其立體異構(gòu)體或化合物或立體異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽，

其中：

r¹為h、-oh、c1-4烷氧基、-o-c(o)-(c1-4烷基)、取代的c1-4烷氧基、-o-c(o)-(取代的c1-4烷基)、-o-ch2-o-p(o)(oh)2、-o-ch2-o-(c1-4烷基)、-o-ch2-s-(c1-4烷基)，或與r³一起形成-ch2-，或與r⁴一起為雙鍵、or^e、或r^e；

r²為h、-oh、c1-4烷基、取代的c1-4烷基、c1-4烷氧基、取代的c1-4烷氧基、-o-c(o)-(c1-4烷基)、-o-c(o)-(取代的c1-4烷基)、-o-ch2-o-(c1-4烷基)、-s-ch2-o-(c1-4烷基)、-o-c(o)-r^e或-r^e；

r³為h、c1-4烷基，或與r¹一起形成-ch2-；

r⁴為h或鹵基，或與r¹一起為雙鍵；

r⁵為h、c1-4?；?、c1-4烷基、取代的c1-4烷基、c1-4烷氧基甲基、(c1-4烷基)硫基甲基、-c(o)-(c1-4烷基)、-c(o)-(取代的c1-4烷基)、-c(o)-o(c1-4烷基)、-c(o)-o(取代的c1-4烷基)、-c(o)-nh(c1-4烷基)、-c(o)-nh(取代的c1-4烷基)或r^e；

r⁶為苯基或取代的苯基；

r⁷為h、-oh、-co-(c1-4烷基)、-co-(取代的c1-4烷基)、c1-4烷基、取代的c1-4烷基、(c1-4烷氧基)甲基或(c1-4烷基)硫基甲基，或與r⁸及與r⁷和r⁸結(jié)合的碳原子一起為五元或六元非芳族雜環(huán)；

r⁸為h、-ch3，或與r⁷及r⁷和r⁸結(jié)合的碳原子一起為五元或六元非芳族雜環(huán)；

r⁹為h、c1-4烷基、取代的c1-4烷基、-co-(c1-4烷基)、-co-(取代的c1-4烷基)或r^e；

r¹⁰為c1-4烷基、取代的c1-4烷基、芳基或取代的芳基；

r¹¹為c1-4烷基、取代的c1-4烷基、苯基、取代的苯基、-sr¹²、-nhr¹²或-or¹²；及

r¹²為c1-4烷基、取代的c1-4烷基、苯基或取代的苯基；

條件為r¹、r²、r⁵及r⁹中的至少一個為r^e，且r^e為l的連接點。

在一些實施方式中：

r¹為h、oh、-ch2sch3、-ch2-o-p(o)(oh)2、or^e或r^e；

r²為h、-oh、-oco-ch3、-co-ch3或-(ch2)2-n-嗎啉代；

r³為甲基，或r³與r⁴一起為亞烷基，諸如-ch2-；

r⁴為h或-f；

r⁵為-co-ch3；

r⁶為苯基；

r⁷為h或oh，

r⁸為h；

或r⁷與r⁸一起為-o-co-o-；

r⁹為h、-c(o)-chbr-(ch2)13-ch3、-c(o)-(ch2)2-nh2；-c(o)-(ch2)14-ch3；-c(o)-ch2-ch(oh)-cooh、-c(o)-ch2-o-c(o)-ch2ch(nh2)-conh2、-c(o)-ch2-o-ch2ch2och3、-c(o)-o-c(o)-ch2ch3或-r^e；

r¹⁰為苯基、(ch3)2chch2-、-2-呋喃基、環(huán)丙基或?qū)妆锦；患?/p>

r¹¹為苯基、叔丁氧基、-s-ch2-ch-(ch3)2、-s-ch(ch3)3、-s-(ch2)3ch3、-o-ch(ch3)3、-nh-ch(ch3)3、-ch＝c(ch3)2或?qū)β缺交?/p>

條件為r¹及r⁹中的至少一個為r^e。

在一些實施例中，式d-l-f中的d具有式

或為其立體異構(gòu)體，或化合物或立體異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽，

其中表示與l的連接點。

在一些實施方式中，式d-l-f中的d為選自以下的化合物的殘基：

或其立體異構(gòu)體，或化合物或立體異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽。

在一些實施方式中，式d-l-f中的d為紫杉醇的殘基。

在一些實施方式中，式d-l-f中的d為多西紫杉醇的殘基。

在一些實施方式中，式d-l-f中的d為長春堿或其類似物的殘基。

(f)熒光部分

熒光部分為本領(lǐng)域中所熟知。在一些方面中，熒光部分的最大激發(fā)波長為760nm和/或最大發(fā)射波長為770nm。在一些方面中，熒光部分的最大激發(fā)波長為600nm和/或最大發(fā)射波長為600nm。在一些方面中，熒光部分的最大激發(fā)波長為500nm和/或最大發(fā)射波長為550nm。在一些實施方式中，熒光部分的激發(fā)波長選自380-450nm、450-495nm、495-570nm、570-590nm、590-620nm、620-650nm、650-700nm或700-760nm。在一些實施方式中，熒光部分的發(fā)射波長選自380-450nm、450-495nm、495-570nm、570-590nm、590-620nm、620-650nm、650-700nm或700-770nm。

在一些方面中，熒光部分的分子量為約100道爾頓至約1000道爾頓或此兩個值中間的任何量，或約100道爾頓至約650道爾頓或此兩個值中間的任何量。在其它實施方式中，熒光部分的分子量為約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900道爾頓或這些值中間的任何量。在又其它實施方式中，熒光部分的分子量為約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650道爾頓或這些值中間的任何量。

在一個方面中，熒光部分(f)為選自以下的化合物的殘基：氧雜蒽衍生物，諸如熒光素、羅丹明、俄勒岡綠、伊紅及德克薩斯紅；花青衍生物，諸如花青、吲哚羰花青、氧羰花青、硫羰花青(thiacarbocyanine)及部花青；萘衍生物，諸如丹?；胺杷徕c衍生物；香豆素衍生物；二唑衍生物，諸如吡啶唑、硝基苯并二唑(nitrobenzoxadiazole)及苯并二唑；蒽衍生物，諸如蒽醌，例如draq5、draq7及cytrakorange；芘衍生物，諸如級聯(lián)藍(cascadeblue)；嗪衍生物，諸如尼羅紅、尼羅藍、甲酚紫及嗪170；吖啶衍生物，諸如原黃素、吖啶橙及吖啶黃；芳基次甲基衍生物，諸如金胺、結(jié)晶紫及孔雀綠；及四吡咯衍生物，諸如卟吩、酞菁及膽紅素。

在一個方面中，熒光部分(f)為

其中

x為o或nr²⁰；

r²⁰為h或c1-4烷基；

r²¹為h、c1-4烷基、鹵基、-oh、-cooh、-o-c(o)-(c1-4烷基)、-c(o)-o-(c1-4烷基)、c1-4烷氧基、鹵基、-no2、-so2cl、-so3^-或r^f；

r²²為h、鹵基、-oh、-cooh、c1-4烷基、取代的c1-4烷基、c1-4烷氧基、取代的c1-4烷氧基、-o-c(o)-(c1-4烷基)、-o-c(o)-(取代的c1-4烷基)、-c(o)-o-(c1-4烷基)、-c(o)-o-(取代的c1-4烷基)、-o-ch2-o-(c1-4烷基)、-s-ch2-o-(c1-4烷基)、-no2、-so2cl、-so3^-或r^f；

各r²³、r²⁴、r²⁵、r²⁶、r²⁷、r²⁸及r²⁹獨立地為h、鹵基、-oh、-no2、-ch3或r^f，

或r²³及r²⁴接合在一起形成5元、6元或7元環(huán)，和/或r²⁴及r²⁵接合在一起形成5元、6元或7元環(huán)，和/或r²⁷及x接合在一起形成5元、6元或7元環(huán)，和/或r²⁸及x接合在一起形成5元、6元或7元環(huán)；

條件為r²¹、r²²、r²³、r²⁴、r²⁵、r²⁶、r²⁷、r²⁸及r²⁹中的至少一個且不超過兩個為r^f；其中r^f為l的連接點。

在一個方面中，熒光部分(f)為

其中r²¹為l的連接點。

在一個方面中，熒光部分(f)為選自以下的化合物的殘基：

其中各r³⁰獨立地為氫、c1-4烷基或取代的c1-4烷基，a¹及a²獨立地為任選取代的含有氮雜芳基，n為選自1至10的整數(shù)。在一些實施方式中，雜芳基為吡咯、咪唑、噻唑、吡啶、喹啉、吲哚、苯并唑或苯并噻唑。

在一個方面中，熒光部分(f)為

其中r⁴⁰中的一者為r³⁰，且另一者為r^f、l⁴⁰-r^f、l⁴⁰-or^f、l⁴⁰-nhr^f，l⁴⁰為(ch2)m，其中一個或兩個ch2基團任選地被o、s、so、so2、c(o)o、oc(o)、c(o)nh、nhc(o)、

nh或任選取代的苯基置換，且r^f為l的連接點。

在一個方面中，熒光部分(f)為

其中

r³¹及r³²獨立地為h、-oh、c1-4烷基、c1-4鹵烷基、-o-c(o)-(c1-4烷基)、-c(o)-o-(c1-4烷基)、c1-4烷氧基、鹵基或r^f；

r³⁴及r³⁵獨立地為h、鹵基、-oh、-cooh、c1-4烷基、取代的c1-4烷基、c1-4烷氧基、-o-c(o)-(c1-4烷基)、-c(o)-o-(c1-4烷基)、-o-ch2-o-(c1-4烷基)、-s-ch2-o-(c1-4烷基)或r^f；

各r³³及r³⁶獨立地為h、鹵基、-oh、-ch3或r^f；

各r³⁷、r³⁸及r³⁹獨立地為鹵基、-oh、-ch3或r^f；

各m、n及p獨立地為0、1、2、3或4；

條件為r³¹、r³²、r³³、r³⁴、r³⁵、r³⁶、r³⁷、r³⁸及r³⁹中的至少一個且不超過兩個為r^f；其中r^f為l的連接點。

在一個方面中，熒光部分(f)為

其中r³²為l的連接點。

(g)連接體

本公開的連接體(l)將熒光部分或熒光團連接至小分子化合物。在特定的方面，連接體為一鍵，即，熒光部分直接連接至小分子化合物。

在一些實施方式中，連接熒光部分不會明顯降低藥物(d)的活性，從而修飾的化合物為生物活性和/或醫(yī)藥有效的。在一些實施方式中，連接熒光部分降低或消除藥物(d)的活性，從而修飾的化合物具有降低的生物和/或醫(yī)藥活性或者為生物非活性和/或醫(yī)藥無效的。

適用于此目的的其它連接體包括出于結(jié)合兩個分子的目的熟知的連接體。

在一些方面中，連接體(l)為穩(wěn)定的且不在施用后降解，且熒光部分及藥物的結(jié)合物為生物和/或醫(yī)藥活性的。示例性穩(wěn)定連接體包括但不限于乙?；彼?參見實施例2)及β-丙氨酸(參見實施例3)。在其它方面中，連接體在生理條件(例如在非凍干狀態(tài)中)下的半衰期比微細胞裝載時間長，以使得在將修飾的化合物裝載至微細胞中之后熒光部分/熒光團及小分子化合物在連接體分解后變得分離。一般而言，裝載微細胞需要約4小時。因此，連接體的半衰期可為至少4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時。優(yōu)選，連接體的半衰期在6-24小時或8-24小時內(nèi)。例如，當用作連接體時，2’-(3-氨基丙?；?部分的半衰期為約8小時。

在其它方面中，連接體在細菌囊泡內(nèi)為穩(wěn)定的，但可為ph敏感性的，且因此，在低于中性的ph下較不穩(wěn)定。因為內(nèi)體/溶酶體中的ph明顯低于正常細胞環(huán)境中的ph，所以此類ph敏感性連接體僅在靶哺乳動物細胞的內(nèi)體/溶酶體中可降解。在此類酸性條件下，連接體可水解。例如，酯可水解成醇殘基及羧酸，或酰胺可水解成胺及羧酸。

已知ph敏感性連接體例如由nie等人在polymericbiomaterials：medicinalandpharmaceuticalapplications，第16章，第413-32頁(dumitriu編，2013)中說明，其描述用于藥物遞送的酸不穩(wěn)定連接體。國際專利申請wo2006/108052也描述酸不穩(wěn)定連接體，其在溶酶體中可見的條件下可降解。duncan，naturereviewscancer6：688-701(2006)描述在曝露于溶酶體酶后可降解的連接體，例如組織蛋白酶b)裂解gly-phe-leu-gly及聚谷氨酸(pga)或以降低ph，例如腙連接體在內(nèi)體及溶酶體(ph6.5至ph＜4.0)中降解。美國專利第5,306,809號描述適用于免疫治療劑的酸不穩(wěn)定連接體。

例如，美國專利第6,521,431號描述乙醇酸或乳酸；羥基酯，諸如3-羥基丁酸、2-羥基丙酸及5-羥基羊油酸；氨基酸；原酯；酸酐；膦嗪；磷酸酯作為連接體的用途。

公開申請us2013/0071482描述具有一或多個諸如以下的部分的連接體

其中x⁵為o或nh，且針對r的結(jié)構(gòu)詳述在‘482公開申請中。

公開申請us2013/0261094描述諸如以下的連接體：-oq-(cnh2n)-s(r’)(r”)-(cmh2m)-ch2-a或-r⁹n-q-(cnh2n)-s(r’)(r”)-(cmh2m)-ch2-a，其中n及m為0至20，且優(yōu)選地1至10的整數(shù)；r’及r”獨立地為電子孤對、氧部分(諸如＝o)或氮部分諸如(＝n-r^x)，其中r^x為原子的同源組或異源組；a為結(jié)合部分；且q為直接鍵、c＝o、c＝nh或c＝nr^p基團，其中r^p為c1-c3烷基，且r⁹可為氫原子或c1-c3烷基。

公開申請us2012/0121615描述連接體，諸如

公開申請us2005/0112065描述ph敏感性連接體，諸如檸康?；蝓ｋ逻B接體；或酶敏感性連接體。申請詳述的此類連接體的實例包括：

其中x、y、z獨立地為0、1、2、3、4或5，條件為x、y及z中的至少一個不為0。在一些實施方式中，x、y及z獨立地為1、2、3、4或5。

nicoletti等人，int’lj.antimicrob.agents33：441-48(2009)描述作為連接體的多肽glypheleugly。

上文所提及的出版物的各個內(nèi)容在此以全文引用的方式并入。一些出版物在描述連接體時使用給定化合物的名稱。在任何情況下，當充當連接體時，任何給定化合物呈現(xiàn)二價自由基，以使得其可連接藥物及熒光部分以提供根據(jù)本發(fā)明的修飾的(熒光)化合物。

在一個方面中，連接體(l)選自：鍵、-c(o)-o-、-c(o)nh-、-oc(o)-(chr⁵⁰)qnr⁵¹c(o)-、和-oc(o)-(chr⁵⁰)qc(o)nr⁵¹-(chr⁵²)u-nh-c(s)-nh-，其中r⁵⁰、r⁵¹及r⁵²獨立地為h或c1-4烷基，且q及u獨立地為1、2、3、4、5、6或7。

在另一方面中，l選自：-o-c(o)-ch(ch3)-nhc(o)-、-o-c(o)-(ch2)2-nh-co-、和-o-c(o)-(ch2)3c(o)nh-(ch2)6-nh-c(s)-nh-。

在一些方面中，連接體為-(chr⁵²)p-，其中-(chr⁵²)-中的至少一個被來自以下基團的一者置換：-o-、-((chr⁵²)-o)q-、-s-、-s-s-、-c(o)nh-、-c(o)o-和-cr⁵²＝nnh，其中r⁵²為h或c1-4烷基；且其中p為選自2-10的整數(shù)，且q為選自1-7的整數(shù)。在一些實施方式中，p為2至10(包括端點)的整數(shù)，且q為1至7(包括端點)的整數(shù)。

(h)治療方法及組合物

依照本發(fā)明的另一方面，通過配體將如上文所描述的組合物的裝載化合物的完整且無生命的細菌囊泡導(dǎo)入靶哺乳動物腫瘤細胞中。在一些實施方式中，配體為“雙特異性的”。即，配體對微細胞及哺乳動物(腫瘤)細胞組分兩者呈現(xiàn)特異性，其從而使得給定囊泡結(jié)合至靶細胞，其中后者吞噬前者。雙特異性配體使微細胞靶向腫瘤細胞的用途進一步描述于wo05/056749及wo05/079854中，且雙特異性配體使殺死的細菌細胞靶向腫瘤細胞的用途進一步描述于美國專利第8,591,862號中，其各自內(nèi)容在此以全文引用的方式并入。在此類配體連接至囊泡后，配體的未占用特異性(“單一特異性”)適用直至其與靶(腫瘤)哺乳動物細胞相互作用。

配體可借助于配體與細胞膜上的組分(諸如多醣、糖蛋白或多肽)之間的相互作用連接至囊泡的細胞膜。表達的配體錨定于囊泡的表面上以使得配體的表面組分結(jié)合部分曝露，從而使得該部分可在囊泡與哺乳動物細胞接觸時結(jié)合靶哺乳動物細胞表面組分。

可選地，可通過細菌衍生的囊泡的活的對應(yīng)物，例如通過微細胞的親本細胞或通過在其變成殺死的細胞之前的細菌細胞表達并呈現(xiàn)配體。在此情況下，配體不需要對囊泡的特異性且僅呈現(xiàn)對哺乳動物細胞所特有的組分的特異性。即，此類組分無需對腫瘤細胞本身或甚至對在治療下的特定種類腫瘤細胞而言為獨特的，只要腫瘤細胞在其表面上呈現(xiàn)該組分即可。

在靜脈內(nèi)施用后，囊泡在腫瘤微環(huán)境中快速積聚。作為上文所描述的滲漏的腫瘤脈管的函數(shù)而出現(xiàn)的此積聚實現(xiàn)將封裝囊泡的治療有效負載遞送至腫瘤細胞，其隨后內(nèi)化封裝囊泡。

本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，此遞送途徑適用于哺乳動物腫瘤細胞的范圍，包括通?？咕芪⒓毎奶禺愋哉掣郊鞍套饔玫募毎＠?，包含引導(dǎo)在抗-her2受體或抗-egf受體處的抗體或抗體衍生物(參見下文)的配體可在靶向的非吞噬細胞(諸如肺、卵巢、大腦、乳房、前列腺及皮膚癌細胞)的范圍上使微細胞結(jié)合至各自受體。

因此，在各類型非吞噬細胞攝取囊泡之前實現(xiàn)結(jié)合。即，在本發(fā)明的情形下，適合的靶細胞呈現(xiàn)細胞表面組分，通過囊泡上的配體，其結(jié)合引發(fā)該囊泡的胞吞作用。

更確切而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，(a)微細胞或殺死的細菌細胞上的配體與(b)哺乳動物細胞表面受體之間的相互作用可活化至靶宿主細胞諸如腫瘤細胞的晚期內(nèi)體/溶酶體區(qū)室中的攝取路徑，此處稱為“受體介導(dǎo)的胞吞作用”(rme)路徑。通過此rme路徑，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，細菌衍生的囊泡通過早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體及溶酶體加工，導(dǎo)致將其有效負載釋放至哺乳動物宿主細胞的細胞質(zhì)中。此外，作為核酸的有效負載不僅在晚期內(nèi)體/溶酶體區(qū)室中逃避完全降解，且亦通過宿主細胞表達。

用于此遞送途徑的配體可為“雙特異性的”，如上文所描述，因為其分別結(jié)合至攜帶有效負載的囊泡及靶細胞上的表面組分，且其與后一組分的相互作用導(dǎo)致囊泡被攝取至rme路徑中。在任何情況下，依照本發(fā)明，若與組分的相互作用實際上接入需要自靶細胞表面的胞溶質(zhì)內(nèi)化的細胞內(nèi)吞路徑，則給定靶細胞表面組分可為配體結(jié)合的候選物。此類候選物易于通過這樣的分析評估在本發(fā)明中的適用性，其中將在其表面上呈現(xiàn)候選物組分的細胞類型在體外與攜帶配體的微細胞共同溫育，該配體結(jié)合候選物且也接合至經(jīng)得起檢測(例如通過共焦顯微鏡檢查可視)的熒光染料或其它標記。(此種體外分析由macdiarmid(2007)在第436頁圖3的圖例中描述。)因此，標記的所觀測到的內(nèi)化構(gòu)成此類分析的陽性指示：所測試的靶細胞表面組分適用于本發(fā)明。

候選物靶細胞表面組分的說明性實例為(a)受體酪氨酸激酶或“rkt”(其為以類似于其它整合膜蛋白的速率進行組成型內(nèi)化(胞吞作用)的跨膜蛋白質(zhì)家族)的成員。參見gohandsorkin，coldspringharb.perspect.biol.5：a017459(2013)。rkt的家族由例如lemmonandschlessinger，cell141：1117-134(2010)描述。下表列出人類蛋白質(zhì)組中的在二十個亞家族中所有五十八種rtk，可測試其中的任何一種或多種在本發(fā)明中的適用性，如上文所描述(也參見圖24)。

同樣地，說明性實例為以下的成員：(b)膜結(jié)合、高親和力葉酸結(jié)合蛋白(葉酸受體)的類別，其結(jié)合葉酸且減少葉酸衍生物，且其介導(dǎo)四氫葉酸遞送至細胞內(nèi)，(c)膜結(jié)合細胞因子受體的亞群，其在同源細胞因子，諸如il13的內(nèi)化方面起作用；(d)表面抗原，諸如cd20、cd33、間皮素及hm1.24，其在某些癌細胞上表達且介導(dǎo)同源單克隆抗體(例如cd20的實例中的利妥昔單抗)的內(nèi)化；及(e)粘附受體(整合素)、跨膜糖蛋白的家族，其通過內(nèi)體路徑運輸且為癌細胞粘附至細胞外基質(zhì)的主要介體。

根據(jù)本發(fā)明，配體可為視具體情況展現(xiàn)期望的一種或多種特異性的任何多肽或多醣。優(yōu)選配體為抗體。在其當前用途中，術(shù)語“抗體”涵蓋通過免疫原性反應(yīng)的體外或體內(nèi)產(chǎn)生獲得的免疫球蛋白分子。因此，“抗體”類別包括單克隆抗體及人化抗體以及抗體衍生物，諸如單鏈抗體片段(scfv)、雙特異性抗體等。已知大量不同雙特異性蛋白質(zhì)及基于抗體的配體，如caravellaandlugovskoy，curr.opin.chem.biol.14：520-28(2010)的綜述文章所證明的，其在此以全文引用的方式并入。根據(jù)本發(fā)明適用的抗體可同樣通過已知重組dna技術(shù)獲得。

因此，通過非限制性實例，依照本發(fā)明，攜帶對表面組分(諸如腫瘤抗原)的特異性的抗體可用于使微細胞靶向待治療的腫瘤中的細胞。在此方面，說明性細胞表面受體包括rtk表皮生長因子受體(egfr)、血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)、血小板衍生的生長因子受體(pdgfr)及胰島素樣生長因子受體(igfr)中的任一者，其每一個在若干實體腫瘤(包括腦瘤)中高度表達；以及葉酸受體，其在一些垂體腺瘤中過度表達。此類雙特異性配體可同樣靶向突變體或變體受體，例如il-13rα2受體，其在50％至80％的人類多形性膠質(zhì)母細胞瘤中表達(參見wykosky等人，clincancerres.14：199-208(2008)；jarboe等人，cancerres.67：7983-86(2007)；debinski等人，j.neurooncol.48：103-11(2000)；及okada等人，j.bacteriol.176：917-22(1994))，但與其生理對應(yīng)物il4r/il13r不同，其在正常組織中表達。參見hershey，j.allergyclin.immunol.ill：677-90(2003)。因此，正常大腦細胞中幾乎不存在il13rα2。參見debinskiandgibo，mol.med.6：440-49(2000)。另外，轉(zhuǎn)移至大腦中的腫瘤可能過度表達某些受體，其也可為適合的靶標。例如，dasilva等人，breastcancerres.12：r46(1-13)(2010)，顯示乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移表達rtk的her家族的所有成員。her2在20％腦轉(zhuǎn)移中擴增且過度表達，egfr在21％腦轉(zhuǎn)移中過度表達，her3在60％腦轉(zhuǎn)移中過度表達，且her4在22％腦轉(zhuǎn)移中過度表達。有趣地，在滯留于大腦中的乳腺癌細胞中her3表達增加。

(i)制劑及施用途徑及時程

本發(fā)明的組合物的制劑可以單位劑型呈現(xiàn)，例如在安瓿或小瓶中或在多劑量容器中，具有或不具有所添加的防腐劑。制劑可為油性或水性媒劑中的溶液、懸浮液或乳液，且可含有配制劑(formulatoryagents)，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。適合的溶液與接受者的血液等滲，且通過鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液說明?？蛇x地，制劑可呈凍干粉末形式，以便用適合的媒劑，例如無菌、無熱原水或生理鹽水復(fù)原。制劑也可呈儲存制劑形式。此類長效制劑可通過植入(例如皮下或肌肉內(nèi))或通過肌肉內(nèi)注射來施用。

在一些方面中，提供包括治療有效量的小分子化合物的含有囊泡的組合物。抗贅生劑的“治療學(xué)上有效”的量為根據(jù)本公開所討論的藥劑的劑量。若小分子化合物在囊泡中呈非活性形式，則“治療學(xué)上有效”的量指在靶細胞的內(nèi)體/溶酶體中釋放有效量的活化的化合物的非活性化合物的量。

因此，在本公開的情形下，當施用攜帶治療有效負載的微細胞時，可參考在動物模型中或在人類個體中腫瘤或腫瘤癥狀的預(yù)防或改善來衡量治療有效量，如下文進一步描述。在給定實例中對于特定個體證明為“治療有效量”的量可能不對針對100％所討論的腫瘤進行類似治療的個體有效，但博學(xué)的臨床醫(yī)師認為此類劑量為“治療有效量”。在此方面，適當?shù)膭┝恳矊⒆鳛槔缒[瘤的類型、階段及嚴重程度的函數(shù)而變化。在任何情況下，根據(jù)本公開，當根據(jù)整個說明書考慮時，體外測試(實施例3及4)及體內(nèi)測試(實施例5、7及8)以及用于定量體內(nèi)藥物分布(實施例9)的方法的本發(fā)明說明使得熟知候選藥物的臨床前及臨床測試的人能夠通過常規(guī)實驗測定針對特定指征的活性劑的治療有效量。同樣地，當“治療學(xué)上有效的”用于指藥物組合物中的微細胞的數(shù)量時，該數(shù)量可基于封裝至微細胞中的抗贅生劑及該藥劑在治療腫瘤方面的功效來確定。在此方面，可用臨床或病理學(xué)參數(shù)，諸如腫瘤質(zhì)量來測量治療效果。因此，腫瘤質(zhì)量減少或增加減少可用于測量治療效果。

本公開內(nèi)的制劑可通過各種途徑局部或全身施用且施用至哺乳動物體中的各種部位，以實現(xiàn)所需治療效果。在一特定方面中，施用途徑為靜脈內(nèi)注射。

一般而言，可以以通過常規(guī)測試所界定的適當?shù)膭┝渴褂帽竟_的制劑，以獲得最佳生理效果，同時使任何潛在毒性減至最小?？筛鶕?jù)多種因素選擇給藥方案，所述因素包括患者的年齡、重量、性別、醫(yī)學(xué)狀況；腫瘤的嚴重性或階段；施用途徑；及患者的腎及肝功能。

獲得產(chǎn)生最大功效而副作用最小的范圍內(nèi)囊泡和治療劑的濃度的最佳精度可能且典型地將需要基于藥劑到達靶部位及靶細胞的動力學(xué)的方案?？稍跍y定治療方案的最佳濃度時考慮囊泡或藥劑的分布、平衡及消除。可分別調(diào)節(jié)囊泡及治療劑的劑量以實現(xiàn)所需效果。

此外，可使用藥物動力學(xué)/藥效動力學(xué)建模系統(tǒng)使制劑的劑量施用最佳化。因此，可選擇一個或多個劑量方案且可使用藥物動力學(xué)/藥效動力學(xué)模型來測定一個或多個劑量方案的藥物動力學(xué)/藥效動力學(xué)概況?；谔囟ǖ拇祟惛艣r，可隨后選擇達成所需藥物動力學(xué)/藥效動力學(xué)反應(yīng)的施用劑量方案中的一者。例如，參見wo00/67776。

可向腫瘤患者施用本公開的制劑一周至少一次歷經(jīng)若干周。因此，可施用制劑一周至少一次歷經(jīng)若干周至若干月的時期。

更確切而言，本發(fā)明制劑可一日至少一次施用約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天或約31天?？蛇x地，制劑可每天施用約一次或每約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天或約31天或更多天施用約一次。

在本公開的另一實施方式中，制劑可每周施用約一次或每約2周、約3周、約4周、約5周、約6周、約7周、約8周、約9周、約10周、約11周、約12周、約13周、約14周、約15周、約16周、約17周、約18周、約19周或約20周或更多周施用約一次?？蛇x地，制劑可一周至少一次施用約2周、約3周、約4周、約5周、約6周、約7周、約8周、約9周、約10周、約11周、約12周、約13周、約14周、約15周、約16周、約17周、約18周、約19周或約20周或更多周。

可選地，制劑可每月施用約一次或每約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月或約12個月或更多個月施用約一次。

制劑可以單一日劑量形式施用?？蛇x地，總的日劑量可以以每日兩次、三次或四次的分開劑量施用。

因此，參考以下實施例將更容易理解通常描述的本發(fā)明，所述實施例以說明方式提供且并不意欲限制本發(fā)明。本文中所參考的所有公開可獲得的文件(包括但不限于專利)尤其以引用的方式并入。

實施例

本發(fā)明人觀測到，熒光類型(固有相對于非固有)及化合物結(jié)構(gòu)不同的裝載化合物的廣泛范圍中，熒光相關(guān)的裝載增強的效果。對于非固有熒光化合物，差異分別涉及熒光團及連接體(若存在)的性質(zhì)。

一般而言，實施例涉及將多種熒光化合物裝載至細菌衍生的完整囊泡中。對于所有實施例，起始物質(zhì)均為源自腸炎沙門氏菌(salmonellaenterica)鼠傷寒血清變型(鼠傷寒沙門桿菌(s.typhimurium))的mincde-染色體缺失突變體的空的完整微細胞的緩沖組合物，游離內(nèi)毒素水平不超過每10⁹個微細胞約5eu。參見美國專利第8,449,877號(產(chǎn)生實質(zhì)上缺乏游離內(nèi)毒素的微細胞組合物)。

對于裝載囊泡(此處為微細胞)，實施例1-5、7-10、12及13中的方法與上文所描述且macdiarmid等人(2007)中所說明的小規(guī)模方案基本上一致。例如，在給定實驗中，可將pbs緩沖液中的空的微細胞添加至微量離心管中且離心(16,000g，10分鐘)。在丟棄所得上清液之后，微細胞球粒將重新懸浮于任選地具有0.01(w/v)所添加的明膠的pbs緩沖液(所謂“bsg緩沖液”)中，且與有效負載化合物(通常每ml微細胞懸浮液約200μg至約1mg)一起溫育。將由此獲得的裝載的微細胞離心(16,000g，10分鐘)且丟棄裝載上清液。隨后將通過使球粒重新懸浮于1ml緩沖液中洗滌裝載的微細胞，離心微細胞(16,000g，10分鐘)，且丟棄上清液洗液。此類洗滌步驟通常重復(fù)三次。最后，將使微細胞重新懸浮于pbs或bsg緩沖液中。

當待裝載的熒光化合物為水可溶(如許多前述實例的情況一般)時，化合物截留至囊泡外表面明顯減少。因此，在較小規(guī)模上洗滌為足夠的，準許使用小規(guī)模方案。然而，在實施例6及11中，裝載的化合物為多柔比星，其為兩親性而非親水性的，且因此截留為顯著因素。因此，盡管這些實施例的裝載步驟在較小規(guī)模上，即，裝載在約毫升規(guī)模體積的緩沖液體中進行，但洗滌步驟涉及利用升規(guī)模體積的緩沖液體的交叉過濾(無離心)，因此構(gòu)成大規(guī)模方法。

最后，實施例14將小規(guī)模方案與大規(guī)模方法進行比較，突顯利用后者所實現(xiàn)的改良稠度及純度。

在所述實施例中，將封裝有效負載的微細胞安裝至玻璃載片上以便通過熒光顯微鏡檢查，使用leica型號dmlb光學(xué)顯微鏡，100×放大率(leicamicrosystems，germany)進行目測。使用leicadc照相機及l(fā)eicaim影像管理軟件采集結(jié)果，其中采用適當?shù)倪^濾器以準許目測有效負載熒光。

實施例1.裝載長春堿fl

此實施例表明長春堿的熒光結(jié)合物至細菌衍生的微細胞的細胞質(zhì)中的封裝。長春堿為常規(guī)用于治療某些類型癌癥，包括霍杰金氏淋巴瘤(hodgkin’slymphoma)、非小細胞肺癌、乳腺癌、頭頸癌及睪丸癌的抗微管藥物。

所采用的化合物長春堿fl為市售的且獲自lifetechnologies(thermofisherscientific)，molecular品牌。該化合物為通過亞甲基連接體與熒光染料fl的結(jié)合物長春堿。在此情形下諸如bodipyr6g、bodipytmr、bodipy581/591、bodipytr、bodipy630/650及bodipy650/665的其它bodipy熒光團可取代fl。參見themolecularhandbook-aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies(第11版)，部分1.4，“bodipydyeseries”，其內(nèi)容在此以引用的方式并入。

長春堿fl具有定義明確的熒光特征(激發(fā)505nm，發(fā)射513nm紅色熒光)。其結(jié)構(gòu)描繪如下。

在起始組合物含有空的微細胞的情況下，根據(jù)小規(guī)模方案裝載(溫育在每ml溶液1mg結(jié)合物中溫育)長春堿fl且洗滌，其中洗滌步驟重復(fù)三次。熒光成像的結(jié)果(圖1)顯示，所有裝載的微細胞發(fā)出亮紅色熒光，指示長春堿fl已轉(zhuǎn)移至微細胞細胞質(zhì)中。另外，長春堿fl分子保留在微細胞內(nèi)，盡管在整個洗滌步驟中濃度梯度反轉(zhuǎn)。

實施例2.裝載flutax-1

此實施例表明紫杉醇的熒光結(jié)合物至完整的細菌衍生的囊泡的細胞質(zhì)中的封裝。紫杉醇為使微管穩(wěn)定的紫杉烷，且因此在細胞分裂期間干擾微管的正常分解。作為有絲分裂抑制劑，紫杉醇用于化學(xué)療法中以治療肺癌、卵巢癌及乳腺癌、頭頸癌及卡波西肉瘤的晚期形式。

所采用的熒光紫杉烷衍生物flutax-1為紫杉醇與熒光素通過乙酰基丙氨酸連接體的市售結(jié)合物。常規(guī)地，認為flutax-1為治療學(xué)上無效的；因此，其僅作為研究試劑出售。對于此實例，結(jié)合物獲自市售來源tocrisbiosciences(bristol，uk)。

flutax-1(分子量：1283.2)具有定義明確的熒光特征(激發(fā)約495nm，發(fā)射約520nm；綠色熒光)。衍生物的正式名稱為2ar，4s，4as，6r，9s，11s，12s，12ar，12bs)-6，12b-雙(乙酰氧基)-9-[(2r，3s)-3-(苯甲酰氨基)-2-羥基-1-氧代-3-苯基丙氧基]-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氫-11-羥基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7,11-亞甲基-1h-環(huán)癸[3，4]苯并[1，2-b]氧雜環(huán)丁(oxet)-4-基酯n-[(3′，6′-二羥基-3-氧代螺[異苯并呋喃-1(3h)，9′-[9h]呫噸]-5-基)羰基]-l-丙氨酸。其化學(xué)結(jié)構(gòu)描繪如下。

將如上文所描述制備的pbs中的微細胞與1ml的200μg/mlflutax-1溶液一起溫育，且隨后依照小規(guī)模方案反復(fù)洗滌。

熒光成像(圖2)顯示，所有微細胞發(fā)出亮綠色熒光，表明flutax-1已轉(zhuǎn)移至微細胞細胞質(zhì)中，且大量flutax-1分子保持被囊封，盡管在整個洗滌步驟中濃度梯度反轉(zhuǎn)。相比于封裝flutax-1的微細胞，背景呈現(xiàn)黑色，證明幾乎沒有(littletono)外部flutax-1。

通過從微細胞提取藥物，繼而hplc分析且與已知濃度的flutax-1樣品的標準曲線進行比較來測定封裝在微細胞內(nèi)的flutax-1的量。如上述macdiarmid等人(2007)所描述，針對封裝有多柔比星的微細胞進行微細胞提取。針對flutax-1的定量研發(fā)出一種hplc方法。hplc方法特征包括(i)流動相：乙腈：milliqdh2o，50∶50，等度洗脫12分鐘，流動速率2毫升/分鐘。(ii)固定相：metalchem3utaxsil，100mm×4.6mm加上c18筒。(iii)柱溫：40℃。(iv)檢測：(a)spd-mloavp二極管陣列檢測器-228nm；(b)rf-10axl熒光檢測器(shimadzu)-激發(fā)495nm，發(fā)射520nm。(v)注射體積：50μl。(vi)hplc系統(tǒng)：shimadzuscl-10avp系統(tǒng)，包含sil-10avp自動注射器、lc-10advp泵、dgu-14a脫氣器、cto-l0avp柱烘箱、rf-10axl熒光檢測器及spd-m10avp二極管陣列檢測器，利用class-vp版本7.2.1軟件(shimadzucorporation，kyoto，japan)。

通過hplc測定用這些藥物裝載條件獲得的flutax-1含量為每1×10⁹個微細胞570ng(圖3)。通過使用阿伏伽德羅數(shù)，這等于每個微細胞封裝約270,000個flutax-1分子，其為紫杉醇封裝的顯著改良，其中每個微細胞flutax-1分子比紫杉醇分子多127倍(參見下文實施例9)。這同樣是驚人的，因為tf.pac(紫杉醇的水可溶衍生物)僅提供每個微細胞多25倍的分子(參見實施例10)。結(jié)果指示，熒光素熒光團增強flutax-1進入及保留在微細胞中。

實施例3.裝載紫杉醇oregon

此實施例表明，可將另一熒光紫杉醇結(jié)合物紫杉醇oregona/k/a“flutax-2”封裝至完整的細菌衍生的囊泡的細胞質(zhì)中。對于此衍生物，通過β-丙氨酸連接體將氟化熒光素部分oregon結(jié)合至紫杉醇的c7。氟化熒光素部分賦予衍生物分子熒光(激發(fā)約495nm，發(fā)射約525nm；綠色熒光)以及改良的水溶性。

所涉及的紫杉醇的衍生化產(chǎn)生生物非活性且因此治療無效的化學(xué)實體，其僅出于研究目的出售。紫杉醇oregon為市售的，因此，且對于此實施例，其獲自lifetechnologies(thermofisherscientific)。

衍生物的正式名稱為l-丙氨酸、n-[(2′，7′-二氟-3′，6′-二羥基-3-氧代螺[異苯并呋喃-1(3h)，9′-[9h]呫噸]-5-基)羰基]-(2ar，4s，4as，6r，9s，11s，12s，12ar，12bs)-6，12b-雙(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-9-[(2r，3s)-3-(苯甲酰氨基)-2-羥基-1-氧代-3-苯基丙氧基]-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氫-11-羥基。其化學(xué)結(jié)構(gòu)表示如下。

根據(jù)小規(guī)模方案制備pbs中的微細胞，將其裝載(100μg/ml結(jié)合物溶液的外部裝載濃度)且洗滌。熒光成像(圖4)顯示，所有微細胞發(fā)出亮綠色熒光，指示紫杉醇oregon已轉(zhuǎn)移至微細胞細胞質(zhì)中，且甚至在整個洗滌步驟中濃度梯度反轉(zhuǎn)后，大量結(jié)合物分子保留在微細胞中。相比于裝載的微細胞，背景呈現(xiàn)黑色證明幾乎沒有外部紫杉醇oregon

不得不間接測定封裝在微細胞內(nèi)的紫杉醇oregon的量，因為在此實例中破壞裝載的微細胞同樣導(dǎo)致裝載的化合物分解，妨礙通過hplc分析進行的定量。因此，通過熒光顯微鏡檢查，將裝載有紫杉醇green-488的微細胞中的(綠色)熒光強度與針對裝載有多柔比星的微細胞(其在提取及定量條件下為穩(wěn)定的)目測到的(紅色)自發(fā)熒光進行比較。參見下文實施例6，每10⁹個微細胞封裝約800ng多柔比星。關(guān)于在多柔比星的情況下觀測到的熒光，裝載有紫杉醇oregon的微細胞所觀測到的熒光的較高強度指示針對后者的類似濃度，即，每10⁹個微細胞約800ng藥物。此值與裝載紫杉醇的微細胞觀測到的每10⁹個微細胞小于10ng藥物的值形成對比(下文實施例9)。

實施例4.裝載fitc結(jié)合的紫杉醇

此實施例表明紫杉醇的異硫氰酸熒光素(fitc)衍生物(縮寫字“fcp”)有效封裝至完整的細菌衍生的囊泡的細胞質(zhì)中。熒光素基團(與flutax-1中所見一致)通過5-氧代-5-((6-硫脲基己基)氨基)戊酸連接體(即，相對長的連接體結(jié)構(gòu)域)結(jié)合至紫杉醇分子上的c2’位置而非c7位置(如flutax-1及紫杉醇oregon中一般)。在此，熒光素基團同樣賦予衍生物分子熒光(激發(fā)：495nm；發(fā)射：519nm)，且連接體提高其水溶解度。

fcp不為生物活性的且到目前為止僅出于研究目的使用。對于此實施例，fcp獲自idtaustralialtd.(boronia，victoria)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)如下。

在如所描述的起始組合物的情況下，根據(jù)小規(guī)模方案制備pbs中的微細胞，通過與fcp溶液(300μg/ml)一起溫育而裝載，且洗滌。熒光成像(圖5)顯示，所有微細胞均發(fā)出亮綠色熒光，指示fcp已轉(zhuǎn)移至微細胞細胞質(zhì)中，且在整個洗滌步驟中濃度梯度的反轉(zhuǎn)留下大量囊封在微細胞中的fcp分子。幾乎不存在外部fcp，如相對于封裝fcp的囊泡背景的黑色外觀所反映。

通過從微細胞提取藥物，繼而hplc分析來測定封裝在微細胞內(nèi)的fcp的量。進行微細胞提取，且如上文針對flutax-1的定量所描述采用hplc方法。

用這些藥物裝載條件獲得的fcp含量定量為每1×10⁹個微細胞550ng(圖6)。這等于每個微細胞封裝約230,000個flcp分子。此為紫杉醇封裝的顯著改良，其中每個微細胞多109倍的分子，盡管fcp為較大分子(分子量1455.6相對于853.9)的事實。

所封裝的fcp分子的數(shù)量類似于flutax-1的數(shù)量(約270,000)。fcp及flutax-1具有相同熒光團。然而，結(jié)合不同，c2′(fcp)相對于c7(flutax-1)，但紫杉醇oregon共有與flutax-1相同的c7結(jié)合位置。因此，熒光素熒光團的結(jié)構(gòu)且非分子的結(jié)合點對于促進藥物分子裝載至微細胞中而言至關(guān)重要。因此，結(jié)合點對熒光介導(dǎo)的化合物裝載至根據(jù)本發(fā)明的完整的細菌衍生的囊泡中的增強而言并非至關(guān)重要。

實施例5.裝載baclight^tmgreen

此實施例表明，細菌染色劑baclight^tmgreen可容易地封裝于細菌衍生的完整囊泡中。綠色熒光染料(吸收/發(fā)射分別為約480/516nm及約581/644nm)，baclight^tmgreen為市售的，且對于此實施例獲自lifetechnologies(thermofisherscientific)，molecular品牌。其化學(xué)結(jié)構(gòu)描繪如下。

將baclight^tmgreen溶液添加至pbs緩沖液中的微細胞達到200nm的最終濃度。依照小規(guī)模方案，在室溫下溫育微細胞30分鐘且如上文所描述進行三次重復(fù)洗滌步驟。

熒光成像(圖7)顯示，所有微細胞發(fā)出亮綠色熒光，指示baclighttmgreen已裝載至微細胞中。相對于如baclight^tmgreen染色的微細胞，黑色背景的外觀證明幾乎沒有外部染色劑。

通過流式細胞術(shù)(beckmancoulterfc500)分析封裝有baclight^tmgreen的微細胞。用抗-lpsalexa熒光647(af647)抗體標記空的微細胞及封裝baclight^tmgreen的微細胞。首先，使用fl4通道分析微細胞以檢測抗-lpsaf647染色的微細胞。在使用fl4熒光相對于向前散射的位圖中目測微細胞群體，且對該群體進行門控以僅選擇抗-lpsaf647染色的微細胞，不考慮任何碎片。

在fl1通道上分析門控的群體以檢測baclighttmgreen熒光。直方圖(圖8)表示當相比于空的微細胞(對數(shù)標度)時，作為完全相異群體的fl1熒光具有較大偏移的封裝baclight^tmgreen的微細胞。此指示，由于有效baclight^tmgreen并入，大于95％的微細胞為熒光的，且其表示，具有比空的微細胞所呈現(xiàn)大許多的fl1熒光的單一熒光群體。

實施例6.裝載多柔比星

此實施例表明，可將兩親性、自發(fā)熒光細胞毒素有效地封裝至細菌衍生的囊泡的細胞質(zhì)中。以下顯示細胞毒素多柔比星的蒽環(huán)結(jié)構(gòu)。多柔比星用于癌癥化學(xué)療法中，其通過化學(xué)半合成衍生自鏈霉菌屬細菌且為市售的。

依照大規(guī)模方法(在小規(guī)模上裝載加上大規(guī)模中的多個洗滌步驟，無離心，利用交叉流過濾)，pbs緩沖液中的微細胞裝載有多柔比星，且通過熒光顯微鏡檢查(激發(fā)480nm，發(fā)射580nm；紅色熒光)目測裝載的微細胞。成像結(jié)果(圖9)顯示，所有微細胞發(fā)出亮紅色熒光，其中相比于封裝多柔比星的微細胞，背景呈現(xiàn)黑色。

通過從微細胞提取藥物(如所描述)，繼而hplc分析來測定封裝在微細胞內(nèi)的多柔比星的量。hplc方法特征包括(i)流動相：0.1m甲酸銨(ph3.0)：milliqh2o：乙腈。梯度0.2分鐘28∶72∶0至28∶42∶30，等度5分鐘，變至28∶72∶0，等度15分鐘，流動速率1.25ml/分鐘。(ii)固定相：watersxbridgephenyl，3.5μm×4.6mm×150mm加上c18濾筒。(iii)柱溫：40℃。(iv)檢測：熒光-激發(fā)480nm，發(fā)射560nm。(v)注射體積：10μl。(vi)hplc系統(tǒng)：shimadzu10avp系統(tǒng)，包含自動進樣器、溶劑脫氣器、四元泵、柱加熱器及熒光檢測器，利用class-vp版本7.2.1軟件(shimadzucorporation，kyoto，japan)。

通過與已知量的多柔比星樣品的線性標準曲線進行比較，利用hplc測定用這些藥物裝載條件獲得的多柔比星的含量為大致每1×10⁹個微細胞770ng(圖10)。這等于裝載至各微細胞中約800,000個多柔比星分子。

實施例7.裝載熒光核酸染色劑

9為綠色熒光的核酸結(jié)合細菌染色劑(激發(fā)約485/6nm，發(fā)射約498/501nm)。對于此實施例，其獲自lifetechnologies(thermofisherscientific)，molecular品牌。

將9溶液添加至pbs緩沖液中的微細胞中達到20μm的最終濃度。依照小規(guī)模方案，溫育微細胞30分鐘且如先前所描述進行三次重復(fù)洗滌步驟。

使用如上文所描述的熒光顯微鏡目測封裝9green的微細胞，其中采用適當?shù)倪^濾器以準許目測9熒光。熒光成像(圖11)顯示，9已在幾乎無外部染色劑的情況下并入微細胞中。

通過流式細胞術(shù)(beckmancoulterfc500)分析封裝有syto的微細胞。用抗-lpsalexa熒光647(af647)抗體標記空的微細胞及9染色微細胞。首先，使用fl4通道分析微細胞以檢測抗-lpsaf647染色的微細胞。在使用fl4熒光相對于向前散射的點圖中目測微細胞群體，且對該群體進行門控以僅選擇抗-lpsaf647染色的微細胞，不考慮任何碎片。隨后在fl1通道上分析門控群體以檢測syto9熒光。

由此獲得的直方圖(圖12)表示當相比于空的微細胞(對數(shù)標度)時，作為相異群體的syto9染色微細胞具有fl1熒光偏移。此指示，由于syto9并入，微細胞為熒光的，且其表示，具有比空的微細胞所示大許多的fl1熒光的熒光群體。

實施例8.裝載9-氨基吖啶化合物

此實施例表明作為鹽酸鹽水合物化合物的熒光染料9-氨基吖啶可封裝至完整的細菌衍生的囊泡的細胞質(zhì)中。化合物9-氨基吖啶鹽酸鹽水合物(9-aahh)可獲自sigma-aldrich(st.louis，mo)且具有下文所示的結(jié)構(gòu)。

通過小規(guī)模方案制備裝載有9-aahh(溫育溶液：500μg/ml)的pbs中的微細胞(2.5×10¹⁰，且進行熒光顯微目測(激發(fā)400nm，發(fā)射420nm；藍色熒光)。熒光成像結(jié)果(圖13)指示9-氨基吖啶已轉(zhuǎn)移至微細胞細胞質(zhì)中且保留在那里，盡管在整個洗滌步驟中濃度梯度反轉(zhuǎn)。

實施例9.紫杉醇的低效裝載

此實施例表明，將疏水性、非熒光細胞毒性藥物紫杉醇(參見以下結(jié)構(gòu))裝載至完整的細菌衍生的囊泡的細胞質(zhì)中的效率低于紫杉醇的熒光衍生物的效率。

根據(jù)小規(guī)模方案制備pbs緩沖液中的微細胞。因此，將空的微細胞(游離內(nèi)毒素水平≤每10⁹個微細胞約2eu)添加至微量離心管中且離心(16,000g，10分鐘)。丟棄上清液且使微細胞沉淀物徹底重新懸浮于0.9mlpbs緩沖液中，該緩沖液被調(diào)節(jié)至ph3(必需較低ph以使溶液中的高疏水性紫杉醇保持溶解狀態(tài)持續(xù)至少30分鐘)。隨后向微細胞懸浮液中添加100μl的6mg/ml紫杉醇(于1∶1克列莫佛el∶etoh中)，得到600μg/ml的外部紫杉醇濃度。微細胞在37℃下旋轉(zhuǎn)溫育過夜。通過離心洗滌來洗滌非特異性連接至微細胞表面的過量紫杉醇溶液及分子。即，離心(16,000g，10分鐘)溫育后微細胞且丟棄紫杉醇裝載上清液。通過使球粒徹底地重新懸浮于1mlpbs(ph7.4)中，離心微細胞(16,000g，10分鐘)且丟棄上清液洗液來洗滌裝載紫杉醇的微細胞。重復(fù)洗滌步驟三次。最后，使裝載紫杉醇的微細胞重新懸浮于pbs中(ph7.4)。

使用hplc分析如上所述測定封裝在微細胞內(nèi)的紫杉醇的量。針對紫杉醇定量研發(fā)出的hplc方法具有包括以下的特征：(i)流動相：乙腈及milliqdh2o，等度0.24分鐘37∶63，自37∶63至60∶40梯度洗脫5分鐘，隨后歷經(jīng)1分鐘流動相返回至初始溶劑組成37∶63且維持在此水平直至結(jié)束，流動速率2ml/分鐘(操作時間8分鐘)；(ii)固定相：metalchem3utaxsil，100mm×4.6mm加上c18筒；(iii)柱溫：40℃；(iv)檢測：spd-m10avp二極管陣列檢測器-228nm；(v)注射體積：50μl：及(vi)hplc系統(tǒng)：shimadzuscl-10avp系統(tǒng)，包含sil-10avp自動注射器、lc-10advp泵、dgu-14a脫氣器、cto-10avp柱烘箱、spd-m10avp二極管陣列檢測器，利用class-vp版本7.2.1軟件(shimadzucorp.，kyoto，japan)。

通過與已知量的紫杉醇樣品的線性標準曲線進行比較，通過hplc定量用這些藥物裝載條件獲得的紫杉醇含量為每1×10⁹個微細胞3ng(圖14)。這等于每個微細胞囊封2115個紫杉醇分子，或大致分別比fcp及flutax-1少110-130倍。采用額外途徑以試圖使微細胞裝載有更大量的紫杉醇。其包括改變?nèi)軇?、緩沖劑、ph；使用環(huán)糊精/紫杉醇，包括復(fù)合物；使用助水溶劑，諸如水楊酸鈉及nn-二乙基煙堿酰胺；及使用膜不穩(wěn)定方法、化學(xué)(例如edta、cacl2處理)及物理(諸如音波穿孔)方法。所有測試途徑產(chǎn)生類似結(jié)果，其中紫杉醇裝載效率在每1×10⁹個微細胞0-10ng范圍內(nèi)。

實施例10.裝載水可溶紫杉醇類似物

此實施例表明2’-β-丙氨?；仙即技姿猁}或“tf.pac”(參見以下結(jié)構(gòu))(紫杉醇的水可溶類似物)的裝載效率僅略微高于紫杉醇自身的裝載效率。

由于結(jié)合至紫杉醇的c2’的β-丙氨?；仙即技姿猁}，tf.pac具有改良的可溶性。非市售，合成tf.pac以闡明是否僅是水溶解度不佳抑制紫杉醇至完整的細菌衍生的囊泡中的有效裝載。紫杉醇可溶于水中直至0.3μg/ml，同時tf.pac的可溶性為至少2mg/ml。

依照小規(guī)模方案使pbs緩沖液中的微細胞裝載有tf.pac(裝載溶液：每ml蒸餾水0.1％乙酸1mg化合物)。

因此通過從微細胞提取藥物，繼而hplc分析來測定封裝在微細胞內(nèi)的tf.pac的量。如上文針對封裝有多柔比星的微細胞所描述進行微細胞提取。所使用的hplc方法與針對紫杉醇定量研發(fā)出的方法一致。

通過hplc定量用這些藥物裝載條件獲得的平均tf.pac含量為每1×10⁹個微細胞78ng(圖15)，其等于每個微細胞封裝約50,000個tf.pac分子。因此裝載效率略微大于紫杉醇，但比flutax-1小約5.4倍。采用諸多緩沖劑以試圖使微細胞裝載有更大量tf.pac；然而，利用上文所描述的方法獲得的效率未提高。因此，僅提高化合物的水溶解度無法增強至完整的細菌衍生的囊泡中的裝載。

實施例11.多柔比星熒光淬滅劑葉酸影響多柔比星至完整微細胞中的裝載

此實施例測定熒光化合物在其熒光被淬滅時至完整的細菌衍生的囊泡中的裝載效率是否降低。在此情況下，化合物為自發(fā)熒光藥物多柔比星(dox)，且淬滅劑為葉酸(fa)。參見husseini，adv.sci.lett.7：726(2012)(fa淬滅dox熒光)。

材料及方法

將pbs中的多柔比星(100μg/ml)與各種濃度(即，0μg/ml、50μg/ml及400μg/ml)的fa混合。在室溫下溫育溶液過夜，且隨后通過0.1μm過濾器過濾以使溶液滅菌，且移除任何顆粒。

在第二天，用熒光盤讀取器測量各溶液的等分試樣的熒光(激發(fā)波長：485nm，發(fā)射波長：590nm及620nm)。同時，用pbs緩沖液洗滌微細胞且隨后裝載有各dox+fa溶液中的一者或另一者，所述溶液先前以2.5×10¹⁰個微細胞/ml的密度制備，體積在約1ml與2ml之間。在30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時及過夜的時刻自處理組中的每一個取出樣品(500μl)。

對于每一時間點，對微細胞進行以下小規(guī)模方案：

1.離心微細胞-16,000g持續(xù)7分鐘。

2.丟棄上清液(sn)且使球粒重新懸浮于1mlpbs緩沖液(ph7.4)中。

3.離心微細胞-16,000g持續(xù)7分鐘。

4.丟棄sn且使球粒再懸浮于0.5mlpbs緩沖液中。

5.傳送微細胞懸浮液通過0.8μm過濾器。

6.用另外0.5mlpbs洗滌過濾器且與微細胞組合。

7.離心微細胞-16,000g持續(xù)7分鐘。

8.丟棄sn且使球粒重新懸浮于1mlpbs緩沖液中。

9.離心微細胞-16,000g持續(xù)7分鐘。

10.丟棄sn且使球粒再懸浮于1mlpbs緩沖液中。

11.離心微細胞-16,000g持續(xù)7分鐘。

12.丟棄sn且最后使球粒重新懸浮于350μlpbs緩沖液中。

a.對于微細胞定量，針對納米顆粒示蹤分析(malveminstruments，uk)，使用nanosight技術(shù)等分20μl微細胞。

b.對于提取及hplc分析，使40μl微細胞成球粒(16,000g，15分鐘，丟棄sn，且球粒儲存在-20℃下)。

裝載多柔比星的微細胞作為離心球粒呈現(xiàn)粉紅色?；谕ㄟ^視覺檢查評估的相對顏色強度，顯而易見，在時間點中的每一個完成洗滌步驟后，在400μg/ml葉酸存在下裝載的微細胞含有明顯少于在葉酸不存在下裝載的那些微細胞的多柔比星。相比于0μg/ml葉酸，在50μg/ml葉酸樣品中同樣觀測到略微較少的裝載量。

表2.多柔比星裝載溶液的熒光讀數(shù)結(jié)果

觀測到，50μg/ml及400μg/ml葉酸在不同程度上淬滅100μg/mldox溶液的熒光(圖16)。當在485nm處激發(fā)溶液且在590nm或620nm處測量發(fā)射時，這是適用的。使用400μg/ml葉酸，多柔比星淬滅更明顯，其中多柔比星熒光發(fā)射信號損失約40％，而使用較低濃度的50μg/ml葉酸多柔比星發(fā)射熒光僅損失6％-7％。

通過比色法定量微細胞dox樣品

除使用hplc測定微細胞樣品中的每一個的dox含量以外，采用比色分析測量多柔比星含量，因為此測量不依賴于dox熒光。

多柔比星標準曲線

產(chǎn)生游離多柔比星的標準曲線。通過生物光度計在490nm處一式兩份測量各種濃度的pbs中多柔比星的吸光率。

結(jié)果

對平均數(shù)據(jù)進行線性回歸，其產(chǎn)生公式y(tǒng)＝0.019x，其中y為吸光率(abs490nm)且x為多柔比星的μg/ml(圖17)。因此，對于所測量的微細胞dox樣品，

μg/ml多柔比星＝abs490nm/0.019

微細胞dox樣品的比色法

根據(jù)上表，在比色杯中用pbs緩沖液(ph7.4)將來自各微細胞dox樣品的微細胞補足至200μl。也在比色杯中在200μlpbs(ph7.4)中補足含有空的微細胞的“空白”樣品。在490nm處測量空白微細胞樣品及所有微細胞dox樣品的吸光率。

表3.微細胞dox樣品的比色分析結(jié)果

結(jié)果呈現(xiàn)于以上表3中。大多數(shù)樣品過于接近0.472的空白吸光率(即，其在0.1的生物光度計誤差內(nèi))而不為適用的。對于大部分樣品而言，此比色分析的靈敏度過低，且因此大多數(shù)時間點的測量值波動。參見圖18。

hplc結(jié)果

如上述macdiarmid等人(2007)所描述，微細胞球粒被處理以便通過hplc進行分析。使用uv250nm檢測及相對熒光(rf)檢測兩者對各樣品中的dox進行定量。

來自uv250nm讀數(shù)的hplc定量呈現(xiàn)于圖19中，且來自相對熒光(rf)讀數(shù)的hplc定量顯示于圖20中。觀測到存在于裝載溶液中的葉酸的提高的量不利地影響多柔比星至微細胞中的裝載。葉酸的外部濃度愈高，裝載至完整微細胞中的多柔比星的濃度愈低。

實施例12.裝載米托蒽醌

此實施例說明米托蒽醌二鹽酸鹽(mtx)(固有熒光細胞毒性藥物，也稱為“米托蒽醌(mitozantrone)”)至完整的細菌衍生的囊泡中的增強裝載。蒽醌抗贅生劑mtx充當ii型拓撲異構(gòu)酶抑制劑，且已用于治療癌癥，諸如轉(zhuǎn)移性乳腺癌、急性髓性白血病及非霍奇金氏淋巴瘤。

米托蒽醌購自sigma-aldrich(st.louis，mo)。如上文所描述制備空的完整微細胞(3.2×10¹⁰/ml)。柱(0.65μm)獲自millipore(billerica，ma)，無菌pbs(ph7.4)獲自sigma-aldrich，且可注射鹽水獲自livingstoneint’l(rosebery，nsw)。

在鹽水中制備2mg/ml的mtx儲備溶液且通過0.1μm過濾器過濾。(米托蒽醌可溶于水達到大致5-7.5mg/ml。)將所得溶液儲存在4℃下且避光。

小規(guī)模方案經(jīng)調(diào)適用于此實施例中。因此，在單獨試管中以781μl等分試樣(2.5×10¹⁰最終)提供微細胞。在臺式eppendorf離心機上以13,200rpm旋轉(zhuǎn)試管8分鐘。移除上清液；使球粒重新懸浮于1mlpbs緩沖液(ph7.4)中，且隨后再次旋轉(zhuǎn)。使由此獲得的球粒重新懸浮于850μlpbs緩沖液中。

將一定體積(150μl)mtx(2mg/ml儲備液)添加至各微細胞懸浮液中以得到300μg/ml(外部濃度)的最終裝載溶液。伴隨在旋轉(zhuǎn)器上混合，在37℃下培肓樣品2小時、4小時或過夜(約12小時)。

在溫育后，以13,200rpm旋轉(zhuǎn)微細胞8分鐘且丟棄上清液。用1mlpbs(ph7.4)洗滌球粒且如上所述進行離心。丟棄上清液。

使球粒重新懸浮于0.5mlpbs(ph7.4)中且在室溫下旋轉(zhuǎn)溫育15分鐘。在溫育之后，將各樣品施加至0.65μm柱上，且以200g旋轉(zhuǎn)1分鐘或直至全部樣品流過。將流過物收集至新試管中。將新一批次0.5mlpbs(ph7.4)施加至同一過濾器中，且旋轉(zhuǎn)，且將流過物添加至初始0.5ml樣品中。

以13,200rpm將樣品離心8分鐘，且丟棄上清液。隨后使各樣品重新懸浮于350μlpbs(ph7.4)中。

使用nanosightltd(amesbury，wiltshire，uk)的產(chǎn)品lm20納米顆粒分析系統(tǒng)，利用含10μl微細胞的990μlpbs(ph7.4)進行微細胞樣品計數(shù)。結(jié)果如下：

2小時：6.24×10¹⁰/ml

4小時：5.77×10¹⁰/ml

過夜：5.93×10¹⁰/ml

以13,200rpm旋轉(zhuǎn)各樣品批料(20μl)8分鐘，且移除上清液，繼而進行針對微細胞樣品中的mtx含量的hplc分析。

通過hplc，各樣品中裝載至微細胞中的mtx的量測量為251nm處的峰面積(注射體積：50μl)。對于一式兩份樣品對(1，2：2小時裝載；3，4：4小時裝載；及5，6：過夜裝載)，結(jié)果如下，包括每個樣品的mtx含量及每10⁹個微細胞的mtx的量。

對于樣品5及6，在裝載過夜的情況下，10⁹個微細胞平均裝載有約0.56μgmtx。此意謂各微細胞含有約759,000個mtx分子，基于藥物的約444的分子量，根據(jù)themerckindexonline(2014)。

相比于同mtx一樣為固有熒光的多柔比星的濃度，微細胞內(nèi)部mtx濃度出人意料地高。參見consoli等人，leukemia11：2066-74(1997)；及bell，biochimbiophysacta949：132-37(1988)(mtx的最大激發(fā)及發(fā)射分別為約610nm及685nm)。也參見smith等人，cancerres.52：4000-08(1992)(低紅色熒光為514nm)。因此，認為略微小于多柔比星的mtx的高裝載效率是其熒光的函數(shù)。

實施例13.在離子存在下裝載熒光化合物

此實施例顯示，離子的存在加強初始實施例所證明的熒光介導(dǎo)的囊泡裝載增強。因此，認為囊泡培養(yǎng)基中的來自鹽解離的離子與細菌衍生的囊泡(此處為微細胞)的完整膜中的通道相互作用以強化對熒光化合物移動通過跨膜通道、化合物與通道中或沿通道排列的分子之間的能量轉(zhuǎn)移的上文所論述的作用。

與小規(guī)模方案一致，用1mlpbs(ph7.4)洗滌微細胞(每試管2.5×10¹⁰)一次，并離心(16,000g，7分鐘)且丟棄上清液。在15％乙醇、85％pbs(ph7.4)中，在具有或不具有200mmkcl(sigma-aldrich)的情況下用100μg/mlflutax-1(tocrisbiosciences)裝載經(jīng)洗滌的微細胞。

在37℃下旋轉(zhuǎn)試管。自各處理移出一個試管以便在15分鐘、45分鐘、2小時及5小時中的每一個時洗滌。各處理洗滌三次以移除試劑且保留微細胞。

通過hplc以上文所描述的方式測量flutax-1水平。因此，將測量值(uv228nm)與已知flutax-1量的標準曲線進行比較且外推得到1×10⁹個微細胞內(nèi)的flutax-1量。

如圖21所描繪，結(jié)果顯示，在裝載溶液中包括200mmkcl顯著增強flutax-1至完整微細胞中的裝載。即，較高鹽濃度與超過兩倍的裝載至微細胞中的熒光藥物的量相關(guān)。實際上，在短至微細胞/藥物共同溫育15分鐘之后，效果是明顯的。

為闡明其它離子鹽是否具有此效果，在等摩爾量的不同鹽存在下測試flutax-1至微細胞中的裝載；且如前所述通過hplc測量裝載量。因此，用1mlpbs(ph7.4)洗滌微細胞(每試管2.5×10¹⁰一次并離心(16,000g，7分鐘)，且丟棄上清液。在15％乙醇、85％pbs(ph7.4)中，在具有或不具有200mmkcl、nacl或kbr的情況下用100μg/mlflutax-1裝載經(jīng)洗滌的微細胞。在37℃下旋轉(zhuǎn)試管。從各條件移出一個試管以便在15分鐘及1小時中的每一個時洗滌。各處理如上文所描述洗滌三次。

如上文所描述裂解且提取微細胞，且在hplc條件下操作裂解物以便測量flutax-1水平。將測量值(uv228nm)與已知flutax-1量的曲線進行比較且外推獲得1×10⁹個微細胞中的flutax-1的量。

結(jié)果顯示在圖21中。在200mm下，所測試的鹽中的每一種顯著增強熒光藥物至微細胞中的裝載，其中在15分鐘及1小時時間點時的改良明顯。圖22中的條形圖表示來自15分鐘時間點的組合數(shù)據(jù)。在各實驗(例如無鹽相對于200mmkcl)中所進行的相同處理提供高度一致的一式兩份數(shù)據(jù)。

鹽kcl、nacl及kbr中的每一種提高熒光藥物至細菌衍生的完整囊泡中的裝載效率，此處在15分鐘時提高了大致2倍。裝載實際上在溫育約4小時內(nèi)完成。這些觀測結(jié)果強調(diào)，通過使囊泡及熒光化合物與添加至外部環(huán)境的陽離子和/或陰離子一起共同溫育來增強熒光化合物至完整囊泡中的裝載。相比之下，離子對另外類似但非熒光化合物的裝載無此類影響。

發(fā)現(xiàn)此離子效果受共同溫育溫度影響。例如，當在hepes鹽水緩沖液(ph6.8)中制備細菌衍生的完整微細胞且通過基本上如上文所描述，分別在室溫(約22℃)及約37℃下與多柔比星一起共同溫育裝載藥物時，基于hplc的不同時間點囊泡內(nèi)多柔比星水平的定量的結(jié)果如下：

表5

這些數(shù)據(jù)的圖形表示(圖23)顯示，當在約37℃下進行共同溫育時裝載至微細胞中的熒光化合物的量大于室溫下的量超過100％。(膜降解導(dǎo)致比約37℃高得多的任何共同溫育溫度不可行。)

實施例14.本發(fā)明大規(guī)模方法優(yōu)于常規(guī)小規(guī)模方案的優(yōu)勢

此實施例將上文相對于macdiarmid等人(2007)所論述的小規(guī)模方案與本發(fā)明的大規(guī)模方法進行比較。如該實施例所表明，本發(fā)明方法為含有完整的細菌衍生的囊泡的組合物提供出人意料地更好稠度及純度。這是因為本發(fā)明的大規(guī)模方法不僅顯著降低內(nèi)毒素水平，且也減少截留在囊泡外部的有效負載化合物。

小規(guī)模方案

基本上根據(jù)macdiarmid等人(2007)的方法制備完整微細胞且裝載有多柔比星，除了微細胞不攜帶任何靶向雙特異性配體，且因此將不會被靶宿主細胞攝取。在37℃下與藥物(約1ml/mg)-起旋轉(zhuǎn)溫育過夜后，裝載的微細胞經(jīng)五次洗滌步驟，其需要離心(13,200rpm，10分鐘)及所得球粒于1mlbsg緩沖液(ph7.4)中的重新懸浮。

隨后在補充有10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺及100u/ml青霉素g及鏈霉素兩者的gibcorpmi-1640組織培養(yǎng)基(以每孔0.5ml形式)中將經(jīng)洗滌的裝載多柔比星的微細胞(1x10⁸)與雌激素受體陰性的mda-mb-468人乳腺癌細胞(每孔10⁴個細胞)一起溫育。

隨后通過共聚焦顯微鏡檢查每24小時監(jiān)測細胞。在兩天內(nèi)，癌細胞在其核內(nèi)呈現(xiàn)紅色熒光，指示多柔比星進入，但裝載的微細胞未被細胞靶向攝取。因此，小規(guī)模方案導(dǎo)致額外多柔比星在微細胞表面上的截留，其瀝濾至組織培養(yǎng)基中且進入癌細胞中。

大規(guī)模方法

獨立于封裝多柔比星的微細胞制備五個批料且用結(jié)合egfr的雙特異性配體靶向(參見macdiarmid等人(2007)第443頁第二段“experimentalprocedures”)。根據(jù)大規(guī)模方法，裝載多柔比星且靶向egfr的微細胞經(jīng)五次pbs緩沖液連續(xù)洗滌，每次洗滌約20升，通過較大交叉流過濾器。

對于各批次微細胞，如上文所描述測定多柔比星濃度，且通過標準lal分析測量游離內(nèi)毒素的水平。參見例如dawson，lalupdate，第22卷，第3期(2005年10月)。結(jié)果列表于下面。

如這些結(jié)果所示，大規(guī)模方法提供每1×10⁹個微細胞約672ng±58ng的裝載微細胞的平均多柔比星濃度。用大規(guī)模方法實現(xiàn)的實質(zhì)上改良的純度通過每1×10⁹個微細胞2.99eu±1.45eu的平均游離內(nèi)毒素水平來證明。

雖然已說明且描述某些實施方式，但應(yīng)理解，可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在不脫離如以下權(quán)利要求中所定義的其較廣方面的技術(shù)的情況下在其中進行改變及修改。

上文所說明性地描述的實施方式可在不存在未特定公開的任何一或多個要素、一或多個限制的情況下適當?shù)貙嵺`。例如，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”等應(yīng)廣泛地且無限制地理解。另外，本文中所采用的術(shù)語及表述以說明且不受限制的方式使用，且在使用這些術(shù)語及表述時不欲排除所顯示及所描述特征的任何等效物或其部分，但應(yīng)認識到可在所要求保護的技術(shù)的范圍內(nèi)進行各種修改。另外，詞組“主要由......組成”應(yīng)理解為包括那些特定列舉的要素及那些并未實質(zhì)上影響所請求保護的技術(shù)的基本及新穎特征的額外要素。詞組“由......組成”不包括任何未規(guī)定的要素。

就在本說明書中所描述的特定實施方式而言本發(fā)明并非限制性的。如對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，可在不脫離其精神及范圍的情況下進行許多修改及改變。除本文中所列舉的那些外，根據(jù)前述描述，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的功能上等效的方法及組合物對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。此類修改及改變意欲落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的術(shù)語以及此權(quán)利要求所賦予權(quán)利的等效物的完整范圍限制。應(yīng)理解，本發(fā)明不限于特定方法、試劑、化合物組合物或生物系統(tǒng)，其當然可改變。同樣應(yīng)理解，本文所使用的術(shù)語僅出于描述特定實施方式的目的且不意欲為限制性的。

另外，在根據(jù)馬庫什群組描述本發(fā)明的特征或方面時，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，本發(fā)明也從而根據(jù)馬庫什群組成員的任何個別成員或子群組進行描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，出于任何及所有目的，尤其就提供書面說明而言，本文所公開的所有范圍也涵蓋其任何及所有可能的子范圍及子范圍組合。任何列出的范圍可因足夠說明而容易地識別且能夠?qū)⑼环秶纸鉃橹辽傧嗤膬煞?、三份、四份、五份、十份等。作為非限制性實例，本文所討論的各范圍可容易地分解為下部三分之一、中間三分之一及上部三分之一等。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)理解，所有語言，諸如“高達”、“至少”、“大于”、“小于”及其類似者均包括所列舉的數(shù)字且指可隨后如上文所討論分解為子范圍的范圍。最終，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，范圍包括各個別成員。

本說明書中所提及的所有出版物、專利申請、頒發(fā)專利及其它文件均以引用的方式并入本文中，該引用程度就如同已特定地且個別地將各個出版物、專利申請、頒發(fā)專利或其它文件以全文引用的方式并入本文中一般。在以引用的方式并入的正文中所含的定義若與在本發(fā)明中的定義矛盾，則將其排除在外。

其它實施方式闡述于以下權(quán)利要求中。