本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)和肽的新的綴合方法，以及涉及新的綴合試劑。
背景技術(shù)：
：近年來，大量的研究一直致力于多種有效載荷(payload)(例如診斷、治療和標(biāo)記試劑)與肽和蛋白質(zhì)的綴合，以用于多種應(yīng)用。所述蛋白質(zhì)和肽本身具有治療特性，和/或其可為結(jié)合蛋白。肽和蛋白質(zhì)具有作為治療試劑的潛在用途，綴合是提高其性能的一種方法。例如，水溶性的合成聚合物，特別是聚亞烷基二醇，被廣泛用于綴合治療性活性肽或蛋白質(zhì)。已表明這些治療性綴合物通過延長循環(huán)時間和降低清除率、降低全身毒性以及在一些情況中顯示出提高的臨床功效而有利地改變藥代動力學(xué)。將聚乙二醇PEG共價綴合到蛋白質(zhì)上的方法通常被稱為“PEG化”。結(jié)合蛋白，特別是抗體或抗體片段，通常是綴合的。結(jié)合蛋白對靶細(xì)胞表面上的特定標(biāo)記物的特異性以及對分子的特異性使它們自身被廣泛用作診斷或治療試劑或被用作有效載荷的載體，所述有效載荷可包括診斷和治療試劑。這些與標(biāo)記和報道基團(tuán)(例如熒光團(tuán)、放射性同位素和酶)綴合的蛋白質(zhì)用于標(biāo)記和成像應(yīng)用，而綴合至細(xì)胞毒性試劑和化療藥物以產(chǎn)生抗體-藥物綴合物(ADC)使得將這類試劑被靶向遞送到特定的組織或結(jié)構(gòu)(例如特定的細(xì)胞類型)，將對正常的、健康組織的影響最小化并且顯著減少與化療治療相關(guān)的副作用。這樣的綴合物在許多疾病領(lǐng)域，特別是癌癥領(lǐng)域中具有廣泛的潛在的治療應(yīng)用。文獻(xiàn)中已報道了許多蛋白質(zhì)和肽的綴合方法。例如，WO95/13312記載了經(jīng)由砜部分的綴合?？赡茏畛Ｊ褂玫姆椒òㄊ褂没隈R來酰亞胺的綴合試劑。這樣的試劑記載于許多出版物中，例如WO2004/060965。產(chǎn)生更均一產(chǎn)物的替代性方法記載于Liberatoreetal，Bioconj.Chem1990，1，36-50和delRosarioetal，Bioconj.Chem.1990，1，51-59中，其記載了可用于通過蛋白質(zhì)(包括抗體)中的二硫鍵交聯(lián)的試劑的用途。WO2005/007197記載了使用新的綴合試劑以使聚合物與蛋白綴合的方法，所述新的綴合試劑能夠與源自蛋白質(zhì)中的二硫鍵的兩個硫原子綴合以產(chǎn)生新的硫醚綴合物，而WO2009/047500記載了使用相同的綴合試劑以結(jié)合至蛋白所連接的多聚組氨酸標(biāo)記。WO2010/010324記載了能夠結(jié)合至蛋白中的單一親核基團(tuán)的單一功能試劑的用途。WO2013/190292、WO2014/064424、WO2014/184564和WO2014/064423均記載了使用多種綴合試劑的綴合方法。大多數(shù)綴合方法的共同特征是，綴合反應(yīng)包括失去綴合試劑中存在的離去基團(tuán)，以及所產(chǎn)生的部分與蛋白質(zhì)中存在的親核基團(tuán)的反應(yīng)。已報道的離去基團(tuán)包括以下類型的基團(tuán)：-SR、-OR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2和-N+H2R，其中R是烷基或芳基和鹵素。Marculescuetal，Chem.Commun.2014，50，7139-7142公開了含有多種離去基團(tuán)的芳氧基馬來酰亞胺綴合試劑。在其他離去基團(tuán)中，公開了包含MeO-(CH2CH2O)2-CH2CH2-的基團(tuán)。相同的結(jié)構(gòu)公開于ChristinaMarculescu的博士論文，“DevelopmentofNovelMaleimideReagentsforProteinModification”，UniversityCollegeLondon，August2014中。出乎意料的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過采用新的離去基團(tuán)替換已知綴合試劑中的已知離去基團(tuán)可獲得改善的結(jié)果，所述新的離去基團(tuán)包含確定數(shù)目的源自乙二醇的重復(fù)單元。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了肽或蛋白質(zhì)的綴合方法，所述方法包括使所述肽或蛋白質(zhì)與綴合試劑反應(yīng)，所述綴合試劑能夠與所述肽或蛋白質(zhì)中存在的至少一個親核基團(tuán)反應(yīng)，所述試劑包含至少一個離去基團(tuán)，所述離去基團(tuán)在與所述親核基團(tuán)反應(yīng)時失去；其特征在于，所述離去基團(tuán)包含-(CH2CH2O)n-部分，其中n是6或更大的數(shù)值。能夠與肽或蛋白質(zhì)中存在的至少一個親核基團(tuán)反應(yīng)的綴合試劑是新的，所述綴合試劑包含至少一個離去基團(tuán)，所述離去基團(tuán)在與所述親核基團(tuán)反應(yīng)時失去，其特征在于，所述離去基團(tuán)包括-(CH2CH2O)n-部分，其中n為6或更大數(shù)值，因此本發(fā)明提供了這樣的綴合試劑本身。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了肽或蛋白質(zhì)的綴合方法，所述方法包括使所述肽或蛋白質(zhì)與綴合試劑反應(yīng)，所述綴合試劑能夠與所述肽或蛋白質(zhì)中的兩個親核基團(tuán)反應(yīng)，所述試劑包含離去基團(tuán)，所述離去基團(tuán)在與所述親核基團(tuán)反應(yīng)時失去，其在所述綴合試劑內(nèi)部具有兩個連接點(diǎn)，并且其包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大數(shù)值。能夠與肽或蛋白質(zhì)中存在的兩個親核基團(tuán)反應(yīng)的綴合試劑是新的，所述綴合試劑包含在與所述親核基團(tuán)反應(yīng)時失去的離去基團(tuán)，其中所述離去基團(tuán)在所述綴合試劑內(nèi)部具有兩個連接點(diǎn)，并且其包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大數(shù)值，因此本發(fā)明提供了這樣的綴合試劑本身。在本說明書全文中，為了方便，將肽和蛋白質(zhì)共同稱為“蛋白質(zhì)”，除非上下文另有要求，提及“蛋白質(zhì)”應(yīng)當(dāng)理解為包括提及蛋白質(zhì)和肽兩者。具體實(shí)施方式離去基團(tuán)本發(fā)明基于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn)：當(dāng)包含至少一個離去基團(tuán)的綴合試劑與蛋白質(zhì)中存在的至少一個親核基團(tuán)反應(yīng)時，與已知的離去基團(tuán)相比，包含重復(fù)單元-(CH2CH2O)n-—－其中n至少為6或n1至少為2——的基團(tuán)是改進(jìn)的離去基團(tuán)；并且在n至少為6的情況下，與具有更少的-(CH2CH2O)-重復(fù)單元的類似離去基團(tuán)相比，包含重復(fù)單元-(CH2CH2O)n-——其中n至少為6或n1至少為2——的基團(tuán)是改進(jìn)的離去基團(tuán)。新的離去基團(tuán)可例如包括-(CH2CH2O)n-R1，其中R1是封端基團(tuán)。可使用眾多種類的封端基團(tuán)。例如R1可以是氫原子；烷基，特別是C1-4烷基，特別是甲基；或任選取代的芳基，例如任選取代的苯基，例如甲苯基。或者，所述封端基團(tuán)可包括官能團(tuán)例如羧基或胺基。這類封端基團(tuán)可例如具有式-CH2CH2CO2H或-CH2CH2NH2，并且可通過使-(CH2CH2O)n-鏈的末端單元官能化來制備。或者，-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-基團(tuán)不被封端基團(tuán)封端，而是在所述綴合試劑內(nèi)部可具有兩個連接點(diǎn)，從而在化學(xué)上相當(dāng)于存在兩個能夠與兩個親核基團(tuán)反應(yīng)的離去基團(tuán)。所述離去基團(tuán)的-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-部分基于PEG聚乙二醇。PEG可以是直鏈或支鏈的，并且可以是以任何方式衍生的或官能化的。n是6或更大數(shù)值，例如6、7、8、9或10或更多。例如，n可以為6至9。n1是2或更大數(shù)值，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多。例如，n1可至少為4；或n1可至少為5，例如5至9；或n1可至少為6，例如6至9。n或n1沒有特定的上限。n或n1可為例如150或更低，例如120或更低，例如100或更低。例如n可以為6或7至150，例如6或7至120，而n1可以為2、3、4、5、6或7至150，例如4、5、6或7至150，例如4、5、6或7至120。離去基團(tuán)的PEG部分-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-可例如具有1至5kDa的分子量；所述分子量可例如為1kDa、2kDa、3kDa、4kDa或5kDa。如果需要，離去基團(tuán)可包含兩個或更多個被一個或更多個間隔基分隔開的-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-部分。本發(fā)明的綴合試劑中的離去基團(tuán)合適地具有式-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P或-N+PR2R3，其中P是包含-(CH2CH2O)n-部分的基團(tuán)，并且R2和R3各自獨(dú)立地代表氫原子、C1-4烷基或基團(tuán)P。離去基團(tuán)-N+PR2R3可通過基團(tuán)-NPR2的質(zhì)子化作用或季銨化作用來制備。優(yōu)選地，R2和R3各自代表C1-4烷基，特別是甲基，或特別地代表氫原子。或者，所述綴合試劑可包括式-S-P-S-、-O-P-O-、-SO2-P-SO2-、-OSO2-P-OSO2-和-N+R2R3-P-N+R2R3-的基團(tuán)，其中P是包含-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-部分的基團(tuán)。如上所述，離去基團(tuán)-N+R2R3-P-N+R2R3-可通過基團(tuán)-NPR2-P-NR2的質(zhì)子化作用或季銨化作用來制備。這種類型的具體基團(tuán)包括-S-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-S-、-O-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-O-、-SO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-SO2-、-OSO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-OSO2-或-N+R2R3-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N+R2R3-，或包含n1而非n的對應(yīng)基團(tuán)。它們也可包括以下類型的基團(tuán)：或包含n1而非n的對應(yīng)基團(tuán)，其中-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-由任何適合的連接基團(tuán)(例如亞烷基)攜帶。這些二價基團(tuán)在化學(xué)上等價于能夠與兩個親核基團(tuán)反應(yīng)的兩個離去基團(tuán)。如果存在兩個或更多個P基團(tuán)，則每個P可以是相同或不同的。優(yōu)選地，所述離去基團(tuán)為式-OSO2-P-OSO2-，例如-SO2-(CH2.CH2O)n1-CH2-CH2-SO2-，或者特別是-SO2P。P可例如包括式-T-(CH2.CH2O)n-的基團(tuán)，其中T為接頭。P可例如具有式-T-(CH2.CH2O)n-OR1。T可例如為直接的鍵，烷基——例如C1-4烷基，或任選取代的芳基，特別是任選取代的苯基。為C1-4烷基的接頭T的存在通常是便利的，因?yàn)榫Y合試劑的制備通常涉及使用市售的PEG，并且這些PEG通常由產(chǎn)生基團(tuán)T的基團(tuán)來封端。綴合試劑許多可用于將有效載荷綴合至蛋白質(zhì)的綴合試劑是已知的，本發(fā)明的新的綴合試劑于這些已知試劑的區(qū)別在于它們所包含的離去基團(tuán)的性質(zhì)。本發(fā)明的綴合試劑必須包含至少一個本發(fā)明的新的離去基團(tuán)。其可包含兩個或更多個離去基團(tuán)。如果存在兩個或更多個新的離去基團(tuán)，這些離去基團(tuán)可以是相同或不同的。例如，一個離去基團(tuán)可以是本發(fā)明的新的離去基團(tuán)，而另一個離去基團(tuán)可以是常規(guī)離去基團(tuán)。如果存在兩個或更多個本發(fā)明的新的離去基團(tuán)，它們可以是相同或不同的，例如它們可包含其中每個n均不同的部分?；蛘?，如上所述，綴合試劑可包含單個基團(tuán)，所述基團(tuán)在化學(xué)上等價于兩個離去基團(tuán)并且能夠與兩個親核基團(tuán)反應(yīng)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述綴合試劑包含本發(fā)明的兩種離去基團(tuán)，或包含在化學(xué)上等價于兩個離去基團(tuán)并且能夠與兩個親核基團(tuán)反應(yīng)的單個基團(tuán)，所述試劑能夠與蛋白質(zhì)或肽中的二硫鍵還原而形成的兩個巰基反應(yīng)。使用這樣的試劑，通過有效地橋連蛋白質(zhì)或肽中的二硫鍵而產(chǎn)生綴合物。所述試劑的一個基團(tuán)基于雙鹵代或雙硫代馬來酰亞胺或其衍生物，如Smithetal，J.Am.Chem.Soc.2010，132，1960-1965和Schumakeretal，Bioconj.Chem.，2011，22，132-136中所描述的。這些試劑包含以下官能團(tuán)：其中至少一個、優(yōu)選每一個L是本發(fā)明的離去基團(tuán)。馬來酰亞胺環(huán)的氮原子可攜帶有效載荷，例如診斷、治療或標(biāo)記試劑，或用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑，例如下文提及的式D-Q-之一。這些試劑能夠橋連蛋白質(zhì)或肽中的二硫鍵。類似地，可使用含有單個離去基團(tuán)L的馬來酰亞胺：同樣，馬來酰亞胺環(huán)的氮原子可攜帶有效載荷，例如下文提及的式D-Q-之一。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述綴合試劑包含以下官能團(tuán)：其中W代表吸電子基團(tuán)，例如酮基、酯基-O-CO-、砜基-SO2-或氰基；A代表C1-5亞烷基鏈或亞烯基鏈；B代表鍵或C1-4亞烷基鏈或亞烯基鏈；以及每個L獨(dú)立地代表離去基團(tuán)，其中至少一個、優(yōu)選兩個必須是本發(fā)明的新的離去基團(tuán)，或者兩個L共同代表本發(fā)明的離去基團(tuán)。使用常規(guī)離去基團(tuán)的這種類型的試劑記載于Bioconj.Chem1990(1)，36-50，Bioconj.Chem1990(1)，51-59和J.Am.Chem.Soc.110，5211-5212中。當(dāng)包含這類基團(tuán)的試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)時，其失去第一離去基團(tuán)L以原位形成包含下式的官能團(tuán)的綴合試劑：其中m是0至4，所述綴合試劑與第一親核基團(tuán)反應(yīng)。然后失去第二離去基團(tuán)L，并且發(fā)生與第二親核基團(tuán)的反應(yīng)。作為將包含官能團(tuán)I的試劑用作起始物質(zhì)的替代，可將包含官能團(tuán)I’的試劑用作起始物質(zhì)。優(yōu)選地，W代表酮基。優(yōu)選地，A代表-CH2-且B代表鍵。式I和I’的特別優(yōu)選的官能團(tuán)具有下式：例如，所述基團(tuán)可以具有下式：綴合試劑的另一種基團(tuán)包含以下官能團(tuán)：～W-CR4R4′-CR4.L.L′(II)其中W具有上文給出含義和優(yōu)選含義，以及或者各R4代表氫原子或C1-4烷基，R4′代表氫原子，以及各L獨(dú)立地代表離去基團(tuán)，其中至少一個、優(yōu)選兩個必須為本發(fā)明的新的離去基團(tuán)，或者兩個L共同代表本發(fā)明的離去基團(tuán)；或各R4代表氫原子或C1-4烷基，L代表本發(fā)明的離去基團(tuán)，并且R4′和L′共同代表鍵。包含官能團(tuán)I、I′或II的試劑能夠橋連蛋白質(zhì)或肽中的二硫鍵。綴合試劑的另一種基團(tuán)包含以下官能團(tuán)：～W-(CH＝CH)p-(CH2)2-L(III)其中W具有上文給出含義和優(yōu)選含義，并且p代表0或1至4的整數(shù)，優(yōu)選0。這種類型的特別優(yōu)選的試劑包含以下官能團(tuán)：～NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L(IIIa)其中Ar代表任選取代的芳基，特別是苯基。本發(fā)明的綴合試劑可包含多于一種官能團(tuán)以與蛋白質(zhì)反應(yīng)。例如，試劑可在分子的一端包含式I或I′的官能團(tuán)，或在分子的其他位置包含含有至少一個本發(fā)明的離去基團(tuán)的任何其他官能團(tuán)，以及一個或更多個額外的官能團(tuán)，所述額外的官能團(tuán)含有本發(fā)明的一個新的離去基團(tuán)或?yàn)槟軌蚺c蛋白質(zhì)或任何其他分子綴合的常規(guī)官能團(tuán)。這樣的結(jié)構(gòu)記載于例如Belchevaetal，J.Biomater.SciPolymerEdn.9(3)，207-226，并且適用于包含多個蛋白質(zhì)的綴合物的合成?？赏ㄟ^與已知方法類似的方法來制備本發(fā)明的新的綴合試劑。例如，可以通過與引入常規(guī)離去基團(tuán)相同的方式，將基于PEG且攜帶合適的官能團(tuán)的分子引入綴合試劑中。例如，使用Mannich反應(yīng)，可將氨基或巰基封端的PEG引入含有羰基的化合物中。具體反應(yīng)將在以下實(shí)施例中進(jìn)行說明。有效載荷綴合試劑可攜帶有效載荷，例如診斷、治療或標(biāo)記試劑，或用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑。在本申請中，包含式I/I′的單元的試劑可具有式(Ic)或(Ic′)，或其中W代表氰基、(Id)或(Id′)：其中Q代表連接基團(tuán)且D代表有效載荷，優(yōu)選診斷、治療或標(biāo)記試劑，或用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑。優(yōu)選D-Q-包括藥物或聚合物或藥物和聚合物兩者。如果存在藥物，則所述藥物可例如為細(xì)胞毒性藥物；如果存在聚合物，則所述聚合物優(yōu)選為聚乙二醇。如果D代表用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑，則優(yōu)選的結(jié)構(gòu)當(dāng)然將取決于最終所需產(chǎn)品中的診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)構(gòu)。例如，可存在能夠與診斷、治療或標(biāo)記試劑反應(yīng)的任何官能團(tuán)。例如，可存在官能團(tuán)，例如-CO2H或其反應(yīng)性衍生物、-NH2或-OH。羧酸基團(tuán)的活化衍生物是本領(lǐng)域公知的。例如，可通過使用活化的酯(例如H-羥基琥珀酰亞胺酯)或酸性鹵化物來活化羧酸。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，Q是任選取代的苯基，D是用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑，例如-CO2H、-NH2或-OH基團(tuán)?？墒褂萌魏芜m合的連接基團(tuán)Q。在一個實(shí)施方案中，Q可例如為直接的鍵、亞烷基(優(yōu)選C1-10亞烷基)，或任選取代的芳基或雜芳基，其中任何基團(tuán)都可被一個或更多個以下原子或基團(tuán)封端或(在亞烷基的情況下)中斷：氧原子、硫原子、-NR基團(tuán)(其中R代表氫原子或烷基(優(yōu)選C1-6烷基)、芳基(優(yōu)選苯基)或烷基-芳基(優(yōu)選C1-6烷基苯基))、酮基、-O-CO-基團(tuán)、-CO-O-基團(tuán)、-O-CO-O-、-O-CO-NR-、-NR-CO-O-、-CO-NR-和/或-NR.CO-基團(tuán)。這類芳基和雜芳基Q形成本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案。適合的芳基包括苯基和萘基，而適合的雜芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、噠嗪、嘧啶和嘌呤。特別適合的連接基團(tuán)Q是雜芳基或特別是芳基，特別是苯基。當(dāng)D是結(jié)合基團(tuán)時，這些可例如包含如上所述的-CO2H、-NH2或-OH。當(dāng)D是診斷、治療或標(biāo)記試劑時，這些可具有與基團(tuán)D連接的連接基團(tuán)，例如-NR.CO-或-CO.NR-基團(tuán)或包含-NR.CO-或-CO.NR-基團(tuán)的基團(tuán)，例如-NH.CO-或-CO.NH-基團(tuán)。其中D包含結(jié)合基團(tuán)的具體的基團(tuán)D-Q-，包括以下基團(tuán)：其中D代表結(jié)合基團(tuán)，例如-CO2H、-NH2或-OH，m和q各自代表從1至6的整數(shù)，例如2或3，其中苯環(huán)可以是未取代的或被例如下文提及的任何取代基取代?？纱嬖谟谌芜x取代的芳基，特別是苯基，或雜芳基上的取代基包括例如一種或更多種相同或不同的選自以下基團(tuán)的取代基：烷基(優(yōu)選C1-4烷基，特別是甲基，任選地被OH或CO2H取代)、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR.CO2R、-NO、-NHOH、-NR.OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR.COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、鹵素例如氟或氯、-C≡CR、-C＝CR2和-C＝CHR，其中每個R獨(dú)立地代表氫原子或烷基(優(yōu)選C1-6烷基)、芳基(優(yōu)選苯基)或烷基芳基(優(yōu)選C1-6烷基苯基)。特別優(yōu)選存在吸電子取代基。優(yōu)選的取代基包括例如CN、NO2、-OR、-OCOR、-SR、-NHCOR、-NR.COR、-NHOH和-NR.COR。在另一個實(shí)施方案中，接頭Q可包含可降解基團(tuán)，即它可包含在生理?xiàng)l件下斷裂的基團(tuán)，使D與其最終將連接的蛋白質(zhì)分離?；蛘撸琎可以是在生理?xiàng)l件下不可裂解的接頭。當(dāng)接頭在生理?xiàng)l件下斷裂時，它優(yōu)選可在細(xì)胞內(nèi)條件下裂解。當(dāng)靶標(biāo)是細(xì)胞內(nèi)時，優(yōu)選所述接頭基本上對細(xì)胞外條件不敏感(即因此將充足劑量的治療試劑向胞內(nèi)靶標(biāo)的遞送不受到抑制)。當(dāng)Q包含可降解基團(tuán)時，該基團(tuán)通常對水解條件敏感，例如它可以是在某一pH值下(例如酸性條件)降解的基團(tuán)。水解/酸性條件可例如在核內(nèi)體或溶酶體中。在酸性條件下易于水解的基團(tuán)的實(shí)例包括腙類、縮氨基脲類、硫代縮氨基脲類、順式烏頭酰胺類(cis-acotinicamides)、原酸酯類和縮酮類。易受水解條件影響的基團(tuán)的實(shí)例包括：在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接頭是或包括：例如，它可以是或包括：所述接頭Q也可以在還原條件下易于降解。例如，它可以包含二硫鍵，其在暴露于生物還原劑如硫醇之后可裂解。二硫基團(tuán)的實(shí)例包括：其中R、R’、R”和R”’分別獨(dú)立地為氫或C1-4烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接頭是或包括：例如，它可以是或包括：所述接頭Q也可包含易于酶解的基團(tuán)，例如它可易于被蛋白酶(例如溶酶體或核內(nèi)體蛋白酶)或肽酶裂解。例如，它可包含含有至少一個，例如至少兩個或至少三個氨基酸殘基(例如Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Ala、Val-Cit、Phe-Lys)的肽基。例如，它可以是或包含具有1至5個(例如2至4個)氨基酸的氨基酸鏈。易于酶解的基團(tuán)的另一個實(shí)例是：其中AA代表蛋白酶特異性氨基酸序列，例如Val-Cit。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭Q是或包括：例如，它可以是或包括所述接頭Q可攜帶單個基團(tuán)D，或多于一個基團(tuán)D。可通過使用分支接頭Q來并入多個基團(tuán)D，所述分支接頭Q可例如并入天冬氨酸或谷氨酸或類似的殘基。這引入下式的分支元件：其中b是1、2或3，b＝1為天冬氨酸，b＝2為谷氨酸，b＝3代表一個優(yōu)選的實(shí)施方案。上式中每個?；糠挚膳c基團(tuán)D偶聯(lián)。因此，以上分支基團(tuán)可以并入-CO.CH2-基團(tuán)中：如果需要，所述天冬氨酸或谷氨酸或類似的殘基可與其他天冬氨酸和/或谷氨酸和/或類似的殘基偶聯(lián)，例如：等等。所有上述接頭可與聚合物連接，例如通過酰胺鍵連接。聚合物在下文進(jìn)行討論。包含式I/I’的單元的優(yōu)選試劑包括：其中Q和D具有上文給出的含義。這類特別優(yōu)選的試劑具有下式：其中Ar代表任選地取代的芳基，特別是苯基，例如上文列出的那些之一。例如，所述試劑或所述試劑的前體可具有下式：其中D是-CO2H、-NH2或-OH基團(tuán)，特別是-CO2H基團(tuán)，并且每個m和q為1至6的整數(shù)，例如2或3。優(yōu)選m和q其中之一為2，另一個為3。上述試劑可被官能化以攜帶任何需要的有效載荷。例如，在式(Ig)/(Ig′)中所示的NH2基團(tuán)、式(Ih)/(Ih′)中的羧酸基團(tuán)、或式(Ii)/(Ii′)中的羥基、或式(Ij)中的對應(yīng)基團(tuán)D可用于與任何適合的基團(tuán)反應(yīng)以連接有效載荷，產(chǎn)生其中NH2基團(tuán)或羧酸基團(tuán)成為另一基團(tuán)D-Q-的一部分的化合物；或上式(If)、(If′)、(Ig)、(Ig′)、(Ih)、(Ih′)、(Ii)、(Ii′)或(Ij)中的芳基/苯基可攜帶額外的適合的反應(yīng)性基團(tuán)，其可用于連接有效載荷。攜帶有效載荷的其他優(yōu)選的綴合試劑具有下式：D-Q-W-CR2R2′-CR2.L.L′(IIa)或D-Q-(CH＝CH)p-(CH2)2-L(IIIa)例如D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L(IIIb)其中各取代基具有上文給出的含義和優(yōu)選含義。當(dāng)D或Q并入聚合物時，所述綴合試劑可以是具有WO99/45964、WO2005/007197或WO2010/100430中所述的基本結(jié)構(gòu)的試劑之一，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式納入本文。優(yōu)選地，含有聚合物的試劑包含上述式I的官能團(tuán)并且是下式Ii：其中X和X′之一代表聚合物，另一個代表氫原子；Q代表連接基團(tuán)；W代表吸電子基團(tuán)，例如酮基、酯基-O-CO-或砜基-SO2-；或者，如果X’代表聚合物，X-Q-W可共同代表吸電子基團(tuán)，例如氰基；A代表C1-5亞烷基鏈或亞烯基鏈；B代表鍵或C1-4亞烷基鏈或亞烯基鏈；以及每個L獨(dú)立地代表本發(fā)明的離去基團(tuán)，或兩個L共同代表本發(fā)明的離去基團(tuán)。相關(guān)的綴合試劑具有通式(Ii′)或(IIa)：其中X、X′、Q、W、A和L具有通式Ii中給出的含義，m代表0至4；或X-Q-W-CR4R4′-CR4.L.L′(IIa)其中X、Q和W具有通式Ii中給出的含義；以及每個R4代表氫原子或C1-4烷基，R4′代表氫原子；以及每個L獨(dú)立地代表離去基團(tuán)，其中至少一個、優(yōu)選兩個必須是本發(fā)明的新的離去基團(tuán)，或者兩個L共同代表本發(fā)明的離去基團(tuán)；或每個R4代表氫原子或C1-4烷基，L代表本發(fā)明的離去基團(tuán)，并且R4′和L′共同代表鍵。式Ii、Ii′和IIa中的各取代基的優(yōu)選含義如上文所給出。在式Ii和Ii′中，優(yōu)選X代表聚合物，X′-Q-代表氫原子。與聚合物X的連接可借助于水解不穩(wěn)定的鍵或借助于非不穩(wěn)定的鍵。特別優(yōu)選的聚合綴合試劑具有下式：用于本發(fā)明的方法的另一組優(yōu)選試劑是基于WO2010/010324中描述的那些。這些試劑具有以下通式：X-[Q-W-(CH＝CH)p-(CH2)2-L]q(IIIc)其中X、Q、W和L具有上文給出的含義和優(yōu)選含義；p代表0或1至4的整數(shù)，優(yōu)選0；q代表1至8的整數(shù)，優(yōu)選1。式IIIc的特別優(yōu)選的試劑具有下式：X-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L(IIId)在以上通式的優(yōu)選實(shí)施方案中，接頭Q或聚合物X可并入有效載荷，例如診斷、治療或標(biāo)記試劑。特別有價值的是以上通式的試劑，其中接頭Q或聚合物X并入藥物分子：這些試劑可例如用于合成抗體-藥物綴合物。本發(fā)明的綴合試劑可包含任何需要的有效載荷，例如診斷、治療或標(biāo)記試劑，或用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑。優(yōu)選包含一種或多種藥物分子，例如細(xì)胞毒性試劑或毒素。奧瑞斯他汀類(Auristatins)和美登木素類(maytansinoids)是典型的細(xì)胞毒性藥物。通常優(yōu)選藥物綴合物(特別是抗體藥物綴合物)應(yīng)當(dāng)包含多拷貝的藥物。標(biāo)記試劑(其應(yīng)當(dāng)被理解為包含顯像劑)可例如包括放射性核素、熒光劑(例如胺衍生的熒光探針，例如5-二甲基氨基萘-1-(N-(2-氨基乙基))磺胺-丹磺酰乙二胺、Oregon488尸胺(目錄編號O-10465，分子探針)、丹磺酰尸胺、N-(2-氨基乙基)-4-氨基-3，6-二硫代-1，8-萘酰亞胺、二鉀鹽(熒光黃乙二胺)，或羅丹明B乙二胺(目錄編號L-2424，分子探針)；或硫醇衍生的熒光探針，例如FLL-胱氨酸(目錄編號B-20340，分子探針)。結(jié)合劑可例如為螯合劑，例如去鐵胺或生物素，其可用于結(jié)合任何其他需要的部分，例如上文提及的那些之一，或者結(jié)合劑可以是上文所述的反應(yīng)性基團(tuán)。我們共同未決的申請GB1418984提供了綴合物，其包括通過接頭與含有美坦辛(maytansine)的有效載荷連接的蛋白質(zhì)、肽和/或聚合物，用于形成這樣的綴合物的綴合試劑，以及用作有效載荷的含有美坦辛的化合物。含有美坦辛的有效載荷和化合物由至少兩個美坦辛部分組成，這兩個部分通過不可降解的橋連基彼此連接。這些美坦辛可用作本發(fā)明的有效載荷，并且所述試劑構(gòu)成本發(fā)明的一方面。我們共同未決的申請公開了以下內(nèi)容：“本發(fā)明在第一方面提供了含有美坦辛的化合物，其中至少兩個美坦辛部分(D)通過橋連基(Bd)彼此連接。所述橋連基(Bd)在生理?xiàng)l件下是不可降解的。有利地，所述橋連基(Bd)具有至少3個鏈碳原子并且除3個鏈碳原子以外任選地包含聚乙二醇間隔基。有利地，在橋連基中沒有兩個雜原子彼此相鄰。有利地，所述橋連基不包含-C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-部分，其中b是1、2或3，R1選自氫原子和C1至C6烷基，X是任意基團(tuán)。第一方面的含有美坦辛的化合物——其中存在兩個美坦辛部分——可由以下式(I)表示：D-Bd-D(I)在第二方面，本發(fā)明提供了綴合試劑，其包含能夠與肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)的官能團(tuán)和/或能夠與聚合物反應(yīng)的官能團(tuán)，有效載荷經(jīng)由一個或更多個接頭與所述官能團(tuán)連接，其特征在于，所述綴合試劑包括含有美坦辛的有效載荷，該有效載荷由至少兩個通過不可降解的橋連基彼此連接的美坦辛部分組成，條件是當(dāng)綴合試劑包含能夠與肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)的官能團(tuán)時，將有效載荷連接至能夠與肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)的官能團(tuán)的接頭是可降解的。當(dāng)綴合試劑包含能夠與肽或蛋白質(zhì)中存在的至少一個親核基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)時，所述官能團(tuán)包含至少一個在與親核基團(tuán)反應(yīng)時失去的離去基團(tuán)，含有美坦辛的有效載荷(其由至少兩個經(jīng)由不可降解的橋連基彼此連接的美坦辛部分組成)有利地經(jīng)由可降解接頭連接至能夠與肽或蛋白質(zhì)中存在的至少一個親核基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)。所述綴合試劑任選地包含能夠與肽或蛋白質(zhì)中存在的至少一個親核基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)，所述官能團(tuán)有利地包含至少一個在與親核基團(tuán)反應(yīng)時失去的離去基團(tuán)，其特征在于所述綴合試劑包含含有美坦辛的有效載荷，所述有效載荷由至少兩個——特別是兩個——通過不可降解的橋連基彼此連接的美坦辛部分組成，以及特征在于所述有效載荷通過接頭——特別是可降解接頭——連接至能夠與肽或蛋白質(zhì)中存在的至少一個親核基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)。所述接頭適于將橋連基團(tuán)連接至能夠與伴侶或靶標(biāo)結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，含有美坦辛的有效載荷(D2Bd)的橋連基(Bd)連接至可降解接頭(Lkd)，該接頭包含在生理?xiàng)l件下斷裂的可降解基團(tuán)。所述可降解基團(tuán)可例如對水解條件，特別是酸性條件敏感；在還原條件下易于降解；或易于被酶解。第二方面的含有美坦辛的綴合試劑——其中存在兩個美坦辛部分——可由下式(II)表示：D2Bd-Lk-F(II)其中D2Bd代表含有美坦辛的有效載荷，其由兩個通過不可降解的橋連基連接的美坦辛部分組成，Lk是接頭，特別是可降解接頭(Lkd)，F(xiàn)代表能夠與肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)的官能團(tuán)和/或能夠與聚合物反應(yīng)的官能團(tuán)。本發(fā)明還提供了肽、蛋白質(zhì)和/或聚合物的綴合方法，所述方法包括使所述肽、蛋白質(zhì)和/或聚合物與本發(fā)明第二方面的綴合試劑反應(yīng)。當(dāng)綴合試劑與肽或聚合物反應(yīng)時，所述綴合試劑有利地能夠與所述肽或蛋白質(zhì)中存在的至少一個親核基團(tuán)反應(yīng)，所述試劑有利地包含至少一個離去基團(tuán)，其在與所述親核基團(tuán)反應(yīng)時失去。本發(fā)明在第三方面還提供了綴合物，其包含通過接頭與含有美坦辛的有效載荷連接的蛋白質(zhì)、肽和/或聚合物，其特征在于，含有美坦辛的有效載荷由至少兩個通過不可降解的橋連基彼此連接的美坦辛部分組成。當(dāng)綴合物包含蛋白質(zhì)或肽時，將有效載荷連接至蛋白質(zhì)或肽的接頭有利地是可降解的。本發(fā)明的第三方面的綴合物可例如包含含有美坦辛的藥物部分(D2Bd)，其通過接頭(Lk)(特別是可降解接頭(Lkd))連接至能夠結(jié)合伴侶或靶標(biāo)的蛋白質(zhì)或肽(Ab)，其中含有美坦辛的藥物部分(D2Bd)包含至少兩個通過不可降解的橋連基(Bd)彼此連接的美坦辛部分(D)。本發(fā)明第三部分的含有美坦辛的綴合物——其中存在兩個美坦辛部分(D)——可由下式(III)表示：D2Bd-Lk-Ab(III)所述接頭(Lk)有利地為可降解接頭(Lkd)，其包含在生理?xiàng)l件下裂解的可降解基團(tuán)，所述裂解將含有美坦辛的藥物部分(D2Bd)——其包含至少兩個通過橋連基(Bd)彼此連接的美坦辛部分(D)——與能夠結(jié)合伴侶或靶標(biāo)的蛋白質(zhì)或肽(Ab)分開。所述可降解基團(tuán)可例如對水解條件，特別是酸性條件敏感；在還原條件下易于降解；或易于被酶解。所述不可降解的橋連基(Bd)不含有下述基團(tuán)：其在與可降解接頭中的可降解基團(tuán)裂解的相同的條件下易于裂解。本發(fā)明第一方面的含有美坦辛的化合物可例如包含至少兩個通過橋連基(Bd)彼此連接的美坦辛部分(特別是兩個美坦辛部分)或由至少兩個通過橋連基(Bd)彼此連接的美坦辛部分(特別是兩個美坦辛部分)組成，所述橋連基具有至少3個鏈碳原子，特別是至少7個鏈碳原子，并且除鏈碳原子以外具有任選的聚乙二醇單元，條件是在所述橋連基中沒有兩個雜原子彼此相鄰，并且條件是所述橋連基不包含-C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-部分，其中b是1、2或3，R1選自氫和C1-C6烷基，X是任意基團(tuán)。任選地，所述橋連基團(tuán)并入0至8個羰基，特別是2至8個羰基。所述橋連基團(tuán)任選地在鏈中并入0至4個不飽和碳-碳雙鍵；和/或0至4個C3-C10芳基或雜芳基。任選地，所述鏈中散布有0至11(特別是2至11)個選自N、O和S的鏈雜原子，條件是兩個雜原子彼此不相鄰。有利地，所述橋連基中的鏈碳原子被選自胺、羧基、炔、疊氮化物、羥基或巰基的垂懸(pendant)連接基團(tuán)取代。有利地，所述橋連基在鏈中包含至少一個酰胺鍵。”使用本發(fā)明使得能夠有效地綴合范圍非常大的有效載荷。對于一些有效載荷而言，使用已知技術(shù)所得的產(chǎn)率較低。例如，將蛋白質(zhì)與不包含PEG的有效載荷綴合是低產(chǎn)的，使用本發(fā)明可獲得更高的產(chǎn)率。此外，與使用已知技術(shù)相比，綴合可明顯更快地發(fā)生，因此更加高效。綴合試劑中存在的聚合物如上文所提及的，所述綴合試劑可用于將低聚物或聚合物(為了方便，本文中共同稱為“聚合物”)，特別是水溶性合成聚合物(特別是聚亞烷基二醇)與蛋白質(zhì)綴合。換言之，所述有效載荷(例如上述通式中的D或X)可以是或可包含聚合物。聚合物可例如為聚亞烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯，例如聚丙烯酰嗎啉、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺，例如聚羧甲基丙烯酰胺，或HPMA共聚物。此外，所述聚合物可以是易于被酶解或水解的聚合物。這樣的聚合物例如包括聚酯、聚縮醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亞氨基碳酸酯和聚酰胺，例如聚氨基酸。聚合物可以是同聚物、無規(guī)共聚物或結(jié)構(gòu)確定的共聚物如嵌段共聚物，例如它可以是源自兩種或更多種環(huán)氧烷的嵌段共聚物，或源自聚環(huán)氧烷和聚酯、聚縮醛、聚原酸酯或聚氨基酸的嵌段共聚物?？墒褂玫亩喙倌芫酆衔锇ǘ蚁┟?馬來酸酐和苯乙烯-馬來酸酐的共聚物。也可使用天然存在的共聚物，例如多糖類，例如殼多糖、葡聚糖、糊精、殼聚糖、淀粉、纖維素、糖原、聚唾液酸、透明質(zhì)酸，及其衍生物。可將蛋白質(zhì)用作共聚物。這允許第一蛋白質(zhì)(例如抗體或抗體片段)與第二蛋白質(zhì)(例如酶或其他活性蛋白質(zhì))或支架蛋白質(zhì)(例如可結(jié)合至生物素化的分子的抗生物素蛋白(avidin))綴合。此外，如果使用包含催化序列的肽，例如針對糖基轉(zhuǎn)移酶的O-聚糖受體位點(diǎn)，這允許并入隨后的酶反應(yīng)的底物或靶標(biāo)。也可使用聚合物如聚谷氨酸，同樣可使用源自天然單體(例如糖類或氨基酸)和合成單體(例如環(huán)氧乙烷和甲基丙烯酸)的雜合聚合物。如果所述聚合物是聚亞烷基二醇，其優(yōu)選包含C2和/或C3單位，特別是聚乙二醇。聚合物，特別是聚亞烷基二醇，可包含單條線性鏈，或可具有由許多短鏈或長鏈組成的分支結(jié)構(gòu)。所謂的普朗尼克類(Pluronics)是PEG嵌段共聚物的重要一類。這些源自環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷嵌段?？墒褂萌〈幕蚍舛说木蹃喭榛迹缂籽趸垡叶?。所述聚合物可例如為通過WO2004/113394中所述的方法產(chǎn)生的梳形聚合物，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式納入本文。例如，所述聚合物可以是具有以下通式的梳形聚合物：(E)e-(F)f-(G)g其中在存在的情況下，E可通過一種或更多種并非如F中定義的烯屬不飽和單體的另外的聚合作用而獲得；F可通過多個單體的另外的聚合作用獲得，所述單體為線性、分支或星形、取代或未取代的，并且具有烯屬不飽和部分；在存在的情況下，G可通過一種或更多種并非如F中定義的烯屬不飽和單體的另外的聚合作用而獲得；e和g是0至500之間的整數(shù)；f是0至1000的整數(shù)；其中存在D、E和F中的至少一個?？赏ㄟ^任何需要的方式使與蛋白質(zhì)綴合的聚合物任選地衍生化或官能化。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合物攜帶例如診斷試劑、治療試劑或標(biāo)記試劑，例如上文提及的那些中的一種，或能夠結(jié)合診斷試劑、治療試劑或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑。反應(yīng)性基團(tuán)可連接在所述聚合物的末端或末端基團(tuán)，或通過垂懸接頭沿著聚合物連接；在這種情況下，所述聚合物是例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或馬來酸酐共聚物。包含多于一種生物分子的多聚綴合物可產(chǎn)生協(xié)同和加成益處。如果需要，可使用常規(guī)方法將所述聚合物偶聯(lián)至固體載體。所述聚合物的最佳分子量當(dāng)然取決于預(yù)期應(yīng)用。可使用長鏈聚合物，例如平均分子量可最高達(dá)約75,000，例如最高達(dá)50,000、40,000或30,000g/摩爾。例如，平均分子量的范圍可為500g/摩爾至約75,000g/摩爾。然而，由離散的PEG鏈——例如少至2個重復(fù)單元、例如2至50個重復(fù)單元——組成的非常小的低聚物適用于一些應(yīng)用，并且存在于本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中。例如，可使用包含2至48，例如2至36，例如2至24個單元的聚合物。例如可使用具有12、20、24、36、40或48個重復(fù)單元的支鏈或支鏈PEG。當(dāng)待綴合的蛋白質(zhì)預(yù)期將離開循環(huán)并滲透到組織中時，例如用于治療由惡性病、感染或自身免疫性疾病或由外傷引起的炎癥時，使用最高達(dá)30,000g/摩爾的較低分子量的聚合物可能是有利的。對于聚合物-蛋白質(zhì)綴合物預(yù)期將留在循環(huán)中的應(yīng)用，使用更高分子量的聚合物可能是有利的，所述聚合物的分子量范圍例如為20,000-75,000g/摩爾。應(yīng)當(dāng)選擇所使用的聚合物，以使綴合物可溶于溶劑介質(zhì)中而發(fā)揮其預(yù)期用途。對于生物應(yīng)用而言，特別是對于對哺乳動物進(jìn)行臨床治療性給藥的診斷應(yīng)用和治療應(yīng)用而言，所述綴合物可溶于水性介質(zhì)中。優(yōu)選所述聚合物是合成聚合物，并且優(yōu)選它是水溶性聚合物。對于許多應(yīng)用，特別優(yōu)選使用水溶性聚乙二醇。我們共同未決的申請GB1418986涉及特定結(jié)構(gòu)的包含PEG的接頭的用途，這些接頭可用于本發(fā)明。該申請公開了以下內(nèi)容：“本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)或肽與治療、診斷或標(biāo)記試劑的綴合物，所述綴合物包含蛋白質(zhì)或肽連接部分以及聚乙二醇部分；其中所述蛋白質(zhì)或肽連接部分具有以下通式：其中Pr代表所述蛋白質(zhì)或肽，每個Nu代表所述蛋白質(zhì)或肽中存在的或與所述蛋白質(zhì)或肽連接的親核基團(tuán)，A和B各自獨(dú)立地代表C1-4亞烷基或亞烯基鏈，W′代表吸電子基團(tuán)或通過吸電子基團(tuán)的還原而獲得的基團(tuán)；其中所述聚乙二醇部分是或包含垂懸的聚乙二醇鏈，所述聚乙二醇鏈具有式-CH2CH2OR的末端基團(tuán)，其中R代表氫原子烷基(例如C1-4烷基，特別是甲基)、或任選取代的芳基，特別是苯基，特別是未取代的苯基。本發(fā)明還提供了能夠與蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)并且包含治療、診斷或標(biāo)記試劑和聚乙二醇部分的綴合試劑；所述綴合試劑包含下式的基團(tuán)：其中W代表吸電子基團(tuán)，A和B具有以上所述的含義，m是0至4，每個L獨(dú)立地代表離去基團(tuán)；并且其中所述聚乙二醇部分是或包含垂懸的聚乙二醇鏈，所述聚乙二醇鏈具有式-CH2CH2OR的末端基團(tuán)，其中R代表氫原子、烷基(例如C1-4烷基，特別是甲基)、或任選取代的芳基，特別是苯基，特別是未取代的苯基。本發(fā)明還提供了用于制備本發(fā)明的綴合物的方法，所述方法包括使蛋白質(zhì)或肽與本發(fā)明的綴合試劑反應(yīng)。本發(fā)明的綴合物可由下式示意性地表示：其中D代表治療、診斷或標(biāo)記試劑，F(xiàn)′代表式I的基團(tuán)，PEG代表垂懸的聚乙二醇鏈，其具有式-CH2CH2OR的末端基團(tuán)。本發(fā)明的試劑可由下式示意性地表示：其中D代表治療、診斷或標(biāo)記時間，F(xiàn)代表式II或II′的基團(tuán)，PEG代表垂懸的聚乙二醇鏈，其具有式-CH2CH2OR的末端基團(tuán)。官能團(tuán)F能夠與蛋白質(zhì)或肽中存在的兩個親核基團(tuán)反應(yīng)，如下文所解釋的。本發(fā)明的綴合物和試劑的聚乙二醇(PEG)部分是或包含垂懸的聚乙二醇鏈，所述聚乙二醇鏈具有式-CH2CH2OR的末端基團(tuán)，其中R代表氫原子、烷基(例如C1-4烷基，特別是甲基)、或任選取代的芳基，特別是苯基，特別是未取代的苯基。優(yōu)選地，R是甲基或氫原子。PEG部分的總體大小當(dāng)然取決于預(yù)期的應(yīng)用。對于一些應(yīng)用，可使用高分子量PEG，例如平均分子量可最高達(dá)約75,000，例如最高達(dá)50,000、40,000或30,000g/摩爾。例如，平均分子量可在500g/摩爾至約75,000的范圍。然而，對于一些應(yīng)用，可優(yōu)選較小的PEG部分。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG部分中的全部PEG存在于垂懸的PEG鏈中。在另一個實(shí)施方案中，PEG也可存在于分子的骨架中，這將在下文中詳細(xì)討論。對于PEG部分，垂懸的PEG鏈的大小將取決于預(yù)期應(yīng)用。對于一些應(yīng)用，可使用高分子量的垂懸PEG鏈，例如平均分子量可最高達(dá)約75,000，例如最高達(dá)50,000、40,000或30,000g/摩爾。例如，平均分子量可在500g/摩爾至約75,000的范圍。然而，對于一些應(yīng)用，可使用較小的垂懸PEG鏈。例如，所述PEG鏈可具有最高達(dá)3,000g/摩爾的分子量。然而，由離散的PEG鏈——例如少至2個重復(fù)單元、例如2至50個重復(fù)單元——組成的非常小的低聚物適用于一些應(yīng)用，并且作為所述PEG鏈存在于本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中。所述垂懸的PEG鏈可以是直鏈的或支鏈的。例如可使用PEG鏈，例如具有12、20、24、36、40或48個重復(fù)單元的直鏈或支鏈PEG鏈?！本Y合方法包含本發(fā)明的離去基團(tuán)的綴合試劑可與蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)以形成綴合物，這樣的反應(yīng)構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，具有上述結(jié)構(gòu)I、I′、II或III(包括全部優(yōu)選的亞結(jié)構(gòu))之一的綴合試劑與蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)以形成綴合物。使用這些綴合試劑之一的綴合方法的直接產(chǎn)物是包含吸電子基團(tuán)W的綴合物。然而，所述綴合物方法在適當(dāng)?shù)臈l件下是可逆的。這對于一些應(yīng)用——例如需要快速釋放蛋白質(zhì)的情況——可能是期望的，但是對于其他應(yīng)用，可能不期望快速釋放蛋白質(zhì)。因此，可能需要通過吸電子基團(tuán)W的還原以產(chǎn)生阻止蛋白質(zhì)釋放的基團(tuán)而穩(wěn)定綴合物。因此，上述方法可包括另外的任選步驟：還原綴合物中的吸電子基團(tuán)W。特別優(yōu)選將硼氫化物，例如硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、硼氫化鉀或三乙酰氧基硼氫化鈉用作還原劑。其他可使用的還原劑包括例如氯化錫(II)，醇鹽例如烷醇鋁(aluminiumalkoxide)，以及氫化鋁鋰。因此，例如，含有酮基的基團(tuán)W可被還原為含有CH(OH)的基團(tuán)；醚基CH.OR可通過羥基與醚化劑的反應(yīng)而獲得；酯基CH.O.C(O)R可通過羥基與?；瘎┑姆磻?yīng)而獲得；胺基CH.NH2、CH.NHR或CH.NR2可通過還原性胺化作用由酮制得；或酰胺CH.NHC(O)R或CH.N(C(O)R)2可通過胺的?；饔枚纬?。砜可被還原為亞砜、硫化物或硫醚。氰基可被還原為胺基。使用上述式I或II的綴合試劑的關(guān)鍵特征在于，α-亞甲基離去基團(tuán)和雙鍵與吸電子官能團(tuán)交叉綴合，所述吸電子官能團(tuán)充當(dāng)Michael活化部分。如果所述離去基團(tuán)在交叉官能性試劑中易于被消除而非直接置換，并且所述吸電子基團(tuán)是Michael反應(yīng)的適合的活化部分，則通過連續(xù)Michael反應(yīng)和逆Michael反應(yīng)可相繼發(fā)生分子內(nèi)雙烷基化。所述離去基團(tuán)用于遮蔽潛在的綴合雙鍵，該綴合雙鍵直到第一烷基化作用發(fā)生之后才暴露以產(chǎn)生式I′的試劑，并且雙烷基化產(chǎn)生自相繼且相互影響的Michael反應(yīng)和逆Michael反應(yīng)。交叉官能性烷化劑可包含綴合至雙鍵或位于離去基團(tuán)和吸電子基團(tuán)之間的多重鍵。當(dāng)與蛋白質(zhì)的結(jié)合是經(jīng)由來自蛋白質(zhì)中二硫鍵的兩個硫原子而進(jìn)行時，所述方法可通過原位還原二硫鍵，之后還原后的產(chǎn)物與具有結(jié)構(gòu)I或II之一的試劑反應(yīng)來進(jìn)行。優(yōu)選地，在引入綴合試劑之前，將二硫鍵還原并例如通過緩沖液交換來除去任何過量的還原劑。可使用常規(guī)方法，例如采用二硫蘇糖醇、巰基乙醇或三羧乙基膦來還原二硫鍵。可在與已知綴合方法的條件(包括以上提及的現(xiàn)有技術(shù)中公開的條件)類似的條件下進(jìn)行綴合反應(yīng)。例如，當(dāng)使用結(jié)構(gòu)I、I′或II之一的綴合試劑時，本發(fā)明的綴合反應(yīng)可在與WO2005/007197，WO2009/047500、WO2014/064423和WO2014/064424中所述的那些條件類似的反應(yīng)條件下進(jìn)行。所述方法例如可在溶劑或溶劑混合物中進(jìn)行，其中所有反應(yīng)物都可溶于所述溶劑或溶劑混合物。例如，可在水性反應(yīng)介質(zhì)中使蛋白質(zhì)與聚合物綴合試劑直接反應(yīng)。根據(jù)親核基團(tuán)的pH要求，該反應(yīng)介質(zhì)也可以是緩沖的。反應(yīng)的最佳pH通常為至少4.5，通常為約5.0至約8.5，優(yōu)選約6.0至7.5。最佳反應(yīng)條件當(dāng)然取決于所使用的具體反應(yīng)物。當(dāng)使用水性反應(yīng)介質(zhì)時，3-40℃的反應(yīng)溫度通常是適合的。在有機(jī)介質(zhì)(例如THF、乙酸乙酯、丙酮)中進(jìn)行的反應(yīng)通常在最高達(dá)室溫的溫度下進(jìn)行。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)在水性緩沖液中進(jìn)行，所述水性緩沖頁可包含部分有機(jī)溶劑，例如最高達(dá)20體積％的有機(jī)溶劑，通常為5-20體積％的有機(jī)溶劑。使用化學(xué)計(jì)量相當(dāng)或稍微過量的綴合試劑可有效地綴合蛋白質(zhì)。然而，也可使用過量的綴合試劑來進(jìn)行綴合反應(yīng)，這對于一些蛋白質(zhì)而言可能是期望的。在隨后的綴合物純化過程中，過量的試劑可通過常規(guī)方法例如離子交換或HPLC色譜法輕易地除去。當(dāng)然，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)包含足夠多適合的連接點(diǎn)時，多于一種綴合試劑與蛋白質(zhì)綴合是可能的。例如，在包含兩個不同的二硫鍵的蛋白質(zhì)中，或在包含一個二硫鍵并且還攜帶多聚組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)中，每分子的蛋白質(zhì)可綴合兩分子的所述試劑。蛋白質(zhì)使用本發(fā)明的方法可綴合包含親核基團(tuán)的任何期望的肽或蛋白質(zhì)。適合的蛋白質(zhì)包括例如肽、多肽、抗體、抗體片段、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、受體、血液因子、肽激素、毒素、轉(zhuǎn)錄蛋白或多亞基蛋白。以下給出了可使用本發(fā)明來綴合的一些具體蛋白質(zhì)。酶包括碳水化合物特異性酶、蛋白水解酶等，例如US4,179,337公開的氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶。所關(guān)注的特異性酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、腺苷脫氨酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、膽紅素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡糖醛酸糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、葡糖苷酸酶和谷氨酰胺酶。血液蛋白質(zhì)包括白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、因子VII、因子VIII或因子IX、vonWillebrand因子、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、甲狀旁腺素、色素激素、生長調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、黃體化激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、催乳素、白細(xì)胞介素、干擾素(例如IFN-α或IFN-β)、集落刺激因子、血紅蛋白、細(xì)胞因子、抗體、抗體片段、絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲狀腺激素和組織纖維蛋白溶酶原激活劑。其他所關(guān)注的蛋白質(zhì)是DreborgetalCrit.Rev.Therap.DrugCarrierSyst.(1990)6315-365中公開的變應(yīng)原蛋白，其在與聚合物如聚環(huán)氧烷綴合時具有降低的變應(yīng)原性，因此適合用作耐受誘導(dǎo)劑。所公開的變應(yīng)原為豚草抗原E、蜜蜂毒液、螨變應(yīng)原等。糖多肽如免疫球蛋白、卵白蛋白、脂肪酶、葡糖腦苷脂酶、凝集素、組織纖維蛋白溶酶原激活劑和糖基化的白細(xì)胞介素、干擾素和集落刺激因子是所關(guān)注的蛋白，免疫球蛋白如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段同樣是所關(guān)注的蛋白。特別關(guān)注的蛋白質(zhì)是在臨床醫(yī)學(xué)中用于診斷和治療目的的受體和配體結(jié)合蛋白，以及抗體和抗體片段。所述結(jié)合蛋白/抗體可與診斷、治療或標(biāo)記試劑(例如放射性同位素或細(xì)胞毒性/抗感染藥物)綴合。特別優(yōu)選的是本發(fā)明用于制備抗體-藥物綴合物的用途，其中所述藥物是細(xì)胞毒性藥物，例如奧瑞斯他汀或美登木素。如果需要，所述蛋白質(zhì)可以是衍生的或官能化的。特別地，在綴合之前，所述蛋白質(zhì)(例如天然蛋白質(zhì))可與多種保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)以保護(hù)其上的敏感基團(tuán)；或可使用本發(fā)明的方法或使用替代方法使所述蛋白質(zhì)先與一種或更多種聚合物或其他分子綴合。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)包含多聚組氨酸標(biāo)記，本發(fā)明的綴合試劑可靶向該標(biāo)記。在本發(fā)明的一方面——其中綴合試劑能夠與肽或蛋白質(zhì)中存在的兩個親核基團(tuán)反應(yīng)，所述試劑可如以下條款中定義。1.一種能夠與肽或蛋白質(zhì)中存在的兩個親核基團(tuán)反應(yīng)的綴合試劑，其包含在與所述親核基團(tuán)反應(yīng)時失去的離去基團(tuán)，其中所述離去基團(tuán)在所述綴合試劑內(nèi)具有兩個連接位點(diǎn)，并且包含-(CH2CH2O)n1部分，其中n1是2或更大的數(shù)值。2.如條款1中所定義的綴合試劑，其中n1為2至5，或5至9。3.如條款1或條款2中所定義的綴合試劑，其中-(CH2CH2O)n1-部分的分子量為最高達(dá)5kDa。4.如前述條款中任一項(xiàng)所定義的試劑，其中所述離去基團(tuán)具有式-S-P-S-、-O-P-O-、-SO2-P-SO2-、-OSO2-P-OSO2-或-N+R2R3-P-N+R2R3-，其中P是包含-(CH2CH2O)n1-部分的基團(tuán)，并且R2和R3各自獨(dú)立地代表氫原子或C1-4烷基或基團(tuán)P。5.如條款1至4中任一項(xiàng)所定義的試劑，其中所述離去基團(tuán)是-S-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-S-、-O-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-O-、-SO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-SO2-、-OSO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-OSO2-、-N+R2R3-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-N+R2R3-，或下式的基團(tuán)之一：其中R1是封端基團(tuán)，并且R2和R3各自獨(dú)立地代表氫原子或C1-4烷基。6.如條款5中所定義的試劑，其中所述離去基團(tuán)是-SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-。7.如條款5中所定義的試劑，其中R1代表氫原子、C1-4烷基、任選取代的芳基，或式-CH2CH2CO2H或-CH2CH2NH2的基團(tuán)。8.如前述條款中任一項(xiàng)所定義的試劑，其攜帶有效載荷，所述有效載荷是診斷、治療或標(biāo)記試劑或用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑。9.如條款1至8中任一項(xiàng)所定義的試劑，其包含官能團(tuán)I、I′、II或III：其中W代表吸電子基團(tuán)；A代表C1-5亞烷基鏈或亞烯基鏈；B代表鍵或C1-4亞烷基鏈或亞烯基鏈；兩個L共同代表離去基團(tuán)，所述離去基團(tuán)包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大的數(shù)值；或～W-CR4R4′-CR4.L.L′(II)其中W具有通式I中給出的含義，并且(i)每個R4代表氫原子或C1-4烷基，R4′代表氫原子，L和L′共同代表離去基團(tuán)，所述離去基團(tuán)包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大的數(shù)值。10.如條款9中所定義的試劑，其具有以下通式：或D-Q-W-CR2R2′-CR2.L.L′(IIa)其中Q代表連接基團(tuán)，D代表有效載荷，其為診斷、治療或標(biāo)記試劑或用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑。11.如條款10中所定義的試劑，其包含以下官能團(tuán)：12.如條款11中所定義的試劑，其具有以下通式：其中Q代表連接基團(tuán)，D代表有效載荷，其為診斷、治療或標(biāo)記試劑或用于診斷、治療或標(biāo)記試劑的結(jié)合劑。13.如條款10或條款12中所定義的試劑，其中D-Q包含藥物或聚合物，或包含藥物和聚合物兩者。14.如條款13中所定義的試劑，其中如果存在藥物，則其為細(xì)胞毒性藥物，并且如果存在聚合物，則其為聚乙二醇。附圖說明圖1示出了實(shí)施例17的結(jié)果。圖2示出了實(shí)施例18的結(jié)果。圖3示出了實(shí)施例19的結(jié)果。圖4示出了實(shí)施例20的結(jié)果。圖5、6和7示出了實(shí)施例21的結(jié)果。圖8示出了實(shí)施例22的結(jié)果。圖9示出了實(shí)施例25的結(jié)果。圖10示出了在2小時反應(yīng)時間之后獲得的實(shí)施例49的結(jié)果。圖11示出了在4小時反應(yīng)時間之后獲得的實(shí)施例49的結(jié)果。以下實(shí)施例說明本發(fā)明。實(shí)施例1：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)的綴合試劑2的合成步驟1：化合物1的合成向4-[2，2-雙[(對甲苯磺?；?-甲基]乙?；鵠苯甲酸(1.50g，NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)于二甲基甲酰胺(DMF，70mL)中的攪拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)(3.20g，IrisBiotech)和三乙胺(2.50mL)。在室溫下，在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷玫姆磻?yīng)混合物。19h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(2.4mL)中并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)－－乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的澄清無色油狀的4-[2，2-雙[α-甲氧基-ω-硫-七(乙二醇)]乙?；鵠-苯甲酸化合物1(1.77g，66％)m/z[M+H+]901。步驟2：試劑2的合成在室溫下向1(1.32g)于甲醇∶水(18mL，9∶1v/v)的攪拌溶液中添加(2.70g)。2.5h之后，真空除去揮發(fā)物并用乙腈(2×15mL)共沸除去水。將所得的殘余物溶于二氯甲烷(3×10mL)中，過濾通過硫酸鎂柱并用二氯甲烷沖洗(2×7mL)。將洗脫液和沖洗液合并，并真空除去揮發(fā)物以生成稠的澄清淺黃色油(1.29g，92％)。將一部分殘余物(700mg)溶于水∶乙腈(1.50mL，3∶1v/v)中，并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的澄清無色油狀的4-[2，2-雙[α-甲氧基-ω-磺?；?乙二醇)]乙?；鵠苯甲酸試劑2(524mg，68％)m/z[M+H+]965。實(shí)施例2：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和10kDaPEG的PEG化試劑3的合成在氬氣下，將試劑2(14mg)于DMF(600μL)中的攪拌溶液冷卻至0℃，并加入1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸鹽(HATU)(5.5mg)和N-甲基嗎啉(NMM)(1.5μL)。當(dāng)加入10kDaH2N-PEG-OMe(132mg)于二氯甲烷(600μL)中的溶液時，在0℃攪拌溶液0.5h。在0℃攪拌所得溶液5min后加入另外的HATU(5.5mg)和NMM(1.5μL)。在0℃下攪拌反應(yīng)溶液2h后，將溶液升溫至室溫。22h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，2.0mL)，并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色粉末狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(10kDa)OMe試劑3(72mg，53％)。1HNMR(600MHz，)3.35(6H)，3.36(3H)，3.40(4H)，3.46-3.59(10H)，3.56-3.70(1065H，m，PEG)，3.71-3.77(7H)，3.85-3.91(4H)，4.76(1H)，8.00(2H)，8.18(2H)。實(shí)施例3：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和羅丹明B染料的熒光綴合試劑4的合成將試劑2(38mg)和麗絲胺羅丹明B乙二胺(20mg，Invitrogen)溶于1.5mL無水DMF，并冷卻至0℃。加入HATU(15mg)并攪拌溶液2min，然后加入NMM(8.7μL)。在0℃下攪拌反應(yīng)混合物2h。在高真空下將粗反應(yīng)產(chǎn)物部分濃縮3h，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成紫色固體狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-羅丹明B試劑4(43mg，69％)。m/z[M+H]+(1549，80％)，[M+2H]2+(783，100％).1HNMR(600MHz；)1.45(9H，s)，2.40-2.45(8H，m)，3.40-3.46(2H，m)，3.52-3.66(m，PEG和CH2-Ts)，4.27(1H，q)，8.01(2H，d)，8.08(1H，dd)，8.15(2H，d)，8.66(1H，d)。實(shí)施例4：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑5的合成向具有以下結(jié)構(gòu)的val-cit-PAB-MMAE的TFA鹽(25.0mg)中加入試劑2(15.6mg)于DMF(1.5mL)中的溶液，并在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢?min。將混合物冷卻到0℃，并每20min添加HATU(6.1mg)和NMM(1.8μL)的等分部分，共添加5次。1.5h之后，使反應(yīng)混合物升溫至室溫。2h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，0.6mL)中，并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色粉末狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE試劑5(22.4mg，68％)m/z[M+2H2+]1035。實(shí)施例5：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑6的合成步驟1：化合物7的合成制備HATU(394mg)于DMF(4ml)中的儲備溶液和NMM(114μL)于DMF(4mL)中的儲備溶液。向試劑2(250mg)的DMF(10mL)溶液中添加H2N-dPEG-(24u)-(CO2tBu)(405mg)。將混合物用DMF(5mL)稀釋并在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢?min。將混合物冷卻至0℃，并每10min添加HATU(1ml)和NMM(1ml)的等分部分，共添加4次。40min之后，使反應(yīng)混合物升溫至室溫。2.5h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(2mL)中，并通過反相C18柱色譜法分離產(chǎn)物，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的澄清的淡黃色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-t丁酯化合物7(422mg，76％)m/z[M-(tBu)+3H3+]698.46Da。步驟2：化合物8的合成將試劑7(382mg)溶于甲酸(5mL)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢璺磻?yīng)混合物1h。通過冷凍干燥法除去甲酸。將所得固體溶于水(1mL)，并通過反相C18柱色譜法分離產(chǎn)物，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)酸化合物8(194mg，53％)m/z[M+3H3+]698.33Da。步驟3：試劑6的合成將試劑8(15mg)溶于DMF(0.2mL)并添加于DMF(0.2mL)中的val-cit-PAB-MMAE.TFA鹽(11mg)。將混合物冷卻至0℃并在惰性氣氛下攪拌。依次添加HATU(2.7mg)和NMM(0.7mg)，在0℃攪拌反應(yīng)混合物。每20min添加額外量的HATU(2.7mg)和NMM(0.4mg)，共添加5次，在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。1h40min之后，將反應(yīng)混合物冷卻至-20℃，保持16h。將反應(yīng)溶液用水(0.4mL)淬滅并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE試劑6(7.9mg，34％)m/z[M+2H]2+1599.98。實(shí)施例6：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和美登木素細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑9的合成向具有以下結(jié)構(gòu)的val-ala-PAB-AHX-DM1(5.2mg)于無水DMF(400μL)的攪拌溶液中添加試劑2(6mg)并在0℃下攪拌5min。依次添加HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，在0℃攪拌反應(yīng)混合物。20min之后，添加額外量的HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。2.5h之后，將反應(yīng)混合物冷卻至-20℃，保持16h。將反應(yīng)溶液真空濃縮，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-val-ala-PAB-AHX-DM1試劑9(6.5mg，74％)m/z[M+H+]2030。實(shí)施例7：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和美登木素細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑10的合成向val-ala-PAB-AHX-DM1(5.0mg)于無水DMF(400μL)的攪拌溶液中添加試劑8(13mg)，并在0℃下攪拌5min。依次添加HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，在0℃攪拌反應(yīng)混合物。20min之后，添加額外量的HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。2.5h之后，將反應(yīng)混合物冷卻至-20℃，保持16h。將反應(yīng)溶液真空濃縮，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的黃色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1試劑10(5.6mg，41％)m/z[M-OH+H]2+1571.5。實(shí)施例8：分別包含2個重復(fù)單元、12個重復(fù)單元、1kDa，2kDa或5kDa多聚乙二醇離去基團(tuán)和美登木素細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑12、13、14和15的合成以與實(shí)施例7中所描述的試劑10的合成方法類似的方法，分別使用硫醇2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇、α-甲氧基-ω-巰基十二(乙二醇)、α-甲氧基-ω-巰基聚(乙二醇1kDa)、α-甲氧基-ω-巰基聚(乙二醇2kDa)和α-甲氧基-ω-巰基聚(乙二醇5kDa)替代實(shí)施例1中用于合成化合物1的α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)來合成美登木素試劑雙-mPEG(12u)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM112、雙-mPEG(1kDa)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM113、雙-mPEG(2kDa)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM114和雙-mPEG(5kDa)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM115。實(shí)施例9：分別包含2個重復(fù)單元、12個重復(fù)單元、1kDa，2kDa或5kDa多聚乙二醇離去基團(tuán)和奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑17、18、19和20的合成以與實(shí)施例5中所描述的試劑6的合成方法類似的方法，分別使用硫醇2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇、α-甲氧基-ω-巰基十二(乙二醇)、α-甲氧基-ω-巰基聚(乙二醇1kDa)、α-甲氧基-ω-巰基聚(乙二醇2kDa)和α-甲氧基-ω-巰基聚(乙二醇5kDa)替代實(shí)施例1中用于合成化合物1的α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)來合成奧瑞斯他汀試劑雙-mPEG(12u)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE17、雙-mPEG(1kDa)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE18、雙-mPEG(2kDa)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE19和雙-mPEG(5kDa）砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE20。實(shí)施例10：包含美登木素細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑21的合成步驟1：化合物22的合成在氬氣氣氛下將Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)于DMF(2mL)中的溶液冷卻至0℃，并加入(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)(41mg)，隨后加入NH2-PEG(24u)-OMe(100mg)和N，N-二異丙基乙胺(19μL)。使溶液升溫至室溫，22h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶解于二氯甲烷(1mL)并通過正相柱色譜法純化，所述柱用二氯甲烷∶甲醇(100∶0v/v至80∶20v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑以生成無色油狀的FmocL-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](84mg，67％)。在氬氣氣氛下將哌啶(49μL)加入化合物Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](74mg)于DMF(2mL)中的溶液中，并在室溫下攪拌所得溶液22h，然后真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物用己烷(3×0.7mL)研磨。每次將有機(jī)溶劑倒出并真空干燥所得殘余物以生成白色固體狀的L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]化合物22(61mg，97％)。m/z[M+H]+(1097，10％)，[M+2H]2+(1035，100％)。步驟2：化合物23的合成在氬氣氣氛下將化合物22(26.6mg)于DMF(550μL)中的溶液冷卻至0℃，向其中加入HATU(10.5mg)并在0℃下攪拌溶液0.5h。向該溶液中加入試劑2(32mg)于DMF(550μL)中的溶液。在0℃下攪拌所得溶液5min，然后加入NMM(2.9μL)和HATU(10.5mg)。在0℃下攪拌反應(yīng)溶液2h，然后使其升溫至室溫并再攪拌3.5h。然后真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，1.2ml)，并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](30.5mg，55％)。1HNMR(400MHz，)8.19(2H，d)，8.04(2H，d)，4.83-4.71(1H，m)，4.58(1H，dd，)，3.92-3.83(6H，m)，3.78-3.56(140H，m)，3.57-3.51(6H，m)，3.40(4H，dd)，3.36(3H，s)，3.35(6H，s)，2.41(2H，t)，2.24-2.13(1H，m)，2.10-1.98(1H，m)，1.45(9H，s)；m/z[M+Na]+(2243，50％)，[M+H]+(2221，40％)，[M+Na+2H]3+(747，100％)。在氬氣氣氛下將雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](30mg)于二氯甲烷(2mL)中的溶液冷卻至0℃，然后向其中加入三氟乙酸(500μL)并攪拌所得溶液1.5h。使反應(yīng)混合物升溫至室溫并再攪拌1h。然后真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，0.6mL)，并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe]化合物23(20mg，68％)。1HNMR(400MHz，)8.19(2H，d)，8.04(2H，d)，4.81-4.72(1H，m)，4.59(1H，dd)，3.92-3.84(6H，m)，3.67-3.50(146H，m)，3.40(4H，dd)，3.36(3H，s)，3.35(6H，s)，2.48(2H，t)，2.26-2.15(1H，m)，2.15-2.03(1H，m)；m/z[M+H]+(2165，55％)，[M+2H]2+(1083，60％)，[M+2H+Na]3+(729，100％)。步驟3：試劑21的合成在氬氣氣氛下將化合物23(15.0mg)于DMF(600μL)中的溶液冷卻至0℃。加入HATU(2.9mg)并在0℃下攪拌溶液0.5h。向該溶液中加入已經(jīng)在室溫下攪拌了0.5h的val-ala-PAB-AHX-DM1(9.2mg)和NMM(0.8μL)于DMF(600μL)中的溶液。5min之后，加入額外量的HATU(2.9mg)和NMM(0.8μL)，并在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。3h之后，添加額外量的HATU(0.7mg)并在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。再過2h之后，將反應(yīng)混合物貯存于-20℃下16h。將反應(yīng)溶液真空濃縮并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-L-Glu-[val-ala-PAB-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe]化合物21(14.3mg，64％)。1HNMR(600MHz，)(選擇的特征信號)5.69(1H，dd，)，6.59(1H，dd)，6.68(1H，s)，6.69(1H，d)，7.10(1H，s)，7.28(2H，d)，7.57(2H，d)，8.01(2H，d)，8.16(2H，d)；m/z[M-AHX-DM1]+(2422，40％)。實(shí)施例11A：包含7個重復(fù)單元多聚離去基團(tuán)和美登木素細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑24的合成在氬氣氣氛下將化合物23(12.4mg)于DMF(500μL)中的溶液冷卻到0℃。加入HATU(2.4mg)并在0℃下攪拌溶液0.5h。向該溶液加入已經(jīng)在室溫下攪拌了0.5小時的val-cit-AHX-DM1(以與化合物50的制備方法類似的方法，使用AHX-DM1代替化合物47，6.4mg而制備)和NMM(0.7μL)于DMF(500μL)中的溶液。5min之后，加入額外量的HATU(1.2mg)和NMM(0.4μL)并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物。2h之后，加入額外量的HATU(1.2mg)和NMM(0.4μL)并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物。再過1h之后，將反應(yīng)混合物真空濃縮并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[val-cit-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe]24(9.6mg，53％)。m/z[M-H2O]+(3148，8％)，[M-H2O]2+(1575，40％)，[M-H2O]3+(1050，100％)，1036[M-NHCO-H2O]3+。實(shí)施例11B：包含奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑25的合成以與實(shí)施例11A中試劑24的制備方法類似的方法，由化合物23和val-cit-PAB-MMAETFA鹽來合成試劑25。雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(24u)-OMe]25是作為無色油狀物而分離的。m/z[M+H]+(3270，12％)，[M+2H]2+(1636，50％)，[M+3H]3+(1091，100％)。實(shí)施例12：包含7個重復(fù)單元聚乙二醇離去基團(tuán)和去鐵胺的用于成像和螯合應(yīng)用的綴合試劑27的合成步驟1：化合物28的合成在室溫下在氬氣氣氛中向21-(Boc-氨基)-4，7，10，13，16，19-六氧雜二十一烷酸(50mg，Sigma-Aldrich)于DMF(2mL)中的溶液中加入(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)(73mg)，并攪拌溶液0.5h。向該溶液中加入已經(jīng)在室溫下攪拌了0.5h的去鐵胺甲磺酸鹽(87mg，Sigma-Aldrich)和N，N-二異丙基乙胺(29μL)于DMF(2mL)中的溶液。24h之后，將反應(yīng)溶液真空濃縮，然后通過反相C18柱色譜法直接純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)－－水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和緩沖液B(v/v)－－乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至50∶50v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的BocNH-PEG(6u)-去鐵胺化合物28(50mg，46％)m/z[M+Na]+(1019，50％)，[M+H]+(997，95％)，[M+2H]2+(499，100％)；1HNMR(600MHz；MeOH-δ4)1.28-1.38(7H，m)，1.43(9H，s)，1.49-1.55(6H，m)，1.60-1.67(5H，m)，2.09(3H，s)，2.41-2.47(6H，m)，2.76(4H，t)，3.14-3.19(6H，m)，3.21(2H，t)，3.50(2H，t)，3.57-3.65(27H，m)，3.70-3.73(2H，t)。步驟2：化合物29的合成在氬氣氣氛下將化合物28(49mg)于二氯甲烷(DCM)(3mL)中的溶液冷卻至0℃并加入三氟乙酸(TFA)(750μL)。使溶液升溫至室溫。1h之后，將甲苯(2mL)加到反應(yīng)混合物中，并真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸(2mL)，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以除去任何殘留的TFA并生成白色固體狀的NH2-PEG(6u)-去鐵胺化合物29(44mg，定量收率)，其用于下一步而無需任何進(jìn)一步的純化：m/z[M+H]+(897，100％)，[M+2H]2+(449，100％)。步驟3：試劑27的合成在氬氣氣氛下將試劑2(17mg)于DMF(750μL)中的溶液冷卻至0℃，然后加入HATU(8.0mg)，并在0℃下攪拌溶液0.5h。向該溶液中加入化合物29(23mg)和NMM(2.1μL)于DMF(750μL)中的溶液并在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。歷時4h加入額外量的試劑2、HATU和NMM。再過15h之后，將反應(yīng)溶液真空濃縮，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至50∶50v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(6u)-去鐵胺試劑27(20.6mg，49％)m/z[M+H]+(1844，95％)，[M+2H]2+(922，100％)，[M+3H]3+(615，100％)。實(shí)施例13(比較)：包含甲苯磺?；x去基團(tuán)和去鐵胺的用于成像和螯合應(yīng)用的綴合試劑30的合成向化合物29(43mg)于DMF(2.5mL)中的溶液中加入NMM(6μL)并在室溫下攪拌0.5h。向該溶液中加入已知的4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)-甲基]乙?；鵠苯甲酸(29mg，NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)于DMF(700μL)中的溶液。1h、2h、19h、23h和25h之后向反應(yīng)混合物中加入額外的NMM(共15.6μL)。26h之后，將反應(yīng)溶液真空濃縮，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的雙-甲苯砜-丙酰基-苯甲酰胺PEG(6u)-去鐵胺試劑30(19mg，29％)m/z[M+H]+(1379，98％)，[M+2H]2+(690，100％)；1HNMR(600MHz；MeOH-δ4)1.28-1.36(7H，m)，1.48-1.55(6H，m)，1.59-1.65(5H，m)，2.09(3H，s)，2.40-2.46(6H，m)，2.50(6H，s)，2.74-2.78(4H，m)，3.14-3.17(5H，m)，3.55-3.61(23H，m)，3.62-3.70(12H，m)，3.75-3.80(2H，m)，4.09-4.14(1H，m)，7.44(4H，d)，7.55(2H，d)，7.62(4H，d)，7.82(2H，d)。實(shí)施例14：包含六PEG-二砜離去基團(tuán)和美登木素細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑31的合成步驟1：化合物32的合成向4-[2，2-雙[(對甲苯磺?；?-甲基]乙酰基]苯甲酸(542mg，NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)于DMF(40mL)中的攪拌溶液中加入六(乙二醇)二硫醇(400μL)和Cs2CO3(2.4g)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷玫姆磻?yīng)混合物。40h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(4mL)中，并且通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的六PEG-二硫醚丙?；?苯甲酸化合物32(180mg，33.1％)m/z[M+Na+]525.1HNMR(600MHz，CDCl3)2.72-2.78(4H，m，CH2-S)，2.95-3.04(4H，m)，3.65-3.72(18H，m，PEG)，4.76(1H，m)，8.11(2H，d)，8.21(2H，d)。步驟2：化合物33的合成以與實(shí)施例1中所描述的試劑2的制備方法類似的方法，使用化合物32替代化合物1來合成六PEG-二砜丙酰基苯甲酸化合物33。步驟3：化合物34的合成以與實(shí)施例5中所描述的化合物7的制備方法類似的方法，使用化合物33替代化合物2來合成六PEG-二砜丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-t丁酯化合物34。步驟4：化合物35的合成以與實(shí)施例5中所描述的化合物8的制備方法類似的方法，使用化合物34替代化合物7來合成六PEG-二砜丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-酸化合物35。步驟5：試劑31的合成以與實(shí)施例7中所描述的試劑10的制備方法類似的方法，使用化合物35替代化合物8來合成美登木素試劑六PEG-二砜丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM131。實(shí)施例15(比較)：包含甲苯磺?；x去基團(tuán)和羅丹明B染料的綴合試劑36的合成步驟1：化合物37的合成以與實(shí)施例5中所描述的試劑8的制備方法類似的方法，使用已知的4-[2，2-雙[(對甲苯磺?；?-甲基]乙酰基]苯甲酸(NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)替代試劑2來合成4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)-甲基]乙?；鵠苯甲酰胺-PEG(12u)-酸化合物37。步驟2：試劑36的合成以與實(shí)施例3中所描述的試劑4的制備方法類似的方法，使用化合物37替代試劑2來合成4-[2，2-雙[(對甲苯磺?；?-甲基]乙?；鵠苯甲酰胺-PEG(12u)-羅丹明B試劑36。實(shí)施例16：包含7個重復(fù)單元多聚離去基團(tuán)、芳基離去基團(tuán)和奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑38的合成步驟1：化合物39的合成向已知的4-[2，2-雙[(對甲苯磺?；?-甲基]乙?；鵠苯甲酸(200mg，NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)于二甲基甲酰胺(DMF，8mL)中的攪拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)(142mg)和NMM(264μL)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。19h之后，真空除去揮發(fā)物，并將所得殘余物溶于乙腈(800μL)，并且通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的澄清的無色油狀的單-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-單-(甲苯磺?；谆?丙?；?苯甲酸化合物39(132mg，47％)m/z[M+H+]701.1。步驟2：試劑40的合成在室溫下向化合物39(116mg)于甲醇∶水(5mL，9∶1v/v)中的攪拌溶液中加入(305mg)。75min之后，真空除去揮發(fā)物并用乙腈(3×15mL)共沸除去水。將所得殘余物溶于二氯甲烷(3×10mL)，過濾通過硫酸鎂柱并用二氯甲烷(2×7mL)沖洗。將洗脫液和沖洗液合并，真空除去揮發(fā)物以生成稠的澄清淺黃色油。將殘余物溶于水∶乙腈(800μL，1∶4v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的澄清的無色油狀的4-(3-((2-七(乙二醇)甲氧基乙基)磺酰基)-2-(甲苯磺?；谆?丙?；?苯甲酸化合物40(103mg，78％)m/z[M+H+]733.2。步驟3：試劑38的合成向val-cit-PAB-MMAE.TFA鹽(25.0mg)中加入試劑40(11.8mg)于DMF(1.5mL)中的溶液，并在室溫下在惰性氣氛下攪拌5min。將混合物冷卻至0℃，并在5h的時間內(nèi)加入HATU(6.1mg)和NMM(1.8μL)的等分部分，共添加5次。1.5h之后，使反應(yīng)混合物升溫至室溫。6h之后，真空除去揮發(fā)物，并將所得殘余物溶于水和乙腈(v/v；1/4，0.6mL)，并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)－－水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)－－乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成亮白粉末狀的單-mPEG(7u)砜-單-(甲苯磺酰基甲基丙?；?苯甲酰胺-)-val-cit-PAB-MMAE試劑38(13.0mg，44％)m/z[M+2H2+]919.3。實(shí)施例17：使用試劑3，在經(jīng)還原的Fab二硫鍵處的PEG化，以及與已知PEG化試劑4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)-甲基]乙?；鵠苯甲酰胺-PEG(10kDa)-OMe41(NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)的比較通過添加50μL0.5M二硫蘇糖醇(DTT)水溶液并在22℃孵育1h來還原Fab(5.71mg，于PBS中2.33mg/mL，通過曲妥珠單抗的木瓜蛋白酶消化而產(chǎn)生)的鏈間二硫鍵。然后使用PD10柱除去還原劑，所述PD10柱用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖液、150mMNaCl、20mMEDTA平衡，并且用相同的緩沖液將經(jīng)還原的Fab進(jìn)一步稀釋至1.24mg/mL。將試劑3和41以10mg/mL的濃度單獨(dú)地溶于超純水，并將它們加入經(jīng)還原的Fab的單獨(dú)的溶液中，PEG試劑相當(dāng)于Fab1.5倍的摩爾當(dāng)量。在22℃進(jìn)行PEG化反應(yīng)，2h和4h之后取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。使用ImageQuantTM系統(tǒng)(GEHealthcare)，根據(jù)SDS-PAGE條帶密度來評估轉(zhuǎn)化為PEG化的Fab的％轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如圖1所示，其比較了PEG化試劑3(黑色柱)相對于試劑41(白色柱)與Fab的綴合程度。在2h和4h，與試劑3的反應(yīng)分別產(chǎn)生63％和83％轉(zhuǎn)化為PEG化的Fab的轉(zhuǎn)化率。對于試劑41，在2h和4h的轉(zhuǎn)化率分別為35％和51％。這些數(shù)據(jù)表明，試劑3反應(yīng)更快，其相對于試劑41在更短的時間范圍內(nèi)產(chǎn)生更大量的PEG化的Fab。實(shí)施例18：使用試劑3，在干擾素α二硫鍵處的PEG化，以及與已知PEG化試劑41的比較使用ZebaTMspin5mL柱，將干擾素α-2a(IFN)(4mL，0.93mg/mL，于20mMTrispH8.0、約100mMNaCl、蛋白酶抑制劑、1mMEDTA、10％甘油中)緩沖交換到磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH7.4)中。在22℃下通過用DTT(25mM)處理30min來還原IFN。使用以PBS(pH7.4)平衡的PD10脫鹽柱來除去還原劑。在4℃下，使試劑3和41(1.5當(dāng)量相對于每當(dāng)量IFN硫化物)與IFN(0.7mg/mL)綴合。1h、2h和4h孵育之后，通過SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物的樣品。使用ImageQuantTM系統(tǒng)(GEHealthcare)，根據(jù)SDS-PAGE條帶密度來評估轉(zhuǎn)化為PEG化的IFN的％轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如圖2所示，其比較了具有聚合乙二醇離去基團(tuán)的熒光試劑4和缺少聚合的離去基團(tuán)的類似試劑41的綴合率。與試劑41在相同的時間點(diǎn)相比，試劑3反應(yīng)更快并且產(chǎn)生更大量的IFN-PEG(10kDa)-OMe(對應(yīng)于約35kDa的條帶)。實(shí)施例19：具有聚合乙二醇離去基團(tuán)的熒光試劑4和缺少聚合的離去基團(tuán)的試劑36的綴合效率的比較使用與實(shí)施例17中所描述的方法類似的綴合方法，在綴合前將試劑4和36分別以1.53mg/mL和1.67mg/mL的濃度單獨(dú)地溶于100％MeCN中。向Fab溶液(在PBS中1.24mg/mL，0.475mL)中添加相當(dāng)于1.5當(dāng)量的試劑4或試劑36(18μL)。使反應(yīng)在22℃進(jìn)行22h，并在反應(yīng)過程中取樣用于SDS-PAGE分析。使用ImageQuantTM系統(tǒng)(GEHealthcare)，根據(jù)SDS-PAGE條帶密度來評估轉(zhuǎn)化為羅丹明綴合的Fab的％轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如圖3所示，其比較了在1.5當(dāng)量的試劑下，使用試劑4(黑色柱)和試劑36(白色柱)，轉(zhuǎn)化為羅丹明綴合的Fab的轉(zhuǎn)化率。在各時間點(diǎn)，試劑4轉(zhuǎn)化為綴合Fab的轉(zhuǎn)化率更高。實(shí)施例20：具有聚合乙二醇離去基團(tuán)的細(xì)胞毒性試劑5與缺少聚合離去基團(tuán)的類似試劑42(4-[2，2-雙[(對甲苯磺?；?-甲基]乙?；鵠苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE)的抗體綴合的比較試劑42如WO2014064423中所述合成。使用與WO2014064423的實(shí)施例中所描述的方法類似的方法，將試劑5和42兩者綴合至抗體曲妥珠單抗。簡言之，在40℃下用三(2-羧乙基)膦(TCEP)來還原曲妥珠單抗(5.2mg/mL)1h。然后通過將試劑5和試劑42兩者溶于DMF至最終濃度為1.6mM，使抗體與相對于每個鏈間二硫鍵1.5摩爾當(dāng)量的試劑5或42綴合。用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖液、150mMNaCl、20mMEDTA將抗體溶液稀釋到4.21mg/mL。將試劑5和42加到單獨(dú)的抗體等分部分中。用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖液、150mMNaCl、20mMEDTA將反應(yīng)中的最終抗體濃度調(diào)節(jié)至4mg/mL。輕輕混合各溶液并在22℃下孵育22h。在16h和22h取等分部分，在22℃下用N-乙?；?L-半胱氨酸(相對于試劑20當(dāng)量)處理1h，然后通過HIC分析。根據(jù)HIC色譜圖中在280nm處測量的吸收峰面積％確定藥物/抗體比例(DAR)為4時的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率％，結(jié)果如圖4所示，其示出了試劑5(黑色柱)和試劑42(白色柱)與抗體綴合的比較。圖4的結(jié)果表明，22h之后，使用試劑42產(chǎn)生了6％的DAR4綴合物，而在22h之后試劑5產(chǎn)生了78％的DAR4綴合物。實(shí)施例21：全部具有聚合乙二醇離去基團(tuán)的細(xì)胞毒性試劑5、6和10與缺少聚合離去基團(tuán)的類似試劑42、43和44的抗體綴合的比較如WO2014064423中所描述的，合成試劑43，并如WO2014064424所描述的，合成試劑44。(a)細(xì)胞毒性試劑43(4-[2，2-雙[(對甲苯磺?；?-甲基]乙酰基]苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)和試劑5的抗體綴合的比較用于將細(xì)胞毒性試劑43與抗體(5mg規(guī)模)綴合的反應(yīng)條件與以上實(shí)施例20中所述的反應(yīng)條件相同，但二者具有以下差異：將試劑43和5制備成3.2mMMeCN溶液。在0.5、1、2、4和22h之后取反應(yīng)溶液的等分部分，并通過用N-乙酰基-L-半胱氨酸處理(22℃下1h)而淬滅，并通過HIC分析。這些綴合反應(yīng)的結(jié)果如圖5所示，其為比較試劑5和試劑43在22h內(nèi)的綴合速率(平均DAR)的時程分析。在圖5中，可以看出試劑5的產(chǎn)物形成速率比試劑43快得多。使用HIC從各反應(yīng)混合物中純化出DAR4種類，并通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。根據(jù)SDS-PAGE分析，通過染色凝膠的ImageQuantTM分析來確定各樣品中存在的半抗體種類的百分?jǐn)?shù)(％)，結(jié)果示于表1，其中由試劑43制備的綴合物所具有的半抗體種類的量幾乎是由試劑5制備的綴合物的2倍。這表明由試劑5產(chǎn)生的綴合物具有顯著更多的重鏈至重鏈鏈間共價鍵，并且更類似于未綴合抗體的結(jié)構(gòu)。表1(b)細(xì)胞毒性試劑44(4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)-甲基]乙?；鵠苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1)和試劑10的抗體綴合的比較用于將細(xì)胞毒性試劑44與抗體(3.8mg規(guī)模)綴合的反應(yīng)條件與以上實(shí)施例20中所述的反應(yīng)條件相同。在16h和22h之后取反應(yīng)溶液的等分部分，并通過用N-乙酰基-L-半胱氨酸處理而淬滅。通過HIC分析各等分部分并確定生成DAR4產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率％。結(jié)果示于圖6，其為試劑10(黑色柱)和44(白色柱)與抗體綴合的比較。可見在16h和22h之后試劑10均產(chǎn)生更多的DAR4產(chǎn)物。(c)細(xì)胞毒性試劑43(4-[2，2-雙[(對甲苯磺?；?-甲基]乙?；鵠苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)和試劑6的抗體綴合的比較用于將細(xì)胞毒性試劑6與抗體(1mg規(guī)模)綴合的反應(yīng)條件與以上實(shí)施例20中所述的反應(yīng)條件類似，但二者具有以下差異：將試劑6制備為3.2mMMeCN溶液并且反應(yīng)中的MeCN濃度為5％。4h之后取反應(yīng)溶液的等分部分，通過用N-乙?；?L-半胱氨酸處理而淬滅并通過分析性HIC進(jìn)行分析，并確定存在的DAR4產(chǎn)物的百分?jǐn)?shù)(％)。結(jié)果示于圖7，其為試劑6(黑色柱)和43(白色柱)與抗體綴合的比較?？梢?，4h之后試劑6(黑色柱)比試劑43(白色柱)產(chǎn)生顯著更多的DAR4產(chǎn)物。實(shí)施例22：具有聚合乙二醇離去基團(tuán)的細(xì)胞毒性試劑12與不具有聚合離去基團(tuán)的類似試劑44的抗體綴合的比較用于將細(xì)胞毒性試劑12與抗體(1mg規(guī)模)綴合的反應(yīng)條件與以上實(shí)施例20中所述的反應(yīng)條件相同。4h之后取反應(yīng)溶液的等分部分，通過用N-乙?；?L-半胱氨酸處理而淬滅并通過HIC進(jìn)行分析。結(jié)果示于圖8，其為試劑44(白色柱)和12(黑色柱)與抗體綴合的比較。在圖8中，可以看出，與試劑44相比，試劑12在4h之后產(chǎn)生顯著更高收率的DAR4產(chǎn)物。實(shí)施例23：具有聚合乙二醇離去基團(tuán)的細(xì)胞毒性試劑14、15和31與不具有聚合離去基團(tuán)的類似試劑44的抗體綴合的比較用于將細(xì)胞毒性試劑14、15和31與抗體(1mg規(guī)模)綴合的反應(yīng)條件與以上實(shí)施例20中所述的反應(yīng)條件相同。4h之后取反應(yīng)溶液的等分部分，并通過用N-乙?；?L-半胱氨酸處理而淬滅。通過HIC分析各等分部分，并確定存在的DAR4產(chǎn)物的百分?jǐn)?shù)(％)。與試劑14、15、31和44的綴合結(jié)果示于表2，從中可見與試劑44相比，4h之后試劑14、15和31產(chǎn)生超過兩倍量的DAR4產(chǎn)物。表2：4h反應(yīng)之后試劑14、15、31和44與抗體綴合的比較用于與抗體綴合的試劑4h之后DAR4產(chǎn)物％449142415233128實(shí)施例24：抗體藥物綴合物的制備通過與WO2014064423和WO2014064424中所述的方法類似的方法，由試劑21、24和25制備抗體藥物綴合物。簡言之，在40℃下使用三(2-羧乙基)膦還原抗體(曲妥珠單抗或brentuximab)1h。然后，通過將試劑溶解在乙腈或DMF中至最終濃度為1.6mM而進(jìn)行抗體與試劑的綴合，每個鏈間二硫鍵使用1.5摩爾當(dāng)量的試劑。使用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖液、150mMNaCl、20mMEDTA將抗體溶液稀釋至4.21mg/mL。將試劑加到抗體中，并用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖液、150mMNaCl、20mMEDTA將反應(yīng)中的最終抗體濃度調(diào)節(jié)至4mg/mL。輕輕混合各溶液并在22℃下孵育。通過適用于各綴合物的疏水作用色譜法純化抗體藥物綴合物產(chǎn)物。實(shí)施例25：在pH6.6和7.9下，使用試劑3的組氨酸標(biāo)記的干擾素α的PEG化在pH6.6或pH7.9(通過分別混合乙酸鈉pH5.3或磷酸鈉pH8.0與磷酸鈉pH7.4而實(shí)現(xiàn))下，在2.5mg/mL下進(jìn)行干擾素α-2a(IFN)(具有8-組氨酸標(biāo)記)和試劑3的綴合。使用每當(dāng)量IFN1當(dāng)量、1.5當(dāng)量和2當(dāng)量的試劑3。在22℃下將所得反應(yīng)混合物孵育22h，在4h時進(jìn)行間斷分析。通過SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物，結(jié)果示于圖9中。在圖9中，泳道M表示Novex蛋白標(biāo)準(zhǔn)物；泳道1表示pH5.4下的IFN；泳道2表示pH8.0下的IFN；泳道3-5表示pH6.6下，4h時分別來自1、1.5和2當(dāng)量的試劑3的綴合產(chǎn)物；泳道7-9表示pH6.6下，22h時分別來自1、1.5和2當(dāng)量的試劑3的綴合產(chǎn)物；泳道10表示pH7.9下，22h時來自1.5當(dāng)量的試劑3的綴合產(chǎn)物。實(shí)施例26：二硫橋連試劑45的合成步驟1：化合物46的合成向下式的氨基己酸美坦辛(AHX-DM1).TFA鹽(29.4mg)于二甲基甲酰胺(DMF)(400μL)中的攪拌溶液中加入4-(N-Boc-氨基)-1，6-庚二酸雙-五氟苯基酯(10.2mg)于DMF(200μL)中的溶液。將所述溶液冷卻至0℃，然后添加N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)(13.5μL)。使溶液升溫至室溫并攪拌18.5h。通過反相C18柱色譜法純化反應(yīng)溶液，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。通過冷凍干燥法除去溶劑以產(chǎn)生白色固體狀的4-(N-boc-氨基)-1，6-庚烷二酰胺雙-AHX-DM1化合物46(假定的定量收率，29.7mg)m/z[M+2H-2(H2O)-NHCO]2+844(100％)，[M+H]+1767。步驟2：細(xì)胞毒性有效載荷47的合成將化合物46(假定的定量收率，29.7mg)溶解于甲酸(700μL)中，在室溫下攪拌溶液1.5h。真空除去揮發(fā)物，并通過溶于緩沖液A∶緩沖液B50∶50v/v％混合物(1.5mL，緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸)將殘余物轉(zhuǎn)化為三氟乙酸鹽。在室溫下攪拌溶液5min，然后通過冷凍干燥法除去溶劑。重復(fù)該過程以生成米黃色固體狀的4-(氨基)-1，6-庚烷二酰胺雙-AHX-DM1化合物47(18.0mg，在2步后60％)m/z[M+2H-2(H2O)-NHCO)]2+794(100％)，[M+H]+1667。步驟3：化合物48的合成按照專利(EP0624377A2)中所述的步驟來合成化合物48以生成白色固體，其具有與之前報道的數(shù)據(jù)一致的光譜數(shù)據(jù)。步驟4：化合物49的合成制備化合物48于DMF(500μL)中的儲備溶液，以及HATU(40.0mg)于DMF(400μL)中的儲備溶液。向化合物47(14.0mg)于DMF(700μL)中的攪拌溶液中加入化合物48儲備溶液(126.9μL)和HATU儲備溶液(77.8μL)的等分部分。將反應(yīng)溶液冷卻至0℃，然后加入DIPEA(4.11μL)。在0℃下攪拌溶液50min，然后再加入化合物48儲備溶液的等分部分(126.9μL)、HATU儲備溶液的等分部分(77.8μL)和DIPEA的等分部分(4.11μL)。在0℃下攪拌溶液40min。通過反相C18柱色譜法純化反應(yīng)溶液，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。通過冷凍干燥法除去溶劑以生成米黃色固體狀的4-(Fmoc-val-cit-氨基)-1，6-庚烷二酰胺雙-AHX-DM1化合物49(假定的定量收率，16.9mg)m/z[M+2H-2(H2O)]2+1055(100％)。步驟5：化合物50的合成向化合物49(假定的定量收率，16.9mg)于DMF(500μL)中的攪拌溶液中加入哌啶(3.04μL)。在室溫下攪拌反應(yīng)溶液1.5h，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。通過冷凍干燥法除去溶劑以生成米黃色固體狀的4-(val-cit-氨基)-1，6-庚烷二酰胺二-AHX-DM1化合物50(8.8mg，在2步后55％)m/z[M+2H]2+962(100％)。步驟6：包含細(xì)胞毒性有效載荷47的二硫橋連試劑45的合成制備化合物8(13.5mg)于DMF(100μL)中的儲備溶液、HATU(10.0mg)于DMF(200μL)中的儲備溶液和NMM(5.83μL)于DMF(94.2μL)中的儲備溶液。向50(1.8mg)于DMF(80μL)中的攪拌溶液中加入化合物23儲備溶液的等分部分(16.5μL)和HATU儲備溶液的等分部分(20.2μL)。將反應(yīng)溶液冷卻至0℃，然后加入NMM儲備溶液的等分部分(5μL)。在0℃下攪拌溶液1h，然后升溫至室溫。3.5h之后，通過反相C18柱色譜法純化反應(yīng)溶液，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。通過冷凍干燥法除去溶劑以生成固體狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-val-cit-氨基)-1，6-庚烷二酰胺雙-AHX-DM1試劑45(1.5mg，42％)m/z[M+4H-2(H2O)]4+992(100％)，[M+3H-2(H2O)]3+1321，[M+2H-2(H2O)]2+1982。實(shí)施例27：包含細(xì)胞毒性有效載荷47的二硫橋連試劑51的合成步驟1：試劑51的合成制備HATU(10mg)于DMF(200μL)中的儲備溶液和NMM(5.83μL)于DMF(94.2μL)中的儲備溶液。在攪拌下將化合物23(5.4mg)溶于化合物50(3.6mg)于DMF(254μL)中的溶液中。向所述攪拌溶液中加入HATU儲備溶液的等分部分(40μL)。將溶液冷卻至0℃，然后加入NMM儲備溶液的等分部分(10μL)。50min之后，加入HATU儲備溶液的等分部分(6.67μL)和NMM儲備溶液的等分部分(1.67μL)。在0℃下再攪拌反應(yīng)溶液20分鐘，并通過反相C18柱色譜法直接純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。通過冷凍干燥法除去溶劑以生成米黃色固體狀的試劑51(3.8mg，53％)m/z[M+4H-(H2O)-NHCO]4+1003(100％)，[M+3H-2(H2O)-NHCO]3+1331，[M+2H-2(H2O)]2+2017。實(shí)施例28：包含細(xì)胞毒性有效載荷47的二硫橋連試劑56的合成步驟1：化合物57的合成制備羥基苯并三唑(HOBt，6.6mg)于DMF(200μL)中的儲備溶液。向細(xì)胞毒性有效載荷47(10mg)于DMF(500μL)中的攪拌溶液中加入Fmoc-val-ala-PAB-PNP(3.7mg)以及HOBt儲備溶液的等分部分(2μL)。將反應(yīng)溶液冷卻至0℃，然后加入DIPEA(2.14μL)。然后將反應(yīng)溶液在室溫下攪拌18h，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。通過冷凍干燥法除去溶劑以生成Fmoc-val-ala-PAB-氨基-1，6-庚烷二酰胺雙-AHX-DM1試劑57。步驟2：化合物58的合成以與所述的化合物50的合成方法類似的方法，使用化合物57替代化合物49，合成雙-美登木素化合物胺-val-ala-PAB-氨基-1，6-庚烷二酰胺雙-AHX-DM1化合物58。步驟3：試劑56的合成以與所述的試劑51的合成方法類似的方法，使用化合物58替代化合物50，合成雙-美登木素試劑雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-Glu-[NH-PEG(24u)-OMe]-[val-ala-PAB-氨基-1，6-庚烷二酰胺雙-AHX-DM1]56。實(shí)施例29：包含細(xì)胞毒性有效載荷AHX-DM1的二硫橋連試劑59的合成向val-cit-AHX-DM1(5.0mg)于無水DMF(400μL)中的攪拌溶液中加入試劑8(13mg)，并在0℃下攪拌5min。依次加入HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，并在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。20min之后，加入額外量的HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)并在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。2.5h之后，將反應(yīng)冷卻至-20℃并保持16h。真空濃縮反應(yīng)溶液，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成稠的黃色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-AHX-DM1試劑59(5.6mg，41％)m/z[M-OH+H]2+1571.5。實(shí)施例30：使用二硫橋連試劑45產(chǎn)生抗體藥物綴合物60；使用二硫橋連試劑51產(chǎn)生抗體藥物綴合物61；以及使用二硫橋連試劑56產(chǎn)生抗體藥物綴合物62通過與WO2014064423和WO2014064424中所述的方法類似的方法，制備抗體藥物綴合物。簡言之，在40℃下使用三(2-羧乙基)膦還原抗體(曲妥珠單抗或brentuximab)1h。然后，通過將試劑在乙腈或DMF中至最終濃度為1.6mM而進(jìn)行抗體與試劑(即45、51或56)的綴合，每個鏈間二硫鍵使用1.5摩爾當(dāng)量的試劑。使用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖液、150mMNaCl、20mMEDTA將抗體溶液稀釋至4.21mg/mL。將試劑加到抗體中，并用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖液、150mMNaCl、20mMEDTA將反應(yīng)中的最終抗體濃度調(diào)節(jié)至4mg/mL。輕輕混合各溶液并在22℃下孵育。通過適用于各綴合物的疏水作用色譜法純化抗體藥物綴合物產(chǎn)物以生成具有確定的藥物/抗體比例(DAR)的產(chǎn)物。對于試劑45、51和56，通過HIC測定的轉(zhuǎn)化為DAR4產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率％分別為30％、65％和40％。實(shí)施例31：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和氟化芳基接頭的PEG綴合試劑63的合成步驟1：化合物64的合成將甲醛(37％溶液)(144μL)、哌啶(14.4μL)和哌啶鹽酸鹽(134mg)添加到4-乙?；?2-氟苯甲酸(200mg)和4-甲苯硫醇(272mg)于無水乙醇(1.5mL)中的混合物中。將反應(yīng)混合物在回流下加熱2.5h，在此期間再加入(1.5h之后)一部分甲醛(37％溶液)(144μL)。然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并攪拌過夜。加入額外量的甲醛(37％溶液)(288μL)和哌啶(14.4μL)，并將反應(yīng)混合物在回流下再加熱8h。然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并攪拌過夜。真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水∶乙腈(800μL，1∶3v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成淡橙色晶體狀的雙-(甲苯硫醚丙?；?-2-氟-苯甲酸化合物64(196.0mg，39％)m/z[M+H]+454.20Da；1HNMR(400MHz，CDCl3)2.35(6H，s，OMe)，3.20-3.30(4H，m，CH2)，3.70-3.80(1H，m，CH)，7.10(4H，d，Ar-H)，7.15(4H，d，Ar-H)，7.20(1H，s，Ar-H)，7.35(1H，d，Ar-H)，7.90(1H，t，Ar-H)。步驟2：化合物65的合成在室溫下向化合物64(75mg)于甲醇∶水(2.0mL，9∶1v/v)中的攪拌溶液中加入(304mg，Sigma-Aldrich)。2h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于二氯甲烷(3×5.0mL)，過濾通過硫酸鎂柱并用二氯甲烷沖洗(2×5.0mL)。合并洗脫液和沖洗液并真空除去揮發(fā)物以生成白色粉末狀的雙-(甲苯磺?；；?-2-氟-苯甲酸化合物65(84.0mg，98％)m/z[M+H]+519.15Da。步驟3：化合物66的合成向化合物65(75mg)于DMF(2.0mL)中的溶液中加入Et3N(240μL，AcrosOrganics)和MeO-PEG-(7u)-SH(154mg，IrisBiotech)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢璺磻?yīng)溶液。6h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水∶乙腈(2.0mL，1∶1v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成無色油狀的雙-mPEG(7u)-硫醚-丙?；?2-氟-苯甲酸化合物67(101mg，78％)m/z[M+H]+919.45Da。步驟4：化合物67的合成在室溫下向化合物66(80mg)于甲醇∶水(2.0mL，9∶1v/v)的攪拌溶液中加入(160mg，Sigma-Aldrich)。3h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于二氯甲烷(3×4mL)，過濾通過硫酸鎂柱并用二氯甲烷沖洗(2×5mL)。合并洗脫液和沖洗液并真空除去揮發(fā)物。將所得油溶于水并進(jìn)行冷凍干燥以產(chǎn)生澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)-砜-丙?；?2-氟-苯甲酸化合物67(82mg，95％)m/z[M+H]+983.26Da。步驟5：化合物63的合成制備HATU(40.0mg，Novabiochem)于DMF(200μL)中的儲備溶液和NMM(11.8μL，AcrosOrganics)于DMF(200μL)中的儲備溶液。向化合物67(25.0mg)的DMF(800μL)溶液中加入H2N-PEG(24u)-OMe(23.4mg，IrisBiotech)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。每10min添加HATU(40.0μL)和NMM(40.0μL)的等分部分，共添加3次，在30min時加入HATU(80.0μL)和NMM(80.0μL)剩余的等分部分。60min之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(1.0mL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)—－乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)-砜-丙?；?2-氟-苯甲酰胺-PEG(24u)試劑63(17.5mg，40％)m/z[M+3H]3+684.94Da。實(shí)施例32：包含7個重復(fù)單位乙二醇氨基離去基團(tuán)的PEG綴合試劑68的合成步驟1：化合物69的合成制備HATU(632mg，Novabiochem)于DMF(1.6mL)中的儲備溶液和NMM(183μL，AcrosOrganics)于DMF(1.6mL)中的儲備溶液。向4-(3-甲苯磺酰基-2-(甲苯磺?；谆?丙?；?苯甲酸(199mg，BioVectra)的DMF(4.0mL)溶液中加入H2N-PEG(24u)-CO2tBu(400.0mg，IrisBiotech)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。每10min添加HATU(320μL)和NMM(320μL)的等分部分，共添加5次。120min之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水∶乙腈(2.0mL，1∶3v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)—－乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的橙色油狀的雙-(甲苯磺?；；?-苯甲酰胺-PEG(24u)-t丁酯化合物69(184mg，33％)m/z[M+Na+H]2+853.43Da，[M-(tBu)+2H]2+814.83Da。步驟2：化合物68的合成向69(32mg)于DMF(500μL)中的溶液中加入無水碳酸鈉(24.1mg，F(xiàn)isherScientific)和MeO-PEG-(7u)-NH2(19mg，IrisBiotech)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢璺磻?yīng)混合物。18h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(1.0mL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)－－水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)-氨基-丙?；?苯甲酰胺-PEG(24u)-t丁酯試劑68(15.0mg，38％)m/z[M+2H]2+1026.09Da，[M+3H]3+665.45Da。實(shí)施例33：包含馬來酰亞胺單元、7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)的綴合試劑70的合成步驟1：化合物71的合成將3，4-二溴呋喃-2，5-二酮(300mg，SigmaAldrich)溶解于乙酸(4.0mL，F(xiàn)isherScientific)并向其中添加CO2tBu-PEG-(24u)-NH2(705mg，IrisBiotech)。在75℃下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢璺磻?yīng)混合物。3h之后，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物，21h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，4.0mL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成米黃色不透明固體狀的二溴-馬來酰亞胺-PEG(24u)-t丁酯化合物71(427mg，51％)m/z[MH-(tBu)]2+692.68Da。步驟2：化合物70的合成向71(250mg)于DMF(1.5mL)中的溶液中加入α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)(186mg，IrisBiotech)和三乙胺(145μL)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。將快速沉淀的三乙胺氫溴酸鹽與DMF(1.0mL)重新溶解于反應(yīng)混合物，30min之后真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于甲酸(3mL，SigmaAldrich)，并在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢璺磻?yīng)混合物。30min之后加入三氟乙酸(50μL，AcrosOrganics)，60min之后加入更多的三氟乙酸(300μL)。100min之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(1.5mL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成蠟狀黃色固體狀的雙-mPEG(7u)-馬來酰亞胺-PEG(24u)-酸試劑70(146mg，43％)m/z[MH3]3+646.28Da。實(shí)施例34：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑72的合成步驟1：化合物73的合成向4-(3-甲苯磺?；；?苯甲酸(99mg，BioconjugateChem.2014，(25)460-469)于二甲基甲酰胺(DMF，5.0mL)中的攪拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)(170mg，IrisBiotech)和三乙胺(250μL)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。4h之后將另外一部分三乙胺(120μL)加到反應(yīng)混合物中。95.0h之后真空除去揮發(fā)物并將所得殘余物溶于水/乙腈(2mL，1∶1v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的mPEG(7u)-硫醚-丙酰基-苯甲酸化合物73(200mg，126％，含有殘留溶劑)m/z[M+H]+(533)。步驟2：化合物74的合成在室溫下向73(200mg)于甲醇∶水(5.5mL，9∶1v/v)的攪拌溶液中加入(320mg)。4.5h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于二氯甲烷(4×3mL)，過濾通過硫酸鎂柱并用二氯甲烷沖洗(2×3mL)。合并洗脫液和沖洗液，并真空除去揮發(fā)物以生成稠的澄清油。將殘余物溶于水∶乙腈(1.0mL，4∶1v/v)，并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的mPEG(7u)-砜-丙?；?苯甲酸試劑74(90mg，60％)m/z[M+H]+(565)。步驟3：化合物72的合成在0℃下向val-cit-PAB-MMAE(30mg)于無水DMF(500μL)中的攪拌溶液中加入化合物73(11mg)并攪拌5min。依次加入HATU(9.95mg)和NMM(4.26μL)并在0℃下攪拌反應(yīng)混合物。0.5h和2h之后加入額外量的HATU和NMM，再過2.0h之后，真空濃縮反應(yīng)溶液，然后通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成米黃色固體狀的mPEG(7u)-砜-丙?；?苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE試劑72(15.0mg，46％)m/z[M+H]+(1671)。實(shí)施例35：包含7個重復(fù)單元乙二醇離去基團(tuán)和呋喃接頭的綴合試劑75的合成步驟1：試劑76的合成向N，N--二甲基亞甲基碘化銨(407mg)于DMF(3.0mL)中的懸浮液中加入5-乙?；秽?2-甲酸(169mg)。將反應(yīng)混合物加熱到125℃并在惰性氣氛下攪拌90min。向一部分反應(yīng)混合物(1.0mL)中加入mPEG-(7u)-SH(325mg)和Et3N(363μL)。在室溫下在惰性氣氛下攪拌反應(yīng)混合物90min。真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(1.0mL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成淺黃色油狀的雙-mPEG(7u)-硫醚-丙?；?呋喃-2-甲酸試劑76(119mg，36％)。收率計(jì)算是基于所使用的起始反應(yīng)混合物的1/3部分。1HNMR(400MHz，DMSO)2.60-2.70(4H，m，CH2)，2.80-2.90(4H，m，CH2)，3.24(6H，s，OMe)，3.40-3.60(m，PEG)，3.90-3.95(1H，m，CH)，7.36(1H，d，Ar-H)，7.69(1H，d，Ar-H)。步驟2：試劑77的合成向76(30.0mg)于甲醇∶水(1.0mL，9∶1v/v)中的溶液中加入(62.1mg，Sigma-Aldrich)。在室溫下在惰性氣氛下攪拌反應(yīng)混合物120min。真空濃縮粗反應(yīng)混合物。將所得殘余物溶于二氯甲烷(3×5.0mL)，過濾通過硫酸鎂柱并用二氯甲烷沖洗(2×5.0mL)。合并洗脫液和沖洗液并真空除去揮發(fā)物以生成澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)-砜-丙酰基-呋喃-2-甲酸試劑77(31.0mg，97％)。m/z[M+H]+955.28Da。步驟3：試劑75的合成制備HATU(51.5mg)于DMF(200μL)中的儲備溶液和NMM(15.0μL)于DMF(200μL)中的儲備溶液。將雙-mPEG(7u)-砜-丙?；?呋喃-2-甲酸77(31.0mg)的DMF(500μL)溶液加到H2N-PEG(24u)-OMe(29.5mg，IrisBiotech)的DMF(500μL)溶液中。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。在0min、10min、30min的時間點(diǎn)時加入HATU的等分部分(40μL)和NMM的等分部分(40μL)，并在90min時加入HATU的等分部分(80μL)和NMM的等分部分(80μL)。120min之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水∶乙腈(1.0mL，1∶1v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)-砜-丙?；?呋喃-2酰胺-PEG(24u)-OMe試劑75(9.6mg，18％)。m/z[M+2H]2+1012.76Da。實(shí)施例36：包含7個重復(fù)單元乙二醇硫化物離去基團(tuán)的綴合試劑78的合成向1-(4-羥苯基)-3-甲苯磺?；?2-(甲苯磺?；谆?丙-1-酮(400mg)于DMF(8.0mL)中的溶液中加入Et3N(708μL，AcrosOrganics)和MeO-PEG-(7u)-SH(905mg，IrisBiotech)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢璺磻?yīng)混合物。48h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水∶乙腈(2.0mL，1∶1v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的化合物79(322mg，43％)m/z[M+H]+873.49Da。實(shí)施例37：包含7個重復(fù)單元乙二醇砜離去基團(tuán)的綴合試劑79的合成在室溫下向化合物78(20.0mg)于甲醇∶水(500μL，9∶1v/v)的攪拌溶液中加入(42.2mg，Sigma-Aldrich)。3h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水∶乙腈(800μL，1∶1v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的化合物79(19.5mg，91％)m/z[M+H]+936.86Da。實(shí)施例38：包含7個重復(fù)單元乙二醇砜離去基團(tuán)和苯酚酯接頭的綴合試劑80的合成步驟1：化合物81的合成向mPEG(24u)-COOH(38.4mg，IrisBiotech)于DMF(400μL)中的溶液中加入HATU(26.1mg)和DIPEA(12.0μL)。在惰性氮?dú)鈿夥障略谑覝叵聰嚢璺磻?yīng)混合物5.0min。向該混合物加入溶于DMF(100μL)的化合物79(20.0mg)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障略贁嚢璺磻?yīng)混合物42h。42h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(800μL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的化合物81(15.4mg，34％)m/z[M+2H-mPEG(7u)碎片]2+824.34Da。步驟2：化合物80的合成在室溫下向化合物81(14.0mg)于甲醇∶水(500μL，9∶1v/v)的攪拌溶液中加入(13.1mg，Sigma-Aldrich)。230min之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(1.0mL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的化合物80(12.7mg，88％)m/z[M+3H]3+679.16Da。實(shí)施例39：包含7個重復(fù)單元乙二醇砜離去基團(tuán)、非芳族接頭和奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑82的合成步驟1：化合物83的合成在室溫下向3-溴-2-(溴甲基)丙酸(1.32g，AlfaAesar)于甲醇(50.0mL)中的攪拌溶液中加入壓碎的氫氧化鈉顆粒(428mg，F(xiàn)isherScientific)。加熱混合物直至固體溶解。加入苯亞磺酸(1.76g，SigmaAldrich)的鈉鹽并在惰性氮?dú)鈿夥障率狗磻?yīng)混合物回流。4.0h之后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢柽^夜。20h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于0.5M氫氧化鈉(30mL)并用二乙醚(3×10.0mL)沖洗。用37％鹽酸使水相部分呈酸性并產(chǎn)生白色沉淀。通過Buchner過濾器收集沉淀物，用蒸餾水(3×20.0mL)沖洗滲余物，并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色粉末狀的化合物83(632mg，32％)m/z[M+H]+369.08Da；[M+Na]+391.04Da。步驟2：化合物84的合成在室溫下向化合物83(111mg)于二甲基甲酰胺(2.0mL)中的攪拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)(428mg，IrisBiotech)和三乙胺(251μL)。在室溫下在惰性氣氛下攪拌所得反應(yīng)混合物。20h之后，將粗反應(yīng)混合物用水(1.0mL)稀釋并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的化合物84(154mg，64％)m/z[M-PEG-(7u)]+473.05Da。步驟3：化合物85的合成在室溫下向雙-mPEG(7u)-硫醚-丙酸(65.0mg)于甲醇∶水(1.5mL，9∶1v/v)中的攪拌溶液中加入(151mg，Sigma-Aldrich)。3.0h之后真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(800μL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的化合物85(41.7mg，59％)m/z[M+H]+860.91Da。步驟4：化合物82的合成制備HATU(26.4mg)于DMF(200μL)中的儲備溶液和NMM(7.6μL)于DMF(200μL)中的儲備溶液。將化合物83(12.0mg)的DMF(200μL)溶液加入NH2-Val-Cit-PAB-MMAE(21.5mg，Concortis)的DMF(400μL)溶液中。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。在0min和40min時加入HATU的等分部分(80μL)和NMM的等分部分(80μL)，共加入2次。180min之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水∶乙腈(1.0mL，1∶1v/v)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色粉末狀的試劑82(13.6mg，50％)。m/z[M+2H]2+983.45Da。實(shí)施例40：含有7個重復(fù)單元乙二醇砜離去基團(tuán)和非芳族接頭的綴合試劑86的合成步驟1：化合物87的合成在室溫下向化合物84(15.0mg)于甲苯(250μL)中的攪拌溶液中加入mPEG-(23u)-OH(19.7mg，IrisBiotech)、三苯基膦(5.43mg，SigmaAldrich)和偶氮二甲酸二異丙酯(4.1μL，SigmaAldrich)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。30min之后，加入額外的三苯基膦(5.43mg，SigmaAldrich)和偶氮二甲酸二異丙酯(4.10μL，SigmaAldrich)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢璺磻?yīng)混合物。1.0h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(700μL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色蠟狀的化合物87(18.5mg，54％)m/z[M-PEG-(7u)]+750.19Da。步驟2：化合物86的合成在室溫下向化合物87(14.5mg)于甲醇∶水(1.0mL，9∶1v/v)中的攪拌溶液中加入(14.7mg，Sigma-Aldrich)。3.0h之后，通過脫脂棉(1.5cm塞(plug))過濾反應(yīng)混合物。將粗產(chǎn)物通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色蠟狀的化合物86(7.1mg，47％)m/z[M+3H]3+629.91Da。實(shí)施例41：包含7個重復(fù)單元乙二醇砜離去基團(tuán)和聚乙二醇間隔基的雙官能綴合試劑88的合成制備HATU(448mg)于DMF(2.0mL)中的儲備溶液和NMM(129μL)于DMF(2.0mL)中的儲備溶液。將氨基-PEG-(11u)-胺(64.1mg，IrisBiotech)的DMF(500μL)溶液加到4-[2，2-雙[α-甲氧基-ω-磺?；?乙二醇)]乙?；鵠苯甲酸(250mg)的DMF(2.0mL)溶液中。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。在0min時加入HATU的等分部分(800μL)和NMM的等分部分(800μL)，并在50min時加入HATU的等分部分(200μL)和NMM的等分部分(200μL)，共加入2次。2.0h之后，真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物溶于水(1.0mL)并通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的試劑88(200mg，69％)。m/z[M+H]2+1219.5Da[M+2H]3+813.35Da，[M+3H]4+610.28Da。實(shí)施例42：包含7個重復(fù)單元乙二醇砜離去基團(tuán)和磺酸側(cè)鏈的綴合試劑89的合成在室溫下向3-(N-(3-磺丙基)-4-(3-甲苯磺?；?2-(甲苯磺酰基甲基)丙?；?苯甲酰氨基)丙酸(ClickChemistryToolsLLC，20.0mg)于二甲基甲酰胺(500μL)中的攪拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)(30.2mg，IrisBiotech)和三乙胺(23.6μL)。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。3.5h之后，將粗中間產(chǎn)物通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)－－水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)－－乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑。將所得澄清的無色殘余物溶于甲醇∶水(750μL，9∶1v/v)中并將該溶液加到(52.1mg，Sigma-Aldrich)中。在室溫下在惰性氮?dú)鈿夥障聰嚢杷梅磻?yīng)混合物。4.5h之后將粗產(chǎn)物通過反相C18柱色譜法純化，所述C18柱用緩沖液A(v/v)－－水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)－－乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的化合物89(4.71mg，14％)m/z[M+H]2+579.67Da，[M+H2O]2+588.17Da。實(shí)施例43：使用綴合試劑63、68和70，在還原的Fab二硫鍵處的PEG化向通過木瓜蛋白酶消化而產(chǎn)生的曲妥珠單抗的Fab中加入1MDTT儲備溶液(25μL，最終濃度10mM)，使用渦旋短暫地混合還原混合物，并在22℃下孵育1h。然后使用PD10柱(GEHealthcare)除去還原劑，所述PD10柱用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖液、150mMNaCl、20mMEDTA平衡。用相同的緩沖液將經(jīng)還原的Fab進(jìn)一步稀釋至1.2mg/mL。在0.719mM下將試劑63、68和70各自溶于乙腈，并加入單獨(dú)的經(jīng)還原的Fab的溶液中(每Fab1.5當(dāng)量試劑)。使PEG化反應(yīng)在22℃下進(jìn)行，22h之后從其中取出樣品進(jìn)行HICHPLC分析。各反應(yīng)混合物的HICHPLC分析表明，對于試劑63、68和70而言，轉(zhuǎn)化為PEG化的Fab的轉(zhuǎn)化率％分別為95％、90％和90％。實(shí)施例44：試劑72與部分還原的曲妥珠單抗的綴合使于pH為7.5的20mM磷酸鈉(20mMEDTA；150mMNaCl)中的曲妥珠單抗(3.5mg，5.2mg/mL)升溫至40℃并保持15min。向該曲妥珠單抗中加入2.08mMTCEP(28μL)并將所得混合物在40℃下孵育1h。1h之后，將經(jīng)TCEP處理的曲妥珠單抗冷卻至22℃。用pH為7.5的20mM磷酸鈉(20mMEDTA；150mMNaCl)(0.12mL)稀釋一部分曲妥珠單抗溶液(3.2mg，0.64mL，5.0mg/mL)。向3個小瓶中裝入稀釋的mAb溶液(1mg，238μL)。制備試劑72于DMF中的溶液(3.2mM)。將該試劑溶液(12.5μL，每mAb6.0當(dāng)量)加到單獨(dú)的小瓶中，將反應(yīng)物混合，然后在22℃下孵育。22h時用N-乙?；?L-半胱氨酸(相對于試劑20當(dāng)量)淬滅反應(yīng)樣品，然后進(jìn)行HIC分析。HICHPLC分析表明與試劑72綴合的曲妥珠單抗的平均DAR為4.5。實(shí)施例45：試劑82和86與曲妥珠單抗的綴合使用相同的方案使試劑82和86與抗體曲妥珠單抗綴合。簡言之，在40℃下將于緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液，150mMNaCl，20mMEDTA，pH8.4)中的曲妥珠單抗(5.2mg/mL)用TCEP(6當(dāng)量)還原1h。然后在40℃下進(jìn)行抗體與每個鏈間二硫鍵1.5摩爾當(dāng)量的試劑82或86的綴合。這通過在乙腈(每個反應(yīng)中5％v/v乙腈)中加入試劑82或試劑86來實(shí)現(xiàn)。用pH為8.4的20mM磷酸鈉緩沖液，150mMNaCl，20mMEDTA將抗體溶液稀釋至4.0mg/mL。輕輕混合各溶液并在40℃下孵育22h。22h時，在22℃用N-乙?；?L-半胱氨酸(相對試劑20當(dāng)量)處理反應(yīng)1h。隨后通過分析性HIC來分析反應(yīng)物?；贖IC色譜圖中在280nm處測量的吸收峰的面積％來確定使用試劑82和86時轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率％。對于試劑82和86而言，轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率數(shù)值％分別為100％和50％。實(shí)施例46：使用綴合試劑75、79和80以及試劑89，在經(jīng)還原的Fab二硫鍵處的PEG化通過與實(shí)施例43中對于綴合試劑63、68和70所述的方法類似的方法，使試劑75、79、80和89與Fabtrast綴合。22h綴合反應(yīng)之后，在還原和非還原條件下通過SDS-PAGE分析樣品。使用ImageQuantTMLAS4010系統(tǒng)(GEHealthcare)，使用以InstantBlueTM染色的凝膠，從條帶密度測量值來評估使用各試劑時PEG化的Fabtrast的轉(zhuǎn)化率％。對于試劑75、79、80和89，轉(zhuǎn)化率％數(shù)值分別為90％、20％、75％和40％。實(shí)施例47：分別包含3或5個重復(fù)單元聚合乙二醇離去基團(tuán)和奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑90(對比)和91(對比)的合成以與實(shí)施例4中所述的試劑5的合成方法類似的方法，分別使用硫醇2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙硫醇和2，5，8，11，14-五氧十六烷-16-硫醇代替實(shí)施例1中用于合成化合物1的α-甲氧基-ω-巰基七(乙二醇)來合成奧瑞斯他汀試劑雙-mPEG(3u)砜-丙?；?苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE90和雙-mPEG(5u)砜-丙?；?苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE91。實(shí)施例48：包含單一7個重復(fù)單元的乙二醇離去基團(tuán)和24個單元PEG的PEG化試劑92的合成根據(jù)NatureProtocols(2006，1，2241-2252)，使用實(shí)施例10中的化合物23來合成單-mPEG(7u)砜-(甲基-丙烯?；?-苯甲酰胺-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe]試劑92。實(shí)施例49：具有聚合乙二醇離去基團(tuán)的細(xì)胞毒性試劑90(對比)、91(對比)和5的抗體綴合的比較用于將細(xì)胞毒性試劑90、91和5與曲妥珠單抗(1mg規(guī)模)綴合的反應(yīng)條件與上述實(shí)施例20中的那些條件相同，在綴合反應(yīng)中使用1.25％v/vMeCN作為溶劑代替DMF。2h和4h之后取反應(yīng)溶液的等分部分并各自通過用N-乙?；?L-半胱氨酸處理而淬滅。通過HIC分析各等分部分并確定％DAR產(chǎn)物特征。試劑90、91和5的綴合結(jié)果示于表3和圖10(2小時)和11(4小時)?？梢?，與使用對比試劑所得結(jié)果相比，使用本發(fā)明的試劑所得的結(jié)果得到顯著改善——產(chǎn)物的同質(zhì)性高得多，產(chǎn)物主要是期望的DAR4綴合物。表3：2h和4h反應(yīng)之后，試劑90、91和5與抗體綴合的比較實(shí)施例50：使用試劑92，在經(jīng)還原的Fab二硫鍵處的PEG化使用與實(shí)施例17中所述的條件相同的條件，使試劑92與經(jīng)還原的Fab綴合。隨后通過SDS-PAGE分析反應(yīng)物，在相對于分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的49kDa處觀察到主要產(chǎn)物——PEG化的Fab。實(shí)施例51：包含奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑93的合成步驟1：化合物94的合成在0℃下在氮?dú)鈿夥障聦oc-L-Glu(135mg)和(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)(724mg)溶于無水DMF(4mL)中并攪拌1.25h。然后將該溶液加到H2N-PEG(12u)-Me(685mg)和NMM(180μL)于DMF(3mL)中的溶液中。然后在N2下攪拌溶液4h。然后在0-4℃下在氮?dú)鈿夥障聰嚢枞芤?.5h。加入另外的BOP(241mg)和NMM(60μL)，使反應(yīng)混合物在4℃下靜置24h。真空除去揮發(fā)物并將所得殘余物通過反相C18快速色譜法純化，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至65∶35v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑。通過正相快速色譜法重新純化材料，所述色譜法用乙酸乙酯∶甲醇(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成無色油狀的Boc-Glu-[PEG(12u)-Me]2化合物94(450mg)。m/z[M+H]+(1331，100％)，[M+2H]2+(665，100％)。步驟2：化合物95的合成將化合物94(450mg)溶于DCM(25mL)中，向其中加入TFA(2.5mL)。在室溫下攪拌溶液5h。然后真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物通過反相C18快速色譜法純化，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至60∶40v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色膠狀的Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2TFA化合物95(320mg)m/z[M+Na]1+(1253.0，10％)[M+H]2+(616.8，100％)。步驟3：化合物96的合成向Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)于無水DMF(2mL)中的攪拌溶液中加入HATU(37mg)。在0℃下在氮?dú)鈿夥障聰嚢璺磻?yīng)混合物1h，然后加入化合物95(103.5mg)和NMM(19μL)于DMF(1mL)中的溶液。加入額外的DMF(1mL)。使攪拌的反應(yīng)物升溫至室溫并保持5h以上。真空除去揮發(fā)物。將所得淺黃色油通過反相C18快速色譜法純化，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至50∶50v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色糊狀的Fmoc-L-Glu-(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物96(173mg)。m/z[M+1]+(1638，100％)&[M+Na]+(1660，57％)。步驟4：化合物97的合成向化合物96(173mg)于無水DMF(3.2mL)中的攪拌溶液中加入哌啶(104μL)。在室溫下在氬氣下攪拌溶液1.5h。真空除去揮發(fā)物并用己烷重復(fù)研磨殘余物。真空干燥產(chǎn)物以生成澄清的無色油狀的L-Glu-(OtBu)-L-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物97(152mg)。m/z[M+H]1+(1416.7，85％)，[M+2H]2+(708.5，100％)，[M+Na]1+(1438.7，30％)。步驟5：化合物98的合成向4-[2，2-雙[α-甲氧基-ω-磺?；?乙二醇)]乙?；鵠苯甲酸(114mg)于無水DMF(3mL)中的攪拌溶液中加入HATU(51mg)。在0℃下攪拌反應(yīng)混合物0.5h，然后將其加到L-Glu(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2(152mg)于DMF(2mL)中的溶液中，并用另外的DMF(1mL)沖洗，然后用NMM(15μL)沖洗。在0-15℃下攪拌反應(yīng)混合物3.5h，然后真空除去揮發(fā)物。將所得殘余物通過反相C18快速色譜法純化，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至55∶45v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-L-Glu-(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物98(161mg)。m/z[M+H]1+(2366.7，100％)，[M+2H]2+(1184.0，80％)[M+H2O]3+(795.5，100％)。步驟6：化合物99的合成向化合物98(58mg)于無水DCM(6mL)中的攪拌溶液中加入TFA(6mL)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物2h，然后真空除去揮發(fā)物，將所得殘余物溶于水(25mL)并冷凍干燥以生成澄清的無色油狀的雙-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-(OH)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2化合物99(160.6mg)。m/z[M+H]1+(2306.8，90％)，[M+2H]2+(1153.0，100％)。步驟7：試劑93的合成以與實(shí)施例11A中試劑24的合成方法類似的方法，從化合物99和val-cit-PAB-MMAETFA鹽合成試劑93。雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-L-Glu-(val-cit-PAB-MMAE)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]293是作為無色油而分離的(69％)。m/z[M+H]1+(3410.4，90％)，[M+2H]2+(1706.2，60％)，[M+3H]3+(1137.2，85％)，[M+4H]4+(852.8，70％)。如實(shí)施例21所述，使Brentuximab與綴合試劑93的綴合反應(yīng)進(jìn)行16h。分析性HIC的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化為DAR4產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為67％。實(shí)施例52：包含奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑100的合成以與實(shí)施例11A中試劑24的合成方法類似的方法，使用化合物20B替代化合物23，以及val-cit-PAB-MMAETFA鹽替代val-cit-AHX-DM1，合成試劑100。以與實(shí)施例10中化合物23的合成方法類似的方法，使用H2N-PEG(12u)-三(m-dPEG(24u)替代H2N-PEG(24u)，制備化合物20B。雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(12u)-三(m-dPEG(24u))]100是作為無色油而分離的。m/z[M+2H]2+(3166，20％)，[M+3H]3+(2111，50％)，[M+4H]4+(1583，100％)。如實(shí)施例21所述，使Brentuximab與綴合試劑100的綴合反應(yīng)進(jìn)行16h。分析性HIC的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化為DAR4產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為65％。實(shí)施例53：包含兩個奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑101的合成步驟1：化合物102的合成向Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(2g)于無水DMF(18mL)中的攪拌溶液中加入HOBt(666mg)和DIC(768μL)。在0℃下攪拌反應(yīng)混合物10min，然后在室溫下攪拌2.5h。在室溫下加入H-L-Glu-(OtBu)-OH(1.19g)和DIPEA(2.46mL)并攪拌反應(yīng)混合物18h。將反應(yīng)混合物用水(100mL)稀釋，并通過加入稀HCl將反應(yīng)混合物酸化至pH2.0。用EtOAc(3×100mL)萃取水層，合并有機(jī)相并用水(2×50mL)和飽和鹽水溶液(1×50mL)沖洗。將EtOAc層通過Na2SO4干燥2h，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。將產(chǎn)物通過反相C18快速色譜法分離，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至80∶20v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的化合物Fmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH102(875mg)。m/z[M+H]1+(610.8，85％)，[M+Na]1+(633.1，55％)，[2M+Na]+(1243.2，55％)。步驟2：化合物103的合成向Fmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH(510mg)和NH2-PEG(24u)-OMe(1g)于無水DMF(5mL)中的攪拌溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(44μL)和HATU(48mg)。在0℃下攪拌反應(yīng)混合物10min，然后在室溫下攪拌16h。將溶液真空濃縮至2ml，并將殘余物通過反相C18快速色譜法純化，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至83∶17v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色糊狀的Fmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe化合物103644mg)。m/z[M+H]1+(1681.0，40％)，[M+Na]1+(1704.0，30％)和[M+2H]2+(841.4，55％)。步驟3：化合物104的合成向Fmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe(193mg)于無水DMF(900μL)中的攪拌溶液中加入哌啶(34μL)，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1h。將溶液真空濃縮至干燥，并用Et2O(2×2.5mL)研磨殘余物。真空干燥產(chǎn)物以生成米黃色固體狀的H-L-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe化合物104(166mg)。步驟4：化合物105的合成以與實(shí)施例10中化合物23的合成方法類似的方法，從化合物104和4-[2，2-雙[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙?；鵠苯甲酸來合成試劑105。雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe105是作為無色油而分離的。m/z[M+H]1+(2407.2，25％)，[M+Na]1+(2429.4，70％)。步驟5：化合物106的合成以與實(shí)施例10中試劑23的合成方法類似的方法，從化合物105合成試劑106。雙-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-Glu-(OH)-Glu-(OH)-PEG(24u)-OMe106是作為無色油而分離的。m/z[M+H]1+(2294.2，20％)，[M+Na]1+(2317.4，10％)和[M+2Na]2+(1217.4，100％)。步驟6：試劑101的合成向化合物106(28mg)、val-cit-PAB-MMAETFA鹽(31mg)和HATU(14mg)于無水DMF(1.5mL)中的攪拌溶液中加入N-甲基嗎啉(7μL)，并在0℃下攪拌反應(yīng)混合物5h。將溶液用水(1mL)稀釋并通過反相C18快速色譜法純化，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％TFA和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.1％TFA(100∶0v/v至60∶40v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的雙-mPEG(7u)砜-丙?；?苯甲酰胺-雙-[Glu-(val-cit-PAB-MMAE)]-PEG(24u)-OMe化合物101(36mg)。m/z[M+2H]2+(2252.7，20％)，[M+3H]3+(1501.6.7，40％)和[M+4H]4+(1126.6，100％)。如實(shí)施例21所述，使Brentuximab與綴合試劑101的綴合反應(yīng)進(jìn)行16h。分析性HIC的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化為DAR4產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為56％。實(shí)施例54：包含兩個奧瑞斯他汀細(xì)胞毒性有效載荷的綴合試劑107的合成步驟1：化合物108的合成向Boc-L-Glu(OH)-OH(51.6mg)于無水DMF(6mL)中的攪拌溶液中加入BOP(277mg)。在0℃下攪拌溶液20min，然后加入MeO-PEG(24)-NH2(500mg)，之后加入NMM(69μL)。4h之后，加入額外量的BOP(92mg)和NMM(23μL)。再過2.5h之后，將反應(yīng)混合物貯存在-20℃下18h，然后真空濃縮并通過反相柱C18柱色譜法純化，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體(373mg)。將甲酸(6mL)加到所述固體中，并在惰性氣氛下攪拌所得混合物60min，然后真空濃縮。將殘余物溶于95％水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸(約6mL)并冷凍干燥過夜以生成米黃色固體狀的TFA·H2N-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe，化合物108(330mg)。m/z[M+2H]2+(1144，5％)，[M+3H]3+(763，35％)，[M+4H]+(573，100％)。步驟2：化合物109的合成在0℃下向Fmoc-Glu(OtBu)-OH(2g)于無水DMF(18mL)中的攪拌溶液中加入HOBt(666mg)和DIC(768μL)。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，2h之后加入Glu(OtBu)-OH(1.19g)和DIPEA(2.46mL)。攪拌20h之后，將反應(yīng)混合物真空濃縮并通過反相柱C18柱色譜法純化，所述色譜法用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成Fmoc-(L-Glu(OtBu))2-OH，化合物109，其為白色固體(1.03g)。m/z[2M+H]+(1221，15％)，[M+H]+(611，60％)，[M-tBu+H]+(554，65％)，[M-2tBu+H]+(499，100％)。步驟4：化合物110的合成向化合物108(330mg)于無水DMF(10mL)中的攪拌溶液中加入化合物109(100mg)。然后在0℃下加入HATU(156mg)和NMM(45μL)并攪拌所得溶液5min，然后再加入NMM(3μL)和HATU(11mg)。將反應(yīng)溶液再攪拌20min，然后升溫至室溫，再繼續(xù)攪拌4h。然后加入額外量的HATU(51mg)和NMM(15μL)。再過1.5h之后，將混合物在-20℃下貯存18h，然后通過反相C18柱色譜法純化，用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的Fmoc-(L-Glu(OtBu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe，化合物110(193mg)。m/z[M+3H]3+(961，20％)，[M-tBu+4H]4+(707，100％)，[M-2tBu+4H]4+(693，85％)，[M+5H]5+(577，75％)。步驟5：化合物111的合成向111(193mg)于無水DMF(1.5mL)中的攪拌溶液中加入哌啶(20μL)。90min之后，加入額外量的哌啶(13μL)，將反應(yīng)溶液再攪拌90min，然后在-20℃下貯存18h。在高真空下除去溶劑并在己烷中研磨所得殘余物。將殘余物在高真空下進(jìn)一步干燥30min，然后將其溶于緩沖液A∶緩沖液B的50∶50混合物(2mL，緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸)中，并冷凍干燥過夜以生成淡藍(lán)色固體狀的TFA·H2N-(L-Glu(OtBu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe，化合物111(186mg)。m/z[M+3H]3+(887，20％)，[M+4H]4+(666，100％)，[M+5H]5+(533，30％)。步驟6：化合物112的合成向4-[2，2-雙[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙?；鵠苯甲酸(71mg)于無水DMF(1.5mL)中的攪拌溶液中加入HATU(28mg)。將混合物冷卻至0℃并在惰性氣氛下攪拌30min。加入111(186mg)于無水DMF(2.5mL)中的溶液，然后加入HATU(22.9mg)和NMM(14.7μL)，并使混合物升溫至室溫。3h之后，加入額外量的4-[2，2-雙[α-甲氧基-ω-磺?；?乙二醇)]乙?；鵠苯甲酸(18mg)、HATU(50.8mg)和NMM(15μL)。再過1.5h之后，加入額外量的4-[2，2-雙[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙?；鵠苯甲酸(9mg)、HATU(51mg)和NMM(15μL)。將反應(yīng)混合物再攪拌8h，并通過反相C18柱色譜法純化兩次，用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成淺黃色油狀的112(假定的定量)。m/z[M+4H]4+(902，60％)，[M-tBu+4H]4+(888，60％)，[M-2tBu+4H]4+(874，45％)，[M-tBu+5H]5+(711，100％)。步驟7：化合物113的合成在惰性氣氛下將甲酸(2mL)加到112中。攪拌反應(yīng)混合物60min，然后真空濃縮。將所述材料通過反相C18柱色譜法純化，用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成無色油狀的113(28.1mg)。m/z[M+3H]3+(1165，5％)，[M+4H]4+(874，65％)，[M+5H]5+(699，100％)。步驟7：試劑107的合成向113(15mg)于無水DMF(270μL)中的攪拌溶液中加入HATU(4mg)。將混合物冷卻至0℃并在惰性氣氛下攪拌20min。加入val-Cit-PAB-MMAE(12mg)于無水DMF(300μL)中的溶液，然后加入HATU(2.5mg)和NMM(2μL)，并使混合物升溫至室溫。4h20min之后，加入額外量的HATU(3.3mg)和NMM(0.9μL)。將反應(yīng)混合物再攪拌2h，然后在-20℃下貯存18h。升溫至室溫之后，向攪拌的溶液中加入HATU(3.3mg)和NMM(0.9μL)。4.5h之后，加入額外量的HATU(1.6mg)和NMM(0.5μL)并將反應(yīng)混合物再攪拌2.5h，然后在-20℃下貯存18h。將材料通過反相C18柱色譜法純化，用緩沖液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和緩沖液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脫。真空除去有機(jī)溶劑并通過冷凍干燥法除去水性溶劑以生成白色固體狀的107(13.8mg)。m/z[M+4H]4+(1426，5％)，[M+5H]5+(1141，70％)，[M+6H]6+(951，100％)，[M+7H]7+(815，20％)。如實(shí)施例21所述，使Brentuximab與綴合試劑107的綴合反應(yīng)進(jìn)行17h。分析性HIC的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化為DAR4產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為61％。當(dāng)前第1頁1 2 3