本發(fā)明涉及具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子；其作為藥物的用途；其作為抗凝劑和血小板抑制劑的選擇性配置和用途，或者其主要作為抗凝劑或血小板抑制劑的選擇性配置和用途；以及其產(chǎn)生方法。本發(fā)明在醫(yī)療和獸醫(yī)行業(yè)均有應用。

發(fā)明背景

循環(huán)的血液從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z樣基質(zhì)的這一凝結(jié)的生理過程是復雜的，并且涉及依次進行的多個生化反應。

凝血的生理過程涉及血小板的血管損傷特異性的活化、粘附和聚集，以產(chǎn)生最初的栓狀物或密封物，隨后纖維蛋白沉積并成熟以產(chǎn)生穩(wěn)定的凝塊。前面的血小板活性能夠被血小板抑制劑抑制，而后面的纖維蛋白沉積能夠被抗凝劑抑制。

差不多在血管損傷破壞血管的內(nèi)皮襯和/或更深層之后立即開始凝血過程。血液暴露于內(nèi)皮下的空間啟動了兩個過程：血小板改變和內(nèi)皮下組織因子暴露于血漿凝結(jié)因子VII，在其它凝結(jié)因子中，凝結(jié)因子VII顯著促進凝血酶生成和纖維蛋白形成。

當內(nèi)皮被破壞時，下面的膠原蛋白暴露于循環(huán)的血小板，其經(jīng)由膠原蛋白特異性的糖蛋白表面受體與膠原蛋白直接結(jié)合。間接地，血管性假血友病因子將血小板束縛至與膠原蛋白緊密接觸，并且還將血小板與膠原蛋白橋接。血小板定位至細胞外基質(zhì)促進膠原蛋白與血小板糖蛋白VI的相互作用，引發(fā)信號級聯(lián)，導致血小板整合蛋白的活化并引起血小板隨后粘附至損傷部位。這在損傷部位產(chǎn)生了直接的血小板形成的栓狀物，稱為初級止血。

次級止血同時發(fā)生，并且涉及所謂的‘凝結(jié)級聯(lián)’。除了因子VII，還有其它的凝結(jié)因子或凝血因子在復雜的級聯(lián)中響應，導致纖維蛋白原的酶切，從而形成增強血小板栓狀物的纖維蛋白鏈。凝結(jié)級聯(lián)由一系列步驟組成，其中蛋白酶切割并隨后活化酶原，酶原然后按次序充當下一種蛋白酶。這些反應的結(jié)果是纖維蛋白原(一種可溶蛋白)在活化的血小板表面轉(zhuǎn)變成不溶的纖維蛋白線狀物。纖維蛋白線狀物與聚集的血小板一起形成穩(wěn)定的血塊。關(guān)鍵性的血管性假血友病因子和纖維蛋白原由血小板以及其它血漿提供。

凝結(jié)級聯(lián)被典型地(并且有點人為地)分成三條通路，首先為組織因子，然后為接觸活化通路，其均活化因子X和凝血酶的第三“最終共同的通路”，導致纖維蛋白形成。組織因子通路的主要作用是生成“凝血酶爆發(fā)”，其為這樣一個過程：通過該過程，凝血酶(就其反饋活化作用而言是凝結(jié)級聯(lián)最重要的成分)被非?？焖俚匦纬伞Ｓ腥さ氖?，凝血酶是血小板活化和凝結(jié)之間的紐帶，因為其盡管由凝結(jié)級聯(lián)產(chǎn)生，但是其是最強有力的血小板活化劑，因而能夠靶向該分子的治療劑可能是極其有效的抗血栓劑。

凝結(jié)級聯(lián)是旨在預防血管損傷之后大量的失血或出血的正常的生理過程。最終，血塊被稱為纖維蛋白溶解的過程再組織和再吸收。負責該過程的主要的酶(纖維蛋白溶解酶)由多種活化劑和抑制劑調(diào)控。此外，凝結(jié)系統(tǒng)與免疫和補體系統(tǒng)重疊，以便物理捕獲血塊中的入侵微生物，增加血管通透性并為吞噬細胞提供趨化劑。此外，凝結(jié)系統(tǒng)的一些產(chǎn)物直接就是抗微生物的。

然而，有時候，血塊(還稱為血栓)將在其不需要時形成。例如，一些高風險病況如急性內(nèi)科疾病、長期臥床、外科手術(shù)或癌癥能夠增加出現(xiàn)血塊的風險。此外，與凝結(jié)過程相關(guān)的生理問題可能使個體傾向于發(fā)生出血、血栓形成以及偶爾兩者均發(fā)生，這可能具有與動脈粥樣硬化的心血管疾病和/或心律失常相關(guān)的重大后果。

抗血小板劑和抗凝劑用于治療凝血病癥。抗血小板劑包括阿司匹林、雙嘧達莫、噻氯匹啶、氯吡格雷、替格瑞洛和普拉格雷；腸胃外糖蛋白IIb/IIIa抑制劑在冠狀動脈介入術(shù)(血管成形術(shù)和支架術(shù))中使用。在抗凝劑中，華法林(和相關(guān)的香豆素類)以及肝素是最常使用的，但是直接口服的抗凝劑還包括凝血酶抑制劑達比加群和活化因子X的抑制劑，諸如利伐沙班、阿哌沙班和依度沙班。

抗凝血酶(AT)是絲氨酸蛋白酶抑制劑并且是凝結(jié)蛋白酶的主要血漿抑制劑之一。AT通過例如抑制凝血酶(因子IIa)和活化因子X(因子Xa)阻斷/調(diào)控凝結(jié)級聯(lián)。AT與這些因子的相互作用因肝素(未分級肝素；UFH)和低分子量肝素(LMWH；分級肝素)的存在而增加，所述肝素(未分級肝素；UFH)和低分子量肝素(LMWH；分級肝素)通過經(jīng)由特異性戊多糖序列與AT的結(jié)合而抑制凝結(jié)過程。這種結(jié)合導致AT構(gòu)象變化，這加速了其對因子IIa、Xa和參與凝血的其它蛋白酶的抑制。一旦解離，肝素和LMWH自由結(jié)合其它AT分子，然后抑制更多的凝血酶和因子Xa。

除了AT之外，還有其它天然存在的抗凝劑，其中蛋白C和S，組織因子通路抑制劑和肝素輔因子II起重要的作用。這些分子的活性也被肝素增強。

重要的是，標準肝素制劑用于血栓形成的全身治療。它們在凝結(jié)活性盛行的缺乏血小板的血栓如靜脈血栓中最有效。臨床上使用的標準肝素盡管通過阻斷血栓形成的進一步生長而在血栓形成的全身治療中有效，但是單獨并不足以有效預防與內(nèi)源的粥樣斑塊破裂或外源的血管成形術(shù)或血管或微血管外科手術(shù)相關(guān)的血小板驅(qū)動的動脈血栓性并發(fā)癥。

伴有或不伴有支架術(shù)的動脈介入術(shù)如血管成形術(shù)[PT(C)A＝經(jīng)皮腔內(nèi)(冠狀動脈)血管成形術(shù)]以及血管或微血管外科手術(shù)，以及(定向的)斑塊切除術(shù)和外周或肺動脈內(nèi)膜血栓切除術(shù)，代表了針對心血管疾病的發(fā)展的治療方式。因此，伴隨內(nèi)源的血管或微血管損傷和/或外源的介入術(shù)如動靜脈瘺或動靜脈移植物的插入和維持而發(fā)生的血小板驅(qū)動的動脈血栓形成是經(jīng)常遇到的問題，并且在這些情況下，血栓形成的傳統(tǒng)的全身抗凝結(jié)治療通常功效有限。

目前與動脈介入術(shù)相關(guān)的全身抗血栓治療包括抗凝劑如UFH(平均15kDa)或LMWH(平均7.5kDa)與抗血小板藥如乙酰水楊酸(環(huán)氧酶抑制劑)、氯吡格雷或其它ADP拮抗劑的組合。其它進展還表現(xiàn)為強有力的血小板糖蛋白IIb/IIIa、血管性假血友病因子和纖維蛋白原受體拮抗劑如阿昔單抗、替羅非班和依替巴肽。這些相對新的靜脈內(nèi)施用的組合治療已成功預防30-35％的介入性治療的血栓易發(fā)血管的急性血栓封閉。最初的需要輸入血制品的住院患者的流血風險(大出血)為約6-7％，并且隨著強有力的血小板ADP受體阻斷劑的使用，在第一個月期間，門診患者背景下，大出血增加至12-15％。如果在第一個月的隨訪期間自發(fā)流血，死亡的相關(guān)風險為15-30倍。

可惜的是，用未分級肝素的全身治療有劣勢，如不可預期的生物利用度、短半衰期、與蛋白的非特異性結(jié)合，導致受損的抗凝血酶/AT功能和免疫原性效應，其與血小板因子4(PF4)一起，導致血小板減少和血栓形成。這些有害效應已通過使用低分子量分級肝素而緩和，可惜的是，低分子量分級肝素由于對纖維蛋白結(jié)合的凝血酶和血小板結(jié)合的因子Xa的有限的作用以及由于血小板分泌的PF4對肝素活性的部分中和而對動脈血栓形成也功效有限。因此，對開發(fā)有效、可靠且安全的預防和/或治療與血管或微血管損傷和介入術(shù)相關(guān)的血栓形成的治療劑存在重大需求。

我們之前已發(fā)現(xiàn)(WO9926983)，包含大鏈(75±25KDa)天然肝素蛋白聚糖(HEP-PG，可獲自哺乳動物肥大細胞)的合成分子，當連接至蛋白核心時，表現(xiàn)出強有力的抗血栓特性，這基于其對經(jīng)由血小板粘附至膠原蛋白所引發(fā)的血小板活化的強烈抑制而抑制血小板-膠原蛋白相互作用的能力。該分子因此被有效用作抗血小板治療，最適合于局部應用，并且理想地與全身抗血小板藥結(jié)合使用。有利的是，當局部施用時，該分子至少維持全身血小板功能，這確保了正常的止血反應。

其他研究人員(US 5,529,986)已制備了合成的抗血栓分子，其包含連接至直鏈聚酰胺如聚賴氨酸的未分級肝素鏈(約20-100條鏈)。該分子與上文WO9926983中所述的分子相比具有不同的作用機制，因為其結(jié)合抗凝血酶并增強其活性。因此，該分子作為抗凝劑是有效的。

我們正在進行的研究已引導我們開發(fā)出基于肝素使用的另一類合成的抗血栓分子。然而，我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)，我們的新分子類別有利地具有抗血小板活性和抗凝活性。據(jù)我們所知，這是首次鑒定出這樣的雙重分子。而且，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，我們的新穎的分子類別主要或者在較大程度上以抗血小板或抗凝方式起作用的傾向可以根據(jù)連接至各分子或包含在各分子中的肝素的量來操縱/設計。最后，我們還發(fā)現(xiàn)，我們的新穎的分子類別有利地具有局部作用，所以能夠以靶向方式使用而不必擔心全身效應。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子，其包含血漿蛋白，所述血漿蛋白經(jīng)由多個接頭分子連接了多條肝素鏈，各條肝素鏈具有10-21KDa的MW，并且其中與所述血漿蛋白連接的所述肝素鏈的數(shù)目選自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

利用指定濃度的肝素標準品(其提供可以讀取/確定測試樣品所針對的校正曲線)，根據(jù)比色硫酸糖胺聚糖測定，Blyscan測定試劑盒(例如Biocolor Ltd.,UK)來確定本文提及的連接至所述血漿蛋白的肝素鏈的數(shù)量。因此，在發(fā)明的主要概述中提及的肝素鏈與表I的第1列相關(guān)。所用的具體測定在本文中描述。

抗血小板(AP)和抗凝(AC)活性是獨特且極其有利的，因為其使得分子能夠處理這樣的情況：其中諸如在彎曲的血管或狹窄的血管(在狹窄部位需要AP)中以及遠端和近端(當存在紊流并且血栓生長由凝血酶介導時需要AC作用)需要抗血小板活性和/或需要抗凝活性。

除了有利的雙重功能性之外，我們還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分子對細胞外基質(zhì)包括膠原蛋白和血管性假血友病因子具有強烈的結(jié)合能力，并且因此，它們具有靶向的局部抗血栓作用。這是相當可取的特性，因為其意味著分子能夠在特定部位使用以治療特定病況，而不必擔心它們可能具有有害的全身抗血栓效應，這可能潛在地造成流血或出血。不管施用方式如何，即局部的還是全身的，存在這種有利的靶向。

本文提及靶向的抗血栓作用是指在應用部位保留本發(fā)明的分子持續(xù)顯著的時段，例如24小時以上，并且此外，理想地，48小時以上、或50小時以上并且甚至高達120小時。值得注意的是，在血管外和血管內(nèi)施用時均發(fā)生這種在應用部位的保留。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述血漿蛋白是白蛋白、球蛋白或纖維蛋白原，理想地，其是血清白蛋白或α2-巨球蛋白，并且更理想地是人血清白蛋白(HSA)或人α2-巨球蛋白。如通常所了解的，血清白蛋白由肝臟產(chǎn)生，在血漿中溶解并且是哺乳動物中最豐富的血液蛋白。血清白蛋白是約66,000道爾頓分子量的球形水溶性蛋白。還如所了解的，α2-巨球蛋白(α2M和A2M)是大的血漿蛋白，事實上，其是血漿中最大的主要的非免疫球蛋白性的蛋白，并且主要由肝臟產(chǎn)生。α2-巨球蛋白充當抗-蛋白酶，并且能夠使很多種蛋白酶失活。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述血漿蛋白是重組的。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述肝素是未分級肝素。更理想地，所述肝素是哺乳動物來源的，理想地，是人的、或豬的。在血漿蛋白是人的，而肝素是豬或牛的肝素的情況下，所述APAC分子代表嵌合分子。

優(yōu)選地，肝素具有選自以下的MW：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21KDa，理想地15或16或17KDa。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述肝素是重組的。

在本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方案中，至少當所述肝素與所述血漿蛋白的連接是完全的時候，所述接頭分子是結(jié)合一分子肝素的單個接頭分子，因此，一個接頭分子與所述血漿蛋白的連接導致一分子肝素與所述血漿蛋白的連接。因此，所述接頭與所述肝素的化學計量為1:1。優(yōu)選地，所述接頭是胺接頭，并且所以與所述肝素和血漿蛋白上的氨基連接，理想地但不排除地，所述接頭與肝素鏈上的絲氨酸(理想地，所述絲氨酸位于所述鏈的末端或末端附近)，以及理想地但不排除地，血漿蛋白上的賴氨酸綴合。更理想地，所述接頭通過使用二硫鍵將所述肝素與血漿蛋白綴合。更優(yōu)選地，所述接頭是異型雙功能交聯(lián)接頭如SPDP接頭或同型雙功能交聯(lián)接頭如DTSP接頭。

SPDP(可從例如Sigma-Aldrich或Thermo Scientific Pierce商購獲得)是用于經(jīng)由N-羥基丁二酰亞胺(NHS)–酯和吡啶基二硫基反應基的胺與巰基綴合的短鏈交聯(lián)接頭，并且其與半胱氨酸的巰基形成可切割的(可還原的)二硫鍵。其可獲得短鏈和長鏈版本。長鏈版本可以磺化形式獲得并且是水溶性的。我們優(yōu)選使用3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯。盡管所有SPDP均含有胺-反應性N-羥基丁二酰亞胺(NHS)酯，其將與賴氨酸殘基反應以形成穩(wěn)定的酰胺鍵，在接頭的另一端，存在吡啶基二硫基，其將與巰基反應以形成可逆二硫鍵。

DTSP(3,3’-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺(NHS)-酯)，可從例如Sigma-Aldrich或Thermo Scientific Pierce商購獲得)是用于經(jīng)由N-羥基丁二酰亞胺(NHS)酯基的胺與胺綴合的短鏈交聯(lián)接頭。其可獲得短鏈和長鏈版本。長鏈版本可以磺化形式(N-羥基琥珀酰亞胺(硫代-NHS)酯)獲得并且是水溶性的。DTSP含有兩個胺-反應性N-羥基丁二酰亞胺(NHS)酯基和在間隔臂中的二硫鍵。N-羥基丁二酰亞胺酯與含有伯胺的殘基反應以形成穩(wěn)定的酰胺鍵，其在接頭分子中有可切割的二硫鍵。

因此，我們優(yōu)選的合成分子的通式可按下文書寫：

(Hep-接頭)n-PlPr

其中n＝4-16；

PlPr為血漿蛋白如人血清白蛋白或人α2-巨球蛋白；并且

肝素鏈為10-21KDa。

更具體地，當我們使用我們優(yōu)選的接頭3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯(SPDP)或(3,3’-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)(DTSP)時，我們優(yōu)選的合成分子可以按如下書寫：

(Hep-NH-CO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CO-NH)n-PlPr

其中n＝4-16；

PlPr為血漿蛋白如人血清白蛋白或人α2-巨球蛋白；并且

肝素鏈為10-21KDa。

盡管可能將高達36條肝素鏈連接至各血漿蛋白如白蛋白，尤其是HSA，我們發(fā)現(xiàn)，4-16條肝素鏈與各血漿蛋白的連接提供了滿意的抗血小板活性和抗凝活性的雙功能性。此外，如本文的數(shù)據(jù)所顯示的，我們還發(fā)現(xiàn)，6條以下的肝素鏈，理想地4-6條肝素鏈與各血漿蛋白的連接主要或在較大程度上提供了滿意的抗凝活性，而8條以上的肝素鏈，理想地8-16條肝素鏈與各血漿蛋白的連接主要或在較大程度上提供了滿意的抗血小板活性。

因此，在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，當所述APAC分子將主要或在較大程度上用作抗凝劑時，所述分子具有6條或更少的，例如4-6條與所述血漿蛋白連接的肝素鏈。

因此，在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，當所述APAC分子將主要或在較大程度上用作抗血小板劑/血小板抑制劑時，所述分子具有8條或更多的，例如8-16條與所述血漿蛋白連接的肝素鏈。

因此，在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，當所述APAC分子將主要或在較大程度上用作抗血小板劑/血小板抑制劑時，所述分子具有8條與所述血漿蛋白連接的肝素鏈。

因此，在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，當所述APAC分子將主要或在較大程度上用作抗血小板劑/血小板抑制劑時，所述分子具有11條與所述血漿蛋白連接的肝素鏈。

因此，優(yōu)選連接一定數(shù)量的肝素鏈至各血漿蛋白核心能夠影響合成分子的主要功能。該顯著的特性具有技術(shù)應用，因為盡管使用我們的分子時，待實現(xiàn)的結(jié)果是抗血栓的，但是存在需要強調(diào)抗血小板活性的情況和需要另外強調(diào)抗凝活性的其它情況。例如，當正在治療其中剪切率相對低的，即較大的血管腔和較低的血液流速的，諸如靜脈的血管時，抗凝結(jié)占優(yōu)勢或強調(diào)抗凝結(jié)的抗血栓劑是高度可取的。而當正在治療例如其中剪切率相對較高的，即較高的血液流速或具有較小血管腔的血管的，諸如動脈的血管或動靜脈瘺時，抗血小板活性占優(yōu)勢或強調(diào)抗血小板活性的抗血栓劑是高度可取的。類似地，當使用植入物如導管、支架或用于進行氣囊血管成形術(shù)的裝置時，它們可以用本發(fā)明的APAC分子包被，并且所使用的APAC分子的類型理想地將根據(jù)待插入植入物的血管的性質(zhì)確定。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用作藥物的具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子，其包含血漿蛋白，所述血漿蛋白經(jīng)由多個接頭分子連接了多條肝素鏈，各條肝素鏈具有10-21KDa的MW，并且其中與所述血漿蛋白連接的所述肝素鏈的數(shù)目選自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用作抗血栓劑的具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子，其包含血漿蛋白，所述血漿蛋白經(jīng)由多個接頭分子連接了多條肝素鏈，各條肝素鏈具有10-21KDa的MW，并且其中與所述血漿蛋白連接的所述肝素鏈的數(shù)目選自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，所述抗血栓劑局部起作用。據(jù)此，我們意指，抗血栓劑結(jié)合細胞外基質(zhì)，并且因此其被保留在應用部位或預期起作用的部位，具有延長的局部活性。的確，這種局部作用活性是有利的，因為其意味著，本發(fā)明的分子被有效靶向最需要它們的部位，即可能出現(xiàn)血栓形成的部位，換句話說，存在膠原蛋白和血管性假血友病因子的細胞外基質(zhì)/整體部分。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子在制備用于治療血栓形成或疑似血栓形成的藥物中的用途，所述抗血栓分子包含血漿蛋白，所述血漿蛋白經(jīng)由多個接頭分子連接了多條肝素鏈，各條肝素鏈具有10-21KDa的MW，并且其中與所述血漿蛋白連接的所述肝素鏈的數(shù)目選自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

本文提及疑似血栓形成是指可能導致血栓形成的任何情況、環(huán)境或狀況，例如(不限于)外科介入例如外科血栓切除術(shù)的實施，在本實例中，可以將本發(fā)明的分子施用于手術(shù)部位，或注入已被手術(shù)的血管中，或注入鄰近的下游血管，其血液供應將流經(jīng)/流至所述手術(shù)部位。

在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，所述藥物是抗血栓劑，理想地為局部起作用的抗血栓劑。通過局部起作用，我們意指抗血栓劑結(jié)合細胞外基質(zhì)，并且因此其被保留在應用部位，具有延長的局部活性。的確，這種局部作用活性是有利的，因為其意味著，本發(fā)明的分子被有效靶向最需要它們的部位，即可能出現(xiàn)血栓形成的部位，換句話說，存在膠原蛋白和血管性假血友病因子的細胞外基質(zhì)/整體部分。

在本發(fā)明的上述方面當中，當所述APAC分子將主要或在較大程度上用作抗凝劑時，所述分子優(yōu)選具有6條或更少的，諸如4-6條經(jīng)由所述接頭與所述血漿蛋白連接的肝素鏈。

類似地，在本發(fā)明的上述方面當中，當所述APAC分子將主要或在較大程度上用作抗血小板劑/血小板抑制劑時，所述分子優(yōu)選具有8條或更多的，諸如8-16條經(jīng)由所述接頭與所述血漿蛋白連接的肝素鏈。

在本發(fā)明的另外的優(yōu)選實施方案中，所述APAC分子能夠用于治療或預防血栓性并發(fā)癥，諸如與以下相關(guān)的并發(fā)癥：內(nèi)源的粥樣斑塊破裂；或預防再閉塞的血栓溶解療法之后；或外源的血管成形術(shù)；或血管或微血管外科手術(shù)；動脈介入術(shù)如血管成形術(shù)，尤其是伴有或不伴有支架術(shù)的經(jīng)皮腔內(nèi)(冠狀動脈)血管成形術(shù)；(定向的)斑塊切除術(shù)；外周或肺動脈內(nèi)膜血栓切除術(shù)；血小板驅(qū)動的動脈血栓形成；血管或微血管損傷；血栓性血小板減少性紫癜或外源的介入術(shù)，如動靜脈瘺或動靜脈移植物的插入和維持以及抗凝血酶(AT)缺陷。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子用于治療缺血再灌注損傷或急性腎損傷或心肌梗死或卒中或外周動脈閉塞性疾病或腸系膜缺血的用途，所述抗血栓分子包含血漿蛋白，所述血漿蛋白經(jīng)由多個接頭分子連接了多條肝素鏈，各條肝素鏈具有10-21KDa的MW，并且其中與所述血漿蛋白連接的所述肝素鏈的數(shù)目選自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

可選地，根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子在制備用于治療缺血再灌注損傷或急性腎損傷或心肌梗死或卒中或外周動脈閉塞性疾病或腸系膜缺血的藥物中的用途，所述抗血栓分子包含血漿蛋白，所述血漿蛋白經(jīng)由多個接頭分子連接了多條肝素鏈，各條肝素鏈具有10-21KDa的MW，并且其中與所述血漿蛋白連接的所述肝素鏈的數(shù)目選自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供了制備具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子的方法，其包括：

i)修飾未分級肝素(Hep)鏈以產(chǎn)生具有巰基(-SH)基團的反應產(chǎn)物；

ii)修飾諸如血清白蛋白的血漿蛋白以產(chǎn)生具有吡啶基二硫基(-PDP)基團的反應產(chǎn)物；以及

iii)利用異型雙功能交聯(lián)接頭連接i)的反應產(chǎn)物與ii)的反應產(chǎn)物。

在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述接頭是3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯SPDP接頭(可從例如Sigma-Aldrich或Thermo Scientific Pierce商購獲得(任選地，GMP質(zhì)量))。

根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了制備具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子的方法，其包括：

i)修飾未分級肝素(Hep)鏈以產(chǎn)生具有N-羥基丁二酰亞胺酯(-NHS)基團的反應產(chǎn)物；

ii)利用同型雙功能交聯(lián)接頭連接i)的反應產(chǎn)物與含有伯胺的諸如血清白蛋白的血漿蛋白。

在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述接頭是3,3’-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯DTSP接頭(可從例如Sigma-Aldrich或Thermo Scientific Pierce商購獲得(任選地，GMP質(zhì)量))。

根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了治療選自以下的疾病或病況的方法：血栓性并發(fā)癥，諸如與以下相關(guān)的并發(fā)癥：內(nèi)源的粥樣斑塊破裂；預防再閉塞的血栓溶解療法；血小板驅(qū)動的動脈血栓形成；血管或微血管損傷；血栓性血小板減少性紫癜；缺血再灌注損傷；急性腎損傷；心肌梗死；卒中；外周動脈閉塞性疾病、腸系膜缺血和抗凝血酶(AT)缺陷；

其中向待治療的個體施用有效量的具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子，其包含血漿蛋白，所述血漿蛋白經(jīng)由多個接頭分子連接了多條肝素鏈，各條肝素鏈具有10-21KDa的MW，并且其中與所述血漿蛋白連接的所述肝素鏈的數(shù)目選自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，在預防再閉塞的血栓溶解療法之后，施用所述抗血栓分子。

更優(yōu)選地，肝素鏈的所述數(shù)目選自8、9、10、11和12。

根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供了選自以下的治療方法：

外源的血管成形術(shù)；血管或微血管外科手術(shù)；動脈介入術(shù)；血管成形術(shù)，尤其是伴有或不伴有支架術(shù)的經(jīng)皮腔內(nèi)(冠狀動脈)血管成形術(shù)；(定向的)斑塊切除術(shù)；外周或肺動脈內(nèi)膜血栓切除術(shù)；以及外源的介入術(shù)，如動靜脈瘺或動靜脈移植物的插入和維持；

其中在所述治療之前、期間或之后，向待治療的個體施用有效量的具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子，其包含血漿蛋白，所述血漿蛋白經(jīng)由多個接頭分子連接了多條肝素鏈，各條肝素鏈具有10-21KDa的MW，并且其中與所述血漿蛋白連接的所述肝素鏈的數(shù)目選自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，在實施任何一項或多項上述治療之前，施用所述抗血栓分子。

更優(yōu)選地，肝素鏈的所述數(shù)目選自8、9、10、11和12。

更優(yōu)選地，具有抗血小板和抗凝(APAC)活性的抗血栓分子通過層析法諸如利用丁基瓊脂糖介質(zhì)(GE Healthcare,USA)的疏水作用層析(HIC)和/或超濾/滲濾純化。然而，APAC分子可以通過其它方式，諸如陰離子交換層析或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法來純化。

在隨后的權(quán)利要求書以及本發(fā)明的前述描述中，除了由于表達語言或必要的含義上下文有另外的要求，詞語“包含(comprises)”或變型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包括性意義使用，即指定存在所陳述的特征，但不排除存在或增加本發(fā)明的多個實施方案中的其它特征。

本說明書中引用的所有參考文獻包括任何專利或?qū)＠暾埦诖送ㄟ^引用并入。并沒有承認任何參考文獻構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。此外，沒有承認任何現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成了本領(lǐng)域公知常識的一部分。

本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征可以同結(jié)合任何其它方面所描述的一樣。

從以下實施例中，本發(fā)明的其它特征將變得更加明顯。一般而言，本發(fā)明擴展至本說明書(包括隨附的權(quán)利要求書和附圖)所公開的特征的任何新的一個或任何新的組合。因此，結(jié)合本發(fā)明具體方面、實施方案或?qū)嵗枋龅奶卣?、整?shù)、特性、化合物或化學部分應被理解為適用于本文描述的任何其它方面、實施方案或?qū)嵗?，除非與其不相容。

此外，除非另有說明，本文公開的任何特征可以被用于相同或相似目的的備選特征替換。

現(xiàn)將具體參照以下附圖僅通過示例的方式來描述本發(fā)明，其中：

圖1.顯示了在混合血漿中，在存在1.0和1.75μg/mL肝素(Hep)[C]的兩種濃度的第一代APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)、第二代APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)和第三代APAC-CL6至CL16(批次：3.1；3.2；3.3；3.4；3.5和3.6，分別為8條；8條；10條；13條；16條和6條Hep鏈)的情況下，對凝血酶時間(TT)的影響的篩查。TT基線為28s。

圖2.顯示了在混合血漿中，在存在0.75；1.0和1.75μg/mL Hep[C]的三至五種濃度的第四代APAC1(批次4.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次4.2,8條Hep鏈)的情況下的凝血酶時間(TT)。TT基線為31s。

圖3.顯示了在混合血漿中，在存在1；2；3；6和8μg/mL Hep[C]的五種濃度的第一代APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)、第二代APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)和第三代APAC-CL8至-16(批次3.1；3.2；3.3；3.4和3.5，分別為8條、8條、10條、13條和16條Hep鏈)的情況下的活化部分凝血激酶時間(APTT)。APTT基線為30s。

圖4.顯示了五種不同的肝素濃度的APAC中的肝素綴合水平對APTT延長(1倍至10倍)的比較。顯示了混合血漿中，利用1；2；3；6；8μg/mL Hep[C]的APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)、APAC-CL8(批次3.1和3.2,8條Hep鏈)、APAC-CL10(批次3.3,10條Hep鏈)、APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)、APAC-CL13(批次3.4,13條hep鏈)、APAC-CL16(批次3.5,16條Hep鏈)對APTT的結(jié)果。APTT基線為30s。

圖5.顯示了在混合血漿中，在存在1；2；3；6和8μg/mL Hep[C]的五種濃度的第四代APAC1(批次4.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次4.2,8條Hep鏈)的情況下的APTT。APTT基線為30s。

圖6.顯示了在補充有5pM組織因子(TF)和4μM磷脂(PPL)的混合血漿(PP)中，與UFH和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)相比，在存在A)0.25μg/mL和B)0.5μg/mL第一代APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)、第二代APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)的情況下，通過自動校正凝血酶曲線法的延遲的凝血酶生成。

圖7.顯示了在補充有5pM TF和4μM PPL的混合血漿(PP)中，與UFH和PBS相比，在存在A)1.0μg/mL和B)1.5μg/mL第一代APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)、第二代APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)的情況下，通過自動校正凝血酶曲線法的延遲的凝血酶生成。

圖8.顯示了在補充有5M TF和4μM PPL的混合血漿(PP)中，在存在A)0.25μg/mL和B)0.5μg/mL第三代APAC-CL6至-CL16(8條、8條、10條、13條、16條和6條Hep鏈)和PBS的情況下，通過自動校正凝血酶曲線法的凝血酶生成。APAC-CL8(批次3.1和3.2,8條Hep鏈)、APAC-CL10(批次3.3,10條Hep鏈)、APAC-CL13(批次3.4,13條hep鏈)、APAC-CL16(批次3.5,16條Hep鏈)和APAC-CL6(批次3.6,6條Hep鏈)。

圖9.顯示了在補充有5M TF和4μM PPL的混合血漿(PP)中，在存在A)1.0μg/mL和B)1.5μg/mL APAC-CL6至-CL16(8條、8條、10條、13條、16條和6條Hep鏈)和PBS的情況下，通過自動校正凝血酶曲線法的凝血酶生成。APAC-CL8(批次3.1和3.2,8條Hep鏈)、APAC-CL10(批次3.3,10條Hep鏈)、APAC-CL13(批次3.4,13條hep鏈)、APAC-CL16(批次3.5,16條Hep鏈)和APAC-CL6(批次3.6,6條Hep鏈)。

圖10.顯示了在補充有1pM TF，供應PPL的血小板的富血小板血漿(PRP)中，在存在0.25；0.5；1.0；和1.5μg/mL UFH的情況下，通過自動校正凝血酶曲線法的凝血酶生成。

圖11.顯示了在補充有1pM TF，供應PPL的血小板的PRP(供體是高響應者)中，在存在A)0.25μg/mL和B)0.5μg/mL APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)和UFH的情況下，通過自動校正凝血酶曲線法的凝血酶生成。

圖12.顯示了在補充有1pM TF，供應PPL的血小板的PRP(供體是中等響應者)中，在存在A)0.25μg/mL、B)0.5μg/mL和C)1.0μg/mL APAC1(批次4.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次4.2,8條Hep鏈)的情況下，通過自動校正凝血酶曲線法的凝血酶生成。

圖13.顯示了在存在第三代APAC，即APAC-CL6至-CL-16(8條、8條、10條、13條、16條和6條Hep鏈)的情況下，PRP中的膠原蛋白誘導的聚集。給出了在A)1、B)10和C)30μg/mL的Hep[C]時，對APAC的低響應者的實例。通道1：APAC-CL8(批次3.1,8條Hep鏈)，通道2：APAC-CL8(批次3.2,8條Hep鏈)，通道3：APAC-CL10(批次3.3,10條Hep鏈)，通道4：APAC-CL13(批次3.4,13條Hep鏈)，通道5：APAC-CL16(批次3.5,16條Hep鏈)，通道6：APAC-CL6(批次3.6,6條Hep鏈)和通道7：APAC-CL10和-16(10條Hep鏈和16條Hep鏈)的混合物。膠原蛋白的[C]為0.5μg/mL。

圖14.顯示了在對APAC的代表性高(空的圓形)和中等(空的方形)響應者的PRP中，在存在3；10；30；60和90μg/mL的APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)的情況下，膠原蛋白誘導的最大血小板聚集的抑制。還顯示了在存在UFH(黑色三角形)的情況下，供體中的平均血小板聚集抑制。相對于介質(zhì)(PBS)，最大血小板聚集的抑制顯示為百分比(％)。

圖15.顯示了在改良的Folt的狒狒急性血栓形成模型中，在新鮮的損傷部位局部應用UFH和APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)(均為4mg/mL；總共2mg)之后循環(huán)流量減少(CFR)的圖。在返回基線血流之后，動脈立即狹窄(30％)至100mL/min的流速。在用UFH(黑色三角形)處理損傷部位之后觀察到重復的閉塞(25min內(nèi)5個CFR)。在再次實施狹窄(在20-50min時)和增加狹窄(在180min時)之前，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗處理的損傷部位。

相比之下，用APAC處理(空的圓形)，新鮮的損傷部位對于整個實驗的持續(xù)時間均保持開放：首先以100mL/min的動脈血流持續(xù)120min(空的圓形)，其次以50mL/min的動脈血流伴隨收緊的狹窄(60％)持續(xù)14min(黑色交叉)，最后30mL/min的血流在嚴酷的狹窄(90％)下相繼持續(xù)10和15min的時段(黑色星形)。

圖16.顯示了APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)和UFH(均為4mg/mL)在狒狒模型(n＝4)的流動血液的膠原蛋白誘導的血栓形成中的比較。對于以下觀察到降低的血小板沉積：A)在應用部位的膠原蛋白表面，其中與UFH相比，在存在APAC1的情況下血小板沉積降低34±13％(平均值和SD,n＝4)(p＝0.01)，和B)向膠原蛋白節(jié)段遠端擴散10-cm的血栓，其中與UFH相比，在存在APAC1的情況下血小板沉積降低63±11％(平均值和SD,n＝4)(p＝0.19)。與未處理的對照相比，利用APAC1，纖維蛋白形成也降低45％±14％(平均值和SD,n＝4)(p＝0.01)，符合血小板和凝結(jié)抑制的雙重作用。

圖17.顯示了APAC和UFH在大鼠血漿中的直接抗凝作用。以16、32或80μg使用來研究缺血再灌注損傷或急性腎損傷，當利用APTT測定測量時APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)是有效的抗凝劑。作為比較物，未分級肝素(UFH,帶點的黑線)以相同的濃度范圍16、32或80μg使用。能夠看出，兩種治療劑在16μg時表現(xiàn)比較一致，但是在32μg時，UFH延長APTT略大于APAC2，而在80μg時，UFH延長APTT顯著大于APAC2(實黑線)。

靜脈內(nèi)施用劑量為16μg(0.06mg/kg)、32μg(0.13mg/kg)和80μg(0.32mg/kg)的APAC2或UFH之后10min的作為平均值±SD的APTT。n＝5-8只/組，***P<0.001。在16μg的劑量時，利用APAC，APTT為18.0±6.6(n＝7)，而利用UFH，APTT為27±6.2(n＝4)。在32μg的劑量時，利用APAC，APTT為17.4±4.0(n＝10)，而利用UFH，APTT為25.2±2.0(n＝5)。在80μg的劑量時，利用APAC，APTT為42.2±18(n＝8)，而利用UFH，APTT為72-180>(n＝5)。紅色虛線為APTT的基線參照。在Blyscan硫酸化糖胺聚糖測定中利用UFH作為標準品來確定肝素劑量。

圖18.顯示了30-min雙側(cè)腎缺血-再灌注-損傷之后的腎功能和腎小管間質(zhì)損傷。與僅有鹽水介質(zhì)(靜脈內(nèi))的對照相比，當利用建立的標志物測定時，16或32μg APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)對腎功能的作用。在30min可逆缺血再灌注損傷之后的三天時間內(nèi)測定腎功能標志物肌酐、尿素和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)，并且32μg的APAC2濃度在各時間間隔顯著降低各標志物的水平，暗示32μg APAC2的保護作用。

為了分析腎缺血之后的腎功能和腎小管間質(zhì)損傷，在再灌注之后每天收集大鼠血清，持續(xù)3天。在APAC 16μg(0.06mg/kg)和32μg(0.13mg/kg)靜脈內(nèi)預處理的大鼠中，(A)肌酐、(B)尿素氮和(C)NGAL(腎小管間質(zhì)損傷的生物標志物)的血清水平。對照大鼠接受靜脈內(nèi)鹽水介質(zhì)。n＝8只/組，**P<0.01。在Blyscan硫酸化糖胺聚糖測定中利用UFH作為標準品來確定肝素劑量。

圖19.顯示了30-min雙側(cè)腎缺血-再灌注–損傷之后的先天免疫活化和組織病理學。與鹽水介質(zhì)(靜脈內(nèi))對照相比，30min可逆損傷之后缺血再灌注損傷的明顯影響通過使用16或32μg的APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)而改善。研究腎的A)先天免疫配體透明質(zhì)酸(HA)，B)通過腎小管間質(zhì)損傷標志物Kim-1的腎小管傷害以及C)利用蘇木精和曙紅(H&E)染色的腎小管損傷(壓扁、擴張、管型和壞死)。

為了評估再灌注之后3天時的先天免疫活化和腎損傷，對于APAC 16μg(0.06mg/kg)和32μg(0.13mg/kg)靜脈內(nèi)預處理的大鼠的組織病理學，將腎石蠟包埋的橫切片針對(A)先天免疫配體透明質(zhì)酸，(B)腎小管間質(zhì)損傷標志物Kim-1和(C)H&E染色。(A)透明質(zhì)酸陽性區(qū)域用計算機輔助的成像來測量。(C)C＝上皮管型；D＝腎小管擴張；箭頭＝上皮壓扁；箭號＝上皮壞死。對照大鼠接受靜脈內(nèi)鹽水介質(zhì)。IgG對照在插圖中。n＝8只/組，*P<0.05。在Blyscan硫酸化糖胺聚糖測定中利用UFH作為標準品來確定肝素劑量。

圖20.顯示了在重度1小時雙側(cè)腎缺血-再灌注-損傷之后的腎功能和總存活。在夾持兩個腎動脈1小時中，腎遭受重度IRI。為了分析缺血后腎存活和功能，在再灌注之后每天收集大鼠血清，持續(xù)3天。用APAC(批次2.1,11條肝素鏈)32μg處理能夠使組織存活(A)三天監(jiān)視期內(nèi)的大鼠存活％，此外，APAC 32μg(0.13mg/kg)靜脈內(nèi)預處理的大鼠中的(B)肌酐和(C)尿素氮的血清水平也顯示陽性結(jié)果；大鼠血清肌酐和尿素降低，提示腎功能的保留。對照大鼠接受靜脈內(nèi)鹽水介質(zhì)。n＝8只/組，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。在GAG測定中利用UFH作為標準品來確定肝素劑量。

圖21.顯示了在抗凝血酶耗盡的血漿中，在存在1.0和2μg/mL Hep[C]的第五代APAC1(批次5.1,4條Hep鏈)以及2μg/mL Hep[C]的APAC2(批次5.2,8條Hep鏈)的情況下的凝血酶時間(TT)。在GAG測定中利用UFH作為標準品來確定肝素劑量。

圖22.顯示了在抗凝血酶耗盡的血漿中，在存在4和5μg/mL Hep[C]的第五代APAC1(批次5.1,4條Hep鏈)以及4μg/mL Hep[C]的APAC2(批次5.2,8條Hep鏈)和UFH的情況下的活化部分凝血激酶時間(APTT)。在GAG測定中利用UFH作為標準品來確定肝素劑量。

方法

綴合

經(jīng)由通過兩種備選的交聯(lián)接頭和利用以下的反應途徑產(chǎn)生的二硫鍵將未分級肝素(Hep)鏈與人血清白蛋白(HSA)綴合：

i)異型雙功能交聯(lián)接頭3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯(SPDP)。為了綴合，利用Hep接頭區(qū)的Ser和HSA的Lys上的游離胺。Hep和HSA在單獨的反應中被分別修飾成巰基(-SH)–和吡啶基二硫基(-PDP)-衍生物。在最后的綴合反應中，HSA的吡啶基二硫基基團與Hep的巰基基團反應，導致二硫鍵復合物的形成和吡啶2-硫酮的釋放。

ii)同型雙功能交聯(lián)接頭3,3’-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺(NHS)-酯)(DTSP)。為了綴合，利用Hep接頭區(qū)的Ser和HSA的Lys上的游離胺。Hep首先被修飾成N-羥基丁二酰亞胺(NHS)-酯-衍生物，伴隨第一NHS-基團的釋放。在最后的綴合反應中，HSA的Lys與衍生的Hep的N-羥基丁二酰亞胺(NHS)-酯基團反應，導致復合物(在接頭區(qū)具有可切割的二硫鍵)的形成和第二N-羥基-丁二酰亞胺基團的釋放。

Hep-HSA復合物通過利用丁基瓊脂糖介質(zhì)(GE Healthcare,USA)的疏水作用層析(HIC)或超濾/滲濾純化。在結(jié)束時，將Hep-HSA復合物洗脫入pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。將復合物命名為APAC-標明Hep鏈與HSA的綴合水平的下標后綴。

示例本發(fā)明的APAC復合物的通式為

(Hep-NH-CO-CH₂-CH₂-S-S-CH₂-CH₂-CO-NH)_n-HSA

其中與HSA結(jié)合的未分級肝素鏈的平均數(shù)目被定義為n。

利用Hep和HSA的濃度及其平均分子量，通過以下公式確定Hep與HSA的平均綴合水平(CL)：

Hep的mol數(shù)＝Hep[C]/平均Hep MW

HSA的mol數(shù)＝HSA[C]/HSA MW

CL＝Hep的mol數(shù)/HSA的mol數(shù)

Hep MW＝15800

HSA MW＝66472

Hep聚合物的平均MW基于從肝素生產(chǎn)商獲得的信息。HSA MW基于來自UniProtKB/Swiss-Prot的ALBU_HUMAN,P02768，無信號肽和前肽的同種型1。

APAC復合物，參見表I。

APAC1具有4-6mol Hep/1mol HSA的平均CL。

APAC2具有8-16mol Hep/1mol HSA的平均CL。

在2010年，以相對大(1g)的規(guī)模制備了第一代APAC，即APAC1，其具有6mol Hep/1mol HSA的平均CL(CL 6:1；批次1.1)。APAC1顯示出體外抗凝功效和抗血小板功效。在兩個不同的急性血栓形成的狒狒模型中，其相對于未分級肝素(UFH)的對照，即未與HSA結(jié)合的肝素，維持血管通暢并降低血栓形成和纖維蛋白累積。另外，與對照即UFH相比，放射性(Cu-64)標記的APAC1在新鮮的大鼠吻合術(shù)上在局部施用部位具有延長的定位(在IPS Therapeutics,Canada的研究)。

在2011年，制備了稱為APAC2的第二代APAC(批次2.1)，其與APAC1相比，具有幾乎二倍的Hep與HSA的平均CL(11:1)。當與APAC1相比時，APAC2在相同的肝素濃度時，在抑制富血小板血漿(PRP)中膠原蛋白誘導的血小板聚集中更加有效。在大鼠吻合術(shù)模型中，Cu-64標記的APAC2被施用在血管內(nèi)，并且可檢測到持續(xù)UFH對照時間的二倍(IPST,Canada)。

在2012年，制備第三代APAC(這次以多個批次3.1至3.6)。小規(guī)模(～50mg的批量)地制備了6種不同的APAC復合物(CL 6:1至16:1)，以便研究綴合反應(CR)自身的可再現(xiàn)性。這些APAC復合物根據(jù)制備順序命名(CR1至6)，因此這些名字并不反映產(chǎn)物的具體CL。由于制備方案針對小規(guī)模而調(diào)整，相應的變化可能輕微地改變了產(chǎn)物的最終特性。有趣且一致的是，具有較高CL的化合物在抑制PRP中膠原蛋白誘導的血小板聚集中比具有較低CL的化合物更加有效。另一方面，較低CL的抗凝功效似乎更加明顯。

在2013年，制備了第四代APAC，即APAC1(CL 4:1；批次4.1)和APAC2(CL 8:1；批次4.2)。

在2014年，制備了第五代APAC，即APAC1(CL 4:1；批次5.1)和APAC2(CL 8:1；批次5.2)。2014批次的分析在持續(xù)。

定量

由于綴合分子，即具有HSA蛋白和高度硫酸化的肝素部分的綴合分子的性質(zhì)，已要求確定APAC產(chǎn)物的CL。用二辛可寧酸(BCA)蛋白測定，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Pierce Biotechnology,USA)確定HSA濃度。在2013年，還進行在280nm處的直接的UV測量來驗證BCA測定，因為BCA測定似乎會高估蛋白。用Blyscan硫酸糖胺聚糖測定，即Blyscan測定，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Biocolor Ltd.,UK)確定Hep(Heparin Leo,Leo Pharma,Denmark)。

在2010和2012年，針對糖胺聚糖(GAG)標準品(牛氣管軟骨素4-硫酸)測定Hep。利用該GAG標準品，Hep濃度通常被高估。因此，在2013年，包括肝素起始材料作為Blyscan測定的新的標準品。為了充分和比較的原因，GAG和肝素用于后續(xù)分析。CL的確定受肝素測定中所用的具體標準品(表I)的影響，并且還受HSA分析的影響。然而，在比較不同APAC和對照UFH的所有的研究中，用相同的測定確定Hep濃度，GAG或更新的Hep標準品(硫酸糖胺聚糖測定，Blyscan測定試劑盒,Biocolor Ltd.,UK)。

簡而言之，將待定量的試樣添加到微量離心管中，并用水將體積調(diào)整至100μl。對于各測定，還以指定的濃度范圍運行Blyscan測定試劑盒硫酸GAG標準品或已知的肝素標準品，除了試劑空白(0μg；水或PBS)。為了開始測定，添加1.0ml Blyscan染料試劑(1,9-二甲基-亞甲藍于無機緩沖液中)，并混合至少30min。含有硫酸肝素的管變成紫色/粉紅色。通過離心(>10,000×g，持續(xù)10分鐘)將得到的GAG-染料復合物與未結(jié)合的染料分離。棄去上清液，添加1.0ml Blyscan解離試劑并渦旋。然后通過在656nm處的分光光度讀數(shù)來測定得到的溶液。標準品與試劑空白一起用于產(chǎn)生校正曲線，其被用于確定肝素濃度。吸光度值為0.05至1.5單位，否則樣品被分別復原或稀釋。

分子量

APAC的分子量(MW)尚未被敲定，并且溶液的摩爾濃度只能是近似的。利用常規(guī)的尺寸排阻層析(SEC)以及聯(lián)合高壓SEC和三重探測器陣列(TDA；利用折射計、粘度計以及左右角光散射探測器)技術(shù)的研究粗略地表明APAC1(批次1.1)和APAC2(批次2.1)之間MW的兩倍增加。

體外APAC功能的評估

材料和方法

血液收集

使用來自健康供體的血液，該健康供體在樣品收集至少6-7天之前沒有服用過任何藥物。在通宵禁食之后經(jīng)由靜脈穿刺將樣品從肘前靜脈收集至標準的真空血液收集管(0.109M枸櫞酸鈉，Vacuette 455322,Greiner Bio-one)中。在血液收集之后的4小時內(nèi)，樣品被認為是有效的。

富血小板血漿和貧血小板血漿

將血液在22攝氏度以180×g離心12min以分離富血小板血漿(PRP)。對于貧血小板血漿(PPP)收集，將剩余的血液在22攝氏度以1500×g再次離心10min。用細胞計數(shù)儀Sysmex KX-21(Sysmex Corporation,Japan)測量PRP中的血小板(PLT)數(shù)并用PPP調(diào)整至150×10⁶10％PLT/mL(用于自動校正凝血酶曲線法(CAT)分析)和300×10⁶±10％PLT/mL(用于激動劑誘導的PRP聚集)。對于內(nèi)部的混合血漿，收集來自11名供體的血液并于2000×g下離心10min。將PPP于10000×g再離心10min以去除任何殘留的血小板。將血漿合并，以等分式樣儲存并冷凍直至使用。對于CAT，將血漿離心兩次。

血漿

測試相等肝素濃度的APAC復合物和UFH對照的抗凝功效(Blyscan GAG研究)。使用三種不同的血漿：實驗室對照血漿，即標準的人血漿(SHP,Siemens,Germany)、溶劑/洗滌劑(S/D)–處理的血漿(Octaplas,Octapharma,Switzerland)和內(nèi)部混合血漿(PP,11名健康供體)。在該概述中，得到的內(nèi)部混合血漿作為實例顯示。

抗凝血酶(AT)–耗盡的血漿(American Diagnostica,USA)用于研究APAC以及APTT測定中的UFH的AT依賴性的抗凝功效。

凝結(jié)

肝素結(jié)合抗凝血酶和凝血酶(IIa)的復合物并增強抗凝血酶失活凝血酶和凝結(jié)因子Xa以及凝結(jié)內(nèi)在和外在途徑上游的數(shù)種其它凝結(jié)因子的能力。相比之下，低分子量肝素(LMWH)僅結(jié)合幾乎專門抑制因子Xa的抗凝血酶。凝血酶靶向要求更長的鏈長；需要肝素中至少18個戊多糖單位序列。通過缺乏血小板和其它血細胞的PPP中纖維蛋白凝塊形成的時間常規(guī)地測試含有肝素的血漿樣品的抗凝功效。肝素是高度硫酸化的并具有強負電荷。因此，與循環(huán)的血漿蛋白或血管內(nèi)皮的非特異性結(jié)合可誘導在此處未探究的其它相互作用。

凝血酶時間

在凝血酶時間(TT)(凝血酶BC試劑，Siemens,Germany)測定中，稀釋的(40μL血漿和100μL凝血酶BC)枸櫞酸鈉血漿補充有標準化的高劑量凝血酶(0.8IU/ml)，并在凝度計(KC-4,Sigma-Amelung,USA)中測量纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白凝塊的時間。

活化部分凝血激酶時間

在活化部分凝血激酶時間(APTT,試劑Dade Actin FSL,Siemens,USA)測定中，凝塊形成由代表接觸活化的內(nèi)在途徑(I、II、V、VIII、IX、X、XI、XII)的凝結(jié)因子和血漿的再鈣化誘導。在實驗中，將50μL血漿用50μL Actin FSL(大豆和兔腦磷脂，在100μM鞣花酸中)稀釋并用50μL 25mM CaCl₂再鈣化。在存在足量肝素的情況下，TT和APTT開始劑量依賴地延長。臨床上主要用APTT監(jiān)測靜脈內(nèi)施用的肝素的抗凝程度。為了達到治療水平的抗凝，靶向?qū)φ諛悠返?.5倍至3倍的延長。APTT測定依賴于所用的試劑和凝度計，但是基線范圍通常為20-40s。

自動校正凝血酶曲線法

凝血酶生成在實驗上用于估計與流血或血栓形成的風險相關(guān)的狀況(Hemker et al.Pathophysiol Haemost Thromb 2002；32:249-53)。盡管凝血酶在整個凝結(jié)過程中形成，但是對于在體外纖維蛋白至凝塊僅需要總凝血酶的2至5％。因此，傳統(tǒng)的凝結(jié)時間(即TT和APTT)忽視凝結(jié)過程中的大部分凝血酶活性，其能夠被Hemker的方法自動校正凝血酶曲線法(CAT)捕獲。CAT評估組織因子引發(fā)的凝血酶生成，其通過檢測熒光凝血酶底物的分裂并平行比較樣品與具有已知凝血酶活性的對照來監(jiān)測。在凝血酶生成的過程中，抗凝因子和促凝因子影響凝血酶曲線的可測量的特性。滯后時間反映纖維蛋白凝塊形成的時間，其反映PT(由組織因子(TF)引發(fā))/APTT(由鞣花酸引發(fā))。曲線的峰值顯示最大的凈凝血酶生成速率和達到它的時間(tt峰值)。曲線下面積，即內(nèi)源性凝血酶潛能(ETP)，測量了所形成的總的凝血酶。在CAT中，凝血酶生成能夠在枸櫞酸鈉PPP或PRP中評估。通過用TF(5pM)和磷脂(PPL)(4μM)(PPP試劑，Stago,France)或者用TF(1pM,PRP試劑，Stago,France)(分別對于PPP和PRP)引發(fā)和補充樣品使凝血酶在再鈣化血漿中活化。CAT能夠檢測凝血因子的不足或過度活性，以及抗凝劑(像肝素或直接的凝血酶抑制劑)的使用，或如果發(fā)生流血病癥的替代療法。

PRP中的血小板聚集

采用Born的濁度方法(J Physiol 1962；162:67-68)，利用Aggram聚集計(Helena Laboratories Inc.,USA)，在37℃以1000r.p.m的攪拌子速度研究血小板聚集。以0.5μg/mL終濃度的膠原蛋白(I型原纖維,Kollagenreagens-Horm,Nycomed Pharma,Austria或Chronolog膠原蛋白,Chronolog Ltd.,USA)用作主要的激動劑。在誘導血小板聚集之前，將測試物質(zhì)與PRP在22℃孵育2min并在37℃孵育1min。當可應用時，測量5min時的最大聚集(光傳導的變化％)、斜率和曲線下面積。

在所有測定中，用與測試物質(zhì)等體積的介質(zhì)(PBS,pH7.4)測量基線。我們還研究了其它激動劑：腺苷二磷酸(ADP)，瑞斯西丁素和膠原蛋白相關(guān)的肽(CRP)。APAC并不抑制ADP誘導的血小板聚集，而在高濃度時，瑞斯西丁素誘導的聚集被抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。APAC針對膠原蛋白的抗血小板活性是血小板聚集測試中最突出的特點。

狒狒急性血栓形成模型

APAC1(批次1.1.)和UFH與介質(zhì)相比的抗血栓功效在兩個完善建立的麻醉狒狒的急性血栓形成模型中進行研究。在改良的Folts模型中，在股動脈和靜脈之間產(chǎn)生體外AV-分路。通過放置在動脈上的外部縮窄器控制血流，并用探測器監(jiān)測流動。通過用Martin持針器(Hegar-Baumgartner TC Gold 14cm)橫向夾持10s兩次，從外部使動脈損傷。損傷近端的所有側(cè)支被結(jié)扎。用針(26G)在血管通路近端1cm處刺破分路，用于注射APAC1或UFH或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的推注(4mg/mL)。在暴露于血流之前，用研究物質(zhì)處理損傷3min。在恢復基線血流之后立即將外部縮窄器放置于損傷處，流動降低至30-100mL/min(90至30％的狹窄)。通過降低的血流來檢測狹窄的動脈處血小板的累積，并記錄為循環(huán)流量減少(CFR)。在5mL/min時，動脈被認為是閉塞的，并且通過釋放縮窄器并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗來驅(qū)逐血栓。在恢復基線血流之后，再應用狹窄并重復實驗。

在第二個狒狒模型中，通過將膠原蛋白包被的PTFE移植物(2cm,4mm腔)放置于外露的動靜脈分路來誘導血栓形成。形成血栓的膠原蛋白表面用APAC或UFH(均為4mg/mL)處理10min。啟動血流(100mL/min；265-1)，定量111-銦標記的血小板和纖維蛋白(125-碘-纖維蛋白原的累積)的沉積60min。

損傷部位的保留

通過對大鼠中部分結(jié)扎的(2根寬松的縫合線，分開1cm)股動脈吻合術(shù)PET成像50h來評估局部施用的64-Cu-標記的APAC或UFH(3mg/Kg)的功效、分布和原位保留。

缺血再灌注損傷和急性腎損傷模型

動物.使用重235-250g的特定的、無病原體的遠交系雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(Harlan Laborato-ries；Horst,Nederland)。大鼠接受規(guī)律的鼠糧和任意的自來水，并且以12-h光/夜循環(huán)飼養(yǎng)。動物接受符合國家衛(wèi)生研究院和動物護理和使用辦公室出版的實驗室動物資源的護理和使用指南(National Research Council,Washington DC,National Academy Press,1996)的人文關(guān)懷。

血細胞計數(shù)和凝結(jié)譜.SD大鼠被靜脈內(nèi)施用(n＝8只/組)用PBS(10mM磷酸鈉、137mM氯化鈉、2.7mM氯化鉀，pH 7.4)稀釋至合適濃度的APAC2(批次2.1；16μg、32μg或80μg或UFH 32μg(輸注溶液5000IU/mL；200IU/mg；Leo Pharma,Denmark)。對照大鼠接受靜脈內(nèi)鹽水介質(zhì)。在10分鐘時，處死大鼠，用于血細胞計數(shù)和凝結(jié)譜分析。將第一份血液樣品吸入預充3.8％枸櫞酸鈉抗凝劑的2mL注射器中，并放置于3mL聚丙烯樣品管中。將第二份樣品立即吸入另一個用于收集大鼠血清的2mL空注射器中。分別處理樣品用于血細胞計數(shù)、PPP和血漿以及血清。用細胞計數(shù)器Sysmex KX-21在枸櫞酸鈉血液樣品中確定血細胞計數(shù)。對于PPP，將血液于1200×g離心15min(22℃)以分離白細胞和紅血細胞。小心不要擾動血沉棕黃層，同時將PPP吸量至新管中。將PPP于16100×g再次離心5min，之后將PPP收集至新管中。如果不立即使用將PPP于-40℃儲存。

腎動脈夾持模型.取決于研究模型，SD大鼠在熱缺血發(fā)作之前或之后10min靜脈內(nèi)接受(n＝8只/組)用PBS稀釋至合適濃度的APAC2(批次2.1)16μg、32μg或80μg或UFH 32μg(輸注溶液5000IU/mL,200mg/IU)。對照大鼠接受靜脈內(nèi)鹽水介質(zhì)。用吸入性異氟烷麻醉大鼠并實施中線剖腹術(shù)。取決于研究模型，將兩個腎動脈夾持30或60min。在去除夾具之后，檢查腎臟的血流恢復，并縫合腹部。將大鼠施用1mL PBS和0.1mL丁丙諾啡(Temgesic 0.3mg/ml,Schering-Plough,Kenilworth,NJ)，分別用于手術(shù)后維持液體平衡和止疼。

腎功能和急性腎損傷的評估.為了評估腎功能和腎損傷，在腎損傷之后第1天、第2天和第3天在麻醉下收集大鼠尾靜脈血液樣品。血清于-20℃冷凍直至在芬蘭赫爾辛基的赫爾辛基大學醫(yī)院的HUSLAB臨床化學部門進一步分析肌酐和尿素氮活性。作為急性腎損傷的生物標志物，我們使用大鼠中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)。在雙側(cè)腎動脈夾持之后3天，利用小鼠單克隆抗-NGAL(來自BioPorto Diagnostics A/S,Gentofte,Denmark的ABS 039-08)，通過ELISA估算NGAL血清水平。

免疫組織化學.對于免疫組織化學，在載玻片上連續(xù)切下4mm厚石蠟包埋的或冷凍的橫切片，并利用過氧化物酶ABC方法(Vectastain Elite ABC Kit,Vector Laboratories)染色。通過3-氨基-9-乙基咔唑(AEC,Vector Laboratories)顯示反應。對于免疫染色，將樣本通過以下來封閉：與pH 7.40的1.5％正常的山羊血清/PBS孵育20min，隨后與最佳稀釋度的一抗在室溫下孵育30min(單克隆抗體)或于+4℃孵育15小時(多克隆抗體)。一抗用0.1％牛血清白蛋白/PBS溶液稀釋。在PBS中洗滌之后，用與0.1％過氧化氫酶(30％)/PBS溶液孵育10-min來封閉內(nèi)源過氧化物酶活性。伴隨著間插的在PBS中洗滌，將樣本進一步與于PBS緩沖液中的生物素化抗體在RT下孵育30min；用于PBS緩沖液中的親和素-生物素化辣根復合物在RT下檢測30min，并通過AEC(Vector Laboratories)顯示反應。載玻片用Mayer的蘇木精明礬復染。為了確定陽性細胞的密度，用40倍的放大率計數(shù)橫切片每個象限的四個隨機的視野，評分提供成1mm²的總數(shù)。所用的抗體和稀釋物為來自BD Pharmingen,San Diego,CA的CD8+T細胞(5mg/mL,22071D)和來自R&D systems,Abingdon,UK的KIM-1(8mg/mL,AF3689)。

利用特異性的生物素化bHABC透明質(zhì)酸結(jié)合復合物對來自石蠟切片的透明質(zhì)酸(HA)進行染色，如所描述的，利用0.05％3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)通過親和素-生物素-過氧化物酶檢測(Vector Laboratories；1:200稀釋)，該復合物含有由牛關(guān)節(jié)軟骨制備的聚集蛋白聚糖的生物素化G1結(jié)構(gòu)域和連接蛋白。染色的特異性通過以下來控制：在染色之前在存在蛋白酶抑制劑的情況下用鏈霉菌透明質(zhì)酸酶消化一些切片，或用透明質(zhì)酸寡糖預孵育bHABP探針。從每個樣品采集10張40倍放大率的照片，并且用計算機輔助的成像(Zeiss Axionvision 4.4,Carl Zeiss International)來測量透明質(zhì)酸為陽性的區(qū)域。將這10次測量的平均區(qū)域用于統(tǒng)計學分析中。由兩個獨立的觀察員以盲法進行所有分析。

腎組織學.如下進行組織傷害的半定量評估：2mm厚石蠟包埋的腎樣品用蘇木精和曙紅染色。腎小管損傷的以下參數(shù)的嚴重程度(壓扁、擴張、管型和壞死)在如下的0至3的范圍上分級：0級＝無傷害，1級＝輕微傷害，2級＝中度傷害，3級＝重度傷害，并且表示為總的腎小管損傷評分(0-12)。

統(tǒng)計學.所有數(shù)據(jù)為平均值+/-SEM，并且通過Windows,15.0版本的SPSS(SPSS Inc,Chicago,IL)分析。對于雙組比較，應用非參數(shù)的曼-惠特尼U檢驗和參數(shù)的學生t-檢驗。對于多組比較，應用利用鄧恩事后檢驗的非參數(shù)的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗以及利用Dunnett校正的參數(shù)的ANOVA。對于存活，應用利用對數(shù)秩的Kaplan–Meier分析(Mantel-Cox)。P<0.05被認為是統(tǒng)計學顯著的。

結(jié)果

凝血酶時間

在存在來自2010年至2012年的APAC復合物(CL 6:1至16:1)的情況下，混合血漿中TT量值的實例顯示在圖1中，并且對于APAC1(批次4.1)和APAC2(批次4.2)，混合血漿中TT量值的實例顯示在圖2中。

圖1

在1μg/mL時，所有APAC使TT延長到基線(30s)的至少1.5倍，而UFH使TT延長到基線的1.3倍。APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)達到了所測量的最大TT(300s)，而APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)使TT延長到基線的2.5倍(圖1)。APAC-CL6(6條Hep鏈)使TT延長到基線值的5.5倍，APAC-CL8,批次3.2(8條Hep鏈)延長到基線值的5.8倍和批次3.1(8條Hep鏈)延長到基線值的4.3倍，APAC-CL10(10條Hep鏈)延長到基線值的2.4倍，APAC-CL13(13條Hep鏈)延長到基線值的2.5倍并且APAC-CL16(16條Hep鏈)延長到基線值的3.7倍(圖1)。在1.5μg/mL時，所有APAC和UFH均達到了最大測量時間。

圖2

APAC1(批次4.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次4.2,8條Hep鏈)分別使TT延長到2.1倍至2.4倍(圖2)。在1.25μg/mL時，APAC1(批次4.1,4條Hep鏈)達到了所測量的最大時間(300s)，而APAC2(批次4.2,8條Hep鏈)使TT延長到3.2倍(圖2)。

活化部分凝血激酶時間

圖3

在存在APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)、APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)和來自批次3.1至3.5的具有CL 6:1至16:1的APAC(8條、8條、10條、13條、16條Hep鏈)的情況下，混合血漿中APTT量值的實例顯示在圖3中。

與APTT基線(30s)相比，在1μg/mL時，APAC1(批次1.1)使APTT延長到1.4倍，而其它APAC和UFH使APTT延長到1.1至1.2倍。在2μg/mL時，APAC1(批次1.1)使APTT延長到2.0倍，而其它APAC和UFH展現(xiàn)出較低的，即1.4倍至1.6倍的延長。在3μg/mL時，與基線相比，APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)使APTT延長到2.6倍，APAC-CL8(批次3.1和3.2,8條Hep鏈)延長到2.1倍，APAC-CL10(批次3.3,10條Hep鏈)延長到2.0倍，APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)延長到1.9倍，APAC-CL13(批次3.4,13條Hep鏈)、APAC-CL16(批次3.5,16條Hep鏈)和UFH均延長到1.8倍。在6μg/mL時，APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)使APTT延長到6.7倍,APAC-CL8(批次3.1和3.2,8條Hep鏈)延長到5.4倍至4.7倍，APAC-CL10(批次3.3,10條Hep鏈)延長到4.5倍，APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)延長到4倍，APAC-CL13(批次3.4,13條hep鏈)延長到3.8倍，APAC-CL16(批次3.5,16條Hep鏈)延長到3.6倍并且UFH延長到3.1倍。在8μg/mL時，APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)使APTT延長到9.8倍，APAC-CL8(批次3.1和3.2,8條Hep鏈)延長到9.3倍至8.7倍，APAC-CL10(批次3.3,10條Hep鏈)延長到7.4倍，APAC-CL13(批次3.4,13條hep鏈)延長到6.0倍，APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)延長到5.4倍，APAC-CL16(批次3.5.16條Hep鏈)延長到5.8倍，并且UFH延長到至少4.2倍。在所用的最高濃度時，APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)和APAC-CL10(批次3.3,10條Hep鏈)之間APTT的差異為25％，并且與APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)之間為45％?？傊诖嬖谧畹虲L的第一和第二代APAC(批次1.1和2.1,4條和11條Hep鏈)的情況下，與基線相比，APTT通常被延長的最多。

第四代APAC(APAC1對比APAC2)不同于以前的批次在于APTT延長相當類似，直至使用較高劑量(6μg/mL以上)的Hep。而且，抗凝結(jié)受益于較低結(jié)合CL的肝素。與基線值(29s)相比，在1μg/mL時，APAC1(批次4.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次4.2,8條Hep鏈)均使APTT延長到1.2倍。在2μg/mL時，APAC1(批次4.1)和APAC2(批次4.2)類似地分別使APTT延長到1.4倍和1.3倍。在3μg/mL時，APAC1(批次4.1)和APAC2(批次4.2)再次類似地分別使APTT延長到1.8倍和1.7倍。在6μg/mL時，APAC1(批次4.1)和APAC2(批次4.2)分別使APTT延長到3.9倍和3.4倍。在8μg/mL時，APAC1(批次4.1)和APAC2(批次4.2)分別使APTT延長到7.5倍和6.0倍。在所用的最高濃度時，APAC1(批次4.1)和APAC-2(批次4.2)之間APTT的差異為21％。

圖4

具有不同肝素結(jié)合度，即CL的APAC的APTT評估的抗凝作用顯示于圖4中。

圖5

在存在第四代APAC1(批次4.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次4.2,8條Hep鏈)的情況下的APTT顯示在圖5中。

PPP中的自動校正凝血酶曲線法(CAT)

圖6-9

CAT，其由組織因子(外在途徑活化劑，5pM)引發(fā)，顯示了利用低于延長APTT所需的濃度的APAC的抗凝作用。在0.25-1.5μg/mL的低肝素濃度時，APAC在所測試的所有三種不同的血漿(PP、SHP和Octaplas)中劑量依賴地降低峰值和ETP并延長tt峰值。描繪混合血漿中第一代APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)、第二代APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)、UFH和第三代APAC-CL6至CL16的影響的凝血酶曲線作為實例顯示在圖7-12中，APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)的滯后時間(s)、ETP(nM)、峰值(nM)和tt峰值(s)在表II中總結(jié)，并且對于APAC-CL6至APAC-CL16在表III中。顯示了與介質(zhì)對照相比，數(shù)值的相對變化(％)。如果凝血酶生成被完全抑制，滯后時間(s)、ETP(nM)、峰值(nM)、tt峰值(s)表示為0。

與UFH相比，滯后時間和tt峰值明顯被所測試的所有濃度的所有APAC延長。與UFH相比，ETP被所有濃度的APAC降低，除了1.0μg/mL的APAC-CL6(批次3.6,6條Hep鏈)，其中ETP與UFH類似。與UFH相比，峰值被所有濃度的APAC降低，除了1.0μg/mL的APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)，其中峰值與UFH類似。利用1.5μg/mL的APAC，凝血酶生成被完全廢除，除了APAC-CL6(批次3.6,6條Hep鏈)，其展現(xiàn)出15％的基線峰值?？傊?，APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)具有相對類似的凝血酶生成的抑制作用。在第三代中，相比CL<10的APAC，具有CL 13:1和16:1的APAC是更強效的抑制劑。

PRP中的自動校正凝血酶曲線法

圖10-12

這些圖探討血小板依賴的凝血酶生成，即促凝活性(以估計流血或血栓形成的風險)，并顯示APAC抑制凝血酶生成。在存在血小板的情況下，使用低(1pM)的TF引發(fā)劑，并且由此添加了PPL的血漿CAT中凝血酶生成也低。在0.25-1.5μg/mL的低Hep濃度時，在所測試的單獨的健康供體的PRP中，APAC劑量依賴地降低峰值和ETP并延長tt峰值。

圖10中描繪UFH濃度的影響的凝血酶曲線，圖11中描繪第一代APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)、第二代APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)的影響的凝血酶曲線，以及圖12中描繪第四代APAC1(批次4.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次4.2,8條Hep鏈)的影響的凝血酶曲線顯示為反映研究結(jié)果利用所選濃度的實例。在0.5μg/mL時，APAC作為凝血酶生成的強效抑制劑是UFH的至少兩倍。具有CL 8:1和11:1的APAC是更強的血小板促凝活性抑制劑，并且降低峰值和tt峰值超過具有CL 6:1的APAC。在1.0μg/mL時，所有APAC相對于UFH的功效差異更加明顯。

綜上，與UFH相比，利用APAC，UFH凝血酶生成被延遲并且血小板活性被明顯抑制。所綴合的肝素鏈的數(shù)目越高，抑制越強。

膠原蛋白誘導的血小板聚集

圖13-14.在對APAC具有高(50％的供體)，中等(30％的供體)和低敏感性的供體中的代表性聚集曲線(圖13)以及APAC1在高和中等響應者中的混合劑量-響應分析(圖14)。

圖13.在來自3名獨立供體的枸櫞酸鹽抗凝PRP中測試APAC，即APAC-CL6至-CL16(在Hep[C]1；3；10；30和90μg/mL)，各供體具有不同的敏感性(定義為在30μg/mL的肝素濃度時的抑制％(總的ED50))：在膠原蛋白(coll；0.5μg/mL)誘導的血小板聚集中對APAC的高>60％、低<40％和中等40-60％響應者。檢測到在6min時最大聚集％和曲線斜率(聚集速度)的結(jié)果。

APAC-CL6至APAC-CL16(8條、8條、10條、13條、16條和6條Hep鏈)和APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)降低血小板聚集率和最大血小板聚集，而UFH則沒有。具有較高結(jié)合度CL 11至16:1的APAC與具有較低的CL 6至10:1的分子相比是更強效抑制劑。對于APAC-CL6至APAC-CL16，利用低響應者在1、10和30μg/mL時的結(jié)果呈現(xiàn)在圖13中。利用所有APAC變體，聚集曲線(與聚集速度相關(guān))劑量依賴地下降，盡管最大聚集被影響較小。APAC-CL16(批次3.5,16條Hep鏈)在該低響應者(供體2)中是最佳的抑制劑，并將最大聚集％從92％降低至38％。

圖14.APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)在10μg/mL時在高響應者PRP中抑制了最大血小板聚集的90％，而在中等響應者PRP中抑制聚集的75％需要90μg/mL。呈現(xiàn)了利用高和中等響應者在3；10；30；60和90μg/mL APAC1時的結(jié)果。

狒狒急性血栓形成模型

圖15-16

在狒狒急性血栓形成模型中，將APAC和UFH以4mg/mL局部施用到損傷處(圖15)。在存在UFH的情況下，動脈以100mL/min(30％狹窄)的流速反復(5CFR/27min)閉塞。相比之下，120min的隨訪時間后，APAC1(批次1.1,4條Hep鏈)有效地抑制血栓形成直至實驗中斷。在實驗結(jié)束時，在時間點180min時，動脈先被再狹窄至50mL/min(60％狹窄)并最終至30mL/min(90％狹窄)，而對于所選擇的測試時段(分別為10和15min)，APAC持續(xù)抑制閉塞。在利用UFH和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的對照實驗中，發(fā)生反復CFR(結(jié)果未顯示)。在狒狒血栓形成模型中，在體外膠原蛋白移植物上(圖16)，與UFH相比，APAC1使膠原蛋白上的血小板沉積降低了34±13％(平均值和SD,n＝4,p＝0.01)。遠端血栓傳播也減少了63±11％(n＝4,p＝0.19)。利用UFH的結(jié)果與未處理對照值類似(n＝21)。纖維蛋白累積被APAC1降低(45±14％)，但是并未被UFH降低(1.1±0.1％,n＝4,p＝0.01)。

與強保留潛能和慢降解相容，PET在50h(-120h)內(nèi)在大鼠的吻合術(shù)部位檢測到未降解的APAC，而UFH在24h后已檢測不到(n＝2)。約10％APAC直接附著至血管應用部位。APAC和UFH通過泌尿途徑清除。

缺血再灌注損傷和急性腎損傷模型

圖17-20

顯著地，盡管缺血再灌注損傷已在急性腎損傷模型中證實，本發(fā)明的治療劑具有與任何其它再灌注損傷相關(guān)的用途，并且能夠用于預防、減輕或治療其它如心肌梗死或卒中或外周動脈閉塞性疾病或腸系膜缺血所示例的損傷。

分析了從IRI的腎功能恢復。16或32μg APAC2(批次2.1,11條Hep鏈)的劑量基于大鼠中的血液分析。APAC2的臨床相關(guān)的劑量范圍和UFH的比較臨床劑量基于之前的動物模型。在靜脈內(nèi)(i.v.)注射之后10min通過APTT顯示與APAC2和UFH的抗凝功效相關(guān)的劑量(圖17)，其中UFH使APTT延長到3倍，超過最高劑量(80μg)的APAC2。在兩個腎動脈被夾持30min之前10min，用鹽水介質(zhì)(靜脈內(nèi))或APAC2 16或32μg(靜脈內(nèi))處理SD大鼠。為了估計缺血之后的腎功能，在再灌注之后3天收集大鼠血清和血漿。與介質(zhì)處理的大鼠相比，在APAC2 32μg處理的大鼠中，血清肌酐(**P<0.01,圖18A)和尿素氮(**P<0.01,圖18B)水平降低。中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)血清水平(腎損傷的生物標志物)的ELISA分析顯示，APAC2 32μg預處理也降低了腎小管間質(zhì)損傷(**P<0.01,圖18C)。

在30-min雙側(cè)腎動脈夾持模型中，APAC2預處理降低了危險相關(guān)的先天免疫配體透明質(zhì)酸表達和炎性細胞浸潤。在再灌注之后3天取出右腎。腎小管間質(zhì)損傷標志物Kim-1的密度描繪了，與介質(zhì)處理的相比，APAC2 32μg預處理的大鼠腎中損傷的免疫反應性小管的數(shù)目顯著降低(*P<0.05,圖19B)。由于IRI誘導先天免疫配體透明質(zhì)酸(HA)的腎皮質(zhì)累積，我們分析了APAC2預處理對IRI之后HA蛋白表達的影響。當與介質(zhì)處理的腎相比時，在進行30-min熱缺血和3天再灌注的腎中，APAC2 32μg預處理顯著減小了HA免疫反應性區(qū)域(*P<0.05,圖19A)。

腎小管損傷的半定量評估，包括腎小管擴張、上皮壞死、壓扁和管型的分析，顯示在第3天時介質(zhì)處理的腎中重度的腎小管損傷(圖19)。APAC2 16和32μg預處理降低了總腎小管損傷評分，因為在分離的腎小管橫切片中僅觀察到輕微的腎小管擴張和上皮的壓扁(*P<0.05,圖19)。

在1小時雙側(cè)腎動脈夾持模型中，APAC預處理預防了急性腎損傷。

最后，我們研究了APAC(批次2.1,11條肝素鏈)預處理在重度、幾乎不可逆的IRI模型中的作用。兩個腎動脈均被夾持1小時。在誘導熱缺血之前10min，SD大鼠接受鹽水介質(zhì)(靜脈內(nèi))或32μg(靜脈內(nèi))。在介質(zhì)處理當中，大鼠存活為75％(8只中的6只)，并且在APAC2 32μg組中為100％(8只中的8只)(*P<0.05,圖20A)。

然后，我們用血清肌酐和尿素氮量值分析腎功能。當與介質(zhì)處理的腎相比時，APAC2預處理降低了血清肌酐和尿素氮水平(紅色虛線，**P<0.01和***P<0.001,圖20B&C)。

抗凝血酶耗盡的血漿中的凝血酶時間和活化部分凝血激酶時間

在存在APAC1(批次5.1,4條Hep鏈)和APAC2(批次5.2,8條Hep鏈)的情況下，AT耗盡的血漿中TT和APTT量值的實例分別顯示在圖21和22中。用肝素起始材料作為標準品來確定肝素濃度。

圖21

在1μg/mL時，APAC1(批次5.1,4條Hep鏈)使TT延長到基線的至少2倍，并且在2μg/mL時，TT達到了所測量的最大時間(250s)。在2μg/mL時，APAC2(批次5.2,8條Hep鏈)使TT延長到基線的4.6倍(圖21)。

圖22

在4μg/mL時，所有APAC1(批次5.1,4條Hep鏈)使APTT延長到基線的1.4倍，并且在5μg/mL時延長到1.7倍。在4μg/mL時，APAC2(批次5.2,8條Hep鏈)使APTT延長到基線的1.9倍(圖22)。在4μg/mL時，UFH使APTT延長到基線的1.5倍。

Hep的綴合水平(CL)及其與抗凝和抗血小板作用的關(guān)聯(lián)的結(jié)論

所有變體表現(xiàn)出雙重的抗凝和抗血小板(膠原蛋白誘導的聚集和血小板促凝活性)作用。

具有CL 6-16:1的APAC共享以下抗凝特性：

(在Blyscan GAG標準品上估算肝素濃度)

●在臨床劑量(約3μg/mL)時與UFH類似的APTT的延長

●在高臨床劑量(約6-8μg/mL)時比UFH更有效的APTT的延長

●具有Hep CL 6:1的APAC似乎是比具有CL≥8:1的APAC更強效的抗凝劑，尤其在較高濃度時

●在低于APTT延長(1.0μg/mL)所需的濃度時，CAT中的凝血酶生成在PPP和PRP中均被延遲并且降低，至少與UFH同樣有效

●具有CL≥8:1的APAC在抑制PRP的凝血酶生成中似乎比具有較低CL的種類更強效

APAC具有抗血小板特性：

●降低枸櫞酸鈉PRP中膠原蛋白誘導的血小板聚集率和最大血小板聚集，而UFH則沒有

●相比具有CL 4-6:1的分子，具有CL(8-16:1)的APAC一致地是更強效的膠原蛋白誘導的血小板聚集的抑制劑

APAC

具有CL≤6:1的APAC延長TT超過具有CL≥8的APAC

具有CL≤6:1的APAC延長APTT超過具有CL≥8的APAC

具有CL≥8:1的APAC抑制CAT中尤其是PRP中的凝血酶生成超過具有CL 4-6:1的APAC

具有CL≥8:1的APAC抑制膠原蛋白誘導的PRP聚集超過具有CL 4-6:1的APAC

總之，血小板聚集和血小板促凝活性的抑制得益于與HSA綴合的高數(shù)目的肝素鏈。

表I.APAC以及Hep與HSA的綴合水平。

兩種不同的方法用于分析確定與HSA綴合水平(CL)的Hep[C]，即mol Hep/mol HSA：

1.肝素起始材料(Hep st.)；和

2.糖胺聚糖標準品(GAG st.)。

用BCA測定測量HSA[C]。

表II.在用5pM TF和4μM磷脂(PPL)引發(fā)的混合血漿(PP)中，在存在第一代APAC1(批次1.1)、第二代APAC2(批次2.1)、UFH和PBS的情況下，CAT中的凝血酶生成。Hep濃度基于測定中的Blyscan(GAG st.)估算。

表III.在用5pM TF和4μM PPL引發(fā)的混合血漿(PP)中，在存在APAC-CL6至APAC-CL16和PBS的情況下，CAT中的凝血酶生成。Hep濃度基于Blyscan(GAG st.)估算。