本專利申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求于2014年8月19日提交的美國臨時申請?zhí)?2/039,340、于2014年8月20日提交的美國臨時申請?zhí)?2/039,608和于2015年3月23日提交的美國臨時申請?zhí)?2/137,183的優(yōu)先權(quán)利益，所述美國臨時申請的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。

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本發(fā)明在由美國空軍科學(xué)研究辦公室(Air Force Office of Scientific Research)授予的授權(quán)號FA9550-12-1-0280和FA9550-11-1-0275，以及由美國國防高級研究計劃署(Defense Advanced Research Projects Agency)授權(quán)的授予號HR0011-13-2-0018下由政府支持進(jìn)行。政府在本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。

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背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)代表快速擴(kuò)展的治療劑類別，具有在藥物遞送、藥物靶向、癌癥治療和酶替代療法中的潛在應(yīng)用。然而，例如細(xì)胞攝取不良、先天免疫應(yīng)答的激活、生物利用度低、被細(xì)胞蛋白酶降解或長期貯存后的聚集和失活的問題目前限制了蛋白質(zhì)的治療潛力。

利用由定向寡核苷酸功能化以產(chǎn)生具有明確限定的“價態(tài)”的實(shí)體的剛性構(gòu)件塊的DNA介導(dǎo)的裝配策略[Mirkin等人，Nature 382(6592):607-609(1996)；Seeman,Mol Biotechnol 37(3):246-257(2007)]，已作為用于編程形成結(jié)晶材料的有力新方法出現(xiàn)[Park等人，Nature 451(7178):553-556(2008)；Nykypanchuk等人，Nature 451(7178):549-552(2008)]。使用這樣的方法，可制備具有明確定義的晶格參數(shù)[Hill等人，Nano Lett 8(8):2341-2344(2008)；Macfarlane等人，Angew Chem Int Ed Engl 49(27):4589-4592(2010)；Macfarlane等人，Science 334(6053):204-208(2011)；Xiong等人，Phys Rev Lett 102(1):015504(2009)；Auyeung等人，Nat Nanotechnol 7(1):24-28(2012)；Auyeung等人，Nature 505(7481):73-77(2014)；Zhang等人，Nat Mater 12(8):741-746(2013)]、對稱性[Park等人，Nature 451(7178):553-556(2008)；Macfarlane等人，Science 334(6053):204-208(2011)；Auyeung等人，Nat Nanotechnol 7(1):24-28(2012)；Zhang等人，Nat Mater 12(8):741-746(2013)]、以及組成[Auyeung等人，Nat Nanotechnol 7(1):24-28(2012)；Zhang等人，Nat Mater 12(8):741-746(2013)；Zhang等人，Nat Nanotechnol 8(11):865-872(2013)]的體系結(jié)構(gòu)，但迄今為止，它們主要局限于使用硬無機(jī)納米顆?；蚋叨戎Щ募兒怂岵牧蟍Seeman,Mol Biotechnol 37(3):246-257(2007)；Winfree等人，Nature 394(6693):539-544(1998)；Zheng等人，Nature 461(7260):74-77(2009)]。相比之下，自然界最強(qiáng)大和最通用的納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建塊是蛋白質(zhì)，并且用于實(shí)現(xiàn)活系統(tǒng)中的絕大多數(shù)過程[Mann,Angew Chem Int Ed 47(29):5306-5320(2008)]。與大多數(shù)無機(jī)納米顆粒系統(tǒng)不同，蛋白質(zhì)可以純的和完美的單分散形式制備，使其成為用于超分子裝配的理想合成子。然而，改造由多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和無機(jī)納米材料組成的晶格的能力受到限制，并且蛋白質(zhì)構(gòu)建塊的選擇通常受到結(jié)構(gòu)約束的限制，這限制了可摻入這些結(jié)構(gòu)內(nèi)的催化功能性。目前，用于制備蛋白質(zhì)晶格的主要方法依賴于使用天然蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[Liljestrom等人，Nat Commun 5:4445(2014)]，無機(jī)納米顆粒(NP)表面上的蛋白質(zhì)和配體之間的相互作用[Liljestrom等人，Nat Commun 5:4445(2014)；Kostiainen等人，Nat Nanotechnol 8(1):52-56(2013)]，金屬配位化學(xué)[Brodin等人，Nat Chem 4(5):375-382(2012)]，小分子配體-蛋白質(zhì)相互作用[Dotan等人，Angew Chem Int Ed 38(16):2363-2366(1999)；Ringler等人，Science 302(5642):106-109(2003)；Sakai等人，Nat Commun 5:4634(2014)；Oohora等人，Chem Commun 48(96):11714-11726(2012)]，使蛋白質(zhì)復(fù)合物與特定對稱性遺傳融合[Padilla等人，Proc Natl Acad Sci USA 98(5):2217-2221(2001)；Sinclair等人，Nat Nanotechnol 6(9):558-562(2011)]，或DNA介導(dǎo)的病毒裝配[Strable等人，Nano Lett 4(8):1385-1389(2004)；Cigler等人，Nat Mater 9(11):918-922(2010)]。

DNA定向裝配已被證明是用于構(gòu)建形成納米級前體的結(jié)晶材料的有力方法。然而，盡管反復(fù)證明顯示這種方法的效用，但研究的系統(tǒng)在很大程度上限于金屬納米顆粒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述問題，本公開內(nèi)容提供了產(chǎn)物和方法，由此蛋白質(zhì)的表面由寡核苷酸的致密殼進(jìn)行化學(xué)功能化，產(chǎn)生蛋白質(zhì)/DNA核-殼納米顆粒(NP)。蛋白質(zhì)/DNA核-殼納米顆粒由蛋白質(zhì)核和寡核苷酸的致密殼組成。這些雜交大分子可用于從催化活性蛋白質(zhì)構(gòu)建結(jié)晶材料。另外，DNA模板化(DNA-templated)蛋白質(zhì)結(jié)晶的策略可用于裝配適合于通過X射線晶體學(xué)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的晶體。本文考慮通過寡核苷酸殼對蛋白質(zhì)賦予的致密和高度陰離子表面防止功能化蛋白質(zhì)的聚集和解折疊，并且還將提供限制由細(xì)胞蛋白酶降解的屏障。類似于用核酸的致密殼修飾的其他納米材料，由本公開內(nèi)容提供的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)將有效地進(jìn)入細(xì)胞并引發(fā)最低限度的免疫應(yīng)答。此外，蛋白質(zhì)-寡核苷酸綴合物充當(dāng)雙重功能治療劑，其中酶的天然化學(xué)功能性和寡核苷酸殼的基因調(diào)節(jié)能力各自引起不同的治療應(yīng)答。

預(yù)測性地控制多個納米級構(gòu)件塊(尤其是具有迥然不同的化學(xué)和物理性質(zhì)的那些，例如生物分子和無機(jī)納米顆粒)的共裝配的能力在催化、感測和光子學(xué)方面具有深遠(yuǎn)的牽連，但用于改造這些顆粒之間的特異性接觸的一般化策略是巨大的挑戰(zhàn)。這在蛋白質(zhì)的情況下尤其如此，其中可能的顆粒間相互作用的類型是眾多、多樣和復(fù)雜的。在本文中，提供蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對于DNA-DNA相互作用交易的概念，以指導(dǎo)具有不同表面化學(xué)的兩種核酸功能化蛋白質(zhì)裝配成由催化活性蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和DNA修飾的金納米顆粒的組合組成的六個獨(dú)特的晶格。在該策略中采用的DNA-DNA相互作用的可編程性質(zhì)允許控制所得到的晶體的晶格對稱性和晶胞常數(shù)、以及組成和習(xí)性。本公開內(nèi)容提供了用于構(gòu)建獨(dú)特類別的材料的一般化策略，所述策略利用用于裝配功能性結(jié)晶材料的蛋白質(zhì)的不同形態(tài)、表面化學(xué)和功能性。

相應(yīng)地，在不同方面，本公開內(nèi)容提供了通過使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用與互補(bǔ)寡核苷酸-寡核苷酸相互作用交易來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法。通過使用由適當(dāng)?shù)墓押塑账峁δ芑牟煌鞍踪|(zhì)，連同對于無機(jī)系統(tǒng)引入的設(shè)計規(guī)則[Macfarlane等人，Angew Chem Int Ed Engl 49(27):4589-4592(2010)；Macfarlane等人，Science 334(6053):204-208(2011)；Macfarlane等人，Angew Chem Int Ed 52(22):5688-5698(2013)]，本公開內(nèi)容顯示了DNA-功能化酶，以及酶和無機(jī)納米顆粒的不同組合被有意地裝配成預(yù)先考慮的晶格，并且在一些情況下，裝配成明確限定的晶體習(xí)性。重要的是，酶在用DNA廣泛修飾其表面后保留其天然結(jié)構(gòu)和催化功能，并裝配成結(jié)晶超晶格。本公開內(nèi)容尤其證明，DNA可用于將許多容易獲得的功能性蛋白質(zhì)裝配成有序材料，而不管其原子組成如何。

本文公開了一類由蛋白質(zhì)核和致密寡核苷酸殼組成的基于蛋白質(zhì)的材料的合成。寡核苷酸殼不僅對酶核賦予穩(wěn)定性，還充當(dāng)另外的寡核苷酸可與之雜交的通用支架，最終提供DNA指導(dǎo)的蛋白質(zhì)裝配成結(jié)晶材料。與用于編程將蛋白質(zhì)裝配成超分子結(jié)構(gòu)的其他方法相比較，本公開內(nèi)容提供的DNA模板化策略是例如且不限于一般化至任何蛋白質(zhì)，不需要蛋白質(zhì)核的遺傳操作，并且允許將具有多種組分(例如，多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和無機(jī)納米結(jié)構(gòu)的組合)的晶格裝配成具有限定的化學(xué)計量和相對取向的材料。預(yù)期對于廣泛范圍的蛋白質(zhì)采用這種方法將導(dǎo)致在催化和感測中的應(yīng)用，并且充當(dāng)裝配適合于結(jié)構(gòu)測定的蛋白質(zhì)晶體的策略。

因此，在一些方面，本公開內(nèi)容提供了核-殼納米顆粒，所述核包含單一蛋白質(zhì)，并且所述殼包含多個多核苷酸，所述多核苷酸經(jīng)由共價鍵附著至蛋白質(zhì)表面。在不同實(shí)施例中，蛋白質(zhì)顯示出催化、信號傳導(dǎo)、治療或轉(zhuǎn)運(yùn)活性。在一些實(shí)施例中，多個中的每個多核苷酸是相同的。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，多個多核苷酸中的至少兩個是不同的。

在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)表面上的多核苷酸密度為約2pmol/cm²至約200pmol/cm²。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，蛋白質(zhì)表面上的多核苷酸密度為約10pmol/cm²。在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，蛋白質(zhì)表面上的多核苷酸密度為約100pmol/cm²。

在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的核-殼納米顆粒還包含與多個多核苷酸中的至少一個共價或非共價附著的另外的試劑。在不同實(shí)施例中，另外的試劑是多核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、磷脂、寡糖、金屬絡(luò)合物、小分子、治療試劑、造影劑或其組合。在一些實(shí)施例中，另外的試劑通過雜交非共價附著至多個多核苷酸中的至少一個。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，另外的試劑與多個多核苷酸中的至少一個共價結(jié)合。

本公開內(nèi)容還提供了其中殼的至少一個多核苷酸經(jīng)由蛋白質(zhì)的表面氨基連接到蛋白質(zhì)表面的實(shí)施例。在一些實(shí)施例中，表面氨基來自Lys殘基。

在一些實(shí)施例中，至少一個多核苷酸經(jīng)由三唑連接附著，所述三唑連接由(a)附著至表面氨基的疊氮化物部分和(b)在至少一個多核苷酸上的炔官能團(tuán)反應(yīng)形成。

在另外的實(shí)施例中，至少一個多核苷酸經(jīng)由如式(I)、(II)或兩者中所示的連接附著至蛋白質(zhì)表面：

L和L²各自獨(dú)立地選自C_1-10亞烷基、–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–和–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–C_1-10亞烷基–(OCH₂CH₂)_m–Y–；

每個Y獨(dú)立地選自鍵、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；

m為0、1、2、3、4或5；和

PN是至少一個多核苷酸。

在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，殼的至少一個多核苷酸經(jīng)由蛋白質(zhì)的表面羧基附著至蛋白質(zhì)表面。在一些實(shí)施例中，殼的至少一個多核苷酸經(jīng)由蛋白質(zhì)的表面巰基附著至蛋白質(zhì)表面。在另外的實(shí)施例中，殼的至少一個多核苷酸與靶多核苷酸充分互補(bǔ)，以雜交并抑制靶多核苷酸的表達(dá)。

在一些實(shí)施例中，另外的試劑是與靶多核苷酸充分互補(bǔ)以雜交并抑制靶多核苷酸的表達(dá)的多核苷酸。

在一些方面，本公開內(nèi)容提供了包含多個前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核-殼納米顆粒的組合物。在一些實(shí)施例中，多個核-殼納米顆粒形成晶體結(jié)構(gòu)。

在一些實(shí)施例中，每個核-殼納米顆粒包含相同的蛋白質(zhì)。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，至少兩個核-殼納米顆粒包含不同的蛋白質(zhì)。

在另外的實(shí)施例中，組合物還包含金屬納米顆粒。在不同實(shí)施例中，金屬納米顆粒包括金、銀、鉑、鋁、鈀、銅、鈷、銦、鎳或其混合物。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，第一核-殼納米顆粒的多個多核苷酸具有的多核苷酸序列與第二核-殼納米顆粒的多個多核苷酸的多核苷酸序列充分互補(bǔ)以雜交并形成超晶格結(jié)構(gòu)。

在本公開內(nèi)容的進(jìn)一步方面，提供了催化反應(yīng)的方法，所述方法包括使用于反應(yīng)的試劑與本公開內(nèi)容的組合物接觸，其中試劑和組合物之間的接觸導(dǎo)致反應(yīng)被催化。

在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了檢測靶分子的方法，所述方法包括使靶分子與本公開內(nèi)容的核-殼納米顆粒或組合物接觸，其中靶分子和核-殼納米顆?；蚪M合物之間的接觸導(dǎo)致可檢測的變化。在一些實(shí)施例中，檢測是在體外的。在一些實(shí)施例中，檢測是在體內(nèi)的。

在一些方面，提供了抑制由靶多核苷酸編碼的基因產(chǎn)物表達(dá)的方法，所述方法包括在足以抑制基因產(chǎn)物表達(dá)的條件下，使靶多核苷酸與本公開內(nèi)容的核-殼納米顆粒或組合物接觸。在一些實(shí)施例中，基因產(chǎn)物的表達(dá)在體內(nèi)被抑制。在一些實(shí)施例中，基因產(chǎn)物的表達(dá)在體外被抑制。在一些實(shí)施例中，基因產(chǎn)物的表達(dá)被抑制至少約5％。

在本公開內(nèi)容的進(jìn)一步方面，提供了將治療蛋白質(zhì)遞送至細(xì)胞的方法，所述方法包括將本公開內(nèi)容的核-殼納米顆粒或組合物施用于細(xì)胞，其中核-殼納米顆粒的蛋白質(zhì)是治療蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，遞送是體外遞送。在一些實(shí)施例中，遞送是體內(nèi)遞送。

在不同實(shí)施例中，細(xì)胞在受試者中。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，受試者需要治療蛋白質(zhì)。

在本公開內(nèi)容的一些實(shí)施例中，與單獨(dú)施用治療蛋白質(zhì)相比較，所述方法提供受試者中降低的免疫原性應(yīng)答。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，與單獨(dú)施用治療蛋白質(zhì)相比較，所述方法提供治療蛋白質(zhì)的細(xì)胞攝取增加。

在一些方面，本公開內(nèi)容提供了制備核-殼納米顆粒的方法，所述方法包括在足以將多個多核苷酸共價附著至蛋白質(zhì)表面的條件下，使蛋白質(zhì)與多個多核苷酸接觸。

在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：

蛋白質(zhì)-X-L-N₃，

X來自蛋白質(zhì)上的表面氨基、羧基或巰基；

L選自C_1-10亞烷基、–Y-C(O)–C_1-10亞烷基–Y–和–Y-C(O)–C_1-10亞烷基–Y–C_1-10亞烷基–(OCH₂CH₂)_m–Y–；

每個Y獨(dú)立地選自鍵、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；和

m為0、1、2、3、4或5。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，至少一個多核苷酸具有以下結(jié)構(gòu)：

多核苷酸-L₂-X-≡-R；

L²選自C_1-10亞烷基、–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–和–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–C_1-10亞烷基–(OCH₂CH₂)_m–Y–；

每個Y獨(dú)立地選自鍵、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；

m為0、1、2、3、4或5；和

X是鍵，并且R是H或C_1-10烷基；

或者X和R連同它們與之附著的碳一起形成8-10元碳環(huán)或8-10元雜環(huán)基。

在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，至少一個多核苷酸具有以下結(jié)構(gòu)：

附圖說明

圖1a-b描述了用于將寡核苷酸共價附著至蛋白質(zhì)表面的策略。(1a)牛過氧化氫酶的卡通表示。含有伯胺的賴氨酸氨基酸突出顯示為藍(lán)色棒。(1b)用寡核苷酸的致密殼修飾蛋白質(zhì)表面的反應(yīng)方案。為了清楚起見，僅顯示一種表面胺。外圓代表共軛疊氮化物(中間結(jié)構(gòu))或DNA(底部結(jié)構(gòu))的殼。

圖2a-b顯示了用(1)(小圖a)和(2)(小圖b)測定過氧化氫酶的表面修飾程度。(2a)天然(左光譜)和疊氮化物標(biāo)記(右光譜)的過氧化氫酶的MALDI-TOF-MS光譜。4190Da的分子量差異對應(yīng)于用大約60當(dāng)量的(1)標(biāo)記。(2b)天然黑色和DNA標(biāo)記(顯示高達(dá)300nm的峰的光譜)的過氧化氫酶的UV-Vis光譜。在260nm處的吸光度差異對應(yīng)于大約64個寡核苷酸的共價附著。在405nm處的吸光度(插圖)用于測定蛋白質(zhì)濃度，并證實(shí)活性位點(diǎn)周圍的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的保留。

圖3a-c顯示了蛋白質(zhì)/DNA核-殼納米顆粒的表征。(3a)天然、疊氮化物和DNA標(biāo)記的過氧化氫酶的圓二色譜。在208nm和222nm處的最小值對應(yīng)于蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)。DNA共價附著后在光譜中的微小差異是由于附加的DNA鏈的特征性CD標(biāo)記。(3b)測量H₂O₂分解成H₂O和O₂的過氧化氫酶的酶測定。(3c)天然、疊氮化物和DNA標(biāo)記的過氧化氫酶的動態(tài)光散射光譜。

圖4描繪了顯示用大約1.5個FITC分子和大約50個含Cy5的寡核苷酸標(biāo)記的過氧化氫酶的攝取的C8S細(xì)胞的熒光顯微照片。

圖5a-c描述了用于將寡核苷酸共價附著至蛋白質(zhì)表面的策略。(5a)牛過氧化氫酶的卡通表示。突出顯示了含有伯胺的賴氨酸氨基酸。(5b)谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutmicum)("Cg")過氧化氫酶的卡通表示。(5c)用寡核苷酸的致密殼修飾蛋白質(zhì)表面的反應(yīng)方案。為了清楚起見，僅顯示一種表面胺。外圓代表共軛疊氮化物(中間結(jié)構(gòu))或DNA(底部結(jié)構(gòu))的殼。

圖6a-c描述了單組分蛋白質(zhì)超晶格的裝配。(6a)使用自互補(bǔ)接頭裝配蛋白質(zhì)的方案。圖6b)添加自互補(bǔ)接頭后的DNA標(biāo)記的牛過氧化氫酶的照片。未聚集的樣品(右)顯示非自互補(bǔ)接頭的添加不導(dǎo)致聚集。圖6c)蛋白質(zhì)聚集體的熱誘導(dǎo)的解聚，隨后為UV光譜。

圖7a-e顯示了二元蛋白質(zhì)超晶格的裝配。(7a)使用非自互補(bǔ)接頭裝配蛋白質(zhì)的方案。圖7b)包含牛和Cg過氧化氫酶的DNA模板化聚集體的照片，所述聚集體在添加自互補(bǔ)接頭時形成。圖7c)二元蛋白質(zhì)聚集體的熱誘導(dǎo)的解聚，隨后為UV光譜。圖7d)含有牛過氧化氫酶和AuNP的DNA模板化聚集體的照片，所述聚集體在加入與另一種顆粒類型上的接頭互補(bǔ)的接頭時形成。圖7e)二元蛋白質(zhì)AuNP聚集體的熱誘導(dǎo)的解聚，隨后為UV光譜。

圖8a-d顯示了通過SAXS表征蛋白質(zhì)晶格。圖8a)完全由蛋白質(zhì)構(gòu)建塊組成的體心立方(BCC)晶胞的描述。圖8b)BCC超晶格的實(shí)驗(yàn)(紅色)和理論(黑色)1-D SAXS散射分布曲線。圖8c)由蛋白質(zhì)和Au PAE的組合形成的BCC晶胞的描述。圖8d)二元Au-蛋白超晶格的1-D SAXS散射分布曲線。

圖9a-b顯示了由Cg過氧化氫酶組成的晶體的STEM顯微照片。在SE模式下收集低放大率圖像(9a)，并且在Z對比模式下收集更高放大率圖像(9b)。

圖10a-b顯示了由二元蛋白質(zhì)-AuNP晶體組成的晶體的STEM顯微照片。在SE模式下收集低放大率圖像(10a)，并且在Z對比模式下收集更高放大率圖像(10b)。

圖11描繪了天然、AF647和DNA功能化的β-gal的UV-可見光譜。在大約650nm處的吸光度峰來自共價附著的AlexaFluor染料，并用于在用DNA標(biāo)記蛋白質(zhì)后測量蛋白質(zhì)的濃度(上線)?；?60nm處的吸光度測定DNA的濃度。

圖12描繪了通過共焦熒光顯微鏡檢查測定的天然(左)和DNA功能化(右)β-gal的細(xì)胞攝取。細(xì)胞核用DAPI染色并染成藍(lán)色。來自共價附著至蛋白質(zhì)表面的AlexaFluor染料的熒光信號染成紅色。

圖13顯示了轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的天然(左)和DNA功能化(右)β-gal的催化活性。

圖14a-g描述了蛋白質(zhì)-DNA綴合物的另外的合成和表征。圖14a)牛和Cg過氧化氫酶的卡通描述，顯示它們的分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和表面可接近的胺的位置。圖14b)用于合成和裝配DNA功能化的過氧化氫酶的方案。表面可接近的胺用在相對末端處含有NHS和N3部分的疊氮化物進(jìn)行修飾(i)，這之后共價附著的疊氮化物經(jīng)由無銅“點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)”反應(yīng)綴合至兩條不同的5’-DBCO修飾的DNA鏈(ii)。接頭鏈與DNA功能化蛋白質(zhì)的雜交(iii)隨后為蛋白質(zhì)與互補(bǔ)接頭的混合(iv)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)裝配成BCC或CsCl型晶胞。圖14c-e)如通過DLS測定的，天然(圖14c)、N3功能化(圖14d)和DNA功能化(圖14e)Cg過氧化氫酶的流體動力學(xué)直徑的比較。(圖14f)通過天然(黑色圓圈)、DNA功能化(紅色(鏈1)和藍(lán)色(鏈2)正方形)、以及結(jié)晶(青色三角形)Cg過氧化氫酶，根據(jù)底物濃度的酶催化的H₂O₂歧化速率的比較。圖14g)由Cg過氧化氫酶組成的DNA模板化聚集體的熱熔融轉(zhuǎn)變。

圖15a-e顯示了表面修飾對過氧化氫酶直徑的作用。圖15a)DNA功能化的Cg過氧化氫酶的卡通描述，顯示DNA、蛋白質(zhì)和接頭對綴合物的流體動力學(xué)直徑的相對貢獻(xiàn)。接頭區(qū)(青色)由來自疊氮化物接頭的四甘醇間隔物以及DBCO dT合成亞磷酰胺的DBCO和胸苷部分之間的間隔物組成(插圖)。二間隔物18亞磷酰胺也包括在DNA設(shè)計中，并且為了清楚起見，未在卡通中描繪。圖15b-d)天然(b)、疊氮化物功能化(c)和DNA功能化(d)牛過氧化氫酶的動態(tài)光散射(DLS)光譜。圖15e)牛和Cg過氧化氫酶及其疊氮化物和DNA功能化變體的流體動力學(xué)直徑的概括。注意到圖15a中的距離是如通過ProDrug Server[Schuttelkopf等人，Acta Crystallogr D 60:1355-1363(2004)]計算的，基于結(jié)晶狀態(tài)中的每堿基對的距離以及采用理想化的鍵距離和角度的接頭的估計值。

圖16a-e顯示了通過MALDI-MS測定蛋白質(zhì)由疊氮化物的標(biāo)記程度。通過MALDI-MS測定天然(左線)和N3標(biāo)記(右線)牛(圖16a)和Cg(圖16b)過氧化氫酶由疊氮化物的功能化程度。與蛋白質(zhì)反應(yīng)的每個疊氮化物接頭使其分子量增加274Da。因?yàn)樗木垠w酶在樣品制備和分析期間解離成單體，所以此處觀察到的值是關(guān)于單個亞單位的。用寡核苷酸1(空心正方形)和2(實(shí)心正方形)功能化且廣泛洗滌以去除未反應(yīng)的DNA后，通過UV-可見光譜測定牛(圖16c)和Cg(圖16d)過氧化氫酶與DNA的DNA:蛋白質(zhì)比。在260nm處的差異吸光度是由于用DNA修飾蛋白質(zhì)。圖16e)使用疊氮化物和每個寡核苷酸的蛋白質(zhì)功能化程度的概括。從在Pymol Molecular Graphics System[The PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.5.0.4LLC.]中生成的每種蛋白質(zhì)的表面呈現(xiàn)計算表面可接近的賴氨酸數(shù)目。每種胺的實(shí)際溶劑可接近性不同，這可能解釋了為何觀察到的得率小于理論上可能的得率。然而，功能化胺的數(shù)目在幾個標(biāo)記反應(yīng)(對于牛過氧化氫酶在15和16之間，并且對于Cg過氧化氫酶在11和12之間)之間是高度可重復(fù)的。關(guān)于寡核苷酸2的DNA鏈對牛過氧化氫酶的明顯過量可能是由于估計蛋白質(zhì)濃度中的誤差和/或在擁擠環(huán)境中DNA在蛋白質(zhì)表面上的消光中的輕微變化或計算的DNA消光的不確定性。

圖17a-f天然和DNA功能化的牛(圖17a-c)和Cg(圖17d-f)過氧化氫酶的結(jié)構(gòu)表征。在用寡核苷酸1和2功能化之前(空心圓圈)和之后(正方形)，牛(圖17a)和Cg(圖17d)過氧化氫酶的UV-可見吸收光譜?；旧蠜]有觀察到DNA功能化蛋白質(zhì)的可見吸收光譜中的變化，指示在用每條DNA鏈功能化任一蛋白質(zhì)后，活性位點(diǎn)周圍的蛋白質(zhì)環(huán)境是完整的。在用寡核苷酸1(圖17b和e)或寡核苷酸2(圖17c和f)功能化之前(空心圓圈)和之后(實(shí)心圓圈)，牛(圖17b-c)和Cg(圖17e-f)過氧化氫酶的圓二色譜。游離寡核苷酸1和2的光譜表示為空心正方形，并且是單個DNA分子的Δε乘以預(yù)期的DNA:蛋白質(zhì)比的乘積。實(shí)心正方形表示天然過氧化氫酶和每種游離寡核苷酸的CD光譜的總和。計算和觀察到的光譜之間的一致性提示由吸收光譜計算的DNA:蛋白質(zhì)比率是實(shí)際的功能化程度的合理估計。

圖18a-d顯示了在用疊氮化物接頭功能化之前(空心圓圈)和之后(空心圓圈)，牛(圖18a和b)和“Cg”(圖18c和d)過氧化氫酶結(jié)構(gòu)的光譜表征。圖18a和c)天然和N3功能化的牛(圖18a)和Cg(圖18c)過氧化氫酶的UV-可見吸收光譜。N3功能化的蛋白質(zhì)變體相對于天然酶的幾乎相同的可見吸收光譜證實(shí)蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)在功能化后大部分是完整的。405:280比率的保留證實(shí)在功能化程序期間不發(fā)生血紅素?fù)p失。圖18b和d)牛(圖18b)和Cg(圖18d)過氧化氫酶的CD光譜。特征性吸收特征和強(qiáng)度的保留證實(shí)酶在用疊氮化物功能化后保留其二級結(jié)構(gòu)。

圖19a-k顯示了H₂O₂通過天然過氧化氫酶、DNA功能化的過氧化氫酶和Cg過氧化氫酶晶體的催化分解。在加入天然(圖19a和d)或DNA功能化的(圖19b-c和e-f)Cg(圖19a-c)和牛(圖19d-f)過氧化氫酶之后，在240nm處的吸光度中的變化轉(zhuǎn)化為通過除以H₂O₂的摩爾消光系數(shù)(43M^-1cm^-1)分解的H₂O₂的濃度，并繪制為時間的函數(shù)。計算每個H₂O₂濃度的初始反應(yīng)速率，并在圖14f(Cg過氧化氫酶)和19g(牛過氧化氫酶)中繪制。圖19h)H₂O₂通過每種酶變體分解的速度常數(shù)的概括。圖19i)通過Cg過氧化氫酶晶體在不同底物濃度下的H₂O₂分解。圖19j)酶晶體的回收。下點(diǎn)和上點(diǎn)分別對應(yīng)于上清液和團(tuán)塊。圖19k)在5輪催化、離心和重懸浮之前(底部)和之后(頂部)的蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)。

圖20a-g顯示了DNA模板化的蛋白質(zhì)聚集體的熱熔融轉(zhuǎn)變的分析。從與具有互補(bǔ)粘性末端的接頭雜交的兩種蛋白質(zhì)(圖20a-d)或蛋白質(zhì)和10nm核SNA-AuNP綴合物(圖20e-f)的每種可能組合裝配聚集體。隨著溫度從室溫緩慢增加(0.1℃/分鐘)到45℃，通過跟蹤在含有聚集體的溶液的260nm處的消光的變化獲得熔融曲線。所有顆粒組合均獲得顯示尖銳熔融轉(zhuǎn)變的聚集體，所述尖銳熔融轉(zhuǎn)變與寡核苷酸對組分納米顆粒的表面的致密覆蓋一致。圖20g)每條熔融(melting)曲線的一階導(dǎo)數(shù)的熔融溫度和半高全寬的概括。

圖21a-f顯示了關(guān)于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)(圖21a-d)和蛋白質(zhì)-AuNP(圖21e-f)超晶格的SAXS數(shù)據(jù)。每個小圖顯示了對于含有蛋白質(zhì)的超晶格的實(shí)驗(yàn)觀察到的一維SAXS模式(上部跡線)和理論預(yù)測(下部跡線)之間的比較。每個超晶格類型的組分和晶胞的圖示顯示在每個小圖的頂部處，其中Cg過氧化氫酶、牛過氧化氫酶和AuNP分別描述為紅色卡通、青色卡通或金色球體。超晶格與圖21a)BCC(藍(lán)色理論跡線)和CsCl(黑色理論跡線)的混合物、(圖21b-d)CsCl和(圖21e-f)簡單立方是等結(jié)構(gòu)的。

圖22a-d顯示了通過TEM表征單晶超晶格。Cg過氧化氫酶-AuNP混合超晶格的低(圖22a)和高(圖22b)放大率TEM顯微照片顯示預(yù)期的菱形十二面體晶體習(xí)性的均勻形成。對于具有匹配取向的實(shí)驗(yàn)觀察的超晶格，并排顯示了菱形十二面體的不同取向的卡通描繪。(圖22b)中的插圖描繪了單晶內(nèi)的AuNP之間的高度短程有序。圖c-d)由Cg過氧化氫酶組成的超晶格的低和高放大率TEM圖像。圖22d)具有清楚可見的晶格面的單一Cg過氧化氫酶晶體的高放大率TEM圖像，證明其單晶性質(zhì)。比例尺對于(圖22a)和(圖22c)為5μm，并且對于(圖22b)為500nm和對于(圖22d)為200nm。

圖23顯示了由DNA功能化的Cg過氧化氫酶和SNA-AuNP綴合物裝配的單晶超晶格的代表性低放大率顯微照片。比例尺＝10μm。

圖24是舉例說明用互補(bǔ)寡核苷酸功能化的顆粒之間的DNA介導(dǎo)的相互作用的方案。每個顆粒(蛋白質(zhì)＝品紅色卡通和AuNP＝金色球體)用寡核苷酸功能化，所述寡核苷酸由含有用于顆粒附著的化學(xué)反應(yīng)部分(分別用于AuNP和蛋白質(zhì)的硫醇和DBCO部分)的區(qū)域(i)和短柔性區(qū)域組成，所述短柔性區(qū)域由PEG間隔物(Sp)組成。還包括這些間隔物(所述間隔物也包括在接頭鏈的識別和粘性末端部分之間)以增加DNA互連的柔性并促進(jìn)高質(zhì)量晶體的形成。柔性區(qū)側(cè)翼為與互補(bǔ)接頭鏈(藍(lán)色或黃色)雜交的識別序列(ii)。每個接頭的末端由與另一種顆粒類型上的粘性末端互補(bǔ)的短粘性末端(iii)組成。雖然為了清楚僅顯示了一個蛋白質(zhì)-DNA或AuNP-DNA連接，但蛋白質(zhì)的表面含有許多潛在的可功能化的賴氨酸殘基(藍(lán)色棒)。

具體實(shí)施方式

由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和多樣的催化功能，蛋白質(zhì)代表用于構(gòu)建功能性超分子材料的幾乎無限的前體集合。然而，編程將甚至單一蛋白質(zhì)裝配成有序的超晶格也是困難的任務(wù)，并且目前不存在用于共裝配具有不同表面化學(xué)的多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和無機(jī)納米顆粒的一般化策略。此處，DNA-DNA“鍵”的高保真相互作用特征用于指導(dǎo)在不同實(shí)施例中將兩種蛋白質(zhì)裝配成由單一蛋白質(zhì)、多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和金納米顆粒組成的六個獨(dú)特的超晶格。重要的是，DNA功能化的蛋白質(zhì)在溶液和結(jié)晶狀態(tài)兩者中保持其天然催化功能性。

DNA介導(dǎo)的納米顆粒(NP)裝配和結(jié)晶[Mirkin等人，Nature 382(6592):607-609(1996)；Park等人，Nature 451(7178):553-556(2008)；Nykypanchuk等人，Nature 451(7178):549-552(2008)]要求用徑向取向的寡核苷酸的致密單層來修飾組分構(gòu)件塊的表面。該體系結(jié)構(gòu)也稱為可編程原子等價物[Macfarlane等人，Angew Chem Int Ed 52(22):5688-5698(2013)]或球形核酸(SNA)-NP綴合物，使得在與具有短的互補(bǔ)粘性末端的接頭鏈雜交的顆粒之間多價相互作用能夠形成(圖1和24)。當(dāng)具有互補(bǔ)粘性末端的納米顆粒組合，加熱至足以破壞這些多價相互作用的溫度，并且隨后緩慢冷卻至室溫時，許多單獨(dú)弱的顆粒間相互作用的可逆形成共同有利于形成熱力學(xué)穩(wěn)定的單晶超晶格超過動力學(xué)上捕獲的無定形聚集體[Auyeung等人，Nature 505(7481):73-77(2014)]。將功能性蛋白質(zhì)包括在DNA介導(dǎo)的超晶格內(nèi)是可能的，條件是它們的表面可用寡核苷酸充分功能化，同時保持其天然結(jié)構(gòu)完整，這對于保持其功能性是至關(guān)重要的。開發(fā)了在溫和條件下將寡核苷酸附加到蛋白質(zhì)表面的兩步反應(yīng)方案，表征DNA功能化的蛋白質(zhì)以確保它們保持其天然結(jié)構(gòu)和功能，并且觀察到它們的DNA介導(dǎo)的裝配成單晶超晶格。

本公開內(nèi)容涉及不同應(yīng)用，包括但不限于：

用寡核苷酸的致密殼化學(xué)修飾蛋白質(zhì)表面的方法；

基于潛在蛋白質(zhì)的治療劑針對通過細(xì)胞蛋白酶的降解或長期貯存后的穩(wěn)定化；

蛋白質(zhì)-寡核苷酸綴合物用于替代缺陷酶(例如，用于溶酶體貯積病癥)或用于毒性代謝產(chǎn)物(例如，在創(chuàng)傷性腦損傷或中風(fēng)后分解H₂O₂的過氧化氫酶)的酶促轉(zhuǎn)化的應(yīng)用；

蛋白質(zhì)由用于細(xì)胞進(jìn)入的寡核苷酸和用于靶向的其他化學(xué)部分(例如，用于靶向溶酶體的甘露糖-6-磷酸)的組合功能化；

蛋白質(zhì)-寡核苷酸綴合物作為多功能治療劑的應(yīng)用。

由本公開內(nèi)容提供的優(yōu)點(diǎn)包括但不限于：

使用寡核苷酸作為涂層允許聯(lián)合治療策略；

與用于遞送寡核苷酸的其他方法相比較，酶核的使用賦予另外的功能性；

寡核苷酸殼的序列可被定制為以特定的速率降解并暴露蛋白質(zhì)表面，以允許控制細(xì)胞過程(例如，受體結(jié)合以控制信號傳導(dǎo)級聯(lián))；

蛋白質(zhì)的表面呈現(xiàn)具有正交化學(xué)修飾化學(xué)的多個官能團(tuán)。這應(yīng)當(dāng)允許例如用多個寡核苷酸修飾蛋白質(zhì)表面或除寡核苷酸殼之外的靶向部分的綴合。

本公開內(nèi)容提供了與使用蛋白質(zhì)治療劑相關(guān)的許多挑戰(zhàn)(細(xì)胞攝取不良、先天免疫應(yīng)答的激活、生物利用度低、被細(xì)胞蛋白酶降解、或長期貯存后的聚集和失活)的解決方案。

所公開的顆粒是可擴(kuò)展到許多不同的基于蛋白質(zhì)的產(chǎn)品的核心技術(shù)。它具有穩(wěn)定和改善任何酶的藥效學(xué)性質(zhì)的潛力，并且因此可應(yīng)用于一系列疾病的治療。另外，雖然用于DNA遞送的傳統(tǒng)支架僅充當(dāng)支撐物，但基于蛋白質(zhì)的支架本身可用作治療劑。

蛋白質(zhì)-寡核苷酸核-殼NP由用寡核苷酸的致密殼化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)核組成。蛋白質(zhì)核可選自廣泛范圍的蛋白質(zhì)，例如且不限于治療、催化、信號傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)功能性。類似地，可就其治療價值或具有可調(diào)諧的降解速率選擇寡核苷酸殼，使得蛋白質(zhì)核在生理環(huán)境中變得有功能。

本發(fā)明允許功能性蛋白質(zhì)可預(yù)測地裝配成超分子材料。這將允許合成具有兩種或更多種組分(例如，多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和無機(jī)納米結(jié)構(gòu))的限定比例的材料。

該技術(shù)的應(yīng)用包括但不限于：用于合成蛋白質(zhì)/DNA核-殼納米顆粒的一般方法；在室溫下長期貯存后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；酶促活性晶體的裝配；含有在串聯(lián)催化中有應(yīng)用的超過一種蛋白質(zhì)的晶體的裝配；由蛋白質(zhì)分子和無機(jī)納米顆粒組成的多組分晶體的裝配；和用于結(jié)構(gòu)測定中的蛋白質(zhì)的結(jié)晶。

該技術(shù)的一些優(yōu)點(diǎn)包括但不限于：DNA雙鏈體形成的高保真性允許使用其他策略預(yù)測寡核苷酸功能化蛋白質(zhì)的裝配行為至不可能的程度；蛋白質(zhì)具有許多固有特征，使得它們成為用于裝配功能材料的理想構(gòu)件塊，例如相對于其他納米級材料的均勻的原子組成和高度的結(jié)構(gòu)均勻性，包含具有正交化學(xué)性質(zhì)和廣泛范圍的催化功能的多個化學(xué)可修飾官能團(tuán)的表面的存在。

如本文使用的，“多個”意指超過一個。在多核苷酸的上下文中，多個是附著至蛋白質(zhì)核表面的許多多核苷酸，其提供足夠的覆蓋以形成“殼”。在一些情況下，該多個通過多核苷酸密度進(jìn)行測量。

如本文使用的，“生物分子”理解為包括多核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、磷脂、寡糖、小分子、治療試劑、造影劑及其組合。

此處注意到除非上下文另有明確說明，否則如在本說明書和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一種”、“一個”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)指代物。

還注意到如本文使用的術(shù)語“約”理解為意指大約。

核-殼納米顆粒

本公開內(nèi)容的核-殼納米顆粒的基本組分是多個多核苷酸和單一蛋白質(zhì)。在核-殼納米顆粒的不同方面，所有多核苷酸是相同的，或者在替代方案中，至少兩個多核苷酸是不同的。

蛋白質(zhì)

如本文使用的，蛋白質(zhì)與“多肽”可互換使用，并且指由氨基酸殘基組成的聚合物。如本文使用的，“單一蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基的連續(xù)聚合物。如本文公開的蛋白質(zhì)一般充當(dāng)核-殼納米顆粒的“核”。

蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域中是理解的，并且包括但不限于抗體、酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和激素。因此，由本公開內(nèi)容考慮的蛋白質(zhì)包括但不限于具有催化、信號傳導(dǎo)、治療或轉(zhuǎn)運(yùn)活性的那些。在不同實(shí)施例中，催化功能性包括生物相關(guān)功能，例如替代溶酶體貯積病癥中缺陷的酶(尤其是α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-腦苷脂酶、葡糖苷酶-α、α-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、α-葡糖苷酶、β-氨基己糖苷酶A、酸性脂肪酶和這些酶的變體)、胃腸道病癥中缺陷的酶(乳糖酶、脂肪酶、淀粉酶或蛋白酶)、或涉及免疫缺陷的酶(腺苷脫氨酶)，或包括與技術(shù)應(yīng)用相關(guān)的酶(氫化酶、脂肪酶、蛋白酶、加氧酶或漆酶)，其在不同實(shí)施例中在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外使用。信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)包括生長因子如TNF-α或胱天蛋白酶。考慮人血清白蛋白用作轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，其中小分子治療劑或顯像劑將結(jié)合在核中，并且DNA外殼將充當(dāng)細(xì)胞攝取信號。

本公開內(nèi)容的蛋白質(zhì)可以是天然存在的或非天然存在的。蛋白質(zhì)任選包括如本文所述的間隔物。

天然存在的蛋白質(zhì)

天然存在的蛋白質(zhì)包括但不限于自然界中存在的或可通過例如化學(xué)合成或重組表達(dá)技術(shù)以在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式產(chǎn)生的生物活性蛋白質(zhì)(包括抗體)。天然存在的蛋白質(zhì)還包括脂蛋白和翻譯后修飾的蛋白質(zhì)，例如且不限于糖基化蛋白質(zhì)。

考慮用于本公開內(nèi)容的方法和組合物中的抗體包括但不限于在體內(nèi)或體外識別靶分子并與靶分子結(jié)合的抗體。

由本公開內(nèi)容考慮的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)包括但不限于肌動蛋白、微管蛋白、膠原、彈性蛋白、肌球蛋白、驅(qū)動蛋白和動力蛋白。

非天然存在的蛋白質(zhì)

由本公開內(nèi)容考慮的非天然存在的蛋白質(zhì)包括但不限于合成蛋白質(zhì)，以及如本文定義的天然存在或非天然存在的蛋白質(zhì)的片段、類似物和變體。非天然存在的蛋白質(zhì)還包括具有D-氨基酸，以D-或L-構(gòu)型的經(jīng)修飾的、衍生的或非天然存在的氨基酸和/或擬肽單位作為其結(jié)構(gòu)的一部分的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)物質(zhì)。術(shù)語“肽”通常指短的多肽/蛋白質(zhì)。

非天然存在的蛋白質(zhì)例如使用自動化蛋白質(zhì)合成儀或可替代地使用編碼所需蛋白質(zhì)的經(jīng)修飾的多核苷酸使用重組表達(dá)技術(shù)來制備。

如本文使用的，蛋白質(zhì)的“片段”意指小于全長蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的任何部分。

如本文使用的，“類似物”指在結(jié)構(gòu)上基本相似并且具有相同生物活性，但對整個分子或其片段具有不同程度活性的兩種或更多種蛋白質(zhì)中的任一種?；谏婕皩τ谄渌被岬囊粋€或多個氨基酸取代、缺失、插入和/或添加的一個或多個突變，類似物在其氨基酸序列的組成中不同。基于被替代的氨基酸和替代其的氨基酸的物理化學(xué)或功能相關(guān)性，取代可以是保守的或非保守的。

如本文使用的，“變體”指進(jìn)行修飾以包含通常并非分子的部分的另外化學(xué)部分的蛋白質(zhì)或其類似物。這些部分可調(diào)節(jié)例如且不限于分子的溶解度、吸收和/或生物半衰期。能夠介導(dǎo)這種效應(yīng)的部分公開于Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)中。將這些部分偶聯(lián)至分子的程序是本領(lǐng)域眾所周知的。在不同方面，蛋白質(zhì)通過糖基化、聚乙二醇化和/或多唾液酸化來修飾。

還考慮了融合蛋白，包括其中一個融合成分是片段或模擬物的融合蛋白。如本文使用的，“模擬物”意指具有與其為模擬物的蛋白質(zhì)可比較的生物活性的肽或蛋白質(zhì)。例如，內(nèi)皮生長因子模擬物是具有與天然內(nèi)皮生長因子可比較的生物活性的肽或蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括間接模擬目的蛋白質(zhì)的活性的肽或蛋白質(zhì)，例如通過增強(qiáng)目的蛋白質(zhì)的天然配體的作用。

蛋白質(zhì)包括抗體連同其片段和衍生物，包括但不限于Fab'片段、F(ab)2片段、Fv片段、Fc片段、一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、個別重鏈、個別輕鏈、二聚重鏈和輕鏈(與在完整抗體中發(fā)現(xiàn)的異源四聚重鏈和輕鏈相反、單鏈抗體(scAb)、人源化抗體(以及以人源化抗體的方式修飾的抗體，但所得到的抗體更緊密類似于非人物種中的抗體)、螯合重組抗體(CRAB)、雙特異性抗體和多特異性抗體、以及本領(lǐng)域已知的其他抗體衍生物或片段。

密度

根據(jù)蛋白質(zhì)的覆蓋程度和制備混合物中起始組分(即多核苷酸)的量，提供的核-殼納米顆?？紤]具有不同的密度。因此，在一個方面，蛋白質(zhì)被多核苷酸完全覆蓋，或在一個可替代方面，被多核苷酸顯著覆蓋，或被多核苷酸稀疏覆蓋。在一個方面，蛋白質(zhì)的覆蓋密度在整個表面上是平均的，或在替代方案中，密度在表面上是不均勻的。

在一些方面，構(gòu)成核-殼納米顆粒的殼的多核苷酸的密度提供增加的降解抗性。在一個方面，核-殼納米顆粒被細(xì)胞攝取受與納米顆粒相關(guān)的多核苷酸的密度影響。如PCT/US2008/65366(以引用的方式全文并入本文)中所述，多核苷酸功能化納米顆粒的表面上的較高密度的多核苷酸與納米顆粒被細(xì)胞攝取增加相關(guān)。同樣考慮這一方面是核-殼納米顆粒的性質(zhì)，其中包含核-殼納米顆粒的殼的更高密度的多核苷酸與核-殼納米顆粒被細(xì)胞攝取增加相關(guān)。

一般地，至少2pmol/cm²的多核苷酸的表面密度將足以提供穩(wěn)定的核-殼納米顆粒。在一些方面，表面密度為至少15pmol/cm²。還提供了組合物和方法，其中所述多核苷酸以至少2pmol/cm²、至少3pmol/cm²、至少4pmol/cm²、至少5pmol/cm²、至少6pmol/cm²、至少7pmol/cm²、至少8pmol/cm²、至少9pmol/cm²、至少10pmol/cm²、至少約15pmol/cm²、至少約20pmol/cm²、至少約25pmol/cm²、至少約30pmol/cm²、至少約35pmol/cm²、至少約40pmol/cm²、至少約45pmol/cm²、至少約50pmol/cm²、至少約55pmol/cm²、至少約60pmol/cm²、至少約65pmol/cm²、至少約70pmol/cm²、至少約75pmol/cm²、至少約80pmol/cm²、至少約85pmol/cm²、至少約90pmol/cm²、至少約95pmol/cm²、至少約100pmol/cm²、至少約125pmol/cm²、至少約150pmol/cm²、至少約175pmol/cm²、至少約200pmol/cm²、至少約250pmol/cm²、至少約300pmol/cm²、至少約350pmol/cm²、至少約400pmol/cm²、至少約450pmol/cm²、至少約500pmol/cm²、至少約550pmol/cm²、至少約600pmol/cm²、至少約650pmol/cm²、至少約700pmol/cm²、至少約750pmol/cm²、至少約800pmol/cm²、至少約850pmol/cm²、至少約900pmol/cm²、至少約950pmol/cm²、至少約1000pmol/cm²或更多的表面密度存在于核-殼納米顆粒中。

多核苷酸

術(shù)語“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互換使用。本公開內(nèi)容考慮了多核苷酸，無論是作為核-殼顆粒的殼的一部分還是作為另外的試劑，包括如本文定義的DNA、RNA、修飾形式及其組合。相應(yīng)地，在一些方面，核-殼納米顆粒包含DNA。在一些實(shí)施例中，DNA是雙鏈的，而在進(jìn)一步的實(shí)施例中，DNA是單鏈的。在進(jìn)一步的方面，核-殼納米顆粒包含RNA，而在再進(jìn)一步的方面，核-殼納米顆粒包含雙鏈RNA，并且在一個具體實(shí)施例中，雙鏈RNA試劑是小干擾RNA(siRNA)。術(shù)語“RNA”包括兩條分開鏈的雙鏈體，以及單鏈結(jié)構(gòu)。單鏈RNA還包括具有二級結(jié)構(gòu)的RNA。在一個方面，考慮了具有發(fā)夾環(huán)的RNA。

在不同實(shí)施例中，核-殼納米顆粒包含多個多核苷酸，所述多核苷酸由與靶多核苷酸的靶序列充分互補(bǔ)的序列組成，使得其為核-殼納米顆粒的部分的多核苷酸和靶多核苷酸的雜交發(fā)生。在不同方面中，多核苷酸是單鏈或雙鏈的，只要雙鏈分子還包括與靶多核苷酸的單鏈序列雜交的單鏈序列。在一些方面，其為核-殼納米顆粒的部分的多核苷酸的雜交可與雙鏈靶多核苷酸形成三鏈體結(jié)構(gòu)。在另一個方面，可通過其為核-殼納米顆粒的部分的雙鏈多核苷酸與單鏈靶多核苷酸的雜交來形成三鏈體結(jié)構(gòu)。三鏈體多核苷酸復(fù)合物的進(jìn)一步描述在PCT/US2006/40124中發(fā)現(xiàn)，所述專利以引用的方式全文并入本文。

在一些方面，多核苷酸含有如本文所述的間隔物。

“多核苷酸”在本領(lǐng)域中理解為包含個別聚合的核苷酸亞基。如本文使用的，術(shù)語“核苷酸”或其復(fù)數(shù)可與如本文討論和本領(lǐng)域另外已知的修飾形式互換。在某些情況下，本領(lǐng)域使用包含天然存在的核苷酸以及包括經(jīng)修飾的核苷酸的非天然存在的核苷酸的術(shù)語“核堿基”。因此，核苷酸或核堿基意指天然存在的核堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。非天然存在的核堿基包括例如且不限于黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮雜黃嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、N4,N4-乙醇胞嘧啶(ethanocytosin)、N',N'-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3—C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷和“非天然存在的”核堿基，其在Benner等人、美國專利號5,432,272以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research，第25卷：第4429-4443頁中描述。術(shù)語“核堿基”不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。進(jìn)一步的天然和非天然存在的核堿基包括在下述中公開的那些：美國專利號3,687,808(Merigan等人)，Sanghvi在Antisense Research and Application，編輯S.T.Crooke和B.Lebleu,CRC Press,1993中的第15章，Englisch等人，1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613-722(尤其參見第622和623頁，以及Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,J.I.Kroschwitz Ed.,John Wiley&Sons,1990，第858-859頁，Cook,Anti-Cancer Drug Design 1991,6,585-607，所述參考文獻(xiàn)各自以引用的方式在此全文并入)。在不同方面，多核苷酸還包括一個或多個“核苷堿基”或“堿基單元”，其是一類非天然存在的核苷酸，包括可如核堿基起作用的化合物，例如雜環(huán)化合物，包括在最經(jīng)典的意義上并非核苷堿基，但充當(dāng)核苷堿基的某些“通用堿基”。通用堿基包括3-硝基吡咯，任選取代的吲哚(例如5-硝基吲哚)和任選取代的次黃嘌呤。其他期望的通用堿基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本領(lǐng)域已知的那些通用堿基。

修飾的核苷酸在EP 1 072 679和WO 97/12896中描述，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。經(jīng)修飾的核苷酸包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵素特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-去氮雜鳥嘌呤和7-去氮雜腺嘌呤以及3-去氮雜鳥嘌呤和3-去氮雜腺嘌呤。進(jìn)一步的經(jīng)修飾的堿基包括三環(huán)嘧啶，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G夾例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。經(jīng)修飾的堿基還可包括其中嘌呤或嘧啶堿基被其他雜環(huán)例如7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮替代的那些。另外的核堿基包括在美國專利號3,687,808中公開的那些，在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859頁，Kroschwitz,J.I.編輯John Wiley&Sons,1990中公開的那些，由Englisch等人，1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613中公開的那些，以及由Sanghvi,Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302頁，Crooke,S.T.和Lebleu,B.編輯，CRC Press,1993中公開的那些。這些堿基中的某些可用于增加結(jié)合親和力，并且包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加0.6-1.2℃，并且在某些方面，與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合。參見，美國專利號3,687,808，美國專利號4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

制備具有預(yù)定序列的多核苷酸的方法是眾所周知的。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版1989)和F.Eckstein(編輯)Oligonucleotides and Analogues，第1版(Oxford University Press,New York,1991)。固相合成方法優(yōu)選用于聚核糖核苷酸和聚脫氧核糖核苷酸(合成DNA的眾所周知的方法也可用于合成RNA)。聚核糖核苷酸也可酶促制備。非天然存在的核堿基也可摻入多核苷酸內(nèi)。參見例如美國專利號7,223,833；Katz,J.Am.Chem.Soc.,74:2238(1951)；Yamane等人，J.Am.Chem.Soc.,83:2599(1961)；Kosturko等人，Biochemistry,13:3949(1974)；Thomas,J.Am.Chem.Soc.,76:6032(1954)；Zhang等人，J.Am.Chem.Soc.,127:74-75(2005)；和Zimmermann等人，J.Am.Chem.Soc.,124:13684-13685(2002)。

本公開內(nèi)容的多核苷酸或其修飾形式一般為長度約5個核苷酸至約100個核苷酸。一般而言，較長的多核苷酸將導(dǎo)致核-殼納米顆粒的較慢降解。更具體地，核-殼納米顆粒包含長度約5至約90個核苷酸、長度約5至約80個核苷酸、長度約5至約70個核苷酸、長度約5至約60個核苷酸、長度約5至約50個核苷酸、長度約5至約45個核苷酸、長度約5至約40個核苷酸、長度約5至約35個核苷酸、長度約5至約30個核苷酸、長度約5至約25個核苷酸、長度約5至約20個核苷酸、長度約5至約15個核苷酸、長度約5至約10個核苷酸的多核苷酸，以及具體公開至多核苷酸能夠?qū)崿F(xiàn)所需結(jié)果的程度的尺寸長度中間的所有多核苷酸。相應(yīng)地，考慮了長度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多個核苷酸的多核苷酸。本文具體考慮的是具有15至100個核苷酸、或15至60個核苷酸、或18至30個核苷酸的多核苷酸。

如本文定義的多核苷酸也包括適體。適體的生產(chǎn)和使用是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。一般而言，適體是能夠緊密結(jié)合并精確區(qū)分靶配體的核酸或肽結(jié)合種類[Yan等人，RNA Biol.6(3)316-320(2009)，以引用的方式全文并入本文]。在一些實(shí)施例中，適體可通過稱為配體指數(shù)富集的系統(tǒng)演化(SELEX)過程的技術(shù)來獲得[Tuerk等人，Science 249:505–10(1990)，美國專利號5,270,163和美國專利號5,637,459，所述參考文獻(xiàn)各自以引用的方式全文并入本文]。核酸適體的一般討論在例如且不限于Nucleic Acid and Peptide Aptamers:Methods and Protocols(由Mayer編輯，Humana Press,2009)和Crawford等人，Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2(1):72–79(2003)中發(fā)現(xiàn)。適體的另外討論，包括但不限于RNA適體的選擇、DNA適體的選擇、能夠共價連接至靶蛋白的適體的選擇、經(jīng)修飾的適體文庫的使用、以及適體作為診斷試劑和治療試劑的用途，在Kopylov等人，Molecular Biology 34(6):940–954(2000)中提供，其翻譯自Molekulyarnaya Biologiya，第34卷，No.6,2000，第1097–1113頁，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式全文并入本文。在不同方面，適體長度在10-100個核苷酸之間。

間隔物

在某些方面，考慮了核-殼納米顆粒，其包括其中核-殼納米顆粒包含還包含間隔物的多核苷酸的那些。

如本文使用的，“間隔物”意指作用于增加多核苷酸和多核苷酸與之附著的核之間的距離的部分。在其中核-殼納米顆粒用于生物活性的本公開內(nèi)容的一些方面，考慮間隔物不直接參與它與之附著的多核苷酸的活性。在可替代的方面，間隔物可與靶多核苷酸全部或部分互補(bǔ)。

在不同方面，間隔物另外考慮為位于串聯(lián)的個別多核苷酸之間，無論多核苷酸是具有相同的序列還是具有不同的序列。在一個方面，當(dāng)存在時，間隔物是有機(jī)部分。在另一個方面，間隔物是聚合物，包括但不限于水溶性聚合物、核酸、蛋白質(zhì)、寡糖、碳水化合物、脂質(zhì)或其組合。

在不同實(shí)施例中，間隔物的長度為至少約5個核苷酸、至少約10個核苷酸、10-30個核苷酸、10-40個核苷酸、10-50個核苷酸、10-60個核苷酸、或甚至大于60個核苷酸。間隔物不應(yīng)具有與彼此或多核苷酸的序列互補(bǔ)的序列。在某些方面，多核苷酸間隔物的堿基全部是腺嘌呤，全部是胸腺嘧啶，全部是胞苷，全部是鳥嘌呤，全部是尿嘧啶或全部是一些其他經(jīng)修飾的堿基。在一些實(shí)施例中，間隔物不含核苷酸，并且在這樣的實(shí)施例中，間隔物長度等價于至少約5個核苷酸、至少約10個核苷酸、10-30個核苷酸、10-40個核苷酸、10-50個核苷酸、10-60個核苷酸、或甚至大于60個核苷酸。

經(jīng)修飾的多核苷酸

如上文討論的，經(jīng)修飾的多核苷酸考慮用于生產(chǎn)核-殼納米顆粒。在不同方面，本公開內(nèi)容的多核苷酸被完全修飾或部分修飾。因此，在不同方面，多核苷酸中的核苷酸單元的一個或多個或所有糖和/或一個或多個或所有核苷酸間連接由“非天然存在的”基團(tuán)替代。

在一個方面，本公開內(nèi)容考慮了肽核酸(PNA)的使用。在PNA化合物中，多核苷酸的糖主鏈被含酰胺的主鏈替代。參見例如美國專利號5,539,082；5,714,331；和5,719,262，以及Nielsen等人，Science,1991,254,1497-1500，所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

考慮用于所公開的多核苷酸的核苷酸和非天然核苷酸之間的其他連接包括在美國專利號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920；美國專利公開號20040219565；國際專利公開號WO 98/39352和WO 99/14226；Mesmaeker等人，Current Opinion in Structural Biology 5:343-355(1995)以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,Nucleic Acids Research,25:4429-4443(1997)中描述的那些，所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

多核苷酸的具體例子包括含有經(jīng)修飾的主鏈或非天然核苷間連接的那些。具有經(jīng)修飾的主鏈的多核苷酸包括在主鏈中保留磷原子的那些和在主鏈中不具有磷原子的那些。在其核苷間主鏈中不具有磷原子的經(jīng)修飾的多核苷酸視為在“多核苷酸”的含義內(nèi)。

含有磷原子的經(jīng)修飾的多核苷酸主鏈包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3'-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和具有正常3'-5'連接的硼烷磷酸酯、這些的2'-5'連接的類似物和具有反向極性的那些，其中一個或多個核苷酸間連接是3'至3'、5'至5'或2'至2'連接。還考慮的是具有反向極性的多核苷酸，其在最3'的核苷酸間連接處包含單一3'至3'連接，即可為無堿基(核苷酸缺失或在其位置中具有羥基)的單個反向核苷殘基。還考慮了鹽、混合鹽和游離酸形式。

教導(dǎo)上述含磷連接的制備的代表性美國專利包括美國專利號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

不包括磷原子的經(jīng)修飾的多核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接、或者一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接形成的主鏈。這些包括具有下述的那些：嗎啉代連接；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲?；?formacetyl)和硫代甲?；麈?；亞甲基甲?；土虼柞；麈?；核糖乙?；麈湥缓N的主鏈；氨基磺酸鹽主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸鹽和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；以及具有混合的N、O、S和CH₂組分部分的其他。在另外其他實(shí)施例中，提供具有硫代磷酸酯主鏈和具有雜原子主鏈的寡核苷的多核苷酸，并且包括美國專利號5,489,677和5,602,240中描述的—CH₂—NH—O—CH₂—、—CH₂—N(CH₃)—O—CH₂—、—CH₂—O—N(CH₃)—CH₂—、—CH₂—N(CH₃)—N(CH₃)—CH₂—和—O—N(CH₃)—CH₂—CH₂—。參見例如，美國專利號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。

在不同形式中，多核苷酸中的兩個相繼單體之間的連接由2至4個，期望為3個選自—CH2—、—O—、—S—、—NRH—、>C＝O、>C＝NRH、>C＝S、—Si(R")₂—、—SO—、—S(O)₂—、—P(O)₂—、—PO(BH₃)—、—P(O,S)—、—P(S)₂—、—PO(R")—、—PO(OCH₃)—和—PO(NHRH)—的基團(tuán)/原子組成，其中RH選自氫和C1-4-烷基，并且R"選自C1-6-烷基和苯基。這種連接的舉例說明性例子是—CH₂—CH₂—CH₂—、—CH₂—CO—CH₂—、—CH₂—CHOH—CH₂—、—O—CH₂—O—、—O—CH₂—CH₂—、—O—CH₂—CH＝(當(dāng)用作與相繼單體的連接時包括R₅)、—CH₂—CH₂—O—、—NRH—CH₂—CH₂—、—CH₂—CH₂—NRH—、—CH2—NRH—CH₂—-、—O—CH₂—CH₂—NRH—、—NRH—CO—O—、—NRH—CO—NRH—、—NRH—CS—NRH—、—NRH—C(＝NRH)—NRH—、—NRH—CO—CH₂—NRH—O—CO—O—、—O—CO—CH₂—O—、—O—CH₂—CO—O—、—CH₂—CO—NRH—、—O—CO—NRH—、—NRH—CO—CH₂—、—O—CH₂—CO—NRH—、—O—CH₂—CH₂—NRH—、—CH＝N—O—、—CH₂—NRH—O—、—CH₂—O—N＝(當(dāng)用作與相繼單體的連接時包括R₅)、—CH₂—O—NRH—、—CO—NRH—CH₂—、—CH₂—NRH—O—、—CH₂—NRH—CO—、—O—NRH—CH₂—、—O—NRH、—O—CH₂—S—、—S—CH₂—O—、—CH₂—CH₂—S—、—O—CH₂—CH₂—S—、—S—CH₂—CH＝(當(dāng)用作與相繼單體的連接時包括R₅)、—S—CH₂—CH₂—、—S—CH₂—CH₂—-O—、—S—CH₂—CH₂—S—、—CH₂—S—CH₂—、—CH₂—SO—CH₂—、—CH₂—SO₂—CH₂—、—O—SO—O—、—O—S(O)₂—O—、—O—S(O)₂—CH₂—、—O—S(O)₂—NRH—、—NRH—S(O)₂—CH₂—；—O—S(O)₂—CH₂—、—O—P(O)₂—O—、—O—P(O,S)—O—、—O—P(S)₂—O—、—S—P(O)₂—O—、—S—P(O,S)—O—、—S—P(S)₂—O—、—O—P(O)₂—S—、—O—P(O,S)—S—、—O—P(S)₂—S—、—S—P(O)₂—S—、—S—P(O,S)—S—、—S—P(S)₂—S—、—O—PO(R")—O—、—O—PO(OCH₃)—O—、—O—PO(O CH₂CH₃)—O—、—O—PO(O CH₂CH₂S—R)—O—、—O—PO(BH₃)—O—、—O—PO(NHRN)—O—、—O—P(O)₂—NRH H—、—NRH—P(O)₂—O—、—O—P(O,NRH)—O—、—CH₂—P(O)₂—O—、—O—P(O)₂—CH₂—和—O—Si(R")₂—O—；其中考慮了—CH₂—CO—NRH—、—CH₂—NRH—O—、—S—CH₂—O—、—O—P(O)₂—O—O—P(-O,S)—O—、—O—P(S)₂—O—、—NRH P(O)₂—O—、—O—P(O,NRH)—O—、—O—PO(R")—O—、—O—PO(CH₃)—O—和—O—PO(NHRN)—O—，其中RH選自氫和C_1-4-烷基，并且R"選自C_1-6-烷基和苯基。進(jìn)一步的舉例說明性例子在Mesmaeker等人，1995,Current Opinion in Structural Biology,5:343-355以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research，第25卷：第4429-4443頁中給出。

多核苷酸的另外其他修飾形式在美國專利公開號20040219565中詳細(xì)描述，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。

經(jīng)修飾的多核苷酸還可含有一個或多個取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2'位置處包含下述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。其他實(shí)施例包括O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON[(CH2)_nCH₃]₂，其中n和m為1至約10。其他多核苷酸在2'位置處包含下述之一：C1至C10低級烷基、取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報告基團(tuán)、嵌入劑、用于改善多核苷酸的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或用于改善多核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、以及具有類似性質(zhì)的其他取代基。在一個方面，修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，1995,Helv.Chim.Acta,78:486-504)，即烷氧基烷氧基。其他修飾包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基團(tuán)，也稱為2'-DMAOE，以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領(lǐng)域中也稱為2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O—CH₂—O—CH₂—N(CH₃)₂。

另外其他修飾包括2'-甲氧基(2'-O—CH₃)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂)、2'-烯丙基(2'-CH₂—CH＝CH₂)、2'-O-烯丙基(2'-O—CH₂—CH＝CH₂)和2'-氟(2'-F)。2'-修飾可在阿拉伯糖基(上)位或核糖(下)位中。在一個方面，2'-阿拉伯糖基修飾是2'-F。也可在多核苷酸上的其他位置，例如在3'末端核苷酸上或2'-5'連接的多核苷酸中的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置處進(jìn)行類似的修飾。多核苷酸也可具有糖模擬物，例如代替戊呋喃基糖的環(huán)丁基部分。參見例如，美國專利號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。

在一個方面，糖的修飾包括鎖核酸(LNA)，其中2'-羥基連接到糖環(huán)的3'或4'碳原子，由此形成雙環(huán)糖部分。在某些方面，連接是橋接2'氧原子和4'碳原子的亞甲基(—CH₂—)n基團(tuán)，其中n為1或2。LNA及其制備在WO 98/39352和WO 99/14226中描述，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

多核苷酸特征

提供的每個核-殼納米顆粒包含多個多核苷酸。因此，每個核-殼納米顆粒具有結(jié)合具有足夠互補(bǔ)序列的多個靶多核苷酸的能力。例如，如果特定的多核苷酸被靶向，則單個核-殼納米顆粒具有結(jié)合相同分子的多個拷貝的能力。在一個方面，提供了其中核-殼納米顆粒包含相同的多核苷酸，即每個多核苷酸具有相同的長度和相同的序列的方法。在其他方面，核-殼納米顆粒包含兩個或更多個不相同的多核苷酸，即，核-殼納米顆粒的至少一個多核苷酸不同于核-殼納米顆粒的至少一個其他多核苷酸，因?yàn)槠渚哂胁煌拈L度和/或不同的序列。在其中核-殼納米顆粒包含不同多核苷酸的方面，這些不同的多核苷酸結(jié)合相同的單個靶多核苷酸但在不同位置處，或結(jié)合編碼不同基因產(chǎn)物的不同靶多核苷酸。相應(yīng)地，在不同方面，單個核-殼納米顆?？捎糜谝种瞥^一種基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法中。多核苷酸因此用于靶向特異性多核苷酸，無論是在靶多核苷酸中的一個或多個特定區(qū)域處，還是在靶多核苷酸的整個長度上，因?yàn)樾枰蓪?shí)現(xiàn)所需水平的基因表達(dá)抑制。

相應(yīng)地，在一個方面，伴隨靶序列的了解設(shè)計多核苷酸。可替代地，核-殼納米顆粒中的多核苷酸無需與靶多核苷酸雜交，以便實(shí)現(xiàn)如本文所述的所需效應(yīng)。無論如何，制備具有預(yù)定序列的多核苷酸的方法是眾所周知的。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版1989)和F.Eckstein(編輯)Oligonucleotides and Analogues，第1版(Oxford University Press,New York,1991)?？紤]用于寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸的固相合成方法(合成DNA的眾所周知的方法也可用于合成RNA)。寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸也可酶促制備。

可替代地，多核苷酸選自文庫。這種類型的文庫的制備是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如，Oligonucleotide libraries：美國專利申請20050214782，于2005年9月29日公開。

在不同方面，考慮用于生產(chǎn)核-殼納米顆粒的多核苷酸包括調(diào)節(jié)從靶多核苷酸表達(dá)的基因產(chǎn)物表達(dá)的那些。相應(yīng)地，考慮了與靶多核苷酸雜交并抑制翻譯的反義多核苷酸，與靶多核苷酸雜交并啟動RNA酶活性(例如RNA酶H)的siRNA多核苷酸，與雙鏈多核苷酸雜交并抑制轉(zhuǎn)錄的三鏈體螺旋形成多核苷酸，以及與靶多核苷酸雜交并抑制翻譯的核酶。

在一些方面，核-殼納米顆粒允許核-殼納米顆粒的有效攝取。在不同方面，多核苷酸包含允許核-殼納米顆粒的攝取效率增加的核苷酸序列。如本文使用的，“效率”指核/殼納米顆粒在細(xì)胞中/被細(xì)胞攝取的數(shù)目或速率。因?yàn)檫M(jìn)入和離開細(xì)胞的核-殼納米顆粒的過程是動態(tài)過程，所以可通過攝取更多的核-殼納米顆?；蛲ㄟ^保留進(jìn)入細(xì)胞的那些核-殼納米顆粒較長時間段來增加效率。類似地，可通過攝取更少的核-殼納米顆?；蛲ㄟ^保留進(jìn)入細(xì)胞的那些核-殼納米顆粒較短時間段來減少效率。

因此，在不同方面，核苷酸序列可以是可選擇用于增加或減少核-殼納米顆?；蚧蛘{(diào)節(jié)的細(xì)胞攝取的需要的任何核苷酸序列。在一些方面，核苷酸序列包含影響核-殼納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率的均聚序列。相應(yīng)地，均聚序列增加或減少效率。還考慮在不同方面，核苷酸序列是核堿基的組合，使得它不嚴(yán)格地是均聚序列。例如且不限于，在不同方面，核苷酸序列包括交替的胸苷和尿苷殘基，兩個胸苷隨后為兩個尿苷或本公開內(nèi)容考慮影響增加的攝取的任何組合。在一些方面，影響攝取效率的核苷酸序列作為結(jié)構(gòu)域包括在包含另外序列的多核苷酸中。該“結(jié)構(gòu)域”將作用于充當(dāng)影響攝取效率的特征，而另外的核苷酸序列將作用于例如且不限于調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在不同方面，多核苷酸中的結(jié)構(gòu)域可在相對于核的近端、遠(yuǎn)端或中心位置。還考慮多核苷酸包含超過一個結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施例中，均聚序列增加核-殼納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率。在一些方面，均聚序列包含胸苷殘基(聚T)或尿苷殘基(聚U)的序列。在進(jìn)一步的方面，聚T或聚U序列包含兩個胸苷或尿苷。在不同方面，聚T或聚U序列包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500個或更多個胸苷或尿苷殘基。

在一些實(shí)施例中，考慮包含含有均聚序列的多核苷酸的核-殼納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率高于包含相同多核苷酸但缺少均聚序列的核-殼納米顆粒。在不同方面，包含含有均聚序列的多核苷酸的核-殼納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率是包含相同多核苷酸但缺少均聚序列的核-殼納米顆粒的約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約100倍高或更高。

在其他方面，結(jié)構(gòu)域是磷酸鹽聚合物(C3殘基)。在一些方面，結(jié)構(gòu)域包含由兩個磷酸鹽組成的磷酸鹽聚合物(C3殘基)。在不同方面，C3殘基包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500個或更多個磷酸鹽。

在一些實(shí)施例中，考慮包含含有結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的核-殼納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率低于包含相同多核苷酸但缺少結(jié)構(gòu)域的核-殼納米顆粒。在不同方面，包含含有結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的核-殼納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率是包含相同多核苷酸但缺少結(jié)構(gòu)域的核-殼納米顆粒的約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約100倍低或更低。

如本文使用的，“綴合位點(diǎn)”理解為意指造影劑附著至其的多核苷酸上的位點(diǎn)。在某些方面，本公開內(nèi)容還提供了其為不包含綴合位點(diǎn)的核-殼納米顆粒的部分的一個或多個多核苷酸，而其為相同核-殼納米顆粒的部分的一個或多個多核苷酸確實(shí)包含綴合位點(diǎn)。通過綴合位點(diǎn)將造影劑與核-殼納米顆粒綴合一般在PCT/US2010/44844中描述，所述專利以引用的方式全文并入本文。在一個方面，本公開內(nèi)容提供了包含多核苷酸的核-殼納米顆粒，其中所述多核苷酸包含一個至約十個綴合位點(diǎn)。在另一個方面，所述多核苷酸包含五個綴合位點(diǎn)。一般而言，對于核苷酸，其主鏈(磷酸基)和核堿基兩者均可被修飾。相應(yīng)地，本公開內(nèi)容考慮了存在2n個綴合位點(diǎn)，其中n＝多核苷酸模板的長度。在一些方面，核-殼納米顆粒的多個多核苷酸包含造影劑通過一個或多個綴合位點(diǎn)與其結(jié)合的至少一個多核苷酸，以及具有如本文所述的基因調(diào)節(jié)活性的至少一個多核苷酸。

多核苷酸拷貝-相同/不同序列

提供了核-殼納米顆粒，其包括其中單個多核苷酸中的單個序列或單個多核苷酸中單個序列的多個拷貝是核-殼納米顆粒的部分的那些。因此，在不同方面，考慮了具有串聯(lián)的單個序列的多個拷貝(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個串聯(lián)重復(fù))的多核苷酸。

可替代地，核-殼納米顆粒包括具有不同序列的至少兩個多核苷酸。如上，不同的多核苷酸序列在不同方面以串聯(lián)(即，在單個多核苷酸上)和/或以多個拷貝(即，在至少兩個多核苷酸上)排列。在其中具有不同序列的多核苷酸是核-殼納米顆粒的部分的方法中，本公開內(nèi)容的方面包括其中不同的多核苷酸序列與相同多核苷酸上的不同區(qū)域雜交的那些?？商娲兀煌亩嗪塑账嵝蛄信c不同的多核苷酸雜交。

另外的試劑

由本公開內(nèi)容提供的核-殼納米顆粒任選包括另外的試劑。在不同實(shí)施例中，另外的試劑簡單地與構(gòu)成核-殼納米顆粒的殼的多個多核苷酸中的一個或多個結(jié)合，和/或另外的試劑與核-殼納米顆粒的蛋白質(zhì)核結(jié)合?？紤]這種另外的試劑在一個方面與多個多核苷酸中的一個或多個共價結(jié)合，或者在替代方案中，與多個多核苷酸中的一個或多個非共價結(jié)合。然而，應(yīng)理解本公開內(nèi)容提供了核-殼納米顆粒，其中一種或多種另外的試劑與多個多核苷酸中的一個或多個共價和非共價結(jié)合。還理解非共價結(jié)合包括雜交(即，在多核苷酸之間)、蛋白質(zhì)結(jié)合(即，在可結(jié)合的蛋白質(zhì)之間或在蛋白質(zhì)和適體之間)和/或疏水性相互作用(即，在脂質(zhì)和包括足夠疏水的結(jié)構(gòu)域的其他試劑之間)。

由本公開內(nèi)容考慮的另外的試劑包括但不限于多核苷酸、肽、可檢測標(biāo)記物、磷脂、寡糖、金屬絡(luò)合物、小分子、造影劑、蛋白質(zhì)(例如治療試劑)、抗生素、靶向部分及其組合。本文討論了這些另外的試劑。

治療試劑

如本文使用的，“治療試劑”、“藥物”或“活性劑”意指可用于治療或診斷目的的任何化合物。如本文使用的術(shù)語應(yīng)理解為意指施用于患者用于治療狀況的任何化合物。就下文考慮的任何治療試劑是蛋白質(zhì)的程度，那些蛋白質(zhì)也被考慮用作核-殼納米顆粒的“單一蛋白質(zhì)”。

本公開內(nèi)容適用于需要關(guān)于其的遞送的任何治療試劑。這種活性劑以及疏水性藥物的非限制性例子在美國專利7,611,728中找到，所述專利以引用的方式全文并入本文?？紤]使用的另外的治療試劑在PCT/US2010/55018中找到，所述專利以引用的方式全文并入本文。

在不同實(shí)施例中，提供了本文公開的核-殼納米顆粒和方法，其中核-殼納米顆粒包含多種治療試劑。在一個方面，提供了組合物和方法，其中多種治療試劑經(jīng)由與殼中的一個或多個多核苷酸結(jié)合而特異性附著至一個核-殼納米顆粒。在另一個方面，多種治療試劑特異性附著至超過一個核-殼納米顆粒。

治療試劑包括但不限于親水性和疏水性化合物。

蛋白質(zhì)治療試劑包括但不限于肽、酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、受體和其他細(xì)胞或循環(huán)蛋白質(zhì)以及其片段和衍生物，其異常表達(dá)產(chǎn)生一種或多種病癥。作為一個具體實(shí)施例，治療試劑還包括化學(xué)治療劑。在不同實(shí)施例中，治療試劑還包括放射性材料。

在不同方面，蛋白質(zhì)治療試劑包括細(xì)胞因子或造血因子，包括但不限于IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-11，集落刺激因子-1(CSF-1)，M-CSF，SCF，GM-CSF，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，干擾素-α(IFN-α)，復(fù)合干擾素，IFN-β、IFN-γ，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，促血小板生成素(TPO)，血管生成素，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y，人血管生成素樣多肽，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，血管生成素，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-3，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-8，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-10，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-11，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-12，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-13，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-14，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IA，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子1，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2α，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2β，β內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，內(nèi)皮素1，表皮生長因子，上皮來源的嗜中性粒細(xì)胞引誘劑，成纖維細(xì)胞生長因子4，成纖維細(xì)胞生長因子5，成纖維細(xì)胞生長因子6，成纖維細(xì)胞生長因子7，成纖維細(xì)胞生長因子8，成纖維細(xì)胞生長因子8b，成纖維細(xì)胞生長因子8c，成纖維細(xì)胞生長因子9，成纖維細(xì)胞生長因子10，成纖維細(xì)胞生長因子酸性，成纖維細(xì)胞生長因子堿性，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α1，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α2，生長相關(guān)蛋白質(zhì)，生長相關(guān)蛋白質(zhì)α，生長相關(guān)蛋白質(zhì)β，生長相關(guān)蛋白質(zhì)γ，肝素結(jié)合表皮生長因子，肝細(xì)胞生長因子，肝細(xì)胞生長因子受體，胰島素樣生長因子I，胰島素樣生長因子受體，胰島素樣生長因子II，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白，角化細(xì)胞生長因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受體α，神經(jīng)生長因子，神經(jīng)生長因子受體，神經(jīng)營養(yǎng)因子3，神經(jīng)營養(yǎng)因子4，胎盤生長因子，胎盤生長因子2，血小板來源的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，血小板來源的生長因子，血小板來源的生長因子A鏈，血小板來源的生長因子AA，血小板來源的生長因子AB，血小板來源的生長因子B鏈，血小板來源的生長因子BB，血小板來源的生長因子受體α，血小板來源的生長因子受體β，前B細(xì)胞生長刺激因子，干細(xì)胞因子受體，TNF包括TNF0、TNF1、TNF2，轉(zhuǎn)化生長因子α，轉(zhuǎn)化生長因子β，轉(zhuǎn)化生長因子β1，轉(zhuǎn)化生長因子β1.2，轉(zhuǎn)化生長因子β2，轉(zhuǎn)化生長因子β3，轉(zhuǎn)化生長因子β5，潛伏性轉(zhuǎn)化生長因子β1，轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白I，轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白II，轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白III，腫瘤壞死因子受體I型，腫瘤壞死因子受體II型，尿激酶型纖溶酶原激活物受體，血管內(nèi)皮生長因子和嵌合蛋白質(zhì)及其生物學(xué)或免疫學(xué)活性片段。生物試劑的例子包括但不限于免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子，針對腫瘤抗原的單克隆抗體，腫瘤抑制基因和癌癥疫苗?？膳c本發(fā)明的組合物和方法結(jié)合使用的白細(xì)胞介素的例子包括但不限于白細(xì)胞介素2(IL-2)和白細(xì)胞介素4(IL-4)，白細(xì)胞介素12(IL-22)。除了細(xì)胞因子之外的其他免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于卡介苗、左旋咪唑和奧曲肽。

如由本公開內(nèi)容描述的，在一些方面，治療試劑包括小分子。如本文使用的，術(shù)語“小分子”指化學(xué)化合物，例如可任選衍生的擬肽，或者天然或合成的任何其他低分子量有機(jī)化合物。這種小分子可以是治療上可遞送的物質(zhì)或可進(jìn)一步衍生化以促進(jìn)遞送。

“低分子量”意指具有小于1000道爾頓，通常在300和700道爾頓之間的分子量的化合物。在不同方面，低分子量化合物為約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約1000道爾頓。

術(shù)語“藥物樣分子”是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括具有使得其適用于醫(yī)學(xué)中的特征的化合物的含義，例如且不限于作為藥劑中的活性劑。因此，例如且不限于，藥物樣分子是通過有機(jī)化學(xué)技術(shù)或通過分子生物學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)合成的分子，并且在一些方面是如本文定義的小分子。藥物樣分子在不同方面還顯示出與一種或多種特定蛋白質(zhì)選擇性相互作用的特征，并且是生物可利用的和/或能夠單獨(dú)或與本公開內(nèi)容的組合物或方法組合穿透細(xì)胞膜。

在不同實(shí)施例中，美國專利7,667,004(以引用的方式全文并入本文)中描述的治療試劑考慮用于本文公開的組合物和方法中，并且包括但不限于烷基化劑、抗生素試劑、抗代謝劑、激素試劑、植物衍生試劑和生物試劑。

烷基化劑的例子包括但不限于雙氯乙胺(氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、美法侖、尿嘧啶氮芥)、氮丙啶(例如噻替派)、烷基酮磺酸鹽(例如白消安)、亞硝基脲(例如卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星)、非經(jīng)典烷基化劑(六甲蜜胺、達(dá)卡巴嗪和丙卡巴肼)、鉑化合物(例如卡鉑、順鉑和鉑(IV)(Pt(IV)))

抗生素試劑的例子包括但不限于蒽環(huán)(例如多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和蒽二酮)、絲裂霉素C、博來霉素、更生霉素、普卡霉素(plicatomycin)。另外的抗生素試劑在下文詳細(xì)討論。

抗代謝劑的例子包括但不限于氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤、亞葉酸、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、巰嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、噴司他丁、磷酸氟達(dá)拉濱、克拉屈濱(2-CDA)、天冬酰胺酶、甲磺酸伊馬替尼(或)和吉西他濱。

激素試劑的例子包括但不限于合成雌激素(例如二乙基己烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬、托瑞米芬、氟甲睪酮(fluoxymesterol)和雷洛昔芬)、抗雄激素(比卡魯胺、尼魯米特、氟他胺)、芳香酶抑制劑(例如氨魯米特、阿那曲唑和四唑)、酮康唑、乙酸戈舍瑞林、亮丙瑞林、乙酸甲地孕酮和米非司酮。

植物衍生試劑的例子包括但不限于長春花生物堿(例如長春新堿、長春花堿、長春地辛、長春利定和長春瑞濱)、鬼臼毒素(例如依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26))、喜樹堿化合物(例如20(S)喜樹堿、拓?fù)涮婵?、盧比替康和伊立替康)、紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)。

考慮使用的化學(xué)治療劑包括但不限于烷基化劑，包括：氮芥，例如氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖和苯丁酸氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU)；乙烯亞胺/甲基三聚氰胺，例如三乙烯蜜胺(TEM)、三乙烯、硫代磷酰胺(噻替派)、六甲基三聚氰胺(HMM，六甲蜜胺)；烷基磺酸鹽，例如白消安；三嗪，例如達(dá)卡巴嗪(DTIC)；抗代謝藥包括葉酸類似物，例如氨甲蝶呤和三甲曲沙，嘧啶類似物，例如5-氟尿嘧啶、氟脫氧尿苷、吉西他濱、胞嘧啶阿糖核苷(AraC、阿糖胞苷)、5-氮雜胞苷、2,2'-二氟脫氧胞苷，嘌呤類似物，例如6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤、2’-脫氧助間型霉素(噴司他丁)、赤型羥基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟達(dá)拉濱和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱、2-CdA)；天然產(chǎn)物，包括抗有絲分裂藥物例如紫杉醇，長春花生物堿包括長春堿(VLB)、長春新堿和長春瑞濱，泰索帝，雌莫司汀和磷酸雌莫司?。槐砉砭识舅?，例如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素例如放線菌素D、道諾霉素(紅霉素)、多柔比星、米托蒽醌、伊達(dá)比星、博萊霉素、普卡霉素(光神霉素)、絲裂霉素C和放線菌素；酶例如L-天冬酰胺酶；生物應(yīng)答修飾劑，例如干擾素-α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；混雜試劑包括鉑配位絡(luò)合物例如順鉑、Pt(IV)和卡鉑，蒽二酮例如米托蒽醌，取代的脲例如羥基脲，甲基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼，腎上腺皮質(zhì)抑制劑例如米托坦(o,p′-DDD)和氨魯米特；激素和拮抗劑，包括腎上腺皮質(zhì)類固醇拮抗劑，例如潑尼松和等價物、地塞米松和氨魯米特；孕激素例如己酸羥孕酮、乙酸甲羥孕酮和乙酸甲地孕酮；雌激素例如己烯雌酚和炔雌醇等價物；抗雌激素例如他莫昔芬；雄激素包括丙酸睪酮和氟甲睪酮/等價物；抗雄激素例如氟他胺、促性腺素釋放激素類似物和亮丙瑞林；以及非甾體抗雄激素例如氟他胺。

標(biāo)記物/標(biāo)記

在不同方面，如本文所述的蛋白質(zhì)、多核苷酸或另外的試劑任選包含可檢測標(biāo)記物。相應(yīng)地，本公開內(nèi)容提供了其中通過可檢測的變化檢測復(fù)合物形成的組合物和方法。在一個方面，復(fù)合物形成產(chǎn)生用肉眼或光譜觀察到的變色。

用于顯現(xiàn)起因于生物分子復(fù)合物形成的可檢測變化的方法還包括任何熒光檢測方法，包括但不限于熒光顯微鏡檢查、微量滴定板讀數(shù)器或熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。

應(yīng)理解由本公開內(nèi)容考慮的標(biāo)記包括本文所述的熒光團(tuán)中的任何以及本領(lǐng)域已知的其他可檢測標(biāo)記。例如，標(biāo)記還包括但不限于氧化還原活性探針、化學(xué)發(fā)光分子、放射性標(biāo)記、染料、熒光分子、磷光分子、如下所述的顯像劑和/或造影劑、量子點(diǎn)、以及可使用光譜手段檢測的任何標(biāo)記物，即，使用顯微鏡檢查和細(xì)胞計數(shù)法可檢測的那些標(biāo)記物。在其中要檢測可檢測標(biāo)記的本公開內(nèi)容的方面，本公開內(nèi)容提供了任何發(fā)光、熒光或磷光分子或顆?？赏ㄟ^貴金屬表面有效地淬滅。相應(yīng)地，每種類型的分子考慮用于所公開的組合物和方法中。

用熒光分子標(biāo)記生物分子和測量熒光的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。

合適的熒光分子也是本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于1,8-ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸)、1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)、5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯熒光素pH 9.0、5-FAM pH 9.0、5-ROX(5-羧基-X-羅丹明、三乙基銨鹽)、5-ROX pH 7.0、5-TAMRA、5-TAMRA pH 7.0、5-TAMRA-MeOH、6JOE、6,8-二氟-7-羥基-4-甲基香豆素pH 9.0、6-羧基羅丹明6G pH 7.0、6-羧基羅丹明6G、鹽酸鹽、6-HEX、SE pH 9.0、6-TET、SE pH 9.0、7-氨基-4-甲基香豆素pH 7.0、7-羥基-4-甲基香豆素、7-羥基-4-甲基香豆素pH 9.0、Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 647、Alexa 660、Alexa 680、Alexa 700、Alexa Fluor 430抗體綴合物pH 7.2、Alexa Fluor 488抗體綴合物pH 8.0、Alexa Fluor 488酰肼-水、Alexa Fluor 532抗體綴合物pH 7.2、Alexa Fluor 555抗體綴合物pH 7.2、Alexa Fluor 568抗體綴合物pH 7.2、Alexa Fluor 610R-藻紅蛋白鏈霉親和素pH 7.2、Alexa Fluor 647抗體綴合物pH 7.2、Alexa Fluor 647R-藻紅蛋白鏈霉親和素pH 7.2、Alexa Fluor 660抗體綴合物pH 7.2、Alexa Fluor 680抗體綴合物pH 7.2、Alexa Fluor 700抗體綴合物pH 7.2、別藻藍(lán)蛋白pH 7.5、AMCA綴合物、氨基香豆素、APC(別藻藍(lán)蛋白)、Atto 647、BCECF pH 5.5、BCECF pH 9.0、BFP(藍(lán)色熒光蛋白)、BO-PRO-1-DNA、BO-PRO-3-DNA、BOBO-1-DNA、BOBO-3-DNA、BODIPY 650/665-X、MeOH、BODIPY FL綴合物、BODIPY FL、MeOH、Bodipy R6G SE、BODIPY R6G、MeOH、BODIPY TMR-X抗體綴合物pH 7.2、Bodipy TMR-X綴合物、BODIPY TMR-X、MeOH、BODIPY TMR-X、SE、BODIPY TR-X類鬼筆毒環(huán)肽(phallacidin)pH 7.0、BODIPY TR-X、MeOH、BODIPY TR-X、SE、BOPRO-1、BOPRO-3、鈣黃綠素、鈣黃綠素pH 9.0、Calcium Crimson、Calcium Crimson Ca2+、Calcium Green、Calcium Green-1Ca2+、Calcium Orange、Calcium Orange Ca2+、羧基萘并熒光素pH 10.0、級聯(lián)藍(lán)、級聯(lián)藍(lán)BSA pH 7.0、級聯(lián)黃、級聯(lián)黃抗體綴合物pH 8.0、CFDA、CFP(青色熒光蛋白)、CI-NERF pH 2.5、CI-NERF pH 6.0、檸檬素、香豆素、Cy 2、Cy 3、Cy 3.5、Cy 5、Cy 5.5、CyQUANT GR-DNA、丹磺酰尸胺、丹磺酰尸胺、MeOH、DAPI、DAPI-DNA、Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺、DDAO pH 9.0、Di-8ANEPPS、Di-8-ANEPPS-脂質(zhì)、DiI、DiO、DM-NERF pH 4.0、DM-NERF pH 7.0、DsRed、DTAF、dTomato、eCFP(增強(qiáng)型青色熒光蛋白)、eGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)、曙紅、曙紅抗體綴合物pH 8.0、赤蘚紅-5-異硫氰酸酯pH 9.0、溴化乙錠、乙錠同二聚體、乙錠同二聚體-1-DNA、eYFP(增強(qiáng)型黃色熒光蛋白)、FDA、FITC、FITC抗體綴合物pH 8.0、FlAsH、Fluo-3、Fluo-3Ca2+、Fluo-4、Fluor-Ruby、熒光素、熒光素0.1M NaOH、熒光素抗體綴合物pH 8.0、熒光素葡聚糖pH 8.0、熒光素pH 9.0、Fluoro-Emerald、FM 1-43、FM 1-43脂質(zhì)、FM 4-64、FM 4-64、2％CHAPS、Fura Red Ca2+、Fura Red、高Ca、Fura Red、低Ca、Fura-2Ca2+、Fura-2、高Ca、Fura-2、無Ca、GFP(S65T)、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33258-DNA、Hoechst 33342、Indo-1Ca2+、Indo-1、無Ca、Indo-1、Ca飽和的、JC-1、JC-1pH 8.2、麗絲胺羅丹明、LOLO-1-DNA、熒光黃、CH、LysoSensor Blue、LysoSensor Blue pH 5.0、LysoSensor Green、LysoSensor Green pH 5.0、LysoSensor Yellow pH 3.0、LysoSensor Yellow pH 9.0、LysoTracker Blue、LysoTracker Green、LysoTracker Red、鎂綠色、鎂綠色Mg2+、鎂橙色、藏青色、mBanana、mCherry、mHoneydew、MitoTracker Green、MitoTracker Green FM、MeOH、MitoTracker Orange、MitoTracker Orange、MeOH、MitoTracker Red、MitoTracker Red、MeOH、mOrange、mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD-X、NBD-X、MeOH、NeuroTrace 500/525、綠色熒光Nissl染色RNA、尼羅藍(lán)、EtOH、尼羅紅、尼羅紅-脂質(zhì)、Nissl、Oregon Green 488、Oregon Green 488抗體綴合物pH 8.0、Oregon Green 514、Oregon Green 514抗體綴合物pH 8.0、Pacific Blue、Pacific Blue抗體綴合物pH 8.0、藻紅蛋白、PicoGreen dsDNA定量試劑、PO-PRO-1、PO-PRO-1-DNA、PO-PRO-3、PO-PRO-3-DNA、POPO-1、POPO-1-DNA、POPO-3、碘化丙啶、碘化丙啶-DNA、R-藻紅蛋白pH 7.5、ReAsH、試鹵靈、試鹵靈pH 9.0、Rhod-2、Rhod-2Ca2+、羅丹明、羅丹明110、羅丹明110pH 7.0、羅丹明123、MeOH、羅丹明綠、羅丹明鬼筆環(huán)肽pH 7.0、羅丹明紅-X-抗體綴合物pH 8.0、羅丹明綠pH 7.0、Rhodol Green抗體綴合物pH 8.0、Sapphire、SBFI-Na+、Sodium Green Na+、磺基羅丹明101、EtOH、SYBR Green I、SYPRO Ruby、SYTO 13-DNA、SYTO 45-DNA、SYTOX Blue-DNA、四甲基羅丹明抗體綴合物pH 8.0、四甲基羅丹明葡聚糖pH 7.0、德克薩斯紅-X抗體綴合物pH 7.2、TO-PRO-1-DNA、TO-PRO-3-DNA、TOTO-1-DNA、TOTO-3-DNA、TRITC、X-Rhod-1Ca2+、YO-PRO-1-DNA、YO-PRO-3-DNA、YOYO-1-DNA和YOYO-3-DNA。

在一些方面，本公開內(nèi)容還考慮使用熒光蛋白。本領(lǐng)域已知的任何可檢測蛋白質(zhì)可用于本公開內(nèi)容的方法，并且在一些方面，是熒光蛋白，包括但不限于EGFP、ECFP和EYFP。

造影劑

在不同方面，本文公開的是包含核-殼納米顆粒的方法和材料，其中多核苷酸通過綴合位點(diǎn)與造影劑綴合。在進(jìn)一步的方面，造影劑與如本文所述的蛋白質(zhì)或另外的試劑綴合。如本文使用的，“造影劑”是引入細(xì)胞內(nèi)以便產(chǎn)生不同器官和組織的表觀密度差異的化合物或其他物質(zhì)，使得更容易看到描繪的相鄰身體組織和器官。

在一些實(shí)施例中，造影劑選自釓、氙、氧化鐵、錳螯合物(Mn-DPDP)和銅。因此，在一些實(shí)施例中，造影劑是順磁性化合物，并且在一些方面，順磁性化合物是釓。

在某些實(shí)施例中，造影劑包括包含選自¹¹C、¹³N、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁸Ge、^99mTc和⁸²Ru的標(biāo)記的正電子發(fā)射斷層掃描(PET)造影劑。在特定實(shí)施例中，造影劑是選自[¹¹C]膽堿、[¹⁸F]氟脫氧葡萄糖(FDG)、[¹¹C]甲硫氨酸、[¹¹C]膽堿、[¹¹C]乙酸鹽、[¹⁸F]氟膽堿、⁶⁴Cu螯合物、^99mTc螯合物和[¹⁸F]聚乙二醇茋的PET造影劑。

本公開內(nèi)容還提供了其中將PET造影劑在多核苷酸合成過程期間引入多核苷酸內(nèi)或在多核苷酸合成后與核苷酸綴合的方法。例如且不限于，可合成核苷酸，其中磷原子之一被³²P或³³P替代，磷酸基中的氧原子之一被³⁵S替代，或者氫原子中的一個或多個被³H替代。含有放射性核素的官能團(tuán)也可通過綴合位點(diǎn)與核苷酸綴合。

MRI造影劑可包括但不限于陽性造影劑和/或陰性造影劑。陽性造影劑引起T₁弛豫時間中的降低(T₁加權(quán)圖像上增加的信號強(qiáng)度)。它們(在MRI上看起來明亮)通常是含有釓、錳或鐵作為其活性元素的小分子量化合物。一組特殊的陰性造影劑(在MRI上看起來很暗)包括全氟化碳(全氟化合物)，因?yàn)樗鼈兊拇嬖谂懦贛R成像中負(fù)責(zé)信號的氫原子。

在不同方面，本公開內(nèi)容的組合物預(yù)期包括包含約50至約2.5X10⁶造影劑的核-殼納米顆粒。在一些實(shí)施例中，核-殼納米顆粒包含約500至約1X10⁶造影劑。

靶向部分

如本文使用的，術(shù)語“靶向部分”指任何分子結(jié)構(gòu)，其幫助化合物或其他分子結(jié)合或以其他方式定位于特定靶、靶區(qū)域、進(jìn)入靶細(xì)胞或結(jié)合靶受體。例如且不限于，靶向部分可包括蛋白質(zhì)，包括能夠在體內(nèi)或體外結(jié)合所需靶位點(diǎn)的抗體和蛋白質(zhì)片段、肽、小分子、抗癌劑、多核苷酸結(jié)合劑、碳水化合物、用于細(xì)胞表面受體的配體、適體、脂質(zhì)(包括陽離子、中性和甾體脂質(zhì)、病毒體和脂質(zhì)體)、抗體、凝集素、配體、糖、甾體、激素和營養(yǎng)物，可充當(dāng)靶向部分。靶向部分可用于將核-殼納米顆粒遞送至特定細(xì)胞類型和/或器官以及亞細(xì)胞位置。

在一些實(shí)施例中，靶向部分是蛋白質(zhì)。在一些方面，本公開內(nèi)容的組合物的蛋白質(zhì)部分是能夠?qū)⒑?殼納米顆粒靶向至靶細(xì)胞的蛋白質(zhì)。本公開內(nèi)容的靶向蛋白質(zhì)可結(jié)合受體、底物、抗原決定簇或靶細(xì)胞上的其他結(jié)合位點(diǎn)或其他靶位點(diǎn)。

可用作靶向蛋白質(zhì)的抗體可以是多克隆或單克隆的。已開發(fā)了結(jié)合特定類型細(xì)胞的許多單克隆抗體(MAb)。也可使用通過基因工程或蛋白質(zhì)工程衍生的抗體。

在本公開內(nèi)容中用作靶向試劑的抗體可以是完整分子、其片段或其功能等價物?？捎糜诒竟_內(nèi)容的組合物中的抗體片段的例子是F(ab')₂、Fab'Fab和Fv片段，其可通過常規(guī)方法或者通過基因或蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生。

在一些實(shí)施例中，核-殼納米顆粒的多核苷酸部分可充當(dāng)另外的或輔助的靶向部分。可選擇或設(shè)計多核苷酸部分以幫助細(xì)胞外靶向，或充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)靶向部分。即，多核苷酸部分可充當(dāng)尋找靶細(xì)胞的DNA探針。在一些實(shí)施例中，該另外的靶向能力將作用于改善組合物遞送至靶細(xì)胞的特異性。多核苷酸可另外或可替代地被選擇或設(shè)計為將組合物靶向在靶細(xì)胞內(nèi)，而靶向蛋白質(zhì)細(xì)胞外地靶向綴合物。

在不同實(shí)施例中，考慮靶向部分可與核-殼納米顆粒結(jié)合。因此，在一些方面，考慮靶向部分附著至核-殼顆粒的蛋白質(zhì)、核-殼納米顆粒的多核苷酸或兩者。

磷脂

還由本公開內(nèi)容考慮的是包含磷脂的核-殼納米顆粒。在某些方面，磷脂生物分子包括任選的間隔物組分。

脂質(zhì)和磷脂衍生的激素由本公開內(nèi)容加以考慮，并且這些化合物來源于脂質(zhì)，例如亞油酸和花生四烯酸和磷脂。主要類別是來源于膽固醇和類二十烷酸的甾體激素。

金屬絡(luò)合物

如本文使用的，“金屬絡(luò)合物”指金屬，并且包括但不限于如本文所述的鉑化合物、鍺(IV)、鈦(IV)、錫(IV)、釕(III)、金(III)和銅(II)。金屬絡(luò)合物任選包括如本文所述的間隔物。

寡糖

寡糖包括包含通過α或β糖苷鍵連接的約二至約十個單糖或更多個單糖的任何碳水化合物。寡糖在自然界中以游離和結(jié)合形式兩者發(fā)現(xiàn)。寡糖任選包括如上文所述的間隔物。

無機(jī)納米顆粒

本公開內(nèi)容考慮了包含金屬納米顆粒的組合物。因此，考慮了納米顆粒，其包含各種無機(jī)材料，包括但不限于如美國專利申請?zhí)?0030147966中所述的金屬、半導(dǎo)體材料或陶瓷。例如，基于金屬的納米顆粒包括本文所述的那些。陶瓷納米顆粒材料包括但不限于透鈣磷石、磷酸三鈣、氧化鋁、二氧化硅和氧化鋯。納米顆粒由其生產(chǎn)的有機(jī)材料包括碳。納米顆粒聚合物包括聚苯乙烯、硅橡膠、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚酯、聚醚和聚乙烯。還考慮了可生物降解的生物聚合物(例如多肽如BSA、多糖等)、其他生物材料(例如碳水化合物)和/或聚合物化合物用于生產(chǎn)納米顆粒。

在一些實(shí)施例中，納米顆粒是金屬的，并且在不同方面，納米顆粒是膠體金屬。因此，在不同實(shí)施例中，可用于實(shí)踐方法的納米顆粒包括金屬(包括例如且不限于金、銀、鉑、鋁、鈀、銅、鈷、鐵、銦、鎳或順應(yīng)納米顆粒形成的任何其他金屬)、半導(dǎo)體(包括例如且不限于CdSe、CdS和涂覆有ZnS的CdS或CdSe)和磁性(例如，鐵磁體)膠體材料?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)踐的其他納米顆粒包括但不限于ZnS、ZnO、Ti、TiO2、Sn、SnO2、Si、SiO2、Fe、Fe+4、Fe3O4、Fe2O3、Ag、Cu、Ni、Al、鋼、鈷鉻合金、Cd、鈦合金、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs。制備ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs納米顆粒的方法也是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Weller,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,32,41(1993)；Henglein,Top.Curr.Chem.,143,113(1988)；Henglein,Chem.Rev.,89,1861(1989)；Brus,Appl.Phys.A.,53,465(1991)；Bahncmann,在Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy(編輯Pelizetti and Schiavello 1991)中，第251頁；Wang和Herron,J.Phys.Chem.,95,525(1991)；Olshavsky等人，J.Am.Chem.Soc.,112,9438(1990)；Ushida等人，J.Phys.Chem.,95,5382(1992)。

制造金屬、半導(dǎo)體和磁性納米顆粒的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如Schmid,G.(編輯)Clusters and Colloids(VCH,Weinheim,1994)；Hayat,M.A.(編輯)Colloidal Gold:Principles,Methods,and Applications(Academic Press,San Diego,1991)；Massart,R.,IEEE Transactions On Magnetics,17,1247(1981)；Ahmadi,T.S.等人，Science,272,1924(1996)；Henglein,A.等人，J.Phys.Chem.,99,14129(1995)；Curtis,A.C.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,27,1530(1988)。制備的聚氰基丙烯酸烷基酯納米顆粒的制備在Fattal等人，J.Controlled Release(1998)53:137-143和美國專利號4,489,055中描述。用于制備包含聚(D-葡糖酰胺基胺(glucaramidoamine))的納米顆粒的方法在Liu等人，J.Am.Chem.Soc.(2004)126:7422-7423中描述。包含聚合的甲基丙烯酸甲酯(MMA)的納米顆粒的制備在Tondelli等人，Nucl.Acids Res.(1998)26:5425-5431中描述，并且樹枝狀聚合物納米顆粒的制備在例如Kukowska-Latallo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:4897-4902(Starburst聚酰胺胺樹枝狀聚合物)中描述。

還如美國專利申請?zhí)?0030147966中所述，包含本文所述材料的納米顆?？蓮睦鏣ed Pella,Inc.(金)、Amersham Corporation(金)和Nanoprobes,Inc.(金)商購可得，或者它們可由溶液中的逐漸成核(例如通過膠體反應(yīng))或者通過不同的物理和化學(xué)氣相沉積過程(例如濺射沉積)產(chǎn)生。參見例如，HaVashi,(1987)Vac.Sci.Technol.July/August 1987,A5(4):1375-84；Hayashi,(1987)Physics Today,December 1987，第44-60頁；MRS Bulletin,January 1990，第16-47頁。

如美國專利申請?zhí)?0030147966中進(jìn)一步描述的，使用本領(lǐng)域已知的方法，使用HAuCl4和檸檬酸鹽還原劑產(chǎn)生考慮的納米顆粒。參見例如Marinakos等人，(1999)Adv.Mater.11:34-37；Marinakos等人，(1998)Chem.Mater.10:1214-19；Enustun&Turkevich,(1963)J.Am.Chem.Soc.85:3317。具有約140nm的分散聚集體粒徑的氧化錫納米顆粒從日本Chiba的Vacuum Metallurgical Co.,Ltd.商購可得。其他商購可得的具有不同組成和尺寸范圍的納米顆?？衫绲米约又軧urlingame的Vector Laboratories,Inc.。

在不同方面，提供的組合物和方法包括利用納米顆粒的那些，所述納米顆粒尺寸范圍為平均直徑約1nm至約250nm、平均直徑約1nm至約240nm、平均直徑約1nm至約230nm、平均直徑約1nm至約220nm、平均直徑約1nm至約210nm、平均直徑約1nm至約200nm、平均直徑約1nm至約190nm、平均直徑約1nm至約180nm、平均直徑約1nm至約170nm、平均直徑約1nm至約160nm、平均直徑約1nm至約150nm、平均直徑約1nm至約140nm直徑、平均直徑約1nm至約130nm、平均直徑約1nm至約120nm、平均直徑約1nm至約110nm、平均直徑約1nm至約100nm、平均直徑約1nm至約90nm、平均直徑約1nm至約80nm、平均直徑約1nm至約70nm、平均直徑約1nm至約60nm、平均直徑約1nm至約50nm、平均直徑約1nm至約40nm、平均直徑約1mm至約30nm、或平均直徑約1nm至約20nm、平均直徑約1nm至約10nm。在其他方面，納米顆粒的尺寸為約5nm至約150nm(平均直徑)、約5至約50nm、約10至約30nm。納米顆粒的尺寸為約5nm至約150nm(平均直徑)、約30至約100nm、約40至約80nm。在方法中使用的納米顆粒的尺寸根據(jù)其特定用途或應(yīng)用的需要而變。尺寸的變化有利地用于最佳化納米顆粒的某些物理特征，例如可如本文所述衍生化的光學(xué)性質(zhì)或表面積的量。

核-殼納米顆粒合成

多核苷酸可在末端用炔部分進(jìn)行修飾，例如用于與蛋白質(zhì)表面的疊氮化物反應(yīng)的DBCO型部分：其中L是與多核苷酸末端的接頭。L²可以是C_1-10亞烷基、–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–和–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–C_1-10亞烷基–(OCH₂CH₂)_m–Y–；其中每個Y獨(dú)立地選自鍵、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；并且m為0、1、2、3、4或5。例如，DBCO官能團(tuán)可經(jīng)由具有的結(jié)構(gòu)的接頭附著，其中末端“O”來自多核苷酸上的末端核苷酸。在其中表面胺被修飾的情況下，使用這種DBCO型部分導(dǎo)致多核苷酸和蛋白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)為：其中L和L²各自獨(dú)立地選自C_1-10亞烷基、–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–和–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–C_1-10亞烷基–(OCH₂CH₂)_m–Y–；每個Y獨(dú)立地選自鍵、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；m為0、1、2、3、4或5；并且PN是多核苷酸。其中修飾蛋白質(zhì)的表面硫醇或表面羧酸酯的類似結(jié)構(gòu)可以類似的方式進(jìn)行制備，以導(dǎo)致可比較的連接結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)可用以疊氮化物官能團(tuán)終止的接頭在表面官能團(tuán)(例如，表面胺、表面羧酸酯、表面硫醇)處進(jìn)行修飾：蛋白質(zhì)-X-L-N₃，X來自蛋白質(zhì)上的表面氨基(例如-NH-)、羧基(例如-C(O)-或–C(O)O-)或硫醇基(例如-S-)；L選自C_1-10亞烷基、–Y-C(O)–C_1-10亞烷基–Y–和–Y-C(O)–C_1-10亞烷基–Y–C_1-10亞烷基–(OCH₂CH₂)_m–Y–；每個Y獨(dú)立地選自鍵、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；并且m為0、1、2、3、4或5。可使用眾所周知的技術(shù)將“L-N₃”官能團(tuán)引入蛋白質(zhì)的表面部分。例如，蛋白質(zhì)的表面胺可與具有末端N₃的接頭的活化酯反應(yīng)，以在蛋白質(zhì)的胺和接頭試劑的活化酯的羧酸酯之間形成酰胺鍵。

可修飾多核苷酸以在多核苷酸的末端包括炔官能團(tuán)：多核苷酸-L₂-X-≡-R；L²選自C_1-10亞烷基、–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–和–C(O)–C_1-10亞烷基–Y–C_1-10亞烷基–(OCH₂CH₂)_m–Y–；每個Y獨(dú)立地選自鍵、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；m為0、1、2、3、4或5；和X是鍵，并且R是H或C_1-10烷基；或者X和R連同它們與之附著的碳一起形成8-10元碳環(huán)或8-10元雜環(huán)基。在一些情況下，多核苷酸具有結(jié)構(gòu)

具有表面修飾的疊氮化物的蛋白質(zhì)和具有修飾為包括炔的末端的多核苷酸可在銅(II)鹽和還原劑的存在下一起反應(yīng)形成三唑環(huán)，以原位生成銅(I)鹽。在一些情況下，直接加入銅(I)鹽?？紤]的還原劑包括抗壞血酸、抗壞血酸鹽、硼氫化鈉、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、肼、氫化鋁鋰、氫化二異丁基鋁、草酸、Lindlar催化劑、亞硫酸鹽化合物、亞錫化合物、亞鐵化合物、鈉汞齊、三(2-羧乙基)膦、氫醌及其混合物。

蛋白質(zhì)的表面官能團(tuán)可使用其他附著化學(xué)附著至多核苷酸。例如，表面胺可與多核苷酸的末端處的羧酸酯或活化酯定向綴合，以形成酰胺鍵。表面羧酸酯可與多核苷酸的末端上的胺綴合，以形成酰胺鍵。可替代地，表面羧酸酯可與二胺反應(yīng)，以在表面羧酸酯處形成酰胺鍵，并且在另一個末端處形成胺。隨后可以類似于蛋白質(zhì)的表面胺的方式修飾該末端胺。表面硫醇可與多核苷酸上的硫醇部分綴合，以形成二硫鍵?？商娲?，硫醇可與多核苷酸的末端上的活化酯綴合，以形成硫代羧酸酯。

藥物組合物

應(yīng)了解本文所述的組合物中任何均可以治療有效量施用于哺乳動物，以實(shí)現(xiàn)所需的療效。

如本文使用的，術(shù)語“治療有效量”指足以治療、改善或預(yù)防所鑒定的疾病或狀況，或者顯示出可檢測的治療、預(yù)防或抑制效應(yīng)的組合物的量?？赏ㄟ^例如臨床狀況的改善、癥狀的減輕或通過本文所述的測定來檢測所述效應(yīng)。受試者的精確有效量將取決于受試者的體重、大小和健康；狀況的性質(zhì)和程度；以及選擇用于施用的組合物或組合物的組合。對于給定情況的治療有效量可通過在臨床醫(yī)師的技術(shù)和判斷內(nèi)的例行實(shí)驗(yàn)來確定。本文所述的組合物可與藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑一起在藥物組合物中配制?；衔锘蚪M合物可通過允許治療疾病、狀況或感染的任何途徑施用。優(yōu)選的施用途徑是經(jīng)口施用。

多個核-殼顆粒的組合物

本文進(jìn)一步公開的是包含多個核-殼顆粒的組合物。在一些情況下，一個核-殼顆粒的至少一個多核苷酸和第二核-殼顆粒的至少一個多核苷酸是充分互補(bǔ)的，以雜交形成超晶格結(jié)構(gòu)。在不同情況下，一個核-殼顆粒的核的蛋白質(zhì)不同于第二核-殼顆粒的核的蛋白質(zhì)。在其他情況下，多個的所有核-殼顆粒的核的蛋白質(zhì)是相同的。

在不同情況下，組合物的核-殼顆?？煞枪矁r相互作用(例如經(jīng)由殼的互補(bǔ)多核苷酸的雜交)或共價相互作用(例如經(jīng)由多核苷酸的相容的反應(yīng)性功能部分之間的直接鍵形成)，以形成超晶格結(jié)構(gòu)。在其他情況下，多個核-殼納米顆粒并不共價或非共價相互作用，而是僅在相同的組合物內(nèi)。

在不同情況下，一個核-殼顆?？砂糜诨瘜W(xué)反應(yīng)的酶，并且第二核-殼顆?？砂糜诘诙瘜W(xué)反應(yīng)的第二酶。在進(jìn)一步的情況下，一個或多個另外的核-殼顆粒包含另外的酶，所述另外的酶與第一和/或第二核-殼顆粒中存在的酶相同或不同。

使用方法

檢測靶多核苷酸的方法

本公開內(nèi)容提供了檢測靶分子(例如靶多核苷酸)的方法，所述方法包括使靶分子與如本文所述的核-殼納米顆粒接觸。在不同方面，接觸導(dǎo)致如由本公開內(nèi)容提供的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。在另一個方面，接觸導(dǎo)致可檢測的變化，其中可檢測的變化指示靶分子的檢測?？蓹z測標(biāo)記的檢測通過本文所述的方法中的任何執(zhí)行，并且可檢測標(biāo)記可在其為核-殼納米顆粒的部分的分子上，或可在靶分子上。

在不同方面，該方法包括與靶多核苷酸100％互補(bǔ)(即完全匹配)的多核苷酸的使用，而在其他方面，多核苷酸在多核苷酸的長度上與多核苷酸至少(意指大于或等于)約95％互補(bǔ)，在多核苷酸的長度上與多核苷酸至少約90％、至少約85％、至少約80％、至少約75％、至少約70％、至少約65％、至少約60％、至少約55％、至少約50％、至少約45％、至少約40％、至少約35％、至少約30％、至少約25％、至少約20％互補(bǔ)，到多核苷酸能夠?qū)崿F(xiàn)靶基因產(chǎn)物的所需抑制的程度。

在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的核-殼納米顆?？捎糜诩{米閃光技術(shù)中。先前已在用于活細(xì)胞內(nèi)的靶分子水平的熒光檢測的多核苷酸功能化納米顆粒的背景下描述了納米閃光(在以引用的方式全文并入本文的WO 2008/098248中描述)。在該系統(tǒng)中，“閃光”可檢測地標(biāo)記并且通過進(jìn)入的靶多核苷酸從核-殼納米顆粒中置換或釋放。因此預(yù)期納米閃光技術(shù)可用于本文所述的核-殼納米顆粒的背景下。

靶分子

由本公開內(nèi)容考慮的是本文所述的組合物中的任何均可用于檢測靶分子。在不同方面，靶分子是多核苷酸，并且多核苷酸是真核的、原核的或病毒的。靶分子可在細(xì)胞、組織樣品或生物流體中，如本領(lǐng)域已知的。

如果多核苷酸以少量存在，則它可通過本領(lǐng)域已知的方法擴(kuò)增。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版1989)，以及B.D.Hames和S.J.Higgins，編輯Gene Probes 1(IRL Press,New York,1995)。一般地，但不限于，可執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，以使靶核酸的濃度增加到它可更容易檢測的程度。

在不同實(shí)施例中，提供的方法包括其中靶多核苷酸是編碼基因產(chǎn)物的mRNA并且基因產(chǎn)物的翻譯被抑制或靶多核苷酸是編碼基因產(chǎn)物的基因中的DNA并且基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄被抑制的那些。在其中靶多核苷酸是DNA的方法中，多核苷酸在某些方面是編碼被抑制的基因產(chǎn)物的DNA。在其他方法中，DNA與基因產(chǎn)物的編碼區(qū)互補(bǔ)。在另外其他方面，DNA編碼基因產(chǎn)物表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件?！罢{(diào)節(jié)元件”包括但不限于增強(qiáng)子、啟動子、沉默子、多聚腺苷酸化信號、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)合元件、調(diào)節(jié)內(nèi)含子和/或核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。在另外一個方面，靶多核苷酸是內(nèi)源復(fù)制所需的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，靶分子是微小RNA(miRNA)。

抑制基因表達(dá)的方法

由本公開內(nèi)容提供的另外的方法包括抑制從靶多核苷酸表達(dá)的基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法，所述方法包括使靶多核苷酸與如本文所述的核-殼納米顆粒或組合物接觸，其中所述接觸足以抑制基因產(chǎn)物的表達(dá)?；虍a(chǎn)物的抑制起因于靶多核苷酸與本公開內(nèi)容的核-殼納米顆?；蚪M合物的雜交。

在本領(lǐng)域中應(yīng)理解，其為核-殼納米顆粒的部分的多核苷酸的序列無需與其靶多核苷酸的序列100％互補(bǔ)，以便與靶多核苷酸特異性雜交。此外，其為核-殼納米顆粒的部分的多核苷酸可在一個或多個區(qū)段上與靶多核苷酸雜交，使得中間或相鄰區(qū)段不涉及雜交事件(例如且不限于環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。在其為核-殼納米顆粒的部分的多核苷酸的長度上測定互補(bǔ)性百分比。例如，給定包含多核苷酸的核-殼納米顆粒，其中多核苷酸的20個核苷酸中的18個與總長度100個核苷酸的靶多核苷酸中的20個核苷酸的區(qū)域互補(bǔ)，則其為核-殼納米顆粒的部分的多核苷酸是90％互補(bǔ)。在該例子中，剩余的非互補(bǔ)核苷酸可與互補(bǔ)核苷酸聚簇或散布，并且無需與彼此或互補(bǔ)核苷酸鄰接。其為核-殼納米顆粒的部分的多核苷酸與靶多核苷酸的區(qū)域的互補(bǔ)性百分比可使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)常規(guī)地測定。

提供的用于抑制基因產(chǎn)物表達(dá)的方法包括其中與在不存在核-殼納米顆粒的情況下的基因產(chǎn)物表達(dá)相比較，靶基因產(chǎn)物的表達(dá)被抑制至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％的那些。換言之，提供的方法包括導(dǎo)致靶基因產(chǎn)物的表達(dá)基本上任何程度的抑制的那些。

在體內(nèi)從體液樣品或從活組織檢查樣品或者通過本領(lǐng)域眾所周知的成像技術(shù)測定抑制程度?？商娲兀诩?xì)胞培養(yǎng)測定中在體外測定抑制程度，一般作為起因于使用如本文所述的組合物在體內(nèi)可預(yù)期的抑制程度的可預(yù)測量度。由本公開內(nèi)容考慮的是靶多核苷酸的抑制用于評價對給定細(xì)胞的抑制作用。作為非限制性例子，可研究基因產(chǎn)物的抑制效應(yīng)，其中基因產(chǎn)物是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的部分?？商娲?，可研究基因產(chǎn)物的抑制，其中基因產(chǎn)物被假設(shè)涉及細(xì)胞凋亡途徑。

應(yīng)理解本文所述的方法中的任何均可組合使用，以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果。例如且不限于，本文所述的方法可組合以允許檢測靶多核苷酸以及調(diào)節(jié)其表達(dá)兩者。在一些實(shí)施例中，該組合可用于定量在體外或體內(nèi)隨著時間過去的靶多核苷酸表達(dá)的抑制。在一個方面，通過在指定時間點(diǎn)從培養(yǎng)物中取出細(xì)胞并評價在每個時間點(diǎn)的靶多核苷酸表達(dá)的相對水平，來實(shí)現(xiàn)隨著時間過去的定量。在一個方面，如通過可檢測標(biāo)記的可視化評價的靶多核苷酸的量隨著時間過去的減少指示靶多核苷酸的抑制速率。

因此，測定給定多核苷酸與靶多核苷酸雜交并抑制靶多核苷酸表達(dá)的有效性，以及測定給定多核苷酸對細(xì)胞的抑制作用，是考慮的方面。

催化反應(yīng)的方法

本文提供的是使用所公開的核-殼顆粒或其復(fù)合物作為將一種或多種試劑轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)的催化劑的方法。該方法可包括使反應(yīng)的一種或多種試劑與如本文公開的多個核-殼顆粒的組合物接觸，使得一種或多種試劑與組合物的接觸導(dǎo)致反應(yīng)被催化以形成反應(yīng)的產(chǎn)物，其中所述核-殼顆粒的蛋白質(zhì)是用于化學(xué)反應(yīng)的酶。

實(shí)例

實(shí)例1

合成蛋白質(zhì)/寡核苷酸核-殼納米顆粒

材料和儀器：牛過氧化氫酶購自Sigma并如提供的使用。NHS-PEG₄-疊氮化物購自Thermo Scientific，并且經(jīng)修飾的亞磷酰胺購自Glen Research。C8S星形膠質(zhì)細(xì)胞從ATCC獲得。在MerMade 48(MM48)自動化寡核苷酸合成儀(BioAutomation)上合成寡核苷酸。通過在室溫下在NaOH水溶液(含DBCO的寡核苷酸)或0.05M碳酸鉀的甲醇溶液(含Cy5的寡核苷酸)中溫育12小時，使寡核苷酸脫保護(hù)。通過在Varian Prostar色譜站上的反相HPLC純化脫保護(hù)的寡核苷酸，這之后通過基質(zhì)輔助飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)驗(yàn)證其序列，并通過UV光譜法測定其濃度。在Jasco J-18分光光度計上測量圓二色(CD)譜。在Zeiss LSM 510倒置激光掃描共聚焦顯微鏡上，通過熒光共聚焦顯微鏡檢查來監(jiān)測Cy5標(biāo)記的寡核苷酸的細(xì)胞攝取。

蛋白質(zhì)/寡核苷酸核-殼納米顆粒的合成：如圖1b中所示，用寡核苷酸的致密殼修飾牛過氧化氫酶(圖1a)。通過50μM過氧化氫酶與50mM(1)(圖1)在室溫下反應(yīng)2小時，將表面暴露的胺轉(zhuǎn)化為疊氮化物。典型的反應(yīng)導(dǎo)致60+/-1個胺轉(zhuǎn)化為疊氮化物，如通過MALDI質(zhì)譜法測定的(圖2a)。用下述DNA序列共價修飾疊氮化物修飾的蛋白質(zhì)：

1)5’DBCO Sp18₂AAG AAT TTA TAA GCA GAA(ε_260nm＝199,900M^-1cm^-1)(SEQ ID NO:1)

2)5’DBCO Sp18₂AAC AAT TAT ACT CAG CAA(ε_260nm＝187,700M^-1cm^-1)(SEQ ID NO:2)

3)5’DBCO T₁₀–Cy5–T₁₀(ε_260nm＝172,600M^-1cm^-1₎(SEQ ID NO:3)

將含有1μM疊氮化物標(biāo)記的過氧化氫酶和1mM 5’-DBCO修飾的DNA的溶液在室溫下溫育三天。隨后使用Amicon Ultra Centrifugal Filter Units(Millipore)從溶液中去除過量的DNA，這之后如下測定用DNA標(biāo)記的程度。首先，根據(jù)Beer定律和在405nm處324,000M^-1cm^-1的摩爾吸光系數(shù)測定酶濃度。隨后通過測量在260nm處的吸光度變化來測定用DNA標(biāo)記的程度(圖2b)。典型的反應(yīng)獲得大約60-70個寡核苷酸/蛋白質(zhì)。與疊氮化物的數(shù)目相比較，寡核苷酸的輕微過量可能是由于保留了少量的非共價結(jié)合的寡核苷酸，或在估計對于所采用的寡核苷酸序列計算的摩爾吸光系數(shù)中的輕微誤差。

蛋白質(zhì)/寡核苷酸核-殼納米顆粒的表征。通過CD光譜監(jiān)測N3-PEG-疊氮化物和DNA的共價附著后牛過氧化氫酶的二級結(jié)構(gòu)的保留。使用含有1μM過氧化氫酶的溶液測量所有光譜(圖3a)。通過跟蹤H₂O₂的分解來監(jiān)測天然和DNA標(biāo)記的過氧化氫酶的酶促活性(圖3b)。確認(rèn)寡核苷酸共價附著至過氧化氫酶表面，隨后為通過DLS測量酶大小的變化(圖3c)。從大約11nm到大約25nm的變動與單層寡核苷酸共價附著至酶表面一致。

蛋白質(zhì)/DNA核-殼納米顆粒的細(xì)胞攝取。在用DNA修飾之前，用大約1.5個FITC分子標(biāo)記過氧化氫酶。隨后如上所述，用含有5’DBCO和內(nèi)部Cy5亞磷酰胺的T20寡核苷酸(SEQ ID NO:3)標(biāo)記該綴合物。雙重標(biāo)記策略允許跟蹤細(xì)胞攝取后蛋白質(zhì)核和寡核苷酸殼兩者的細(xì)胞命運(yùn)。使用C8S細(xì)胞(ATCC,VA,USA)執(zhí)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，所述C8S細(xì)胞根據(jù)ATCC細(xì)胞培養(yǎng)指南用10％熱滅活的胎牛血清培養(yǎng)，并在37℃下在5％CO₂中維持。在加入過氧化氫酶之前，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無血清培養(yǎng)基中，并與1nM蛋白質(zhì)/DNA核-殼納米顆粒溫育4小時，這之后通過熒光共聚焦顯微鏡檢查來測量核-殼納米顆粒的攝取(圖4)。

實(shí)例2

合成另外的蛋白質(zhì)/寡核苷酸核-殼納米顆粒

材料和儀器。所有酶均購自Sigma并如提供的使用。NHS-PEG4-疊氮化物購自Thermo Scientific，并且經(jīng)修飾的亞磷酰胺購自Glen Research。在MerMade 48(MM48)自動化寡核苷酸合成儀(BioAutomation)上合成寡核苷酸。通過在NaOH水溶液中溫育使寡核苷酸脫保護(hù)。隨后通過在Varian Prostar色譜站上的反相HPLC純化脫保護(hù)的寡核苷酸，這之后通過基質(zhì)輔助飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)驗(yàn)證其序列，并通過UV光譜法測定其濃度。在Jasco J-18分光光度計上測量圓二色(CD)譜。使用DuPont–Northwestern Down Collaborative Access Team束線，在Argonne National Labs執(zhí)行小角度X射線散射實(shí)驗(yàn)。在Hitachi S4800-II cFEG SEM上執(zhí)行掃描電子顯微鏡檢查(SEM)，并使用Hitachi HD-2300STEM收集掃描透射電子顯微鏡檢查(STEM)顯微照片。

蛋白質(zhì)/寡核苷酸核-殼納米顆粒的合成：如圖5c中所示，用寡核苷酸的致密殼修飾牛過氧化氫酶和Cg過氧化氫酶(圖5a和5b)。通過50μM過氧化氫酶與50mM(1)在室溫下反應(yīng)2小時，將表面暴露的胺轉(zhuǎn)化為疊氮化物。典型的反應(yīng)導(dǎo)致對于牛和Cg過氧化氫酶分別60或48個胺轉(zhuǎn)化為疊氮化物，如通過MALDI質(zhì)譜法測定的(圖2a)。用下述DNA序列共價修飾疊氮化物修飾的蛋白質(zhì)：

1)5'DBCO Sp18₂AAG AAT TTA TAA GCA GAA(260nm＝199,900M-1cm-1)(SEQ ID NO:1)

2)5'DBCO Sp18₂AAC AAT TAT ACT CAG CAA(260nm＝187,700M-1cm-1)(SEQ ID NO:2)

將含有1μM疊氮化物標(biāo)記的過氧化氫酶和1mM 5'-DBCO修飾的DNA的DNA標(biāo)記反應(yīng)在室溫下溫育3天。隨后使用Amicon Ultra Centrifugal Filter Units(Millipore)從溶液中去除過量的DNA，這之后如下測定用DNA標(biāo)記的程度。首先，根據(jù)Beer定律和在405nm處324,000M-1cm-1的摩爾吸光系數(shù)測定酶濃度。隨后通過測量在260nm處的吸光度變化來測定DNA分子數(shù)目/蛋白質(zhì)(圖2b)。典型的反應(yīng)分別獲得大約60-70和40-50個DNA鏈牛或Cg過氧化氫酶。與疊氮化物的數(shù)目相比較，DNA鏈的輕微過量可能是由于保留了少量的非共價結(jié)合的DNA鏈，或?qū)τ贒NA鏈計算的摩爾吸光系數(shù)中的輕微誤差。

DNA綴合的蛋白質(zhì)的裝配。兩種不同類型的DNA鏈用于將蛋白質(zhì)裝配成高級結(jié)構(gòu)。首先，使用自互補(bǔ)接頭，如圖6所示裝配單一蛋白質(zhì)。DNA-介導(dǎo)的聚集體的解裝配隨后為測量由于相對于DNA雙鏈體的單鏈DNA的過染色性質(zhì)而出現(xiàn)的在260nm處的吸光度增加。尖銳熔融轉(zhuǎn)變是在用DNA密集修飾的納米顆粒之間實(shí)現(xiàn)的多價相互作用的特征。

使用彼此互補(bǔ)但并非自身互補(bǔ)的接頭允許裝配含有兩種不同酶或酶和AuNP的二元晶格(圖7)。

蛋白質(zhì)晶體的形成和通過小角度X射線散射(SAXS)表征蛋白質(zhì)超晶格。通過加入100當(dāng)量的接頭DNA/蛋白質(zhì)DNA綴合物或AuNP來裝配蛋白質(zhì)晶體。加入接頭DNA后，通過將聚集體加熱至其熔融溫度以上并在熱循環(huán)儀中以1℃/10分鐘的速率冷卻樣品來形成晶體(圖8)。

通過SEM和STEM表征蛋白質(zhì)晶格。僅含有蛋白質(zhì)的晶體被制備用于通過在碳涂覆的網(wǎng)格上滴鑄5μL等分試樣的含晶體溶液并用2％乙酸鈾酰溶液染色來成像(圖9a-b)。將二元蛋白質(zhì)-AuNP晶體嵌入二氧化硅中，這之后將5μL等分試樣的含晶體溶液滴鑄到碳涂覆的網(wǎng)格上。圖10a-b中顯示了圖像。

實(shí)例3

合成β-半乳糖苷酶蛋白質(zhì)/寡核苷酸核-殼納米顆粒

β-半乳糖苷酶(β-gal)購自Sigma，并且在使用前通過尺寸排阻色譜純化。β半乳糖苷酶的表面用多核苷酸修飾，基本上如先前描述的(圖1b)，伴隨下述修改。在用疊氮化物修飾之前，用發(fā)色團(tuán)AlexaFluor 647(Life Technologies)使β-gal功能化，以使細(xì)胞運(yùn)輸成像并提供用于測定蛋白質(zhì)濃度的手段。含有9.75μM蛋白質(zhì)和28μM熒光團(tuán)的反應(yīng)獲得具有大約2.6個熒光團(tuán)/蛋白質(zhì)的綴合物(圖11)。隨后用疊氮化物修飾β-gal，并隨后與多核苷酸反應(yīng)，獲得具有大約38條DNA鏈/蛋白質(zhì)的綴合物(圖11)。

如通過UV-可見吸收光譜法測定的，β-半乳糖苷酶的表面由DNA的功能化。β-半乳糖苷酶首先綴合到發(fā)色團(tuán)AlexaFluor 647，隨后用兩種不同的DNA序列功能化。基于在647nm(來自綴合的熒光團(tuán))和260nm(來自DNA)的吸光度比率來測定功能化得率。兩條DNA鏈均以大約35:1的比率與酶的表面綴合。

通過共聚焦熒光顯微鏡檢查來測量DNA修飾的β-gal的細(xì)胞攝取。C8S細(xì)胞與100nM天然或DNA修飾的β-gal一起溫育12小時，用1X PBS洗滌，并通過共聚焦顯微鏡檢查成像(圖12)。熒光信號源于共價附著至蛋白質(zhì)表面的AlexaFluor染料，并證實(shí)DNA修飾的β-gal的細(xì)胞攝取。

天然和DNA功能化的β-半乳糖苷酶的細(xì)胞攝取也通過流式細(xì)胞術(shù)在C166、HaCat和SKOV3細(xì)胞中進(jìn)行測定。這些數(shù)據(jù)證明相對于天然蛋白質(zhì)，DNA功能化的酶的攝取增強(qiáng)，并且攝取跨越多個細(xì)胞系持續(xù)。

通過圓二色光譜法驗(yàn)證β-半乳糖苷酶在由DNA功能化后保持折疊。測定天然β-半乳糖苷酶和DNA功能化的β-半乳糖苷酶綴合物的光譜。所有光譜就濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。在220nm處的信號減少是由于來自DNA的貢獻(xiàn)，而不是由于蛋白質(zhì)的解折疊。還顯示了熒光β-半乳糖苷酶底物，羧基傘形基β-D-吡喃半乳糖苷通過天然β-半乳糖苷酶和DNA功能化的β-半乳糖苷酶綴合物的酶促水解。

使用β-gal染色試劑盒(Life Technologies)測定轉(zhuǎn)染的β-gal的催化活性，所述試劑盒測量模型底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的水解。在水解后，該化合物形成可通過光學(xué)顯微鏡檢查顯現(xiàn)的藍(lán)色沉淀物。對于這些實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞與100nM天然或DNA修飾的β-gal一起溫育12小時，用1X PBS洗滌并固定，這之后根據(jù)制造商的建議執(zhí)行測定。在與X-gal一起溫育后，將細(xì)胞洗滌并在光學(xué)顯微鏡上成像(圖13)，證明相對于天然β-gal，DNA功能化的β-gal的活性增強(qiáng)。

實(shí)例4

DNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)裝配。

材料和方法。使用得自Glen Research的試劑，在Mermade 48(MM48)寡核苷酸合成儀上在固體支撐物上合成所有寡核苷酸，并通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化。從Ted Pella獲得具有10-nm標(biāo)稱直徑的檸檬酸鹽加帽的金納米顆粒(AuNP)，并如先前所述[Park等人，Nature 451(7178):553-556(2008)；Macfarlane等人，Science 334(6053):204-208(2011)]用DNA功能化。簡言之，加入大約5nmol的適當(dāng)5’-硫醇化寡核苷酸/mL AuNP，這之后加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為0.01％，并且將所得到的溶液在室溫下溫育4小時。經(jīng)過3小時過程以0.1M逐步向溶液中加入5M NaCl的等分試樣，以達(dá)到0.5M NaCl的終濃度。隨后使該溶液在室溫下溫育過夜，以使AuNP表面上的DNA負(fù)載達(dá)到最大。通過在16000rpm下離心三輪，隨后將所得到的沉淀物重懸浮于1mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，來純化DNA功能化顆粒。使用9.55x10⁷M^-1cm^-1(由Ted Pella提供)的摩爾消光系數(shù)(ε₅₂₀)，基于UV-可見吸收光譜(Varian Cary 5000)測定顆粒濃度。

通過超濾(Amicon Ultra,100kDa)將牛和谷氨酸棒狀桿菌(“Cg”)過氧化氫酶(Sigma)交換到PBS內(nèi)，并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)證實(shí)其純度。兩種蛋白質(zhì)均運(yùn)行為具有預(yù)期分子量(大約60kDa/單體)的單一分子種類，并且因此如接受的使用。在化學(xué)功能化之前，將每種蛋白質(zhì)通過超濾濃縮并交換到含有100mM碳酸氫鈉(pH 9,0.5M NaCl)的緩沖液內(nèi)。使用324,000M^-1cm^-1的摩爾消光系數(shù)(ε₄₀₅)，通過UV-可見吸收光譜測定蛋白質(zhì)濃度[Samejima等人，J Biol Chem 238(10):3256-61(1963)]。

向在100mM碳酸氫鈉緩沖液(pH 9,0.5M NaCl)中含有50μM蛋白質(zhì)的100μL溶液中加入大約6mg接頭NHS-PEG4-N3(Thermo Scientific，圖15，插圖)。允許表面胺和NHS-PEG4-N3之間的反應(yīng)在25℃下進(jìn)行2小時，同時在1000rpm下振蕩。通過使用由PBS(pH 7.4)平衡的NAP10柱(GE Healthcare)的尺寸排阻色譜來純化疊氮化物功能化的蛋白質(zhì)。基于274Da/接頭的附加質(zhì)量，在Bruker Autoflex III質(zhì)譜儀(圖16)上，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)測定附著的接頭的數(shù)目。

每個疊氮化物修飾的蛋白質(zhì)用含有5’-末端二苯并環(huán)辛炔(DBCO)部分的兩種不同的寡核苷酸分別功能化。典型的反應(yīng)含有在PBS(0.5M NaCl)中的3nmol蛋白質(zhì)和1μmol所示寡核苷酸。使反應(yīng)在25℃下伴隨以1000rpm的振蕩溫育3天，這之后通過10輪超濾(Millipore Amicon Ultra-15Centrifugal Filter Units)從反應(yīng)溶液中去除未反應(yīng)的DNA。通過UV-可見吸收光譜法測定每種DNA功能化蛋白質(zhì)的寡核苷酸:蛋白質(zhì)比率(圖16)。

在Malvern Zetasizer Nano上執(zhí)行動態(tài)光散射(DLS)實(shí)驗(yàn)。每個樣品含有1μM的天然、疊氮化物功能化或DNA功能化的過氧化氫酶。報告的光譜和流體動力學(xué)直徑(圖1c-e和15)基于強(qiáng)度分布，并且是三次測量的平均值。

UV-可見光吸收和CD光譜用于探測天然、N3-和DNA功能化的過氧化氫酶變體的結(jié)構(gòu)(圖17和18)。在含有PBS(0.5M NaCl)中大約1μM蛋白質(zhì)的溶液的1-cm路徑長度比色皿中記錄UV-可見吸收光譜。在1mm路徑長度比色皿中在Jasco J-818分光光度計上記錄CD光譜。在PBS(0.5M NaCl)中以300nM的濃度制備所有含蛋白質(zhì)的樣品。使用Igor Pro(Wavemetrics)中的Savitzky-Golay算法，將原始橢圓率值(mdeg)轉(zhuǎn)換為Δε(mM^-1cm^-1)，并使所得到的光譜平滑。將疊氮化物功能化的蛋白質(zhì)的光譜直接與其天然配對物比較(圖18)。來自圖3a和圖18b的圓二色信號中的差異是由于疊氮化物標(biāo)記的蛋白質(zhì)的光譜相對不穩(wěn)定。對于圖18b，在完成標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的一天內(nèi)收集光譜，其中將經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)貯存于4℃下。對于圖3a，疊氮化物綴合的蛋白質(zhì)在綴合反應(yīng)完成后在室溫下靜置延長時間段并部分解折疊。

從以大約15μM的濃度制備的樣品收集未綴合的含有5’DBCO的寡核苷酸的CD光譜。隨后將每條DNA鏈的Δε值乘以對于每種蛋白質(zhì)變體計算的DNA:蛋白質(zhì)比率(表1)。通過天然蛋白質(zhì)的光譜和乘以預(yù)期的DNA:蛋白質(zhì)比率的DNA的光譜的總和，來計算每種DNA功能化蛋白質(zhì)的理論光譜(圖17)。

基本上如先前所述[Beers等人，J Biol Chem 195(1):133-140(1952)]，用分光光度法跟蹤H₂O₂向H₂O和O₂的歧化。簡言之，將天然或DNA功能化的過氧化氫酶的10-μL等分試樣從原液(100nM)加入在1000μL PBS(0.5M NaCl)中含有指定濃度的H₂O₂的攪拌比色皿中。在加入過氧化氫酶后，連續(xù)監(jiān)測在240nm處的吸光度1分鐘。隨后使用43M^-1cm^-1的H₂O₂ε₂₄₀值，由這些跡線的初始線性部分的斜率計算反應(yīng)速率。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次試驗(yàn)的平均值(圖19)。對于每個H₂O₂濃度計算標(biāo)準(zhǔn)速度常數(shù)(k_app)，并且在圖19h中報告平均值。為了測試觀察到的催化活性是否是由于存在完整折疊的過氧化氫酶，而不是游離卟啉或包埋在未折疊的蛋白質(zhì)和DNA的基質(zhì)中的卟啉，還使用通過在60℃下溫育10分鐘解折疊的DNA功能化蛋白質(zhì)執(zhí)行酶測定(圖19)。

通過在5,000rpm下的四輪離心分離蛋白質(zhì)晶體(如下所述裝配)。通過在40℃下記錄其UV-可見吸收光譜來測定純化的晶體中所含有的蛋白質(zhì)的總濃度。隨后將晶體稀釋至100nM的最終蛋白質(zhì)濃度，并測試其催化活性(圖14f和19)。為了測試酶晶體的可回收性，將它們與15mM H₂O₂一起溫育10分鐘，并離心以收集剩余的不溶性材料。在該處理之后，測試上清液和不溶性材料兩者的催化活性(圖19j)。將該過程重復(fù)5次，這之后收集SAXS光譜以確保晶格保持完整(圖19k)。

通過將100當(dāng)量的適當(dāng)接頭加入含有在PBS(0.5M NaCl)中的300nM所示蛋白質(zhì)的溶液，DNA功能化的蛋白質(zhì)和AuNP-SNA綴合物與互補(bǔ)接頭鏈雜交。通過混合與兩個不同接頭分開雜交的單個DNA功能化蛋白質(zhì)、兩個不同的DNA功能化蛋白質(zhì)(其各自和與另一個互補(bǔ)的接頭雜交)、或與互補(bǔ)接頭分開雜交的DNA功能化蛋白質(zhì)和SNA-AuNP綴合物，來裝配含有蛋白質(zhì)的聚集體。將所得到的聚集體加入1000μL PBS(0.5M NaCl)中至15nM的最終顆粒濃度，并且通過UV-可見吸收光譜法測定其熔融溫度(圖14g和20)。計算每個熔解曲線的一階導(dǎo)數(shù)，以測定每個樣品的T_m和半高全寬(FWHM)。

通過將由接頭雜交的DNA功能化的蛋白質(zhì)或接頭雜交的蛋白質(zhì)和SNA-AuNP綴合物組成的DNA模板化的聚集體加熱至其熔融溫度(43℃)以上，并且以0.01℃/分鐘的速率將其緩慢冷卻至室溫，來裝配晶體。該程序近期顯示有利于形成單晶超過多晶超晶格[Auyeung等人，Nature 505(7481):73-77(2014)]。

SAXS實(shí)驗(yàn)在Argonne National Laboratory’s Advanced Photon Source(APS)的DuPont-Northwestern-Dow Collaborative Access Team(DND-CAT)束線下進(jìn)行。使用針對山崳酸銀標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)的10keV(波長)準(zhǔn)直X射線執(zhí)行實(shí)驗(yàn)。將樣品轉(zhuǎn)移至1.5mm石英毛細(xì)管(Charles Supper)，并在CCD面積檢測器上原位記錄其2D散射模式。使用的曝光時間對于Au蛋白質(zhì)雜交物和僅蛋白質(zhì)的晶格分別為0.5秒和5秒。通過對二維數(shù)據(jù)徑向求平均值以獲得根據(jù)散射矢量q的散射強(qiáng)度的圖，獲得圖21中呈現(xiàn)的一維散射數(shù)據(jù)：

q＝4πsinθ/λ

其中θ是散射角的一半，并且λ是所使用的X射線的波長。

所有理論X射線衍射模式使用PowderCell軟件包進(jìn)行計算，所述PowderCell軟件包可從Federal Institute for Materials Research and Testing在因特網(wǎng)上免費(fèi)獲得。盡管該軟件最初被開發(fā)用于計算基于原子組成成分的晶格的結(jié)構(gòu)因子，但它也已顯示生成與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)良好匹配的納米顆粒超晶格的理論散射模式。對于由蛋白質(zhì)和AuNP裝配的二元超晶格，其中所得到的散射模式由AuNP控制并且是簡單立方晶格的特征，原子選擇是任意的。對于由單一蛋白質(zhì)組成的BCC型晶格也是如此。為了生成由單一蛋白質(zhì)或兩個蛋白質(zhì)組成的CsCl型晶格的模擬衍射模式，選擇具有相似電子密度的原子。模擬散射模式中的衍射峰的位置與實(shí)驗(yàn)上觀察到的那些良好匹配。

使用下述等式基于第一散射峰q₀的位置計算關(guān)于每個晶格類型的最近鄰距離d：

其中d是兩個顆粒之間以nm計的距離，q₀是以的初始散射峰的位置，并且C是使兩個納米顆粒最近鄰之間的距離和與第一散射峰相關(guān)的[hkl]平面之間的距離關(guān)聯(lián)的常數(shù)。C、q_o、d和晶格參數(shù)的值在表2中概括。

在以SE或Z對比模式在200keV下操作的Hitachi HD2300掃描透射電子顯微鏡上執(zhí)行TEM成像。如先前所述[Auyeung等人，Nature 505(7481):73-77(2014)；Auyeung等人，Adv Mater 24(38):5181-5186(2012)]，將由SNA-AuNP綴合物和DNA功能化蛋白質(zhì)組成的二元超晶格嵌入無定形二氧化硅中。該過程是必要的，以防止DNA介導(dǎo)的晶格在樣品制備和真空成像期間塌陷。將這些二氧化硅包埋的超晶格的5-μL等分試樣滴鑄到碳涂覆的銅網(wǎng)格上，并通過用Whatman濾紙吸印去除過量的液體。僅由DNA功能化的蛋白質(zhì)組成的超晶格用2％乙酸鈾酰溶液染色，以獲得足夠的對比度用于成像。

結(jié)果。含四聚體血紅素的酶，過氧化氫酶的兩種變體(牛過氧化氫酶和Cg過氧化氫酶)，用作研究DNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)裝配的模型系統(tǒng)(圖14)。每種過氧化氫酶變體共享相似的分子拓?fù)?，但特征在于化學(xué)反應(yīng)性表面可接近的胺官能團(tuán)的不同模式。通過加入在相對末端處含有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯和疊氮化物部分的大量過量(相對于蛋白質(zhì)濃度大約3000倍)的四甘醇接頭(圖14b，i和15，插圖)，這些表面可接近的胺以高得率(對于Cg和牛過氧化氫酶分別為75％和83％的所有溶劑可接近的伯胺/四聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物)轉(zhuǎn)化為疊氮化物，如通過質(zhì)譜法測定的(圖16)。經(jīng)過使用三個不同分批的蛋白質(zhì)的五個獨(dú)立反應(yīng)，蛋白質(zhì)由疊氮化物的功能化是高度可重復(fù)的(對于牛和Cg過氧化氫酶分別為15.3±0.3和12.2±0.6個標(biāo)記)。隨后經(jīng)由在表面結(jié)合的疊氮化物和在合成寡核苷酸的5'末端處的二苯并環(huán)辛炔(DBCO)部分之間的應(yīng)激促進(jìn)的環(huán)化加成反應(yīng)(無銅“點(diǎn)擊化學(xué)”)，將疊氮化物修飾的蛋白質(zhì)分別用兩種不同的寡核苷酸功能化(圖14b，ii)。該策略獲得30-50pmol/cm²的DNA功能化密度，如通過每種蛋白質(zhì)-DNA綴合物的UV吸收光譜中的變化所測定的(圖16)。這些值與先前在DNA介導(dǎo)的結(jié)晶方案中采用類似尺寸的無機(jī)納米材料所實(shí)現(xiàn)的值可比較[Zhang等人，Nat Mater 12(8):741-746(2013)；Hurst等人，Anal Chem 78(24):8313-8318(2006)]。通過動態(tài)光散射(DLS)進(jìn)一步表征每種蛋白質(zhì)綴合物揭示，DNA功能化后其流體動力學(xué)直徑對于牛和Cg過氧化氫酶分別從11.7或12nm增加到24.3和25nm，這與形成從蛋白質(zhì)核徑向取向的寡核苷酸殼一致(圖14c-e和15)。不希望受理論束縛，很可能接頭在一定程度上與蛋白質(zhì)相互作用，這解釋了為何流體動力學(xué)直徑并未如預(yù)期增加那么多。類似地，DNA可能不與超晶格中的DNA在構(gòu)象上相同，并且與周圍鏈采用附加的二級結(jié)構(gòu)，如通過CD光譜學(xué)證實(shí)的(圖17)。

1.DBCO dT指由Glen Research制造的二苯并環(huán)辛炔修飾的亞磷酰胺

2.Sp指由Glen Research制造的六甘醇修飾的亞磷酰胺，間隔物18。

表1.本公開內(nèi)容中使用的寡核苷酸的序列。

疊氮化物和DNA修飾的蛋白質(zhì)被廣泛表征以確保它們保持折疊和有功能的。每種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)通過UV-可見光和圓二色(CD)光譜法進(jìn)行探測，其分別提供關(guān)于血紅素活性位點(diǎn)周圍的環(huán)境和蛋白質(zhì)的總體二級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)信息(圖17和18)。兩種技術(shù)均提示在用疊氮化物或DNA功能化后，天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在很大程度上保持完整。通過監(jiān)測過氧化氫酶催化的過氧化氫(H₂O₂,ε₂₄₀＝43M^-1cm^-1)歧化成H₂O和O₂在UV吸光度(在240nm處)中的減少，分光光度法測定DNA功能化蛋白質(zhì)的催化功能性的保留(圖14f和19)[Beers等人，J Biol Chem 195(1):133-140(1952)]。當(dāng)采用mM濃度的底物和相對低(nM)濃度的酶時，該反應(yīng)的初始速率就H₂O₂濃度而言是一階的。標(biāo)準(zhǔn)速度常數(shù)對于DNA功能化的酶及其天然配對物是相似的，并且與先前公開的報告[Beers等人，J Biol Chem 195(1):133-140(1952)]良好一致，指示附加到每種過氧化氫酶變體表面的DNA的密集殼并不顯著影響底物對活性位點(diǎn)的接近或引起其結(jié)構(gòu)中的有害變化。相比之下，當(dāng)DNA功能化的蛋白質(zhì)在測定之前被加熱到其解折疊溫度以上時，未觀察到H₂O₂分解(圖19)。該發(fā)現(xiàn)證明在DNA功能化蛋白質(zhì)的存在下觀察到的速率增強(qiáng)源于完整的活性位點(diǎn)，而不是起因于游離血紅素或嵌入未折疊的蛋白質(zhì)和DNA的基質(zhì)中的血紅素的過氧化物酶活性。

實(shí)例5

接下來測定蛋白質(zhì)-DNA綴合物是否采用了SNA-無機(jī)NP綴合物的DNA依賴性質(zhì)特征。這些綴合物與具有互補(bǔ)寡核苷酸的顆粒形成多價相互作用，并且這些相互作用的特征在于在逐漸增加溫度時在裝配狀態(tài)和解裝配狀態(tài)之間的高度協(xié)同的轉(zhuǎn)變。每個蛋白質(zhì)-DNA綴合物獨(dú)立地與具有單鏈粘性末端序列(5’-AAGGAA-3’或5’-TTCCTT-3’，圖14b，iii和表1)的互補(bǔ)寡核苷酸雜交。當(dāng)具有含互補(bǔ)粘性末端的接頭的蛋白質(zhì)組合時，或當(dāng)任一蛋白質(zhì)與具有互補(bǔ)粘性末端的SNA-金納米顆粒(AuNP)(10nm直徑)綴合物組合時，觀察到溶液的濁度中的快速增加和聚集體的逐漸累積。顯著地，當(dāng)具有非互補(bǔ)粘性末端的顆粒組合時，不發(fā)生這種聚集事件，排除了蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和AuNP表面或蛋白質(zhì)和DNA之間的非特異性相互作用的可能性。緩慢加熱含有這些DNA模板化聚集體的溶液，導(dǎo)致其在260nm處的消光的急劇增加(圖14g和20)。對于僅含有DNA功能化蛋白質(zhì)的聚集體，這種轉(zhuǎn)變起因于在聚集體解離時雙鏈DNA去雜交成過染色單鏈DNA，而對于含有DNA功能化蛋白質(zhì)和SNA-AuNP綴合物的混合物的聚集體，消光中的增加主要是由于AuNP的光學(xué)性質(zhì)中的變化。對于這些轉(zhuǎn)變的熔融溫度和半高全寬類似于對于具有無機(jī)核的SNA-NP綴合物觀察到的那些[Zhang等人，Nat Mater 12(8):741-746(2013)；Hurst等人，Anal Chem 78(24):8313-8318(2006)]。

接下來測定開發(fā)用于SNA-無機(jī)NP綴合物的設(shè)計規(guī)則[Macfarlane等人，Science 334(6053):204-208(2011)；Macfarlane等人，Angew Chem Int Ed 52(22):5688-5698(2013)]是否也適用于DNA功能化蛋白質(zhì)的裝配。先前已顯示，當(dāng)具有相同大小的球形SNA-AuNP綴合物用具有非自互補(bǔ)粘性末端的接頭分開功能化時，熱力學(xué)上有利的晶格是體心立方的。這些晶格被定義為BCC型而不是CsCl，因?yàn)楹思{米顆粒是相同的，盡管它們用不同的DNA序列功能化的事實(shí)。為了測試DNA功能化的蛋白質(zhì)是否形成相似的晶格，將含有等摩爾比的兩種蛋白質(zhì)的聚集體或由蛋白質(zhì)和SNA-AuNP綴合物組成的二元系統(tǒng)加熱至在其熔點(diǎn)以上、但在蛋白質(zhì)解折疊在其下開始的溫度以下的溫度，并以0.01℃/分鐘的速率緩慢冷卻至20℃，以促進(jìn)熱力學(xué)穩(wěn)定的產(chǎn)物的形成。已顯示與其中聚集體在略微低于其熔融溫度的溫度下退火的替代方法相比較，從解離狀態(tài)緩慢冷卻含納米顆粒的溶液有利于形成單晶超過多晶聚集體[Auyeung等人，Nature 505(7481):73-77(2014)]。在觀察到較快的冷卻速率獲得不明確的單晶或多晶聚集體之后，憑經(jīng)驗(yàn)確定0.01℃/分鐘的速率。使用該程序，Cg過氧化氫酶裝配成具有體心立方(BCC)對稱性和25.6nm的顆粒間距的超晶格，如由徑向平均的1D小角度X射線散射(SAXS)模式測定的(圖21a)。這種顆粒間距與測量的DNA修飾的Cg過氧化氫酶的流體動力學(xué)直徑一致(圖14e和15)。還觀察到在處的另外的衍射峰和在處的肩峰，提示存在與氯化銫(CsCl)等結(jié)構(gòu)的分開晶格。由三種另外的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)組合形成的晶體也產(chǎn)生了CsCl型晶格的特征性散射模式，盡管不能排除具有相似顆粒間距的BCC晶格的存在(圖21b-d；表2)。來自幾乎相同的蛋白質(zhì)變體的具有CsCl型對稱性而不是BCC對稱性的晶格的形成提示，盡管位于每個獨(dú)特晶格位置的蛋白質(zhì)與八個最近鄰形成連接，但如預(yù)期的，它們也采取不同的取向。該觀察指示蛋白質(zhì)構(gòu)件塊的獨(dú)特形狀各向異性和不均勻表面化學(xué)以使用傳統(tǒng)SNA-NP綴合物未觀察到的方式影響DNA介導(dǎo)的超晶格裝配，并且將在設(shè)計努力中利用以形成具有新型對稱性的晶格。

表2.晶格參數(shù)的計算和概括。

因?yàn)榈鞍踪|(zhì)相對于AuNP的散射橫截面是可忽略不計的，所以預(yù)期蛋白質(zhì)-AuNP二元晶格產(chǎn)生僅依賴于AuNP在晶格內(nèi)的排列的散射模式。實(shí)際上，當(dāng)DNA功能化蛋白質(zhì)以1:1的比率與具有含互補(bǔ)粘性末端的接頭的SNA-AuNP綴合物組合時，所得到的CsCl型晶格產(chǎn)生簡單的立方散射模式(圖21e-f)。在這些晶格中，蛋白質(zhì)充當(dāng)有效地刪除否則將被AuNP占據(jù)的晶格位置的三維間隔物。組合具有這種不同的物理和化學(xué)性質(zhì)的兩類納米材料而不顯著改變基于軟蛋白質(zhì)的構(gòu)件塊的緊湊3D結(jié)構(gòu)的能力突出顯示了DNA介導(dǎo)的裝配的廣泛泛化，并且在裝配多功能材料中是有用的。

通過二氧化硅包埋的(用于二元蛋白質(zhì)-Au系統(tǒng))或負(fù)染色的(用于僅由DNA功能化的蛋白質(zhì)組成的晶格)樣本的掃描透射電子顯微鏡檢查(STEM)，來調(diào)查蛋白質(zhì)晶體的微米級形態(tài)(圖22和23)。兩個樣品的顯微照片證明在每個維度上單晶1-7μm的均勻形成。二元蛋白質(zhì)-AuNP晶體展示清晰的小平面以及六角形和正方形結(jié)構(gòu)域，類似于以前對于裝配成菱形十二面體的SNA-AuNP綴合物觀察到的那些[Auyeung等人，Nature 505(7481):73-77(2014)]。這不管下述事實(shí)而發(fā)生：對于Au-蛋白質(zhì)二元晶體，蛋白質(zhì)間隔物的包括導(dǎo)致AuNP的簡單立方排列。具有二元蛋白質(zhì)-AuNP組合物的單晶的高放大率圖像(圖22b)揭示了顯著的有序度，其中個別納米顆粒的堆疊可清楚地辨別(圖22b，插圖)。類似地，晶格平面可在由Cg過氧化氫酶晶體制備的負(fù)染色樣本中顯現(xiàn)(圖22d)。

如上所述，由Cg過氧化氫酶組成的晶體用于H₂O₂分解測定中，以測定在結(jié)晶過程后酶是否保持活性。與溶液中游離的天然或DNA功能化的酶一樣，晶體的H₂O₂分解速率顯示對底物濃度的線性依賴性(圖19i)，盡管表觀速率常數(shù)降低大約20倍。催化效率中的類似減少先前已在結(jié)晶酶制劑的研究中觀察到，尤其是對于其中擴(kuò)散進(jìn)入晶體是限制因素的高效酶[Mozzarelli等人，Annu Rev Bioph Biom 25:343-365(1996)]。重要的是，酶可通過離心在催化后容易地再循環(huán)，并且在至少5輪催化自始至終保持完全催化活性(圖19j)。在最后一輪催化后通過SAXS分析不溶性材料證實(shí)晶格保持完整(圖19k)。

結(jié)論。盡管有近期成就[King等人，Science 336(6085):1171-1174(2012)；King等人，Nature 510(7503):103-108(2014)]，但由于缺乏通用相互作用基序，尤其是形成超過二聚體復(fù)合物的超分子結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的從頭設(shè)計仍然是困難的[Stranges等人，Protein Sci 22(1):74-82(2013)]。相比之下，寡核苷酸堿基配對相互作用得到充分理解，以高保真度形成，并且已廣泛用作裝配多種超分子形狀的手段，所述多種超分子形狀可充當(dāng)用于組織外部分子裝配的支架，所述外部分子包括蛋白質(zhì)或基于蛋白質(zhì)的病毒衣殼[Wilner等人，Nat Nanotechnol 4(4):249-254(2009)；Zhang等人，Angew Chem Int Ed 51(14):3382-3385(2012)；Rusling等人，Angew Chem Int Ed 53(15):3979-3982(2014)；Yan等人，Science 301(5641):1882-1884(2003)；Wang等人，ACS Nano 8(8):7896-7904(2014)；Coyle等人，J Am Chem Soc 135(13):5012-5016(2013)]。通過用寡核苷酸雜交替代蛋白質(zhì)間相互作用的形成，本公開內(nèi)容已顯示結(jié)晶超晶格可由單一蛋白質(zhì)、多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和AuNP的組合裝配。該策略尤其提供了用于編程來自功能蛋白質(zhì)的復(fù)雜生物材料(例如，酶級聯(lián)或雜交無機(jī)-有機(jī)晶格)的裝配的手段，而不管其氨基酸組成或分子拓?fù)洹?/p>

序列表

<110> 米爾金等人

<120> 蛋白質(zhì)/寡核苷酸核-殼納米顆粒治療劑

<130> 30938/2014-104R

<150> US 62/039,340

<151> 2014-08-19

<150> US 62/039,608

<151> 2014-08-20

<150> US 62/137,183

<151> 2015-03-23

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是DCBO（二苯并環(huán)辛炔修飾的亞磷酰胺）

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> n是SP（六甘醇修飾的亞磷酰胺）

<400> 1

nnnaagaatt tataagcaga a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是DCBO（二苯并環(huán)辛炔修飾的亞磷酰胺）

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> n是SP（六甘醇修飾的亞磷酰胺）

<400> 2

nnnaacaatt atactcagca a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是DCBO（二苯并環(huán)辛炔修飾的亞磷酰胺）

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n是Cy5亞磷酰胺

<400> 3

nttttttttt tntttttttt tt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是DCBO（二苯并環(huán)辛炔修飾的亞磷酰胺）

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> n是SP（六甘醇修飾的亞磷酰胺）

<400> 4

nnnaagacga atatttaaga a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是DCBO（二苯并環(huán)辛炔修飾的亞磷酰胺）

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> n是SP（六甘醇修飾的亞磷酰胺）

<400> 5

nnnaacgact catattaaca a 21

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> n是SP（六甘醇修飾的亞磷酰胺）

<400> 6

ccccccssnn aagacgaata tttaagaa 28

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n是SP（六甘醇修飾的亞磷酰胺）

<400> 7

ttccttnttc ttaaatattc gtctt 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n是SP（六甘醇修飾的亞磷酰胺）

<400> 8

aaggaanttg ttaatatgag tcgtt 25