本申請要求于2014年8月8日提交的美國臨時專利申請62/034915的優(yōu)先權(quán)，其說明書通過引用的方式并入本文。

背景技術(shù)：

(a)領(lǐng)域

一般而言，所公開的主題涉及抑制患者中癌癥腫瘤生長的方法。更具體地，所述方法涉及包括將對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體與至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合施用給患者的方法。

(b)相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)

奎斯特藥業(yè)技術(shù)公司(Quest PharmaTech)開發(fā)了一系列對諸如CA125、MUC1、PSA、Her2/neu和其它腫瘤相關(guān)抗原等腫瘤抗原特異性的單克隆抗體?？固厮帢I(yè)技術(shù)公司(Quest PharmaTech)正在開發(fā)這些單克隆抗體療法作為癌癥免疫療法，其特別能夠通過由這些特異性抗體刺激的改變的抗原加工和呈遞來刺激抗腫瘤免疫。

已經(jīng)在動物中以及對于幾種抗體，即AR20.5和B43.13，在人臨床試驗中完成了證明研究。與這些努力平行，研究適應(yīng)性免疫的分子事件的免疫學(xué)家已經(jīng)使用在MHC I類和II類的背景中識別抗原的肽片段的T細(xì)胞受體來限定由特異性T細(xì)胞的抗原識別的途徑。急性應(yīng)答的動力學(xué)需要除了T細(xì)胞受體識別之外的第二信號的激活，以避免誘導(dǎo)耐受性。主要的激活第二信號是抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的B7.1和T細(xì)胞上的CD28之間的相互作用。在促炎微環(huán)境中誘導(dǎo)這些第二信號。還定義了額外的激活途徑，以及設(shè)計用于限制抗原特異性激活的一組冗余的檢查點(diǎn)途徑。這些穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)信號包括T細(xì)胞上的CTLA4與APC上的B7.1以及T細(xì)胞上的PD-1與APC上的B7H1的相互作用。

對檢查點(diǎn)抑制的干擾導(dǎo)致特異性免疫的延長和增強(qiáng)。這已經(jīng)應(yīng)用于多種癌癥類型的免疫治療，并且如在美國臨床腫瘤學(xué)會的2014年會議上報告的，使用開發(fā)中的分子激活免疫，以及在一種抗CTLA-4單克隆抗體(易普利姆瑪(ipilimumab))的情況下的商業(yè)化分子可導(dǎo)致晚期實(shí)體惡性腫瘤患者中的可預(yù)測的臨床響應(yīng)，以及腫瘤生長的可持續(xù)控制，以及有時收縮和疾病消除。對治療的響應(yīng)已經(jīng)與常見腫瘤抗原上的突變的存在聯(lián)系起來，推測所述突變產(chǎn)生更易于被內(nèi)源性T細(xì)胞免疫攻擊的新抗原(Neoantigens)(Snyder等人，ASCO Proceedings 2014摘要3003)。然而，免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的性能仍然有限，在少于50％的專利中看到響應(yīng)，并且在僅僅幾個百分比的治療患者中觀察到完全響應(yīng)。

因此，需要改善免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的性能的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)一個實(shí)施方案，提供了用于抑制患者中癌癥腫瘤生長的方法，其包括將對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體與至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合施用給患者。

腫瘤相關(guān)的靶抗原可以在腫瘤的細(xì)胞表面上表達(dá)。

腫瘤相關(guān)的靶抗原可以是可溶性抗原。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是IgG抗體、IgE抗體或其組合。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是對MUC1特異性的抗體。

對MUC1特異性的抗體結(jié)合選自SEQ ID NO:5的MUC1的表位。

對MUC1特異性的抗體的重鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:1的核酸編碼，并且其中對MUC1特異性的抗體的輕鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:2的核酸編碼。

對MUC1特異性的抗體的重鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:3的核酸編碼，并且對MUC1特異性的抗體的輕鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:4的核酸編碼。

對MUC1特異性的抗體可以是mAb-AR20.5、mAb 3C6.hIgE、mAb 4H5.hIgE或其組合。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是對CA125特異性的抗體。

對CA125特異性的抗體可以是mAb-B43.13。

免疫刺激性化合物可以是TLR3激動劑或TLR4激動劑。

TLR3激動劑可以是polyIC，polyICLC

免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑是抗PD-1抗體、抗PDL-1、抗CTLA-4抗體或這些受體的分子抑制劑。

抗PD-1抗體可以選自下組：納武單抗(nivolumab)抗體、派姆單抗(pembrolizumab)抗體、派第利單抗(pidilizumab)抗體或其組合。

抗-PDL-1抗體可以選自下組：B7-H1抗體、BMS-936559抗體、MPDL3280A(艾特佐利單抗(atezolizumab))抗體、MEDI-4736抗體、MSB0010718C抗體或其組合。

抗CTLA-4抗體可以選自下組：易普利姆瑪或特立美麗單抗(tremelimumab)或其組合。

治療性腫瘤相關(guān)抗原特異性抗體可以是鼠單克隆抗體(異種型)、嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體或完全人單克隆抗體。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以具有可以是人起源的恒定區(qū)。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以具有可以是人起源、非人起源或其任何組合的可變區(qū)。

癌癥可以選自胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胃腸癌、肺癌和多發(fā)性骨髓瘤。

腫瘤相關(guān)抗原可以是CA125、葉酸結(jié)合蛋白(FBP)、HER2/neu，MUC1或PSA。

該方法包括以下步驟：

a)施用治療有效量的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體；

b)在步驟a)后施用治療有效量的免疫刺激性化合物；并且

c)在步驟b)后施用治療有效量的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑。

可以在步驟a)的1天或多天后進(jìn)行步驟b)。

可以在步驟b)的1天或多天后進(jìn)行步驟c)。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，提供了對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體與至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合用于在有需要的患者中抑制癌癥腫瘤生長的用途。

腫瘤相關(guān)的靶抗原可以在腫瘤的細(xì)胞表面上表達(dá)。

腫瘤相關(guān)靶抗原可以是可溶性抗原。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是IgG抗體、IgE抗體或其組合。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是對MUC1特異性的抗體。

對MUC1特異性的抗體結(jié)合選自SEQ ID NO:5的MUC1的表位。

對MUC1特異性的抗體的重鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:1的核酸編碼，并且其中對MUC1特異性的抗體的輕鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:2的核酸編碼。

對MUC1特異性的抗體的重鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:3的核酸編碼，并且對MUC1特異性的抗體的輕鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:4的核酸編碼。

對MUC1特異性的抗體可以是mAb-AR20.5、mAb 3C6.hIgE、mAb 4H5.hIgE或其組合。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是對CA125特異性的抗體。

對CA125特異性的抗體可以是mAb-B43.13。

免疫刺激性化合物可以是TLR3激動劑或TLR4激動劑。

TLR3激動劑可以是polyIC，polyICLC

免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑是抗PD-1抗體、抗PDL-1、抗CTLA-4抗體或這些受體的分子抑制劑。

抗PD-1抗體可以選自下組：納武單抗(nivolumab)抗體、派姆單抗(pembrolizumab)抗體、派第利單抗(pidilizumab)抗體或其組合。

抗PDL-1抗體可以選自下組：B7-H1抗體、BMS-936559抗體、MPDL3280A(艾特佐利單抗(atezolizumab))抗體、MEDI-4736抗體、MSB0010718C抗體或其組合。

抗CTLA-4抗體可以選自下組：易普利姆瑪(ipilimumab)或特立美麗單抗(tremelimumab)或其組合。

治療性腫瘤相關(guān)抗原特異性抗體可以是鼠單克隆抗體(異種型)、嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體或完全人單克隆抗體。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以具有可以是人起源的恒定區(qū)。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以具有人起源、非人起源或其任何組合的可變區(qū)。

癌癥可以選自胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胃腸癌、肺癌和多發(fā)性骨髓瘤。

腫瘤相關(guān)抗原可以是CA125、葉酸結(jié)合蛋白(FBP)、HER2/neu，MUC1或PSA。

可以在免疫刺激性化合物前使用對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體。

可以在免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑前使用免疫刺激性化合物。

可以在免疫刺激性化合物的1天或多天前使用對腫瘤相關(guān)抗原特異性的單克隆抗體。

可以在免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑的1天或多天前使用免疫刺激性化合物。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，提供了用于在有需要的患者中抑制癌癥腫瘤生長的組合物，所述組合物包含對腫瘤相關(guān)抗原特異的治療性單克隆抗體、至少一種免疫刺激性化合物、和至少一個免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑。

腫瘤相關(guān)的靶抗原可以在腫瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)。

腫瘤相關(guān)靶抗原可以是可溶性抗原。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是IgG抗體、IgE抗體或其組合。

腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是對MUC1特異性的抗體。

對MUC1特異性的抗體結(jié)合選自SEQ ID NO:5的MUC1的表位。

對MUC1特異性的抗體的重鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:1的核酸編碼，并且其中對MUC1特異性的抗體的輕鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:2的核酸編碼。

對MUC1特異性的抗體的重鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:3的核酸編碼，并且對MUC1特異性的抗體的輕鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:4的核酸編碼。

對MUC1特異性的抗體可以是mAb-AR20.5、mAb 3C6.hIgE、mAb 4H5.hIgE或其組合。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是對CA125特異性的抗體。

對CA125特異性的抗體可以是mAb-B43.13。

免疫刺激性化合物可以是TLR3激動劑或TLR4激動劑。

TLR3激動劑可以是polyIC，polyICLC

免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑是抗PD-1抗體、抗PDL-1、抗CTLA-4抗體或這些受體的分子抑制劑。

抗PD-1抗體可以選自下組：納武單抗抗體，派姆單抗抗體，派第利單抗(pidilizumab)抗體或其組合。

抗PDL-1抗體可以選自下組：B7-H1抗體、BMS-936559抗體、MPDL3280A(艾特佐利單抗(atezolizumab))抗體、MEDI-4736抗體、MSB0010718C抗體或其組合。

抗CTLA-4抗體可以選自下組：易普利姆瑪或特立美麗單抗(tremelimumab)或其組合。

治療性腫瘤相關(guān)抗原特異性抗體可以是鼠單克隆抗體(異種型)、嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體或完全人單克隆抗體。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以具有可以是人起源的恒定區(qū)。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以具有人起源、非人起源或其任何組合的可變區(qū)。

癌癥可以選自胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胃腸癌、肺癌和多發(fā)性骨髓瘤。

腫瘤相關(guān)抗原可以是CA125、葉酸結(jié)合蛋白(FBP)、HER2/neu，MUC1或PSA。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，提供了用于在有需要的患者中抑制癌癥腫瘤生長的試劑盒，所述試劑盒包含

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體，

至少一種免疫刺激性化合物，

至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑，和

關(guān)于如何使用所述試劑盒的用法說明。

腫瘤相關(guān)的靶抗原可以在腫瘤的細(xì)胞表面上表達(dá)。

腫瘤相關(guān)靶抗原可以是可溶性抗原。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是IgG抗體、IgE抗體或其組合。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是對MUC1特異性的抗體。

對MUC1特異性的抗體結(jié)合選自SEQ ID NO:5的MUC1的表位。

對MUC1特異性的抗體的重鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:1的核酸編碼，并且其中對MUC1特異性的抗體的輕鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:2的核酸編碼。

對MUC1特異性的抗體的重鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:3的核酸編碼，并且對MUC1特異性的抗體的輕鏈可變區(qū)可以由包含SEQ ID NO:4的核酸編碼。

對MUC1特異性的抗體可以是mAb-AR20.5、mAb 3C6.hIgE、mAb 4H5.hIgE或其組合。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是對CA125特異性的抗體。

對CA125特異性的抗體可以是mAb-B43.13。

免疫刺激性化合物可以是TLR3激動劑或TLR4激動劑。

TLR3激動劑可以是polyIC，polyICLC

免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑是抗PD-1抗體、抗PDL-1、抗CTLA-4抗體或這些受體的分子抑制劑。

抗PD-1抗體可以選自下組：納武單抗抗體，派姆單抗抗體，派第利單抗(pidilizumab)抗體或其組合。

抗PDL-1抗體可以選自B7-H1抗體、BMS-936559抗體、MPDL3280A(艾特佐利單抗(atezolizumab))抗體、MEDI-4736抗體、MSB0010718C抗體或其組合。

抗CTLA-4抗體可以選自下組：易普利姆瑪或特立美麗單抗(tremelimumab)或其組合。

治療性腫瘤相關(guān)抗原特異性抗體可以是鼠單克隆抗體(異種型)、嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體或完全人單克隆抗體。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以具有可以是人源的恒定區(qū)。

對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以具有人起源、非人起源或其任何組合的可變區(qū)。

癌癥可以選自胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胃腸癌、肺癌和多發(fā)性骨髓瘤。

腫瘤相關(guān)抗原可以是CA125、葉酸結(jié)合蛋白(FBP)、HER2/neu，MUC1或PSA。

下文定義了以下術(shù)語。

如本文中使用，術(shù)語“組合物”意圖涵蓋包含規(guī)定量的規(guī)定成分的產(chǎn)品，以及直接或間接源自規(guī)定量的規(guī)定成分的組合的任何產(chǎn)品。就藥物組合物或其它組合物而言的此類術(shù)語通常意圖涵蓋包含活性成分和構(gòu)成載體的惰性成分的產(chǎn)品，以及直接或間接源自任何兩種或更多種成分的組合、復(fù)合或聚集，或者一種或多種成分的解離，或一種或多種成分的其它類型的反應(yīng)或相互作用的任何產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的藥物組合物或其它組合物通常涵蓋通過混合本發(fā)明的化合物和藥學(xué)上可接受的載體制備的任何組合物?！八帉W(xué)上可接受的”或“可接受的”是指載體、稀釋劑或賦形劑必須與配制劑的其它成分相容并且對其接受者無害。

在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國藥典或其它公認(rèn)的藥典中列出的用于動物，更特別是用于人的。術(shù)語“載體”是指與治療劑一起施用的稀釋劑，佐劑，賦形劑或媒介物。此類藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成起源的那些，如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物組合物時，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要的話，組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以采用溶液，懸浮液，乳液，片劑，丸劑，膠囊，粉劑，緩釋配制劑等形式。組合物可以配制成栓劑，使用傳統(tǒng)的粘合劑和載體如甘油三酯?？诜渲苿┛砂?biāo)準(zhǔn)載體，如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的實(shí)例描述于E.W.Martin的著作“Remington's Pharmaceutical Sciences”。此類組合物將含有治療有效量的抗體或其片段，優(yōu)選以純化形式，與合適量的載體一起以提供用于對患者適當(dāng)施用的形式。配制劑應(yīng)該適合施用方式。

如在本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語“抑制”意指減緩、阻礙、抑制、減少或防止。例如，“抑制腫瘤細(xì)胞生長”在該術(shù)語在本文中使用時是指減緩、阻礙、抑制、減少或防止腫瘤細(xì)胞生長。

如本文所用，術(shù)語“施用”是指在預(yù)定的一種或多種細(xì)胞或組織，通常哺乳動物的情況下導(dǎo)致暴露或接觸根據(jù)本發(fā)明的組合物的任何行為，所述組合物含有與至少一種免疫刺激性化合物，和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體。如本文中使用，可以在體內(nèi)，體外或離體進(jìn)行施用。例如，可以通過注射或通過內(nèi)窺鏡施用組合物。施用還包括將根據(jù)本發(fā)明的組合物直接應(yīng)用于細(xì)胞。例如，在手術(shù)過程中，可以暴露腫瘤細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，可以將這些暴露的細(xì)胞(或腫瘤)直接暴露于本發(fā)明的組合物，例如通過清洗或沖洗手術(shù)部位和/或細(xì)胞，或通過將對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體與至少一種免疫刺激性化合物以及至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合，單獨(dú)或混合，直接在腫瘤內(nèi)注射。

術(shù)語“表位”意指能夠在一個或多個抗體的結(jié)合區(qū)域上被抗體識別和結(jié)合的抗原的部分。表位通常包括分子，如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面聚集(grouping)，并且具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。在一個實(shí)施方案中，抗原的表位是重復(fù)表位。在一個實(shí)施方案中，抗原的表位是非重復(fù)表位。

如本文中所用，術(shù)語“受試者”是人患者或其它動物，如具有功能性肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞的另一種哺乳動物。在人中，適當(dāng)?shù)募?xì)胞表達(dá)對于所施用的本發(fā)明的IgG抗體的針對IgG的高親和力受體，以及針對所施用的本發(fā)明的IgE抗體的IgE(FcεRI)。

如本文中使用，如本文所用的癌癥腫瘤或轉(zhuǎn)移的細(xì)胞或腫瘤的生長動力學(xué)的降低或完全消除定義為是指如本領(lǐng)域所理解的。例如，生長動力學(xué)的降低是指相對于通常對給定的腫瘤類型體內(nèi)或體外觀察到的指數(shù)生長、特定生長速率或倍增時間，原發(fā)性實(shí)體瘤、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性腫瘤的指數(shù)生長、特定生長速率或倍增時間的縮短。腫瘤的完全消除是在與至少一種免疫刺激性化合物以及至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體的存在下，通過癥狀、身體檢查或放射攝影成像的腫瘤存在的缺乏，其中先前通過這些檢測方法看到存在腫瘤。

如本文使用，術(shù)語“腫瘤相關(guān)抗原”(TAA)可以是可與本領(lǐng)域已知的腫瘤相關(guān)的任何類型的癌癥抗原，并且包括在細(xì)胞表面，包括腫瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的抗原，以及可溶性癌癥抗原。腫瘤和正常細(xì)胞上的幾種細(xì)胞表面抗原具有可溶性對應(yīng)物。此類抗原包括但不限于在癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)、腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(TEC)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)上發(fā)現(xiàn)的抗原。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)靶抗原的實(shí)例包括但不限于：碳酸酐酶IX(CAIX)；成纖維細(xì)胞活化蛋白α(FAPα)；和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，包括MMP-2和MMP-9。腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(TEC)靶抗原的實(shí)例包括但不限于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，包括VEGFR-1、2和3；CD-105(內(nèi)皮因子)、腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物(TEM)，包括TEM1和TEM8；MMP-2；存活蛋白和前列腺特異性膜抗原(PMSA)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抗原的實(shí)例包括但不限于：CD105；MMP-9；VEGFR-1、2、3和TEM8。根據(jù)一些實(shí)施方案，腫瘤相關(guān)抗原可以是CA125、葉酸結(jié)合蛋白(FBP)、HER2/neu，MUC1或PSA。

在詳細(xì)描述本發(fā)明前，將定義多個術(shù)語。如本文中使用，單數(shù)形式“一”，“一個/種”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有明確指示。

應(yīng)當(dāng)注意，如“優(yōu)選”，“通?！焙汀暗湫偷亍钡男g(shù)語在本文中不用于限制要求保護(hù)的發(fā)明的范圍或暗示某些特征對于要求保護(hù)的發(fā)明的結(jié)構(gòu)或功能是關(guān)鍵的，必要的或甚至重要的。相反，這些術(shù)語僅旨在突出可以或不可在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中使用的備選或附加特征。

為了描述和限定本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)注意，術(shù)語“基本上”在本文中用于表示可以歸因于任何定量比較、值、測量或其它表示的不確定性的固有程度。術(shù)語“基本上”在本文中也用于表示定量表示可以與敘述參照變化，而不導(dǎo)致所討論的主題的基本功能的變化的程度。

根據(jù)如附圖中所示的所選擇的實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的主題的特征和優(yōu)點(diǎn)將變得更加明顯。如將認(rèn)識到的，所公開和要求保護(hù)的主題能夠在各個方面進(jìn)行修改，都而不脫離權(quán)利要求的范圍。因此，附圖和描述將被視為本質(zhì)上是說明性的，而不是限制性的，并且主題的全部范圍在權(quán)利要求中闡述。

本文引用的參考文獻(xiàn)，包括公開的或相應(yīng)的美國或外國專利申請，公告的美國或外國專利以及任何其它參考文獻(xiàn)通過引用的方式整體并入本文，包括所引用的參考文獻(xiàn)中呈現(xiàn)的所有數(shù)據(jù)、表格、圖和文本。

附圖說明

根據(jù)結(jié)合附圖采用的以下詳細(xì)描述，本公開的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯，其中：

圖1顯示了具有Chou-Fasman預(yù)測的串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征的粘蛋白多肽骨架。

圖2顯示了使用抗原特異性IgG與TLR3激動劑和檢查點(diǎn)抑制劑的組合的實(shí)驗設(shè)計。

圖3顯示了對于第三組動物用MUC1-Panc02腫瘤細(xì)胞的第一次攻擊后腫瘤出現(xiàn)前的時間。用A)單獨(dú)的AR20.5，相對于對照；B)AR20.5和抗PDL-1，相對于對照；C)AR20.5、抗PDL-1和Poly(I:C)相對于對照；D)AR20.5和Poly(I:C)，相對于對照；E)單獨(dú)的抗PDL-1，相對于對照；F)抗PDL-1和Poly(I:C)，相對于對照的處理。實(shí)線表示對照，而虛線表示處理條件。

圖4顯示了用MUC1-Panc02的第一次攻擊后不同處理組的腫瘤生長曲線。在55天的時段內(nèi)隨時間繪制腫瘤體積。

圖5顯示了在用MUC1-Panc02再攻擊后來自不同處理組的存活小鼠的腫瘤生長曲線。在46天的時段內(nèi)繪制來自MUC-1-Panco-2攻擊的體側(cè)的腫瘤體積。

圖6顯示了來自在相反體側(cè)中用Neo-Panc02再攻擊后不同處理的存活小鼠的腫瘤生長曲線。在46天的時段內(nèi)來自neo-panc02的腫瘤體積。

圖7顯示了來自已經(jīng)抵抗用聯(lián)合處理的初次腫瘤攻擊的再攻擊的小鼠的MUC1和新對照腫瘤的圖像。對照小鼠顯示在未免疫的動物中生長的MUC1-panco2和neo-panco-2腫瘤的可比性。在處理的小鼠中，不表達(dá)MUC1(Neo腫瘤)的免疫耐受性腫瘤比表達(dá)MUC1的腫瘤細(xì)胞(MUC1腫瘤)生長得更快，證實(shí)了用AR20.5和Poly(I:C)或AR20.5、Poly(I:C)和抗PDL-1的先前免疫的抗原特異性。

圖8顯示了來自接受AR20.5、抗PDL-1和Poly(I:C)聯(lián)合處理并且排斥初次腫瘤攻擊的小鼠的脾細(xì)胞對兩只MUC-1轉(zhuǎn)基因小鼠的過繼性轉(zhuǎn)移。用MUC1-Panc02腫瘤攻擊小鼠，隨后出現(xiàn)腫瘤。未處理的小鼠充當(dāng)此攻擊的對照。該實(shí)驗證實(shí)脾細(xì)胞傳遞腫瘤抗性。

圖9顯示了使用抗原特異性IgE與TLR3激動劑和檢查點(diǎn)抑制劑的組合的實(shí)驗設(shè)計。

圖10顯示了用MUC1-Panc02腫瘤細(xì)胞的第一次攻擊后腫瘤出現(xiàn)的時間。用A)單獨(dú)的抗MUC1 IgE，相對于對照；B)抗MUC1 IgE和抗PDL-1，相對于對照；C)抗MUC1 IgE、抗PDL-1和Poly(I:C)相對于對照；D)抗MUC1 IgE和Poly(I:C)，相對于對照；E)單獨(dú)的抗PDL-1，相對于對照；F)單獨(dú)的Poly(I:C)，相對于對照；和G)抗PDL-1和Poly(I:C)，相對于對照處理。實(shí)線表示對照，而虛線表示處理條件。

圖11顯示了在46天里在用腫瘤的MUC1-Panc02的第一次攻擊后的不同處理組的腫瘤生長曲線。

圖12顯示了在存活小鼠的一邊體側(cè)中用MUC1-Panc02再攻擊后的MUC1腫瘤的腫瘤生長曲線。A)抗MUC1 IgE、抗PDL-1和Poly(I:C)相對于對照的無腫瘤百分比；和B)抗MUC1 IgE、抗-PDL-1和Poly(I:C)相對于對照的腫瘤體積，在57天時段里。

圖13顯示了在存活小鼠的相反體側(cè)中用MUC1-Panc02再攻擊后Neo腫瘤的腫瘤生長曲線。A)抗MUC1 IgE、抗PDL-1和Poly(I:C)相對于對照的無腫瘤百分比；和B)抗MUC1 IgE、抗-PDL-1和Poly(I:C)相對于對照的腫瘤體積，在57天時段里。

圖14顯示了來自第二次聯(lián)合處理攻擊免疫的小鼠和未免疫的對照小鼠的MUC1和新對照腫瘤的圖像，其證實(shí)了抗原特異性并且顯示在已經(jīng)抵抗初次腫瘤攻擊的先前用抗MUC1 IgE和Poly(I:C)和抗PDL-1免疫的小鼠中，不表達(dá)MUC1的腫瘤(Neo腫瘤)比表達(dá)MUC1的腫瘤細(xì)胞(MUC1腫瘤)生長更快。

具體實(shí)施方式

在實(shí)施方案中，公開了用于治療患者中的癌癥的方法，包括將對腫瘤相關(guān)抗原特異性的單克隆抗體與至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合施用給患者。

出乎意料地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的單克隆抗體可以抑制腫瘤生長。不受理論的束縛，根據(jù)本發(fā)明的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的單克隆抗體與免疫刺激性化合物和免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑的組合似乎保護(hù)受試者免于腫瘤生長。本發(fā)明是獨(dú)特的且出人意料的，因為其提供這三種免疫調(diào)節(jié)劑之間的協(xié)同效應(yīng)，以大大降低甚至完全抑制腫瘤生長。最終結(jié)果是腫瘤會生長緩慢或甚至被消除。這與單獨(dú)使用這些單獨(dú)的免疫效應(yīng)物形成鮮明對比，其在阻斷腫瘤細(xì)胞生長方面效率較低。

如本文中使用，癌癥腫瘤或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或腫瘤的生長動力學(xué)的降低或完全消除定義為是指如本領(lǐng)域所理解的。例如，生長動力學(xué)的降低是指相對于通常對給定的腫瘤類型體內(nèi)或體外觀察到的指數(shù)生長、特定生長速率或倍增時間，原發(fā)性實(shí)體瘤、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性腫瘤的指數(shù)生長、特定生長速率或倍增時間的縮短。腫瘤的完全消除是在與至少一種免疫刺激性化合物以及至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體的存在下通過癥狀、身體檢查或放射攝影成像的腫瘤存在的缺乏，其中先前通過這些檢測方法看到存在腫瘤。

根據(jù)一個實(shí)施方案，抗原特異性抗體可用于增強(qiáng)T細(xì)胞對自身抗原的反應(yīng)性，特別是在與自身相同的人腫瘤相關(guān)抗原(TAA)中沒有突變的患者中。通過用低劑量免疫原性抗體結(jié)合自身抗原，可用的腫瘤特異性T細(xì)胞的庫得到增強(qiáng)，并且檢查點(diǎn)干擾可以導(dǎo)致增加的免疫性和增強(qiáng)的療法的臨床活性。除了已經(jīng)發(fā)現(xiàn)刺激適應(yīng)性免疫的方面的選擇性化療劑和免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑之外，佐劑如TLR3或TLR4激動劑的使用可以進(jìn)一步增強(qiáng)這種效果。

免疫調(diào)節(jié)劑的組合效果完全或部分導(dǎo)致對腫瘤生長的抑制和/或腫瘤破壞的促進(jìn)。

如本發(fā)明中使用，“對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體”是單克隆抗體，其可以是任何合適的單克隆抗體，例如IgG和/或IgE(其包含人Fc epsilon(ε)恒定區(qū))，并且還包含含有至少一個對腫瘤相關(guān)抗原(TAA)特異性的抗原結(jié)合區(qū)的可變區(qū)，所述腫瘤相關(guān)抗原是位于腫瘤微環(huán)境中或以其它方式緊密靠近所治療的腫瘤的細(xì)胞表面抗原或可溶性癌癥抗原。

在一個實(shí)施方案中，對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以對位于非腫瘤細(xì)胞上的癌癥抗原是特異性的，例如VEGFR-2、MMP、存活蛋白、TEM8和PMSA。癌癥抗原可以是上皮癌癥抗原(例如乳腺，胃腸，肺)、前列腺特異性癌癥抗原(PSA)或前列腺特異性膜抗原(PSMA)、膀胱癌癥抗原，肺(例如小細(xì)胞肺)癌癥抗原、結(jié)腸癌癥抗原、卵巢癌癥抗原、腦癌癥抗原、胃癌癥抗原、腎細(xì)胞癌癥抗原、胰腺癌癥抗原、肝癌癥抗原、食管癌癥抗原或頭頸癌抗原。癌癥抗原還可以是淋巴瘤抗原(例如非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)、B細(xì)胞淋巴瘤癌癥抗原、白血病抗原、骨髓瘤(即多發(fā)性骨髓瘤或漿細(xì)胞骨髓瘤)抗原、急性淋巴細(xì)胞性白血病抗原、慢性髓樣白血病抗原或急性骨髓性白血病抗原。

其它癌癥抗原包括但不限于在大多數(shù)人腺癌上發(fā)現(xiàn)的粘蛋白-1蛋白或肽(MUC-1)：胰腺、結(jié)腸、乳腺、卵巢、肺、前列腺、頭和頸，包括多發(fā)性骨髓瘤和一些B細(xì)胞淋巴瘤；人類表皮生長因子受體-2(HER-2/neu)抗原；表皮生長因子受體(EGFR)抗原相關(guān)的肺癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、腦癌和膀胱癌；在雄激素非依賴性前列腺癌中主要表達(dá)的前列腺特異性抗原(PSA)和/或前列腺特異性膜抗原(PSMA)；與黑色素瘤癌胚(CEA)抗原相關(guān)的gp-100(糖蛋白100)；與Lewis A血型物質(zhì)相關(guān)并與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的碳水化合物抗原19.9(CA 19.9)；和黑素瘤癌癥抗原，如MART-1。

其它抗原包括間皮素、葉酸結(jié)合蛋白(FBP)、碳水化合物抗原125(CA-125)和黑素瘤相關(guān)抗原如NYESO 1。

在一個實(shí)施方案中，癌癥抗原是細(xì)胞表面癌癥抗原的釋放的、可溶的形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，嚴(yán)格上，腫瘤相關(guān)靶抗原是位于腫瘤細(xì)胞表面上的細(xì)胞表面抗原。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤相關(guān)抗原選自：CA125、葉酸結(jié)合蛋白(FBP)、HER2/neu，MUC1和PSA。

如本文中使用，術(shù)語“單克隆抗體”是指單分子組合物的抗體制備物。單克隆抗體組合物顯示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選是嵌合的、人源化的或完全人類的，以便當(dāng)受試者宿主是人時結(jié)合人抗體受體，如人Fcε受體。當(dāng)宿主受試者是人時，人源化和完全人抗體也可用于降低針對例如嵌合抗體的鼠組分的免疫原性。單克隆抗體可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，包括但不限于重組和合成方式。

術(shù)語“嵌合單克隆抗體”是指展示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有一個或多個源自一種抗體的區(qū)域和一個或多個源自另一抗體的區(qū)域。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，恒定區(qū)源自人ε(ε)恒定區(qū)(重鏈)和人κ或λ(輕鏈)恒定區(qū)。本發(fā)明的嵌合IgE單克隆抗體的可變區(qū)通常是非人起源的，如來自嚙齒動物，例如小鼠(鼠)、兔、大鼠或倉鼠。

如本文中使用，“人源化”單克隆抗體包含源自人ε恒定區(qū)(重鏈)和人κ或λ(輕鏈)恒定區(qū)的恒定區(qū)?？贵w的可變區(qū)優(yōu)選包含人起源的框架和非人起源的抗原結(jié)合區(qū)(CDR)。

可以通過疫苗接種遺傳工程化動物，如在安進(jìn)公司(Amgen)和百時美施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb)提供的小鼠品系產(chǎn)生完全人或人樣抗體，所述遺傳工程化動物含有人免疫球蛋白遺傳庫，并且響應(yīng)疫苗接種產(chǎn)生完全人抗體。此外，使用摻入人可變區(qū)的編碼區(qū)的噬菌體展示文庫，其可以在抗原篩選測定中被鑒定和選擇，以產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的人免疫球蛋白可變區(qū)。

術(shù)語“抗原結(jié)合區(qū)”是指包含與抗原相互作用并對抗體賦予其對抗原的特異性和親和力的氨基酸殘基的如本發(fā)明中使用的抗體的部分。抗體區(qū)域包括維持抗原結(jié)合殘基的正確構(gòu)象必需的“框架”氨基酸殘基。

“抗原”是能夠被抗體結(jié)合的分子或分子部分，其另外能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生能夠結(jié)合該抗原的表位的抗體?？乖梢跃哂幸粋€或多個相同或不同的表位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對單個表位是特異性的。在一個實(shí)施方案中，抗原能夠被如本發(fā)明中使用的抗體結(jié)合以形成免疫復(fù)合物，能夠抑制癌癥腫瘤生長，所述抗體與至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合。在一個實(shí)施方案中，由于許多原因，抗原本身可能不能刺激免疫應(yīng)答，例如，抗原是“自身”抗原，通常不被免疫系統(tǒng)識別為需要應(yīng)答，或者免疫系統(tǒng)變得對抗原耐受并且不引起免疫應(yīng)答。在另一個實(shí)施方案中，抗原是MUC1。

術(shù)語“表位”意指能夠在一個或多個抗體的結(jié)合區(qū)域被抗體識別和結(jié)合的抗原部分。表位通常包括分子，如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面聚集，并且具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。在一個實(shí)施方案中，抗原的表位是重復(fù)表位。在一個實(shí)施方案中，抗原的表位是非重復(fù)表位。

因此，在實(shí)施方案中，對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是任何合適的抗體。根據(jù)另一個實(shí)施方案，對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體可以是任何合適的IgG和/或IgE抗體。根據(jù)一個實(shí)施方案，腫瘤相關(guān)抗原可以是CA125、葉酸結(jié)合蛋白(FBP)、HER2/neu，MUC1或PSA。根據(jù)另一個實(shí)施方案，對腫瘤相關(guān)抗原特異性的單克隆抗體可以是例如mAb-AR20.5、mAb-B43.13、mAb 3C6.hIgE、mAb 4H5.hIgE。根據(jù)另一實(shí)施方案，治療性腫瘤相關(guān)抗原特異性抗體可以是嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體或完全人單克隆抗體。

用于制備抗體(例如針對抗原的鼠抗體)和用于確定所選抗體是否結(jié)合獨(dú)特抗原表位的方法是本領(lǐng)域熟知的。

期望抗體的篩選可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)完成，例如放射免疫測定，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)，“夾心”免疫測定，免疫放射測定，凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)，免疫擴(kuò)散測定，原位免疫測定(例如使用膠體金，酶或放射性同位素標(biāo)記物)，蛋白質(zhì)印跡，沉淀反應(yīng)，凝集測定(例如凝膠凝集測定，血凝集測定)，補(bǔ)體固定測定，免疫熒光測定，蛋白A測定和免疫電泳測定等。本領(lǐng)域已知用于在免疫測定中檢測結(jié)合的許多手段，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

對于單克隆抗體的制備，可以使用提供通過培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)(參見例如Antibodies--A Laboratory Manual,Harlow和Lane編,Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York,1988)。這些技術(shù)包括但不限于最初由Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495-497)開發(fā)的雜交瘤技術(shù)、以及三體瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人,1983,Immunology Today,4:72)和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96頁)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可以利用最近的技術(shù)(PCT/US90/02545)在無菌動物中產(chǎn)生單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，可以使用人抗體，并且可以通過使用人雜交瘤(Cote等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:2026-2030)或通過用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(Cole等人，1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77-96頁)獲得。事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明，可以使用開發(fā)用于產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等人，1984,J.Bacteriol.159:870；Neuberger等人，1984,Nature 312:604-608；Takeda等人1985,Nature 314:452-454)，其通過剪接來自對多肽特異性的小鼠抗體分子的基因以及來自適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因進(jìn)行；此類抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的抗體是包含選自以下的核酸序列的IgE單克隆抗體：由包含SEQ ID NO:1的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)；由包含SEQ ID NO:2的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)及其任何組合，并且其中將所述重鏈和輕鏈分別植入到人ε重鏈和κ輕鏈基因上。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的抗體是包含選自以下的核酸序列的IgE單克隆抗體：由SEQ ID NO:3的核酸編碼的重鏈可變區(qū)；由SEQ ID NO:4的核酸編碼的輕鏈可變區(qū)及其任何組合，并且其中將所述重鏈和輕鏈分別植入到人ε重鏈和κ輕鏈基因上。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了單克隆抗體3C6.hIgE，其包含從VU-3C6雜交瘤克隆并且分別植入到人Igκ輕鏈和ε重鏈基因上的IgG的輕鏈和重鏈的可變區(qū)。VU-3C6靶向人類粘蛋白1(hMUC1)，源自腺上皮的腫瘤上過表達(dá)的粘蛋白的低糖基化形式。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包含IgE抗體4H5.hIgE，其對于與3C6.hIgE特異性針對的MUC1同種型不同的MUC1同種型是特異性的。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體3C6.hIgE，其包含由包含SEQ ID NO:1的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)；由包含SEQ ID NO:2的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體4H5.hIgE?？贵w4H5.hIgE具有由SEQ ID NO:3的核酸編碼的重鏈可變區(qū)和由SEQ ID NO:4的核酸編碼的輕鏈可變區(qū)，并且植入到人Igκ輕鏈和ε重鏈基因。

在一個實(shí)施方案中，對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體是對MUC1的表位特異性的IgG單克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，IgG單克隆抗體是抗體AR20.5，如Qi,W等人；Hybrid Hybridomics.2001；20(5-6):313-24中公開。MAb AR20.5與許多人類癌細(xì)胞系上的MUC1的可溶形式或細(xì)胞表面表位強(qiáng)烈起反應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對包含MUC1的氨基酸STAPPAHGVTSAPDTRPAPG[SEQ ID NO:5]的MUC1的表位是特異性的。確切的表位位于表征MUC1外部結(jié)構(gòu)域的20個氨基酸重復(fù)之一中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠在STAPPAHGVTSAPDTRPAPG[SEQ ID NO:5]處定義的表位處結(jié)合MUC1。

在一個實(shí)施方案中，對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體是對MUC1的表位特異性的IgE單克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對包含MUC1的氨基酸STAPPAHGVTSAPDTRPAPG[SEQ ID NO:5]的MUC1的表位是特異性的。確切的表位位于表征MUC1外部結(jié)構(gòu)域的20個氨基酸重復(fù)之一中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠在STAPPAHGVTSAPDTRPAPG[SEQ ID NO:5]所定義的表位處結(jié)合MUC1。

在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體由通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和Western印跡鑒定的陽性轉(zhuǎn)染瘤表達(dá)。通過有限稀釋克隆陽性轉(zhuǎn)染瘤以實(shí)現(xiàn)最高生產(chǎn)力并選擇用于抗體產(chǎn)生。如本文中使用，“轉(zhuǎn)染瘤”包括表達(dá)抗體的重組真核宿主細(xì)胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和NS/O骨髓瘤細(xì)胞。此類轉(zhuǎn)染瘤方法是本領(lǐng)域眾所周知的(Morrison,S.(1985)Science,229:1202)。用于產(chǎn)生小鼠/人嵌合或人源化抗體的先前公開的方法已經(jīng)導(dǎo)致了各種人嵌合抗體或抗體融合蛋白的成功產(chǎn)生(Helguera G,Penichet ML.,Methods Mol.Med.(2005)109:347-74)。

一般而言，可以通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生嵌合小鼠-人單克隆抗體(即嵌合抗體)。例如，用限制酶消化編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子的Fc恒定區(qū)的基因以除去編碼鼠Fc的區(qū)域，并且替代編碼人Fc恒定區(qū)的基因的等同部分。(參見Robinson等人,國際專利公開PCT/US86/02269；Akira,等人,歐洲專利申請184,187；Taniguchi,M.,歐洲專利申請171,496；Morrison等人,歐洲專利申請173,494；Neuberger等人,國際申請WO 86/01533；Cabilly等人美國專利號4,816,567；Cabilly等人,歐洲專利申請125,023；Better等人(1988Science,240:1041-1043)；Liu等人(1987)PNAS,84:3439-3443；Liu等人,1987,J.Immunol.,139:3521-3526；Sun等人(1987)PNAS,84:214-218；Nishimura等人,1987,Canc.Res.,47:999-1005；Wood等人(1985)Nature,314:446-449；以及Shaw等人,1988,J.Natl Cancer Inst.,80:1553-1559)。

可以通過用來自人Fv可變區(qū)的等同序列替換不直接參與抗原結(jié)合的Fv可變區(qū)的序列來進(jìn)一步人源化嵌合抗體。人源化嵌合抗體的綜述由Morrison,S.L.,1985,Science,229:1202-1207和Oi等人，1986，BioTechniques，4:214提供。那些方法包括分離，操縱和表達(dá)編碼來自重鏈或輕鏈中至少一個的免疫球蛋白Fv可變區(qū)的全部或部分的核酸序列。此類核酸的來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如，可以從7E3，一種產(chǎn)生抗GPII_bIII_a抗體的雜交瘤獲得。然后，可以將編碼嵌合抗體或其片段的重組DNA克隆到合適的表達(dá)載體中。合適的人源化抗體可以替代地通過CDR取代產(chǎn)生(美國專利號5,225,539；Jones等人1986Nature,321:552-525；Verhoeyan等人1988Science,239:1534；以及Beidler等人1988J.Immunol.,141:4053-4060)。

如本文中使用，本發(fā)明的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體的“有效量”是足以識別和結(jié)合作為細(xì)胞表面抗原的TAA的表位并且誘導(dǎo)、引發(fā)或增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的參考免疫應(yīng)答的量。

根據(jù)一個實(shí)施方案，本發(fā)明包括免疫刺激性化合物。免疫刺激性化合物是具有刺激或引發(fā)免疫應(yīng)答的能力的化合物。如本文中使用，該術(shù)語涉及示例性免疫刺激性化合物，其包括toll樣受體(TLR)激動劑(例如TLR3、TLR4、TLR7、TLR9)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-異谷氨酰胺(MDP)、脂多糖LPS，遺傳修飾和/或降解的LPS、明礬、葡聚糖、集落刺激因子(例如EPO、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、PEG化G-CSF、SCF、IL-3、IL6、PIXY 321)，干擾素(例如γ-干擾素，α-干擾素)，白介素(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、MHC II類結(jié)合肽，皂苷(例如QS21)、未甲基化的CpG序列、1-甲基色氨酸、精氨酸酶抑制劑、環(huán)磷酰胺、阻斷免疫抑制功能的抗體(例如抗CTLA4抗體，抗TGF-β等)及其兩種或更多種的混合物。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫刺激性化合物是TLR3激動劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的TLR3激動劑是選自下組的雙鏈核酸：聚肌苷酸和聚胞苷酸，聚腺苷酸和聚尿苷酸，聚肌苷酸類似物和聚胞苷酸，聚肌苷酸和聚胞苷酸類似物，聚肌苷酸類似物和聚胞苷酸類似物，聚腺苷酸類似物和聚尿苷酸，聚腺苷酸和聚尿苷酸類似物，以及聚腺苷酸類似物和聚尿苷酸類似物。作為TLR3激動劑的雙鏈RNA的具體實(shí)例還包括Polyadenur(Ipsen)和Ampligen(Hemispherx)。Polyadenur是polyA/U RNA分子，即含有polyA鏈和polyU鏈。Ampligen公開在例如EP 281 380或EP 113 162中。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，TLR3激動劑可以是Poly(I:C)LC或polyIC其為羧甲基纖維素、聚肌苷酸-聚胞苷酸和聚-L-賴氨酸雙鏈RNA的合成復(fù)合物。Poly(I:C)LC可刺激細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的釋放，并通過誘導(dǎo)干擾素-γ產(chǎn)生可增加各種免疫造血細(xì)胞的殺腫瘤活性。

在一個實(shí)施方案中，免疫刺激性化合物是TLR4激動劑。示例性TLR4激動劑包括紫杉烷類例如紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxal)、脂多糖(LPS)；大腸桿菌LPS；和牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)LPS。

如本文中使用，本發(fā)明的免疫刺激性化合物的“有效量”是足以誘導(dǎo)、引發(fā)或增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的參考免疫應(yīng)答的量。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明包括免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑。免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑是針對免疫檢查點(diǎn)分子的單克隆抗體(mAb)，所述免疫檢查點(diǎn)分子在免疫細(xì)胞上表達(dá)并介導(dǎo)信號以減弱過度的免疫反應(yīng)。根據(jù)一個實(shí)施方案，可以用針對抑制性免疫受體CTLA-4、PD-1和PDL-1的抑制性單克隆抗體進(jìn)行免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制。根據(jù)一些實(shí)施方案，此類抑制劑已經(jīng)成為晚期黑素瘤患者的成功治療方法。根據(jù)一個實(shí)施方案，免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑可以是抗CTLA-4、抗PD-1和/或抗PDL-1抗體之一。根據(jù)一個實(shí)施方案，抗CTLA-4抗體可以是易普利姆瑪或特立美麗單抗(tremelimumab)或其組合。根據(jù)另一個實(shí)施方案，抗PDL-1抗體可以是B7-H1抗體、BMS-936559抗體、MPDL3280A(艾特佐利單抗(atezolizumab))抗體、MEDI-4736抗體、MSB0010718C抗體或其組合。根據(jù)另一個實(shí)施方案，抗PD-1抗體可以是納武單抗抗體、派姆單抗抗體、派第利單抗(pidilizumab)抗體或其組合。此外，PD-1也可以用AMP-224靶向，AMP-224是PD-L2-IgG重組融合蛋白。通過臨床開發(fā)推進(jìn)了免疫應(yīng)答中抑制途徑的其它拮抗劑。IMP321是可溶性LAG-3Ig融合蛋白和MHC II類激動劑，其用于增加對腫瘤的免疫應(yīng)答。LAG3是免疫檢查點(diǎn)分子。Lirilumab是針對KIR受體的拮抗劑，并且BMS 986016是LAG3的拮抗劑。第三抑制性檢查點(diǎn)途徑是TIM-3-半乳凝素-9途徑，其也是檢查點(diǎn)抑制的有希望的靶標(biāo)。RX518靶向并激活糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)，在多種類型的免疫細(xì)胞表面上表達(dá)的TNF受體超家族的成員，所述免疫細(xì)胞包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞，B細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞和活化的樹突細(xì)胞。

如本文所使用，本發(fā)明的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑的“有效量”是足以誘導(dǎo)、引發(fā)或增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的參考免疫應(yīng)答的量。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)施用治療有效量的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體；

b)在步驟a)后施用治療有效量的免疫刺激性化合物；并且

c)在步驟b)后施用治療有效量的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑。

在一個實(shí)施方案中，可以在步驟a)的1天或多天后進(jìn)行步驟b)。在另一個實(shí)施方案中，可以在步驟b)的1天或多天后進(jìn)行步驟c)。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)施用治療有效量的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體；

b)在步驟a)后施用治療有效量的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑；并且

c)在步驟b)后施用治療有效量的免疫刺激性化合物。

在一個實(shí)施方案中，可以在步驟a)的1天或多天后進(jìn)行步驟b)。在另一個實(shí)施方案中，可以在步驟b)的1天或多天后進(jìn)行步驟c)。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)施用治療有效量的免疫刺激性化合物；

b)在步驟a)后施用治療有效量的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體；并且

c)在步驟b)后施用治療有效量的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑。

在一個實(shí)施方案中，可以在步驟a)的1天或多天后進(jìn)行步驟b)。在另一個實(shí)施方案中，可以在步驟b)的1天或多天后進(jìn)行步驟c)。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)施用治療有效量的免疫刺激性化合物；

b)在步驟a)后施用治療有效量的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑；并且

c)在步驟b)后，施用治療有效量的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體。

在一個實(shí)施方案中，可以在步驟a)的1天或多天后進(jìn)行步驟b)。在另一個實(shí)施方案中，可以在步驟b)的1天或多天后進(jìn)行步驟c)。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)施用治療有效量的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑；

b)在步驟a)后施用治療有效量的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體；并且

c)在步驟b)后施用治療有效量的免疫刺激性化合物。

在一個實(shí)施方案中，可以在步驟a)的1天或多天后進(jìn)行步驟b)。在另一個實(shí)施方案中，可以在步驟b)的1天或多天后進(jìn)行步驟c)。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)施用治療有效量的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑；

b)在步驟a)后施用治療有效量的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑；并且

c)在步驟b)后施用治療有效量的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體。

在一個實(shí)施方案中，可以在步驟a)的1天或多天后進(jìn)行步驟b)。在另一個實(shí)施方案中，可以在步驟b)的1天或多天后進(jìn)行步驟c)。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明還包括對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體與至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合用于抑制有需要的患者中的癌癥腫瘤生長的用途。

在實(shí)施方案中，所述用途采用與至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑組合的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體，如上所述，用于在有需要的患者中抑制癌癥腫瘤生長。

根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明還涵蓋用于在有需要的患者中抑制癌癥腫瘤生長的組合物，所述組合物包含對腫瘤相關(guān)抗原特異的治療性單克隆抗體、至少一種免疫刺激性化合物、和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑。

此類組合物包含治療有效量的對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體，至少一種免疫刺激性化合物和至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑，并且還可包括藥學(xué)上可接受的載體。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物包含特異性結(jié)合MUC1的單個表位的治療性IgE單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的方法或用途，可以通過任何免疫學(xué)上合適的途徑向患者施用本發(fā)明的包含對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體、免疫刺激性化合物和免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑的組合物。例如，它們可以通過靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、膀胱內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)或淋巴內(nèi)途徑單獨(dú)或作為組合引入患者。組合物可以為溶液，片劑，氣霧劑或多相配制劑形式。脂質(zhì)體、長循環(huán)脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、可生物降解的微球、膠束等也可以用作載體、媒介物或遞送系統(tǒng)。此外，使用本領(lǐng)域熟知的體外方法，可以從患者取出來自患者的血液或血清；任選地，可能期望純化患者血液中的抗原；然后可以將血液或血清與包含根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合劑的組合物混合；并且將處理的血液或血清返回到患者。本發(fā)明不應(yīng)限于將結(jié)合劑引入患者的任何特定方法。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)常規(guī)方法將組合物配制為適于靜脈內(nèi)施用于人的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是在無菌等張水性緩沖液中的溶液。當(dāng)通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌藥物級水或鹽水的輸注瓶分配。當(dāng)通過注射施用組合物時，可以提供注射用無菌水或鹽水的安瓿，以便可以在施用前混合成分。

本發(fā)明的組合物可以配制成中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與陰離子如源自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子形成的鹽，以及與陽離子形成的鹽，如源自氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些陽離子。

將有效治療、抑制和預(yù)防與本發(fā)明的抗體特異針對的抗原相關(guān)的腫瘤生長的本發(fā)明組合物的量可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定?？梢皂憫?yīng)純化抗原(例如MUC1)的皮內(nèi)施用，通過標(biāo)準(zhǔn)皮膚風(fēng)團(tuán)和福萊爾(flair)響應(yīng)來測定外血管空間中抗體的存在。此外，可以任選地采用體外測定以幫助鑒定最佳劑量范圍。在配制劑中采用的精確劑量還將取決于施用途徑和疾病或病癥的嚴(yán)重性，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)從業(yè)者的判斷和每個患者的情況來決定。有效劑量可以從源自體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量-響應(yīng)曲線外推。

對于本發(fā)明中使用的抗體，向患者施用的劑量通常為0.001μg/kg至1mg/kg患者體重。優(yōu)選地，向患者施用的劑量為0.01μg/kg至0.1mg/kg患者體重，更優(yōu)選0.02μg/kg至20μg/kg患者體重。本發(fā)明的抗體的較低劑量和較不頻繁的施用也可以是可能的。

對于本發(fā)明中使用的免疫刺激性化合物，施用于患者的劑量可以根據(jù)已由它們各自的制造商優(yōu)化的范圍或濃度。

對于本發(fā)明中使用的免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑，對患者施用的劑量可以根據(jù)其各自制造商已經(jīng)優(yōu)化的范圍或濃度。

本發(fā)明的藥物組合物具有體外和體內(nèi)診斷和治療效用。例如，可以將這些分子施用于培養(yǎng)物中的細(xì)胞，例如，體外或離體，或在受試者中，例如在體內(nèi)，以治療癌癥。如本文中使用，術(shù)語“受試者”意圖包括人和非人動物。優(yōu)選的受試者是患有癌癥的人類患者。如本文中使用，術(shù)語“治療”癌癥包括：預(yù)防患者中腫瘤轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，抑制患者的癌癥發(fā)作；消除或減少患有轉(zhuǎn)移性癌癥或定位于起源器官的癌癥的患者中預(yù)先存在的腫瘤負(fù)荷；延長癌癥患者中的存活；延長用化療和/或手術(shù)的初始治療后癌癥患者中的消退期；和/或延長患者中癌癥消退和癌癥復(fù)發(fā)之間的任何時期。

當(dāng)用作治療癌癥的療法時，以治療有效量(即治療臨床上明顯的腫瘤或防止臨床上明顯的腫瘤的出現(xiàn)需要的量，在初始部位或遠(yuǎn)端部位，在未來的某個時間點(diǎn))向患者施用用于本發(fā)明的抗體。用于本發(fā)明的抗體和含有它們的藥物組合物通常將在可能時胃腸外施用，或在靶細(xì)胞部位或靜脈內(nèi)施用。

根據(jù)又一個實(shí)施方案，本發(fā)明還包括用于在有需要的患者中抑制癌癥腫瘤生長的試劑盒。試劑盒可以包含對腫瘤相關(guān)抗原特異性的治療性單克隆抗體、至少一種免疫刺激性化合物，至少一種免疫穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)抑制劑和關(guān)于如何使用試劑盒的說明書。

通過參考以下實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，所述實(shí)施例用于闡明本發(fā)明而不是限制其范圍。

實(shí)施例1

通過抗原特異性IgG和組合免疫的小鼠中的體內(nèi)腫瘤攻擊研究

為了首先建立此治療方法的原理，需要具有合適的特異性的抗體和表達(dá)腫瘤抗原的腫瘤模型，以在對該腫瘤抗原有耐受性的動物中評估。選擇用人MUC1基因(panc02.muc1)轉(zhuǎn)染的Panc02腫瘤細(xì)胞系。panc02腫瘤與BL6小鼠同基因，并且panc02.muc1與對于人MUC1轉(zhuǎn)基因的BL6Tg小鼠完全同基因。用于證明實(shí)驗的抗體是來自奎斯特藥業(yè)技術(shù)公司(Quest PharmaTech)的mAb-AR20.5，先前證明在多個實(shí)驗系統(tǒng)中誘導(dǎo)對其配體MUC1的免疫的鼠單克隆抗體。AR20.5是結(jié)合MUC1的核心串聯(lián)重復(fù)中的序列DTRPAP的IgG1κ單克隆抗體(參見圖1)。

實(shí)驗設(shè)計

1)MUC1.Tg動物(即對MUC1免疫耐受)：用1×10⁶個Panc02.MUC1細(xì)胞皮下攻擊所有動物。

2)在第7、第17天、第27天和此后每10天直至疾病進(jìn)展或第47天靜脈注射mAb-AR20.5(100μg)。

3)在腫瘤攻擊后第7天，然后在第12天、第17天、第22天和每5天直到疾病進(jìn)展或第47天靜脈給予50μg Poly(I:C)

4)在第8天、第10天、第13天、第15天、第18天、第20天、第23、第25天和相同周期(后第1天和第3天)直到疾病進(jìn)展或第47天腹腔給予200μg抗PDL-1(克隆10F.9G2BioXL)。

關(guān)于本實(shí)施例的實(shí)驗設(shè)計和在實(shí)施例2中顯示腫瘤抗性的小鼠的再攻擊的示例，參見圖2。

實(shí)驗結(jié)果用隨時間的無腫瘤百分比(圖3)和隨時間測量的腫瘤體積(圖4)繪圖。觀察到使用AR20.5和TLR3刺激與抗PDL-1組合結(jié)合的聯(lián)合療法的顯著治療效果。這些結(jié)果顯示三種免疫調(diào)節(jié)劑[抗MUC1AR20.5，抗PDL-1和Poly(I:C)]之間的有力的相互作用，并且證明了出乎意料的有力的腫瘤生長抑制作用和抗腫瘤作用。

實(shí)施例2

再攻擊腫瘤耐受性動物以確認(rèn)免疫記憶和特異性

來自在第47天沒有顯示疾病進(jìn)展的初次攻擊實(shí)驗(實(shí)施例1)的動物不再接受進(jìn)一步的處理，并且再觀察30天(至77天)。如果仍然沒有腫瘤生長，則在一邊體側(cè)用Panc02.MUC1(1×10⁶)再攻擊這些存活的動物，并且在另一邊體側(cè)用不表達(dá)MUC1的對照Panc02細(xì)胞(1×10⁶)再攻擊，以確定是否存在對MUC1的記憶應(yīng)答，以及是否存在對Panc02細(xì)胞上其它腫瘤抗原的表位擴(kuò)展或一般免疫的證據(jù)。另外觀察再攻擊的動物多達(dá)60天以獲得腫瘤生長的證據(jù)(在初次攻擊后137天和二次腫瘤攻擊后60天)。(關(guān)于方案，再次參見圖2)。

這些小鼠的值得注意的比例表現(xiàn)出對MUC1-Panc02細(xì)胞的抗原特異性排斥，但不排斥來自相反體側(cè)的抗原陰性新對照腫瘤細(xì)胞(圖5-6)。此外，在未能完全排斥第二輪MUC1-Panc02細(xì)胞攻擊的小鼠的實(shí)例中，它們在腫瘤細(xì)胞攻擊的50天后產(chǎn)生顯著較小的MUC-1腫瘤(6.0mm×3.8mm×4.8mm)，其與對照腫瘤相比沒有進(jìn)展(18.9mm×21.3mm×22.3mm)(參見圖7)。

實(shí)施例3

從腫瘤免疫小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移

收獲來自用AR20.5+Poly(I:C)+抗-PDL-1組合免疫的腫瘤免疫小鼠的脾細(xì)胞并培養(yǎng)5天，然后通過尾靜脈注射轉(zhuǎn)移到兩只新鮮的MUC1.Tg轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)移后，用2×10⁶個細(xì)胞/ml MUC1-Panc02細(xì)胞攻擊小鼠，將腫瘤的生長再監(jiān)測幾天。尚未接受先前處理或初次攻擊的對照小鼠也在兩邊體側(cè)中接受相同的攻擊。結(jié)果示于圖8。接受轉(zhuǎn)移的脾細(xì)胞的兩只小鼠中的一只完全抵抗腫瘤攻擊，并且在第二只小鼠中，腫瘤的出現(xiàn)相對于未處理的對照小鼠延遲。

實(shí)驗證實(shí)腫瘤特異性抗性存在于脾區(qū)室中。

實(shí)施例4

抗原特異性IgE與TLR3激動劑和檢測點(diǎn)抑制劑組合的使用

用來自同基因大鼠胰腺腫瘤細(xì)胞系humuc1-Panc02轉(zhuǎn)染瘤(表達(dá)人MUC1)的總共10⁶個細(xì)胞皮下接種攜帶人MUC1和人FcεRα鏈兩者的人轉(zhuǎn)基因的雙重人轉(zhuǎn)基因C57BL6/J小鼠。在該模型中，在注射的3周內(nèi)出現(xiàn)含有腫瘤的皮下結(jié)節(jié)，并且追蹤生長，直到根據(jù)機(jī)構(gòu)動物護(hù)理要求處死動物。

聯(lián)合治療包括：在第7天、第17天、第27天和第37天的抗MUC1IgE(20μg/注射)，第8天、第13天、第18天、第23天、第28天、第33天、第38天、第43天的Poly(I:C)(50μg/輸注)；和第9天、第11天、第14天、第16天、第19天、第21天、第24天、第24天、第26天、第29天、第31天、第34天、第36天、第39天、第41天、第44天的抗PDL-1(每次注射200μg)。用n＝8/組處理8組小鼠。分組為：1＝對照；2＝抗PDL-1；3＝Poly(I:C)；4＝抗PDL-1和Poly(I:C)；5＝單獨(dú)的抗MUC1IgE；6＝抗MUC1IgE和Poly(I:C)；7＝抗MUC1IgE和抗-PDL-1；和8＝抗MUC1IgE和Poly(I:C)和抗PDL-1二者。

在圖9中呈現(xiàn)了實(shí)驗設(shè)計，圖10中繪制無腫瘤存活曲線，并且圖11中繪制了處理組的腫瘤生長曲線。

結(jié)果顯示了在圖10中，用抗MUC1IgE、抗PDL-1和Poly(I:C)的聯(lián)合治療導(dǎo)致在70+攻擊期間里腫瘤生長大大減少(圖10C)。在相同的攻擊期里，其它處理條件的動物無一具有相似的腫瘤生長模式(圖10A-B和D-G)，顯示了在同一時期里陡峭得多的腫瘤生長。

圖11顯示了用抗MUC1IgE、抗PDL-1和Poly(I:C)的聯(lián)合治療在46天攻擊期內(nèi)導(dǎo)致低得多的腫瘤體積。其它處理條件的動物中的腫瘤體積都更大，最接近的處理組(抗MUC1和抗PDL-1)在攻擊期的終點(diǎn)時比用抗MUC1IgE、抗PDL-1抗體和Poly(I:C)的處理具有大大約6.7倍的腫瘤體積。

實(shí)施例5

腫瘤抗原特異性

為了檢查療法對處理組中T細(xì)胞記憶和特異性的影響，用1×10⁶個細(xì)胞/ml的對照(表達(dá)新霉素的Panc02-Neo-Panc02)和表達(dá)抗原的Panc02細(xì)胞–MUC1-Panc02在先前排斥Pan02.MUC1腫瘤的小鼠中進(jìn)行第二輪腫瘤攻擊。關(guān)于實(shí)驗方案的總結(jié)，再參見圖9。這些實(shí)驗的結(jié)果見圖12-14。

動物無一排斥MUC1-Panc02或抗原陰性對照腫瘤細(xì)胞(圖12A和13A)。然而，未能排斥第二輪MUC1-Panc02細(xì)胞攻擊的小鼠表明在腫瘤細(xì)胞攻擊57天后與對照腫瘤相比沒有進(jìn)展的顯著更小的腫瘤(參見圖12B和13B以及圖14)。

這些實(shí)驗的結(jié)果證明了三種免疫調(diào)節(jié)劑[抗MUC1IgE、抗PDL-1和Poly(I:C)]之間的重要相互作用，并且證明了組合的有力的抗腫瘤效果。

盡管以上已經(jīng)描述并且在附圖中示出了優(yōu)選實(shí)施方案，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離本公開的情況下可以進(jìn)行修改。認(rèn)為此類修改是包括在本公開的范圍內(nèi)的可能的變型。

序列表

SEQ ID NO:1

<120>3C6.hIgE重鏈可變

<212>DNA

GCCGCCACCATGTACTTGGGACTGAACTGTGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAGCAAAGCTAATAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGTTTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGGGGGGGTACGGCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTAAGTG

SEQ ID NO:2

<120>3C6.hIgE輕鏈可變

<212>DNA

GCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTAAGT

SEQ ID NO:3

<120>4H5.hIgE單克隆抗體重鏈可變區(qū)

<212>DNA

GCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATGCTCTTTTTGGTAGCAACAGCAACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTGACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGCGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGGGGGGGTGATTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGGTAAGT

SEQ ID NO:4

<120>4H5.hIgE單克隆抗體重鏈可變區(qū)

<212>DNA

GCCGCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTAAGT

SEQ ID NO:5

<120>MUC1表位的氨基酸序列

<212>氨基酸序列

STAPPAHGVTSAPDTRPAPG

序列表

<110> 昂奎斯特有限公司

<120> 腫瘤抗原特異性抗體和TLR3刺激以增強(qiáng)檢查點(diǎn)干擾癌癥療法的性能

<130> P2842PC00

<150> 61/034,915

<151> 2014-08-08

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 428

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polynucleotide

<220>

<223> 3C6.hIgE heavy chain variable:

<400> 1

gccgccacca tgtacttggg actgaactgt gtattcatag tttttctctt aaatggtgtc 60

cagagtgaag tgaagcttga ggagtctgga ggaggcttgg tgcaacctgg aggatccatg 120

aaactctctt gtgctgcctc tggattcact tttagtgacg cctggatgga ctgggtccgc 180

cagtctccag agaaggggct tgagtgggtt gctgaaatta gaagcaaagc taataatcat 240

gcaacatact atgctgagtc tgtgaaaggg aggttcacca tctcaagaga tgtttccaaa 300

agtagtgtct acctgcaaat gaacaactta agagctgaag acactggcat ttattactgt 360

accagggggg ggtacggctt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 420

ggtaagtg 428

<210> 2

<211> 409

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polynucleotide

<220>

<223> 3C6.hlgE light chain variable

<400> 2

gccgccacca tgaagttgcc tgttaggctg ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc 60

agcagtgatg ttttgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 120

gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc attgtacata gtaatggaaa cacctattta 180

gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 240

cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300

aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt actgctttca aggttcacat 360

gttccgctca cgttcggtgc tgggaccaag ctggagctga aacgtaagt 409

<210> 3

<211> 427

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polynucleotide

<220>

<223> 4H5.hIgE monoclonal antibody heavy chain variable region

<400> 3

gccgccacca tgggatggag ctgtatcatg ctctttttgg tagcaacagc aacaggtgtc 60

cactcccagg tccaactgca gcagtctggg gctgaactgg tgaagcctgg ggcttcagtg 120

aagttgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcaccagct actatatgta ctgggtgaag 180

cagaggcctg gacaaggcct tgagtggatt ggagagatta atcctagcaa tggtggtact 240

gacttcaatg agaagttcaa gagcaaggcc acactgactg tagacaaatc ctccagcaca 300

gcatacatgc aactcagcag cctgacatct gcggactctg cggtctatta ctgtacaagg 360

gggggtgatt acccctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420

ggtaagt 427

<210> 4

<211> 415

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polynucleotide

<220>

<223> 4H5.hIgE monoclonal antibody heavy chain variable region

<400> 4

gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatgttac tgctgctatg ggtatctggt 60

acctgtgggg acattgtgat gtcacagtct ccatcctccc tagctgtgtc agttggagag 120

aaggttacta tgagctgcaa gtccagtcag agccttttat atagtagcaa tcaaaagaac 180

tacttggcct ggtaccagca gaaaccaggg cagtctccta aactgctgat ttactgggca 240

tccactaggg aatctggggt ccctgatcgc ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc 300

actctcacca tcagcagtgt gaaggctgaa gacctggcag tttattactg tcagcaatat 360

tatagctatc ctctcacgtt cggtgctggg accaagctgg agctgaaacg taagt 415

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Amino Acid Sequence of MUC1 epitope

<400> 5

Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg

1 5 10 15

Pro Ala Pro Gly

20